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CN113637800A - Hpv18病毒的e6和e7基因检测引物和探针组合物及检测试剂盒 - Google Patents

Hpv18病毒的e6和e7基因检测引物和探针组合物及检测试剂盒 Download PDF

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CN113637800A
CN113637800A CN202110952347.6A CN202110952347A CN113637800A CN 113637800 A CN113637800 A CN 113637800A CN 202110952347 A CN202110952347 A CN 202110952347A CN 113637800 A CN113637800 A CN 113637800A
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CN
China
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seq
nucleotide sequence
probe
primer
detecting
Prior art date
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Application number
CN202110952347.6A
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English (en)
Inventor
牛毛毛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Yuanxing Gene Technology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Yuanxing Gene Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Yuanxing Gene Technology Co ltd filed Critical Shenzhen Yuanxing Gene Technology Co ltd
Priority to CN202110952347.6A priority Critical patent/CN113637800A/zh
Publication of CN113637800A publication Critical patent/CN113637800A/zh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

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Abstract

本发明公开了HPV18病毒的E6和E7基因检测引物和探针组合物及检测试剂盒，通过这些专属性引物和探针可定量检测出HPV18E6和E7片段残留量，可直观评估产品安全性。

Description

HPV18病毒的E6和E7基因检测引物和探针组合物及检测试 剂盒
技术领域
本发明涉及HPV18病毒的E6和E7基因检测引物和探针组合物及检测试剂盒。
背景技术
随着生物制品技术发展，生物制药在生产和质量控制上要求也非常高。绝大多数生物制剂是不经过肠道直接进入体内，所以除了生物活性外，监管部门对药品中杂质的限量要求也非常严格。其中，宿主细胞残留DNA因为具有特别的潜在安全风险，一直是国内外药品监管机构关注的重点。
HPV是一种人乳头瘤病毒，该病毒分为许多血清型，E6和E7它属于人乳头瘤状病毒HPV18中的两个基因，这两个基因都是一种早期转录基因，属于致癌基因，所以应控制相关制剂中的E6和E7基因片段的残留量以保证制剂安全。
Hela细胞是重组痘病毒载体溶瘤病毒和疫苗常用的生产用细胞，Hela细胞来源于人类宫颈癌细胞，存在被人乳头瘤病毒HPV污染的风险，因此采用Hela细胞制备痘病毒载体产品的最终原液和制剂中可能含有未纯化的宿主细胞相关DNA杂质，其中残留的DNA杂质就有可能有HPV18 E6/E7片段，如果不进行Hela细胞残留HPV18 E6/E7片段的测定就存在潜在安全风险。
发明内容
本发明针对HPV18 E6和E7片段分别设计两组专属性引物和探针，以HPV18 E6/E7全基因片段的质粒DNA做标准曲线，采用qPCR法扩增并定量样品中的残留HPV18 E6/E7片段。
E6片段设计E6-100bp和E6-289bp两段引物和探针，E7片段设计E7-111bp和E7-244bp两段引物和探针。
HPV E6/E7全基因片段的质粒(碱基数780bp)
5'--3'
ATGGCGCGCTTTGAGGATCCAACACGGCGACCCTACAAGCTACCTGATCTGTGCAGGAACTGAACACTTCATGCAAGACATAGAAATAACCTGTGTATATTGCAAGACAGATTGGAACTTACAGAGGTATTTGAATTTGCATTAAAGATTTATTTGTGGTGTATAGGACAGTATACCCCATGCTGCATGCCATAAATGTATAGATTTTTATTCTAGATTAGAGATTAAGACATTATTCAGACTCTGTGTATGGAGACACATTGGAAAAACTAACTAACAGGGTTATACATTTATTAATAAGGTGCCTGCGGTGCCAGAAACCGTTGAATCCAGAGAAAAACTTAGACACCTTAATGAAAAACGACGATTTCACAACATAGCTGGGCACTATAGAGGCCAGTGCCATTCGTGCTGCAACCGAGCACGACAGGAACGACTCCAACACGCAGAGAAACACAAGTATAA
ATGCATGGACCTAAGGCAACATTGCAAGACATTGTATTGCATTTAGAGCCCCAAAATGAAATTCCGGTTGACTTCTATGTCACGAGCAATTAAGCGACTCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAGATGGAGTTAATCATCAACATTACCAGCCCGACGAGCCGAACCACAACGTCACACAATGTTGTGTATGTGTTGTAAGTGTGAAGCCAGAATTGGCTAGTAGTAGAAAGCTCAGCAGACGACCTTCGAGCATTCCAGCAGCTGTTTCTGAACACCCTGTCCTTTGGTGTCCGTGGTGTGCATCCCAGCAGTAA
引物和探针：
①E6-100
LEFT PRIMER：ATTAATAAGGTGCCTGCGGTG
RIGHT PRIMER：ATAGTGCCCAGCTATGTTGTG
Probe：CCAGAAACCGTTGAATCCAGCAGAA
②E6-289
LEFT PRIMER:GACAGTATTGGAACTTACAGAGGT
RIGHT PRIMER:CCCAGCTATGTTGTGAAATCGT
Probe：AATAAGGTGCCTGCGGTGCCAGAAA
③E7-111
LEFT PRIMER:TCATCAACATTTACCAGCCCGA
