[go: up one dir, main page]

CN113621074A - 一种多价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用 - Google Patents

一种多价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113621074A
CN113621074A CN202110901775.6A CN202110901775A CN113621074A CN 113621074 A CN113621074 A CN 113621074A CN 202110901775 A CN202110901775 A CN 202110901775A CN 113621074 A CN113621074 A CN 113621074A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nac
protein
plant
multivalent
fusion protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110901775.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113621074B (zh
Inventor
孙爱友
蔡增英
王众
张冲
苗诗悦
孙冰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Heqifeng Ecological Technology Co ltd
Original Assignee
Suzhou Yishuimo Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Yishuimo Biotechnology Co ltd filed Critical Suzhou Yishuimo Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110901775.6A priority Critical patent/CN113621074B/zh
Priority to US17/503,356 priority patent/US11702454B2/en
Publication of CN113621074A publication Critical patent/CN113621074A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113621074B publication Critical patent/CN113621074B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
    • A01N47/40—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides
    • A01N47/42—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides containing —N=CX2 groups, e.g. isothiourea
    • A01N47/44—Guanidine; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P21/00—Plant growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/27—Erwinia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及多价融合蛋白AB‑NAC‑189及其生产方法和应用。所述AB‑NAC‑189蛋白，是将多肽片段AB、NAC和HarpinEa蛋白N端的1‑189位氨基酸对应189蛋白，融合而成的融合体。融合体具有多价植物免疫蛋白的特性，其能有效激发烟叶产生超敏反应，且热稳定性好。在激发植物产生免疫反应的同时，还可提高植物抗病能力，促进植物生长。与单独的AB、NAC和单独的HrpN189相比，AB‑NAC‑189多价疫苗单位浓度的活性更高、促进小麦和烟草生长的能力更强，激发烟草SA途径，提高烟草抗病性的能力更强，还可以显著促进枸杞叶绿素的合成，从而提高枸杞果实的产量和品质。

