CN113637674B

CN113637674B - 一种LAMP2突变基因及突变体、以及Danon病检测试剂盒

Info

Publication number: CN113637674B
Application number: CN202110934388.2A
Authority: CN
Inventors: 刘哲; 梁庆渊; 赵娜娜; 赖开生; 刘昕超; 高璇; 李方玉; 侯青; 惠汝太
Original assignee: Bestnovo Beijing Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Bestnovo Beijing Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2021-08-16
Filing date: 2021-08-16
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2041-08-16
Also published as: CN113637674A

Abstract

本发明涉及人类遗传学和内科心血管技术领域，具体涉及了一种LAMP2突变基因，在基因组位置chrX:119575687处，碱基T突变为A。本发明还涉及一种LAMP2突变体，具有p.Cys331Ser突变。本发明还涉及一种Danon病检测试剂盒。本发明提供的LAMP2突变基因可以将Danon病患者和正常人群区分开，可以作为临床辅助诊断Danon病的生物标志物；检测该变异的携带者，可以为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生；为人类攻克Danon病提供可能的药物靶点，促进创新药物研发。

Description

一种LAMP2突变基因及突变体、以及Danon病检测试剂盒

技术领域

本发明涉及人类遗传学和内科心血管技术领域，尤其涉及一种LAMP2突变基因及突变体、以及Danon病检测试剂盒。

背景技术

1981年，Danon等第一次报道了两例非梗塞阻性肥厚型心肌病(hypertrophiccardiomyopathy,HCM)，将之称为“酸性麦芽糖酶正常的溶酶体糖原贮积症”，此后又被命名为Danon病。Danon病是一种X连锁显性遗传性溶酶体病，以肥厚型心肌病、骨骼肌病和智力障碍三联征为主要临床表现，其引起的心肌病变与典型的肥厚型心肌病相似。男性发病较多，发病早，且会逐渐出现肥厚型心肌病，肌无力和智力减退，部分患者出现眼底色素视网膜病；女性患者一般成年后出现心肌病，偶伴轻度的肌无力。

编码Ⅱ型溶酶体相关膜蛋白(lysosome-associated membrane protein-2,LAMP2)的基因突变是导致Danon病的主要病因。随着2000年，Nishino等第一次报道了LAMP2基因突变会导致Danon病以后，多个LAMP2基因的突变位点先后被发现。由于Danon病的临床变现无特异性，可无任何临床症状，也可突发心源性猝死，症状多累及全身多系统，难以预防，所以基因检测成为诊断Danon病的主要手段，发现任何一个LAMP2的突变位点都是对本领域的重要技术贡献。

发明内容

本发明的目的在于针对上述缺陷，提供一种LAMP2突变基因及突变体、以及Danon病检测试剂盒。

本发明通过对Danon病的家系成员进行分析，意料不到地发现了，家系中的Danon病患者具有如下突变：

野生型LAMP2的CDS区域的序列为SEQ ID NO:1。野生型LAMP2基因所编码蛋白质的氨基酸的序列为SEQ ID NO:2。c.991T>A表示：野生型LAMP2的CDS区域中，第991位的碱基T突变为碱基A；p.Cys331Ser表示：LAMP2突变基因编码蛋白第331位氨基酸由半胱氨酸(Cys或C)变为丝氨酸(Ser或S)。

在基因组位置chrX:119575652-chrX:119575701上，野生型LAMP2的序列为SEQ IDNO:3，具体序列为GAAGTTCTTATATGTGCAACAAAGAGCAGACTGTTTCAGTGTCTGGAGCA，其中T为突变前碱基。LAMP2突变基因的序列为SEQ ID NO:4，具体序列为：