RIGHT PRIMER:TCGTCTGCTGAGCTTTCTACTAC
Probe：CCGAACCACAACGTCACACAATGTT
④E7-244
LEFT PRIMER:TGCATGGACCTAAGGCAAC
RIGHT PRIMER:TCGTCTGCTGAGCTTTCTACT
Probe：TCAACATTTACCAGCCCGACGAGCC
本发明所达到的有益效果是：通过以上两组专属性引物和探针可定量检测出HPV18 E6/E7片段残留量，可直观评估产品安全性。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
通过本发明设计的专属性引物和探针检测样品中HPV18 E6/E7 DNA片段残留量，据此确定高中低3个浓度加标量。
设置如下4组：
片段：E6-100、E6-289和E7-111、E7-244
Figure BDA0003218868590000031
样品(浓度在108PFU/mL不稀释)
Figure BDA0003218868590000032
样品+质粒HPV E6/E7 DNA1组(高STD1)
Figure BDA0003218868590000033
样品+质粒HPV E6/E7 DNA1组(中STD2)
Figure BDA0003218868590000034
样品+质粒HPV E6/E7 DNA1组(中STD3)
纯化回收，qPCR检测，不同时间2名实验员检测3次，计算CV值。
接受标准：CV≤30％。如果样品检测值低于方法定量限，则对CV值不做要求。
重复性
方法：设置2组，每组6个重复进行重复性验证：
Figure BDA0003218868590000041
样品组
Figure BDA0003218868590000042
样品组+质粒HPV E6/E7 DNA1组(中STD2)
进行纯化回收实验，qPCR检测，计算CV值。
接受标准：CV≤30％。如果样品检测值低于方法定量限，则对CV值不做要求。
准确度
方法：根据样品中间精密度实验，计算高中低各自加标样品的回收率。
回收率(％)＝(加标样品测定值-样本测定值)*10μL/加标量*100％
接受标准：回收率在50％～150％范围内。
专属性
方法：片段：E6-100、E6-289和E7-111、E7-244四个片段的反应孔中分别加入3ng干扰DNA(293细胞DNA、HER096细胞DNA和Hela细胞DNA)，qPCR扩增后，分析Ct检测值与NTC和STD6的大小。
接受标准：293细胞DNA、HER096细胞DNA的Ct值＞30，并不得高于STD6的Ct值且与NTC的Ct值相近。Hela细胞DNA的Ct值应在标准曲线Ct值范围内。
实验步骤：
1试剂和耗材
Figure BDA0003218868590000045
TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0 Code No.9766
Figure BDA0003218868590000044
Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)TaKaRa Code No.RR390A
Figure BDA0003218868590000043
HPV E6/E7质粒(上海瑞杰生物合成，碱基数780bp)
Figure BDA00032188685900000510
引物和探针：
①E6-100
LEFT PRIMER：ATTAATAAGGTGCCTGCGGTG
RIGHT PRIMER：ATAGTGCCCAGCTATGTTGTG
Probe：CCAGAAACCGTTGAATCCAGCAGAA
②E6-289
LEFT PRIMER:GACAGTATTGGAACTTACAGAGGT
RIGHT PRIMER:CCCAGCTATGTTGTGAAATCGT
Probe：AATAAGGTGCCTGCGGTGCCAGAAA
③E7-111
LEFT PRIMER:TCATCAACATTTACCAGCCCGA
RIGHT PRIMER:TCGTCTGCTGAGCTTTCTACTAC
Probe：CCGAACCACAACGTCACACAATGTT
④E7-244
LEFT PRIMER:TGCATGGACCTAAGGCAAC
RIGHT PRIMER:TCGTCTGCTGAGCTTTCTACT
Probe：TCAACATTTACCAGCCCGACGAGCC
Figure BDA0003218868590000053
TE缓冲液
Figure BDA0003218868590000052
带滤芯的枪头
Figure BDA0003218868590000051
qPCR八联管和盖子
2实验仪器
Figure BDA0003218868590000057
离心机
Figure BDA0003218868590000056
恒温水浴锅
Figure BDA0003218868590000055
涡旋振荡器
Figure BDA0003218868590000054
超微量紫外分光光度计
Figure BDA0003218868590000058
实时荧光定量PCR仪-CFX96，带Bio-Rad CFX Manager软件
Figure BDA0003218868590000059
移液器
3实验过程
3.1标准品的准备
取合成的HPV E6/E7质粒用TE稀释液溶解后，轻弹几下混匀后，短时间快速离心5s。使用超微量紫外分光光度计测浓度为9.15ng/μL，根据公式*计算拷贝数为1.07×1010copies/μL，此质粒溶液按照下表进行稀释，稀释液为TE缓冲液。
稀释管 稀释体积 终浓度
取质粒溶液10μL+90μL稀释液 1.07E+09copies/μL
STD1 30μL上一级+270μL稀释液 1.07E+08copies/μL
STD2 30μL上一级+270μL稀释液 1.07E+07copies/μL
STD3 30μL ST1+270μL稀释液 1.07E+06copies/μL
STD4 30μL ST2+270μL稀释液 1.07E+05copies/μL
STD5 30μL ST3+270μL稀释液 1.07E+04copies/μL
STD6 30μL ST4+270μL稀释液 1.07E+03copies/μL
*公式计算拷贝数：
Figure BDA0003218868590000061
3.2引物
3.2.1合成回来的冻干粉引物，用TE缓冲液稀释成100μM的储存液。
3.2.2引物工作浓度的稀释：把引物的工作浓度调整在10μM，分装储存。
3.3探针
3.3.1合成回来的冻干粉探针，用TE缓冲液稀释成100μM的储存液。
3.3.2探针工作浓度的稀释：把引物的工作浓度调整在5μM，分装储存。
3.4检品处理
3.4.1取样品A，分装100μL/管。
3.4.2取上述样品3管分别加入10μL标准品高中低(STD1/STD2/STD3)三个浓度。
3.4.3取无E6和E7基因片段的样品100μL作为阴性质控(NCS)。
3.4.4取TE缓冲液100μL，作为无模板对照(NTC)。
3.4.5将上述的供试品用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.5.0试剂盒提取核酸，最终每管核酸体积为100μL，得到PCR模板。