Description

一种多价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种多价植物免疫融合蛋白，及其基因工程菌的构建、蛋白的制备和应用。具体涉及多价融合蛋白AB-NAC-189、基因序列、制备方法及在提高植物的免疫力和抗逆性、促进植物的发芽和生长中的应用。
背景技术：
HpalXoo(＝hrfA)基因是通过PCR方法从水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)JxoⅢ菌株中克隆到的,其编码的HarpinXoo蛋白相对分子质量为15.6kDa，是最小的Harpin蛋白，具有其他Harpins所共有的生物活性。HarpinXoo蛋白在烟草上可同时启动过敏性细胞死亡和抗病性信号通路，植物受病原物或激发子等因子的刺激可引发过敏性细胞死亡(Hypersensitive cell death，HCD)。
互隔交链孢霉(Alternaria sp.)是一类重要的植物病原真菌，能引起多种植物病害。从该菌中分离得到的新生多肽相关复合体(Nascent polypeptide-associatedcomplex，NAC)由α-NAC和β-NAC共2个亚基组成，体内和体外实验证实，NAC(尤其是α-NAC)可以形成一个稳定的异源复合体，其能够在蛋白质翻译过程中阻止新生多肽在合成之后与错误的蛋白分子结合。NAC具有蛋白翻译和基因转录的双重功能，同时也是新生多肽从细胞质中进入内质网和线粒体的一个桥梁。近年来，NAC在植物促生长、诱导免疫等方面的研究也取得了快速发展。如，可以增加烟草细胞中叶绿素的含量、促进植物的生长；对植物的花器官的形成和种子发育也具有明显的促进作用；能够增强植物在高盐、干旱等胁迫环境下的生存能力；促进植物体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等的生成，显著激发植物的免疫反应等。
超敏蛋白HarpinEa是由HrpN基因编码，1992年由韦忠民等人从梨火疫病菌(Erwinia amylovora)中分离出来的一种能够激发植物产生过敏反应的蛋白。HrpN是Harpin家族的三个成员之一。HarpinEa蛋白在诱导植物产生抗性的前期，可以激发多种抗性机制，引发植物对病原物的广谱抗性。经过大量的研究表明，HarpinEa激发植物产生防卫的过程中涉及到了三种传导途径：乙烯通路、脱落酸通路、系统获得性抗性。
分别将上述三种蛋白分子的核心片段AB、NAC和HrpN189进行融合表达，使之可以与植物细胞的多个受体结合，将其功能进行叠加，可以达到多价免疫蛋白效果。
发明内容：
本发明提供一种多价植物免疫融合蛋白，所述多价植物免疫融合蛋白命名为AB-NAC-189蛋白，是来源于水稻黄单胞细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)的HpalXoo基因编码的多肽片段AB、来源于互隔交链孢霉(Alternaria sp.)的新生多肽相关复合体α亚基(Nascent polypeptide-associated complex,alpha subunit)NAC和来源于解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)的HrpN蛋白N端的1-189个氨基酸HrpN189，融合而成的多价植物免疫融合蛋白；
所述AB-NAC-189蛋白具体为：
(1)序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或
(2)SEQ ID NO.1同源性75％以上的氨基酸序列；或
(3)在SEQ ID NO.1的基础上进行一个或多个氨基酸替换，和/或缺失，和/或添加后获得的具有SEQ ID NO.1相同功能的氨基酸序列；
本发明还保护编码所述AB-NAC-189蛋白的核酸分子，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA；
进一步地，所述AB-NAC-189蛋白的编码基因如序列表SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一目的是提供含有上述AB-NAC-189蛋白的编码基因的表达盒、重组载体、重组菌；
进一步地，所述重组载体的表达载体可以是pET28a质粒、pET30a质粒或pBV222质粒等；
优选地，所述重组载体的表达载体为含有T7强启动子的pET28a(+)质粒；
进一步地，所述重组菌的宿主可以是大肠杆菌DH5α、BL21、BL21(DE3)、K-12、C802、JM109、TOP10、HB101、DH10B等；
优选地，所述重组菌的宿主为E.coli BL21(DE3)。
本发明还提供上述重组菌的构建方法，是将经过密码子优化过的AB和NAC、HrpN189的编码基因进行分别或共同融合后获得AB-NAC-189基因，与表达载体进行酶切连接后转化入宿主细胞所得；
所述AB片段的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述NAC片段的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述HrpN189片段的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
进一步地，AB和NAC、HrpN189片段编码基因的融合是通过(G4S)3链接肽进行融合连接；融合后获得的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
进一步地，所述重组菌以含有T7强启动子的pET28a(+)质粒为载体，以E.coliBL21(DE3)为宿主，获得基因工程菌E.coli/AB-NAC-189。
本发明还提供融合蛋白AB-NAC-189的生产方法，具体如下：
将构建成功的E.coli/AB-NAC-189基因工程菌接种至发酵培养基中，待OD600达到0.6-1.8，添加IPTG诱导表达，离心收获菌体，破碎，取破碎液上清液，经Ni-NTA亲和层析纯化后，可得纯度超过90％的AB-NAC-189蛋白产品；
进一步地，培养条件为：以1-10％的接种量接种发酵培养基，待OD600达到0.6-1.8，添加IPTG至终浓度0.1-0.6mM，15-20℃，200rpm低温诱导16-20h；经16-20h诱导后，AB-NAC-189蛋白的得率可以达到0.1-0.8g/L发酵液；
进一步地，所述发酵培养基为含50μg/mL卡那霉素的LB培养基；