GAAGTTCTTATATGAGCAACAAAGAGCAGACTGTTTCAGTGTCTGGAGCA，其中A为突变后碱基。

基于以上发现，本发明提供的技术方案如下：

一、本发明提供一种LAMP2突变基因，在基因组位置chrX:119575687处，碱基T突变为A；参考基因组版本是GRCh37。

本发明还提供了一种LAMP2突变体，具有p.Cys331Ser突变。

查询人群频率数据库发现该变异为罕见变异(千人基因组：无，ESP6500：无，ExAC：无)。百世诺本地人群数据库中的心肌病患者和对照人群均未携带该变异。我们进行了多个生物信息预测软件(包括SIFT和Polyphen-2等)交叉预测，结果多为有害(SIFT为“D”，Polyphen-2为“D”，MutationTaster_pred为“D”，VEST3评分为“0.435”，其他为“4个D/1个M/1个T”)，氨基酸由极性不带电荷的半胱氨酸变为极性不带电荷的丝氨酸，提示该变异所致的氨基酸改变可能会对蛋白功能产生影响。查询数据库发现该位置的氨基酸在脊椎动物中高度保守。查询ClinVar、HGMD数据库未发现该变异，该位点附近的错义变异p.Trp321Arg被上报者评定为Danon病的致病突变(ClinVar数据库)；文献检索未发现该变异与疾病相关的报导。根据现有证据：该变异为罕见变异、，软件预测该变异可能会对蛋白功能产生影响，该位置氨基酸在脊椎动物中高度保守，但缺乏家系连锁及功能学证据支持，所以该变异为可疑致病变异。

二、本发明还提供了上述LAMP2突变基因在制备Danon病检测试剂盒中的应用。

三、本发明还提供了上述LAMP2突变体在制备Danon病检测试剂盒中的应用。

四、本发明还提供了一种Danon病检测试剂盒，包括用于检测LAMP2突变基因和/或LAMP2突变体的试剂，在基因组位置chrX:119575687处，碱基T突变为A5687处，碱基T突变为A；LAMP2突变体具有p.Cys331Ser突变。

优选地，还包括正向引物和反向引物，正向引物序列为SEQ ID NO:5，反向引物序列为SEQ ID NO:6。

五、本发明的有益效果在于：

Danon病属于罕见的神经内分泌肿瘤，在基因组位置chrX:119575687处，碱基T突变为A(即LAMP2突变基因c.991T>A)的杂合错义变异的患者会累及肾上腺，导致嗜铬细胞瘤的发生，以常染体显性遗传的模式在家族中传递，遗传概率为50％。LAMP2突变基因及LAMP2突变体可以作为临床辅助诊断Danon病的生物标志物，为人类攻克Danon病提供可能的药物靶点，促进创新药物研发；基于LAMP2突变基因及LAMP2突变体开发的Danon病检测试剂盒，可以将Danon病患者和正常人群区分开，能够为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生。

附图说明

图1为Danon病家系图；

图2为先证者及先证者哥哥的Sanger测序图；

图3为家系中非患病成员Sanger测序图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例1-先证者验证实验

样本来源：常州市第一人民医院，在先证者(31岁)及其家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL全血样本，建立病历资料库，详细记录先证者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。

先证者临床概况：

表1先证者的临床概况

采用Sanger测序法对先证者及其家属的LAMP2基因进行基因检测，具体步骤如下：

S1、提取基因组DNA；

采用江苏百世诺医疗科技有限公司的磁珠法全血基因组DNA提取试剂对先证者及其家属的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，对DNA的浓度和纯度进行检测。

S2、使用经设计的引物组合对LAMP2基因进行扩增；

(1)配制PCR扩增试剂，PCR扩增试剂的组成具体参见下表2：

表2 PCR扩增试剂的组成

2×Taq MasterMix(Dye)中包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg² ⁺、dNTPs、PCR稳定剂和增强剂等常规PCR所需要的组份；正向引物和反向引物的浓度均为10μmol/L。

扩增所需的引物信息如下表3所示：

表3引物信息

序列编号	引物名称	序列(5’→3’)
			SEQ ID NO:5	正向引物(LAMP2-E8F1)	AGGCCTTCACTGAAAAACCCTGA
SEQ ID NO:6	反向引物(LAMP2-E8R1)	TGCTGCTCCCAAGTGCCAT

(2)目的片段扩增

将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共30循环。72℃终延伸2min。

取2μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选用1000bp Marker作为参考。

S3、采用3730XL Genetic Analyzer全自动测序仪对PCR产物进行测序。从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获得参考序列和测序结果进行比对。