3.5 qPCR反应
3.5.1按下列组份配制qPCR mix反应液(反应液配制在冰上进行)：
Figure BDA0003218868590000071
3.5.2将qPCR mix反应液置于冰上，轻微振荡混匀，按下表所示加PCR模板：
Figure BDA0003218868590000072
一般每个样本做复孔。
3.5.3 qPCR扩增标准程序：
Step 1:95℃30秒
Step 2:PCR
GOTO:39(40cycles)
95℃5秒
57℃30秒
4实验结果分析
4.1实验结果是否有效的判定标准：
参数 要求
R<sup>2</sup> ≧0.99
扩增效率 90％-110％
加样质控信号 落在标准曲线范围内
无模板对照Ct值 ＞35或0
阴性对照Ct值 ＞Ct(STD6)
CV <30％
样品回收率 50％-150％
4.2结果计算：得到检测值是copes/μL根据公式计算出E6.E7的残留含量。
公式：浓度(pg/mL)＝检测值(copes/μL)*碱基数*660*106/6.02×1014
检测数据：
中间精密度
Figure BDA0003218868590000081
Figure BDA0003218868590000091
重复性
Figure BDA0003218868590000092
Figure BDA0003218868590000101
Figure BDA0003218868590000111
准确性
第一次
Figure BDA0003218868590000112
第二次
Figure BDA0003218868590000113
第三次
Figure BDA0003218868590000114
Figure BDA0003218868590000121
专属性
Figure BDA0003218868590000122
Figure BDA0003218868590000123
Figure BDA0003218868590000124
总结：
从实验数据处理来看，中间精密度考察的三次试验中，样品A的E6-100、E7-111、E6-289、E7-244片段分别检测CV值均＜30％，说明实验中间精密度良好。另外6个重复样本分别检测E6-100、E7-111、E6-289、E7-244片段检测结果CV均＜30％，说明实验重复性良好。实验中样品的回收率都在50％～150％之间，符合要求，说明准确度可信；293细胞DNA和HER096细胞DNA扩增不出来，针对Hela细胞DNA正常扩增，说明该方法专属性良好。
综上所述，该qPCR方法可以用于Hela细胞残留HPV18 E6/E7片段大小及含量检测。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳源兴基因技术有限公司
<120> HPV18病毒的E6和E7基因检测引物和探针组合物及检测试剂盒
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attaataagg tgcctgcggt g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atagtgccca gctatgttgt g 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccagaaaccg ttgaatccag cagaa 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacagtattg gaacttacag aggt 24
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccagctatg ttgtgaaatc gt 22
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aataaggtgc ctgcggtgcc agaaa 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcatcaacat ttaccagccc ga 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcgtctgctg agctttctac tac 23
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccgaaccaca acgtcacaca atgtt 25
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgcatggacc taaggcaac 19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcgtctgctg agctttctac t 21
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcaacattta ccagcccgac gagcc 25
<210> 13
<211> 779
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atggcgcgct ttgaggatcc aacacggcga ccctacaagc tacctgatct gtgcaggaac 60
tgaacacttc atgcaagaca tagaaataac ctgtgtatat tgcaagacag attggaactt 120
acagaggtat ttgaatttgc attaaagatt tatttgtggt gtataggaca gtatacccca 180
tgctgcatgc cataaatgta tagattttta ttctagatta gagattaaga cattattcag 240
actctgtgta tggagacaca ttggaaaaac taactaacag ggttatacat ttattaataa 300
ggtgcctgcg gtgccagaaa ccgttgaatc cagagaaaaa cttagacacc ttaatgaaaa 360
acgacgattt cacaacatag ctgggcacta tagaggccag tgccattcgt gctgcaaccg 420
agcacgacag gaacgactcc aacacgcaga gaaacacaag tataaatgca tggacctaag 480
gcaacattgc aagacattgt attgcattta gagccccaaa atgaaattcc ggttgacttc 540
tatgtcacga gcaattaagc gactcagagg aagaaaacga tgaaatagat ggagttaatc 600
atcaacatta ccagcccgac gagccgaacc acaacgtcac acaatgttgt gtatgtgttg 660
taagtgtgaa gccagaattg gctagtagta gaaagctcag cagacgacct tcgagcattc 720
cagcagctgt ttctgaacac cctgtccttt ggtgtccgtg gtgtgcatcc cagcagtaa 779