进一步地，IPTG的添加量为终浓度0.3mM。
本发明还提供所述AB-NAC-189蛋白在促进植物生长中的应用；
优选地，所述AB-NAC-189蛋白在促进植物生长中的应用方法如下：
将AB-NAC-189蛋白配比成终浓度为0.125-50μg/mL的溶液，单独或与化学农药混合、与其他农药/微生物菌肥/土壤调理剂/植物刺激剂/植物提取物等混合后，进行叶面喷施或灌根，可以有效激发植物的免疫反应；
优选地，AB-NAC-189蛋白浓度为0.25μg/mL；
优选地，施用方法为叶面喷施。
本发明还提供所述AB-NAC-189蛋白在制备植物促生长剂中的应用；
本发明还提供所述AB-NAC-189蛋白的编码基因，或含有所述编码基因的重组载体、重组菌，在促进植物生长中的应用；
本发明还提供所述AB-NAC-189蛋白的编码基因，或含有所述编码基因的重组载体、重组菌在制备植物促生长剂中的应用；
进一步地，所述植物可以为小麦、水稻、烟草、辣椒、番茄等；
上述应用可快速激发植物的免疫反应，提高植物抗病能力，促进植物生长，增加果实产量。
有益效果：
本发明提供的多价融合蛋白AB-NAC-189，具有多价植物免疫蛋白的特性，其能有效激发烟叶产生超敏反应(HR)，且在沸水(100℃)中煮沸10分钟，依然具有免疫活性，热稳定性好。在激发植物产生免疫反应的同时，还可提高植物的抗病能力，促进植物生长。
与单独的AB、NAC和189相比，AB-NAC-189多价疫苗单位浓度的活性更高、促进小麦和烟草生长的能力更强，且激发烟草SA途径，提高烟草抗病性的能力更强，还可以显著促进枸杞叶绿素的合成，从而提高枸杞果实的产量和品质。
附图说明：
图1：AB-NAC-189基因PCR验证图
其中，(A)M，DNA marker；1，AB。(B)M，DNA marker；1，NAC。(C)M，DNA marker；1，189。(D)M，DNA marker；1，AB-NAC-189。
图2：AB-NAC-189蛋白的Ni-NTA亲和层析图
其中，M，蛋白marker；1，全菌破碎液；2，破碎液上清；3，破碎液沉淀；4，过滤膜穿透液；5，50mM咪唑洗脱液；6，300mM咪唑洗脱液。
图3：AB、NAC、189及AB-NAC-189对烟草叶片的HR反应图
其中，(A)AB对烟草叶片的HR反应图。(B)NAC对烟草叶片的HR反应图。(C)189对烟草叶片的HR反应图。(D)AB-NAC-189对烟草叶片的HR反应图。1，12.5μg/mL；2，25μg/mL；3，50μg/mL；4，100μg/mL；5，水；6，PBS；7，EVP；8，Proteinase K处理1h；9，100℃处理10min；10，200μg/mL。
图4：AB、NAC、189及AB-NAC-189处理后烟草叶片叶绿素含量图
其中，横坐标：a表示叶绿素a；b表示叶绿素b；a+b表示叶绿素总量。每组柱形图从左向右依次表示EVP、AB、NAC、HrpN189、AB-NAC-189处理7d后烟草叶片的叶绿素含量。
图5：AB、NAC、189及AB-NAC-189处理后枸杞叶片叶绿素含量图
其中，横坐标：a表示叶绿素a；b表示叶绿素b；a+b表示叶绿素总量。每组柱形图从左向右依次表示EVP、AB、NAC、HrpN189、AB-NAC-189处理10d后枸杞叶片的叶绿素含量。
图6：AB、NAC、189及AB-NAC-189处理后烟草SA含量变化图
其中，(A)AB处理后烟草SA含量变化图。(B)NAC处理后烟草SA含量变化图。(C)189处理后烟草SA含量变化图。(D)AB-NAC-189处理后烟草SA含量变化图。
图7：AB、NAC、189及AB-NAC-189处理后小麦幼苗生长状况图
其中，(A)AB处理后小麦幼苗生长状况图。(B)NAC处理后小麦幼苗生长状况图。(C)189处理后小麦幼苗生长状况图。(D)AB-NAC-189处理后小麦幼苗生长状况图。从左向右依次为EVP、0.5、2.5、5、25、50μg/mL蛋白浸种处理。
图8：AB、NAC、189及AB-NAC-189处理后小麦幼苗根长、株高、湿重、干重图其中，(A)AB处理后小麦幼苗根长、株高图。(B)AB处理后小麦幼苗湿重、干重图。(C)NAC处理后小麦幼苗根长、株高图。(D)NAC处理后小麦幼苗湿重、干重图。(E)189处理后小麦幼苗根长、株高图。(F)189处理后小麦幼苗湿重、干重图。(G)AB-NAC-189处理后小麦幼苗根长、株高图。(H)AB-NAC-189处理后小麦幼苗湿重、干重图。
图9：多价疫苗AB-NAC-189对枸杞果实产量影响
其中，横坐标从左到右依次为样品EVP、AB、NAC、HrpN189和AB-NAC-189；纵坐标为不同样品处理平均每棵树枸杞果实产量。
具体实施方案：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
下述实施例的实验方法如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中所使用的实验材料及试剂，如无特别说明，均可通过商业途径购买获得。
本发明提供的AB-NAC-189蛋白可根据氨基酸序列进行人工合成，也可通过对编码基因进行生物表达获得。
以下将结合附图及具体实施例对本发明做进一步地解释说明。
实施例1：E.coli/AB-NAC-189基因工程菌构建
本发明提供的AB-NAC-189蛋白可根据氨基酸序列进行人工合成，也可通过对编码基因进行生物表达获得，本实施例将以基因表达的形式为例进行解释说明。
(1)基因融合
①引物序列
AB基因(SEQ ID NO.3所示)、NAC基因(SEQ ID NO.4所示)和189基因(SEQ ID NO.5所示)融合所采用的引物为AB FP、AB RP、NAC FP、NAC RP和189FP、189RP，引物序列如下表所示：
Figure BDA0003200019860000051
Figure BDA0003200019860000061
②基因融合
以含有AB基因的序列为模板，用引物AB FP和AB RP扩增AB基因；以含NAC基因的序列为模板，用引物NAC FP和NAC RP扩增NAC基因；以含189基因的序列为模板，用引物189FP和189RP扩增189基因。将扩增的产物进行基因融合(反应体系50μL，包含18μL的水，3μL的目的基因，2μL的前引物，2μL的后引物，25μL的2×PFU，94℃预变性90s，94℃下变性20s，60℃退火20s，72℃下延伸41s，变性、退火、延伸三个步骤循环10轮，延伸5min)，用引物AB FP和189RP融合PCR扩增得AB-NAC-189基因，PCR结果如图1所示。
(2)工程菌构建