结果表明如图1-图3所示，先证者携带了Danon病的可疑致病变异LAMP2基因c.991T>A杂合错义变异(LAMP2:p.Cys331Ser het)。先证者的父母、丈夫和儿子均未携带LAMP2基因c.991T>A杂合错义变异。先证者的哥哥也携带了LAMP2基因c.991T>A杂合错义变异，但先证者哥哥的妻子和儿子均未携带LAMP2基因c.991T>A杂合错义变异。

LAMP2基因c.991T>A杂合错义变异的致病突变较明确，后期为携带者建立随访计划，并提供与生育有关的遗传咨询。

实施例2-一种Danon病检测试剂盒

本实施例提供用于检测人类LAMP2基因c.991T>A杂合错义变异的试剂盒，包括2×Taq MasterMix(Dye)、根据LAMP2突变基因和/或LAMP2突变体设计的引物等，试剂盒的具体组成如下表4所示。

利用本试剂盒筛选Danon病的具体步骤为：按照实施例1的步骤提取待测者DNA，然后使用经设计的引物组合(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)对LAMP2基因进行扩增，得到PCR产物，最后对PCR产物进行测序。从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获得参考序列和测序结果进行比对，判断待测者LAMP2基因是否携带c.991T>A杂合错义变异，协助临床确诊待测者是否患有Danon病。

表4试剂盒组成

实施例3针对家系外的正常人的突变验证

参照实施例1的方法，对290例同种族无关正常人(即家系外正常人)进行LAMP2基因c.991T>A突变位点检测，结果均未能检测到该突变。

综上结果，并基于LAMP2基因的c.991T>A杂合错义变异会导致LAMP2基因编码的蛋白质发生p.Cys331Ser的改变，而LAMP2基因是Danon病的已知致病基因，从而再次证明了LAMP2基因的c.991T>A杂合错义变异为Danon病的致病突变。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 百世诺（北京）医疗科技有限公司

<120> 一种LAMP2突变基因及突变体、以及Danon病检测试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1236

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atggtgtgct tccgcctctt cccggttccg ggctcagggc tcgttctggt ctgcctagtc 60

ctgggagctg tgcggtctta tgcattggaa cttaatttga cagattcaga aaatgccact 120

tgcctttatg caaaatggca gatgaatttc acagtacgct atgaaactac aaataaaact 180

tataaaactg taaccatttc agaccatggc actgtgacat ataatggaag catttgtggg 240

gatgatcaga atggtcccaa aatagcagtg cagttcggac ctggcttttc ctggattgcg 300

aattttacca aggcagcatc tacttattca attgacagcg tctcattttc ctacaacact 360

ggtgataaca caacatttcc tgatgctgaa gataaaggaa ttcttactgt tgatgaactt 420

ttggccatca gaattccatt gaatgacctt tttagatgca atagtttatc aactttggaa 480

aagaatgatg ttgtccaaca ctactgggat gttcttgtac aagcttttgt ccaaaatggc 540

acagtgagca caaatgagtt cctgtgtgat aaagacaaaa cttcaacagt ggcacccacc 600

atacacacca ctgtgccatc tcctactaca acacctactc caaaggaaaa accagaagct 660

ggaacctatt cagttaataa tggcaatgat acttgtctgc tggctaccat ggggctgcag 720

ctgaacatca ctcaggataa ggttgcttca gttattaaca tcaaccccaa tacaactcac 780

tccacaggca gctgccgttc tcacactgct ctacttagac tcaatagcag caccattaag 840

tatctagact ttgtctttgc tgtgaaaaat gaaaaccgat tttatctgaa ggaagtgaac 900

atcagcatgt atttggttaa tggctccgtt ttcagcattg caaataacaa tctcagctac 960

tgggatgccc ccctgggaag ttcttatatg tgcaacaaag agcagactgt ttcagtgtct 1020

ggagcatttc agataaatac ctttgatcta agggttcagc ctttcaatgt gacacaagga 1080

aagtattcta cagctgaaga atgttctgct gactctgacc tcaactttct tattcctgtt 1140

gcagtgggtg tggccttggg cttccttata attgttgtct ttatctctta tatgattgga 1200

agaaggaaaa gtcgtactgg ttatcagtct gtgtaa 1236

<210> 2

<211> 410

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Val Cys Phe Arg Leu Phe Pro Val Pro Gly Ser Gly Leu Val Leu