Claims (3)

1.HPV18病毒的E6和E7基因检测引物和探针组合物，其特征在于，包括如下引物对和分子信标探针：
检测E6-100的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，探针的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；
检测E6-289的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4～5所示，探针的核苷酸序列如SEQID NO.6所示；
检测E7-111的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示，探针的核苷酸序列如SEQID NO.9所示；
检测E7-244的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
2.HPV18病毒的E6和E7基因检测试剂盒，其特征在于，包括如下引物对和分子信标探针：
检测E6-100的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，探针的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；
检测E6-289的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4～5所示，探针的核苷酸序列如SEQID NO.6所示；
检测E7-111的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示，探针的核苷酸序列如SEQID NO.9所示；
检测E7-244的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒用于检品处理时，对样品进行qPCR扩增的标准程序为Step 1:95℃30秒
Step 2:PCR
GOTO:39(40cycles)
95℃5秒
57℃30秒。
CN202110952347.6A 2021-08-19 2021-08-19 Hpv18病毒的e6和e7基因检测引物和探针组合物及检测试剂盒 Pending CN113637800A (zh)

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Citations (3)

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EP0402132A2 (en) * 1989-06-08 1990-12-12 Takara Shuzo Co. Ltd. Method for the detection of human papilloma-virus
CN107641663A (zh) * 2017-07-28 2018-01-30 中国药科大学 用于检测高危型人乳头瘤病毒致癌基因e6/e7dna分型的引物和探针及试剂盒
CN107641662A (zh) * 2017-07-28 2018-01-30 中国药科大学 用于检测高危型人乳头瘤病毒致癌基因E6/E7mRNA分型的引物和探针及试剂盒

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