AB-NAC-189基因插入含有T7强启动子的pET28a(+)质粒的Nco I和Xho I酶切位点中间，构建成pET-28a-AB-NAC-189重组质粒。将此重组质粒以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌，进行转化，经PCR验证和基因测序确定，阳性克隆即为构建成功的E.coli/AB-NAC-189基因工程菌。
实施例2：AB-NAC-189多价融合蛋白的诱导表达
将重组菌株E.coli/AB-NAC-189接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养12h制备成种子液；
按5％的接种量将种子液接种到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃继续培养，待OD600达到1.0，添加IPTG至终浓度0.3mM，18℃，200rpm低温诱导18h；AB-NAC-189蛋白的得率可以达到0.8g/L发酵液。
诱导结束后，8000rpm离心10min，收集菌体，破碎，8000rpm离心30min，取上清，将上清液滤膜过滤，进样Ni-NTA亲和层析柱，管中蛋白样减少一个柱体积后即取穿透样，用4个柱体积的裂解缓冲液洗涤镍柱，然后用50mM或300mM的咪唑洗脱，收集洗脱液。结果显示，300mM的咪唑可以将AB-NAC-189蛋白完全洗脱下来，蛋白纯度约为90％。将蛋白样品进行SDS-PAGE检测，结果如图2所示，泳道6可以看到清晰的AB-NAC-189融合蛋白，条带大小约为48kDa。
实施例3：AB-NAC-189对烟草叶片HR反应的检测
将AB、NAC、189及AB-NAC-189蛋白产品用PBS缓冲液稀释，配置如下样品：
(A-D)样品1：12.5μg/mL AB、NAC、189及AB-NAC-189；
(A-D)样品2：25μg/mL AB、NAC、189及AB-NAC-189；
(A-D)样品3：50μg/mL AB、NAC、189及AB-NAC-189；
(A-D)样品4：100μg/mL AB、NAC、189及AB-NAC-189；
(A-D)样品9：200μg/mL AB和NAC、100μg/mL 189和AB-NAC-189蛋白100℃水浴加热10min；
(A，B)样品10：200μg/mL AB、NAC；
阴性对照1(样品5)：水；
阴性对照2(样品6)：PBS缓冲液；
阴性对照3(样品7)：空载大肠杆菌破碎液(EVP)；
阴性对照4(样品8)：Proteinase K处理1h的蛋白。
取上述蛋白样品和对照样品，对处于生长期的烟草叶片进行注射，每孔的注射剂量均为50μl。将注射后的烟草放置在植物培养箱中，28℃培养3天，观察叶片中的枯斑大小。
结果如图3(D)所示，AB-NAC-189能强烈引起烟草叶片的HR反应，12.5μg/mL(0.32μM)AB-NAC-189蛋白注射后,烟草产生明显的枯斑；用100℃水浴处理10min后，AB-NAC-189蛋白仍可使烟草叶片产生HR反应，没有明显影响蛋白的生物活性，说明多价免疫蛋白空间结构未受影响，且可稳定存在，可大量生产并投入使用。图3还说明，与同质量浓度对照AB(2.02μM)、NAC(0.94μM)和189(0.65μM)相比，AB和NAC没有使叶片产生明显的枯斑，189和AB-NAC-189引起了枯斑，但AB-NAC-189枯斑面积更大，且其摩尔浓度最小，仅为189摩尔浓度的一半，说明融合蛋白AB-NAC-189的活性具有更好的累加效果，能显著激发烟草的HR反应。
实施例4：AB-NAC-189促进烟草叶绿素合成实验
用15μg/mL的AB、NAC、189及AB-NAC-189蛋白产品及阴性对照EVP分别喷施烟草下位三片叶10mL，7d后取样测定烟草叶绿素含量。每份样品0.1g，加入10mL 95％乙醇，避光静置24h后分别于A665、A649测定其叶绿素a、叶绿素b含量。
结果如图4所示，同质量浓度AB(2.42μM)、NAC(1.13μM)、189(0.78μM)及AB-NAC-189(0.39μM)处理后的烟草叶绿素含量分别约为阴性对照的1.3、1.8、1.5、1.9倍。由此可见，AB-NAC-189的摩尔浓度最低，仅为189摩尔浓度的一半，但促进烟草叶绿素的合成效果更为显著，说明AB-NAC-189对烟草的生长具有明显的积极影响。
实施例5：AB-NAC-189促进枸杞叶绿素合成实验
采用体积3mL浓度为10μg/mL的AB(1.61μM)、NAC(0.75μM)、189(0.52μM)、AB-NAC-189(0.26μM)蛋白产品及阴性对照EVP溶液分别喷施大小相当的五片枸杞叶，每组3个平行实验，10d后取样测定枸杞叶绿素含量。每份样品0.1g，加入10mL 95％乙醇，避光静置24h后分别于A665、A649测定其叶绿素a、叶绿素b含量。
结果如图5和表1所示，AB、NAC、189及AB-NAC-189处理后的枸杞叶绿素含量分别约为阴性对照的1.1、1.15、1.13、1.8倍。由此可见，单体AB、NAC和189对枸杞叶绿素含量并无明显提升，而AB-NAC-189不但摩尔浓度最低，还可以显著促进枸杞叶绿素的合成，从而提高枸杞果实的产量和品质，是一种很适合枸杞生长和生产的植物疫苗，效果远优于AB、NAC、189蛋白。
表1.AB-NAC-189对枸杞叶片叶绿素合成影响
Figure BDA0003200019860000081
实施例6：AB-NAC-189处理后烟草SA含量变化
选取长势相近的烟草植株，分别均匀喷施15μg/mL的AB、NAC、189及AB-NAC-189蛋白产品至烟草下位三片叶，以EVP作为阴性对照，处理后不同时间取样，通过UPLC-MS法测定烟草叶片SA含量。
结果如图6所示，AB-NAC-189(0.39μM)处理后，烟草叶片SA含量迅速上升，24h达到峰值3.59μg/g，约为基础水平的29.82倍，随后迅速下降至基础水平，并在60h和84h左右再次发生上升再回落的情况，说明AB-NAC-189处理激发了烟草的SA途径。且与对照AB(2.42μM)、NAC(1.13μM)、189(0.78μM)分别提高了约2.25、5.75、17.69倍相比，AB-NAC-189激发SA途径的效果更强，且远高于AB、NAC、189三者总和。从摩尔角度分析，单个分子激发烟草叶片SA水平，AB-NAC-189是剩余三者表现最好的189的3.37倍，是表现最差AB的82倍，从而更准确说明AB-NAC-189提高植物抗病性的能力更强。
实施例7：AB-NAC-189处理促进小麦幼苗生长实验