1 5 10 15

Val Cys Leu Val Leu Gly Ala Val Arg Ser Tyr Ala Leu Glu Leu Asn

20 25 30

Leu Thr Asp Ser Glu Asn Ala Thr Cys Leu Tyr Ala Lys Trp Gln Met

35 40 45

Asn Phe Thr Val Arg Tyr Glu Thr Thr Asn Lys Thr Tyr Lys Thr Val

50 55 60

Thr Ile Ser Asp His Gly Thr Val Thr Tyr Asn Gly Ser Ile Cys Gly

65 70 75 80

Asp Asp Gln Asn Gly Pro Lys Ile Ala Val Gln Phe Gly Pro Gly Phe

85 90 95

Ser Trp Ile Ala Asn Phe Thr Lys Ala Ala Ser Thr Tyr Ser Ile Asp

100 105 110

Ser Val Ser Phe Ser Tyr Asn Thr Gly Asp Asn Thr Thr Phe Pro Asp

115 120 125

Ala Glu Asp Lys Gly Ile Leu Thr Val Asp Glu Leu Leu Ala Ile Arg

130 135 140

Ile Pro Leu Asn Asp Leu Phe Arg Cys Asn Ser Leu Ser Thr Leu Glu

145 150 155 160

Lys Asn Asp Val Val Gln His Tyr Trp Asp Val Leu Val Gln Ala Phe

165 170 175

Val Gln Asn Gly Thr Val Ser Thr Asn Glu Phe Leu Cys Asp Lys Asp

180 185 190

Lys Thr Ser Thr Val Ala Pro Thr Ile His Thr Thr Val Pro Ser Pro

195 200 205

Thr Thr Thr Pro Thr Pro Lys Glu Lys Pro Glu Ala Gly Thr Tyr Ser

210 215 220

Val Asn Asn Gly Asn Asp Thr Cys Leu Leu Ala Thr Met Gly Leu Gln

225 230 235 240

Leu Asn Ile Thr Gln Asp Lys Val Ala Ser Val Ile Asn Ile Asn Pro

245 250 255

Asn Thr Thr His Ser Thr Gly Ser Cys Arg Ser His Thr Ala Leu Leu

260 265 270

Arg Leu Asn Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Leu Asp Phe Val Phe Ala Val

275 280 285

Lys Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Leu Lys Glu Val Asn Ile Ser Met Tyr

290 295 300

Leu Val Asn Gly Ser Val Phe Ser Ile Ala Asn Asn Asn Leu Ser Tyr

305 310 315 320

Arg Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Thr

325 330 335

Val Ser Val Ser Gly Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asp Leu Arg Val

340 345 350

Gln Pro Phe Asn Val Thr Gln Gly Lys Tyr Ser Thr Ala Gln Glu Cys

355 360 365

Ser Leu Asp Asp Asp Thr Ile Leu Ile Pro Ile Ile Val Gly Ala Gly

370 375 380

Leu Ser Gly Leu Ile Ile Val Ile Val Ile Ala Tyr Val Ile Gly Arg

385 390 395 400

Arg Lys Ser Tyr Ala Xaa Tyr Gln Thr Leu

405 410

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

gaagttctta tatgtgcaac aaagagcaga ctgtttcagt gtctggagca 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

gaagttctta tatgagcaac aaagagcaga ctgtttcagt gtctggagca 50

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

aggccttcac tgaaaaaccc tga 23

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

tgctgctccc aagtgccat 19

Claims

1.一种LAMP2突变基因，其特征在于，在基因组位置chrX:119575687处，碱基T突变为A；参考基因组版本是GRCh37。

2.根据权利要求1所述的LAMP2突变基因在制备Danon病检测试剂盒中的应用。

3.一种Danon病检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测LAMP2突变基因的试剂，所述突变是在基因组位置chrX:119575687处，碱基T突变为A。

4.根据权利要求3所述的Danon病检测试剂盒，其特征在于，还包括正向引物和反向引物，正向引物序列为SEQ ID NO:5，反向引物序列为SEQ ID NO:6。