用不同浓度的AB-NAC-189蛋白对小麦种子进行浸种处理，浸种12h后，将小麦种子播种于96孔培养盒，水培7d后测量其参数，EVP作为阴性对照作相同处理。
结果如图7、8所示，AB-NAC-189处理的小麦根长可达EVP处理的1.38倍，株高可达EVP处理的1.45倍，湿重可达EVP处理的1.32倍，干重可达EVP处理的1.31倍。并且，相较于AB、NAC、189处理，促进效果分别提高了约10％、5％和6％，说明融合后的AB-NAC-189对小麦的促生长效果强于单体蛋白。
实施例8：AB-NAC-189处理促进枸杞果实产量实验
选取同一批播种育苗生长，树龄为6年，长势一致的25棵枸杞树(共5组，每组5颗)为实验对象，采用300mL浓度为15μg/mL的AB、NAC、189、AB-NAC-189蛋白产品及阴性对照EVP溶液，分别在4-5月份之间(生枝现蕾和抽新枝的高峰期)和六月份(新枝继续生长、现蕾、生枝坐果及幼果膨大期)各喷施一次，总共两次，然后在采摘期确定枸杞果实的产量。
结果如图9和表2所示，同质量浓度AB(2.42μM)、NAC(1.13μM)、189(0.78μM)及AB-NAC-189(0.39μM)处理后的枸杞果实的产量分别为阴性对照的1.08、1.15、1.20、1.7。由此可见，单体AB、NAC和189对枸杞果实产量提升并不明显，而AB-NAC-189摩尔浓度最低，但可以显著促进枸杞产量的提升，果实鲜重提升70％，且大而饱满，因此AB-NAC-189是一种很适合提高枸杞果实产量和质量的多价植物疫苗。
表2 AB-NAC-189对枸杞果实影响
Figure BDA0003200019860000091
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州乙水茉生物科技有限公司
<120> 一种多价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用
<130> 1
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Gly Asn Ser Leu Asn Thr Gln Phe Gly Gly Ser Thr Ser Asn Leu
1 5 10 15
Gln Val Gly Pro Ser Gln Asp Thr Thr Phe Gly Ser Asn Gln Gly Gly
20 25 30
Asn Gln Gly Ile Ser Glu Lys Gln Leu Asp Gln Leu Leu Cys Gln Leu
35 40 45
Ile Ser Ala Leu Leu Gln Ser Ser Lys Asn Ala Glu Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Asn Pro Arg Ile
65 70 75 80
Glu Glu Leu Pro Asp Glu Pro Glu Lys Lys Asn Val Gln Ile Glu Glu
85 90 95
Asp Glu Ser Ser Asp Glu Ser Glu Gly Glu Glu Gly Glu Val Ser Val
100 105 110
Pro Ala Gly Ser Ser Val Ala Val His Ser Arg Asn Glu Lys Lys Ala
115 120 125
Arg Lys Ala Ile Ala Lys Leu Gly Leu Lys His Ile Asp Gly Ile Thr
130 135 140
Arg Val Thr Leu Arg Arg Pro Lys Asn Ile Leu Phe Val Ile Asn Gln
145 150 155 160
Pro Asp Val Tyr Lys Ser Pro Ser Ser Asn Thr Trp Ile Ile Phe Gly
165 170 175
Glu Ala Lys Ile Glu Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr
195 200 205
Met Gln Ile Ser Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly
210 215 220
Thr Ser Arg Gln Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu
225 230 235 240
Gly Gly Gly Asn Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu
245 250 255
Thr Gly Met Met Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met
260 265 270
Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly
275 280 285
Gly Leu Gly Glu Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly
290 295 300
Ser Leu Asn Thr Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr
305 310 315 320
Thr Asn Ser Pro Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln
325 330 335
Asn Asp Asp Ser Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp
340 345 350
Pro Met Gln Gln Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu
355 360 365
Phe Gly Asp Gly Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys
370 375 380
Leu Glu His His His His His His
385 390
<210> 2
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgggcaact ctctgaacac ccagttcggt ggttctacct ctaacctgca ggttggtccg 60
tctcaggaca ccaccttcgg ttctaaccag ggtggtaacc agggtatctc tgaaaaacag 120
ctggaccagc tgctgtgcca gctgataagt gctctgctgc agtcttctaa aaacgctgaa 180
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggctaa cccgcgtatc 240
gaagaactgc cggacgaacc ggaaaaaaaa aacgttcaga tagaagaaga cgaatcttct 300
gacgaatctg aaggtgaaga aggtgaagtt tctgttccgg ctggttcttc tgttgctgtt 360
cactctcgta acgaaaaaaa agctcgtaaa gctatcgcta aactgggtct gaaacacatc 420
gacggtatca cccgtgttac cctgcgtcgt ccgaaaaaca tcctgttcgt tatcaaccag 480
ccagacgtgt acaaaagccc gtcttctaac acctggataa tcttcggtga agctaaaatc 540
gaagacggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc gtctctgaac 600
acctctggtc tgggtgcttc taccatgcag ataagtatcg gtggtgctgg tggtaacaac 660
ggtctgctgg gtacttctcg tcagaacgct ggtctgggtg gtaactctgc tctgggtctg 720
ggtggtggta accagaacga caccgttaac cagctggctg gtctgctgac cggtatgatg 780
atgatgatgt ctatgatggg tggtggtggt ctgatgggtg gtggtctggg tggtggtctg 840
ggtaacggtc tgggtggttc tggtggtctg ggtgaaggtc tgtctaacgc tctgaacgac 900
atgctgggtg gttctctgaa caccctgggt tctaaaggtg gtaacaacac cacctctacc 960
accaactctc cgctggacca ggctctgggt atcaactcta cctctcagaa cgacgactct 1020
acctctggta ctgactctac ctctgactct tctgacccga tgcagcagct gctgaaaatg 1080
ttctctgaaa tcatgcagtc tctgttcggt gacggtcagg acggtactca gggttcttct 1140
tctggtggta aactcgagca ccaccaccac caccactga 1179
<210> 3
<211> 180
<212> DNA
<213> 水稻黄单胞细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)
<400> 3
atgggcaact ctctgaacac ccagttcggt ggttctacct ctaacctgca ggttggtccg 60
tctcaggaca ccaccttcgg ttctaaccag ggtggtaacc agggtatctc tgaaaaacag 120
ctggaccagc tgctgtgcca gctgataagt gctctgctgc agtcttctaa aaacgctgaa 180
<210> 4
<211> 324
<212> DNA
<213> 互隔交链孢霉（Alternaria sp.）
<400> 4
atggctaacc cgcgtatcga agaactgccg gacgaaccgg aaaaaaaaaa cgttcagata 60
gaagaagacg aatcttctga cgaatctgaa ggtgaagaag gtgaagtttc tgttccggct 120
ggttcttctg ttgctgttca ctctcgtaac gaaaaaaaag ctcgtaaagc tatcgctaaa 180
ctgggtctga aacacatcga cggtatcacc cgtgttaccc tgcgtcgtcc gaaaaacatc 240
ctgttcgtta tcaaccagcc agacgtgtac aaaagcccgt cttctaacac ctggataatc 300
ttcggtgaag ctaaaatcga agac 324
<210> 5
<211> 564
<212> DNA
<213> 解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）
<400> 5
atgtctctga acacctctgg tctgggtgct tctaccatgc agataagtat cggtggtgct 60
ggtggtaaca acggtctgct gggtacttct cgtcagaacg ctggtctggg tggtaactct 120
gctctgggtc tgggtggtgg taaccagaac gacaccgtta accagctggc tggtctgctg 180
accggtatga tgatgatgat gtctatgatg ggtggtggtg gtctgatggg tggtggtctg 240
ggtggtggtc tgggtaacgg tctgggtggt tctggtggtc tgggtgaagg tctgtctaac 300
gctctgaacg acatgctggg tggttctctg aacaccctgg gttctaaagg tggtaacaac 360
accacctcta ccaccaactc tccgctggac caggctctgg gtatcaactc tacctctcag 420
aacgacgact ctacctctgg tactgactct acctctgact cttctgaccc gatgcagcag 480
ctgctgaaaa tgttctctga aatcatgcag tctctgttcg gtgacggtca ggacggtact 540
cagggttctt cttctggtgg taaa 564

Claims (9)

1.一种多价植物免疫融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为AB-NAC-189蛋白，是将来源于水稻黄单胞细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)的HpalXoo基因编码的多肽片段AB、来源于互隔交链孢霉(Alternaria sp.)的新生多肽相关复合体α亚基(nascentpolypeptide-associated complex,alpha subunit)NAC和来源于解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)的HrpN蛋白N端的1-189个氨基酸HrpN189，融合而成的多价植物免疫融合蛋白。
2.如权利要求1所述的一种多价植物免疫融合蛋白，其特征在于，所述AB-NAC-189蛋白具体为：
(1)序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或
(2)SEQ ID NO.1同源性75％以上的氨基酸序列；或
(3)在SEQ ID NO.1的基础上进行一个或多个氨基酸替换，和/或缺失，和/或添加后获得的具有SEQ ID NO.1相同功能的氨基酸序列。
3.编码权利要求1或2所述多价植物免疫融合蛋白的核酸分子。
4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
5.含有权利要求3或4核酸分子的重组载体、重组菌。
6.一种制备权利要求1-3任一一项所述多价植物免疫融合蛋白的方法，其特征在于，采用权利要求5所述的重组菌以1-10％的接种量接种发酵培养基，待OD600达到0.6-1.8，添加IPTG至终浓度0.1-0.6mM，15-20℃，200rpm低温诱导16-20h。
7.权利要求1-3任意一项所述多价植物免疫融合蛋白在促进植物生长或在制备植物促生长剂中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，具体方法如下：将AB-NAC-189蛋白配比成终浓度为0.125-50μg/mL的溶液，单独或与化学农药混合、与其他农药/微生物菌肥/土壤调理剂/植物刺激剂/植物提取物等混合后，进行叶面喷施或灌根。
9.权利要求5所述的重组载体、重组菌在促进植物生长或在制备植物促生长剂中的应用。
CN202110901775.6A 2021-08-06 2021-08-06 一种多价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用 Active CN113621074B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110901775.6A CN113621074B (zh) 2021-08-06 2021-08-06 一种多价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用
US17/503,356 US11702454B2 (en) 2021-08-06 2021-10-17 Multivalent plant immune fusion protein, production method thereof and its use

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110901775.6A CN113621074B (zh) 2021-08-06 2021-08-06 一种多价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113621074A true CN113621074A (zh) 2021-11-09
CN113621074B CN113621074B (zh) 2023-04-25

Family

ID=78383172

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110901775.6A Active CN113621074B (zh) 2021-08-06 2021-08-06 一种多价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用

Country Status (2)

Country Link
US (1) US11702454B2 (zh)
CN (1) CN113621074B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114163549A (zh) * 2022-01-06 2022-03-11 苏州乙水茉生物科技有限公司 壳寡糖与二价植物疫苗共价偶联体及其制备方法和应用
CN114437231A (zh) * 2020-11-02 2022-05-06 苏州乙水茉生物科技有限公司 二价植物免疫蛋白ab-nac及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1451754A (zh) * 2002-12-23 2003-10-29 南京农业大学 水稻黄单胞hrf1基因重组载体及转基因植物育种方法
US20130172185A1 (en) * 2011-12-30 2013-07-04 Plant Healthcare, Inc. Method for increasing plant yield, and yield improving compositions
US20160095314A1 (en) * 2014-10-01 2016-04-07 Plant Health Care, Inc. Hypersensitive response elicitor peptides and use thereof
CN113087804A (zh) * 2019-12-23 2021-07-09 苏州乙水茉生物科技有限公司 一种二价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69333980T2 (de) * 1992-07-01 2006-10-05 Cornell Research Foundation, Inc. Auslöser von überempfindlichkeitsreaktionen in pflanzen
CA2223616C (en) * 1995-06-07 2011-02-15 Cornell Research Foundation, Inc. Hypersensitive response induced resistance in plants
US9133251B2 (en) 2008-02-22 2015-09-15 The Curators Of The University Of Missouri Bacillus based delivery system and methods of use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1451754A (zh) * 2002-12-23 2003-10-29 南京农业大学 水稻黄单胞hrf1基因重组载体及转基因植物育种方法
US20130172185A1 (en) * 2011-12-30 2013-07-04 Plant Healthcare, Inc. Method for increasing plant yield, and yield improving compositions
US20160095314A1 (en) * 2014-10-01 2016-04-07 Plant Health Care, Inc. Hypersensitive response elicitor peptides and use thereof
CN113087804A (zh) * 2019-12-23 2021-07-09 苏州乙水茉生物科技有限公司 一种二价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WANG,P.H.等: "The Role of a Nascent Polypeptide-Associated Complex Subunit Alpha in Siderophore Biosynthesis, Oxidative Stress Response, and Virulence in Alternaria alternata", 《MOL PLANT MICROBE INTERACT》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114437231A (zh) * 2020-11-02 2022-05-06 苏州乙水茉生物科技有限公司 二价植物免疫蛋白ab-nac及其应用
CN114437231B (zh) * 2020-11-02 2024-10-25 苏州乙水茉生物科技有限公司 二价植物免疫蛋白ab-nac及其应用
CN114163549A (zh) * 2022-01-06 2022-03-11 苏州乙水茉生物科技有限公司 壳寡糖与二价植物疫苗共价偶联体及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
US11702454B2 (en) 2023-07-18
US20230053680A1 (en) 2023-02-23
CN113621074B (zh) 2023-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113087804B (zh) 一种二价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用
CN107937415B (zh) 一种马铃薯gata转录因子及其克隆方法与应用
CN113621074B (zh) 一种多价植物免疫融合蛋白及其生产方法和应用
CN107955067B (zh) 参与桃黄酮醇生物合成调控的两个myb转录因子及其应用
CN112725349B (zh) 一种鸭茅锌指蛋白基因DgMYM1及其表达载体和应用
CN104357456A (zh) 葡萄特异抗白粉病基因VpR8H-1cDNA序列及其应用
CN101153057B (zh) 一种提高植物抗性促进植物生长的蛋白质及其编码基因
CN108728450B (zh) 狗牙根中一个受低温显著诱导的基因CdERF1及其应用
CN112812161B (zh) 蛋白质IbMYC2在调控植物抗旱性中的应用
CN112724213B (zh) 甘薯花青苷合成和抗逆相关蛋白IbMYB4及其编码基因与应用
CN110184280A (zh) 一种控制水稻粒长和千粒重的glw10基因及其编码的蛋白和应用
CN113354741A (zh) SUMO-HarpinEa蛋白及其生产方法和应用
CN104745561B (zh) 茄子查尔酮异构酶SmCHI蛋白及其编码基因
CN111423500A (zh) SiMYB56蛋白及其编码基因在调控植物耐干旱能力中的应用
CN114990140B (zh) 一种木薯吡哆醛激酶基因及其在提高植物耐盐性的应用
CN112458101B (zh) 一种鸭茅锌指蛋白基因DgZFP125及其表达载体和应用
CN113322260B (zh) 高粱基因SbbZIP51在调控耐盐性中的应用
CN114214334A (zh) 来源于盐芥的基因EsH2A.3在调控植物耐盐性中的应用
CN113373161A (zh) GhERF017基因在调控植物耐盐性中的应用
JP2003334084A (ja) ストレスに応答する根特異的遺伝子
CN108018292B (zh) 一种耐旱基因及其用于制备耐旱转基因植物的应用
CN114437231B (zh) 二价植物免疫蛋白ab-nac及其应用
CN112794889B (zh) 抗逆相关蛋白IbMYB48及其编码基因与应用
CN117777262B (zh) 小麦TaALDHase基因在调控小麦茎基腐病抗性中的应用
CN114805520B (zh) 胁迫抗性相关蛋白IbGT1及其编码基因及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20231027

Address after: 1628 suzhao Road, Minhang District, Shanghai 201114

Patentee after: Shanghai Heqifeng Ecological Technology Co.,Ltd.

Address before: 215213 No.145, Donggang Road, luxui, Lili Town, Wujiang District, Suzhou City, Jiangsu Province

Patentee before: Suzhou yishuimo Biotechnology Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right