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CN113616806A - 一种铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物、纳米载药系统及其应用 - Google Patents

一种铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物、纳米载药系统及其应用 Download PDF

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CN113616806A CN202110990139.5A CN202110990139A CN113616806A CN 113616806 A CN113616806 A CN 113616806A CN 202110990139 A CN202110990139 A CN 202110990139A CN 113616806 A CN113616806 A CN 113616806A
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Abstract

本发明属于纳米载药系统领域，公开了一种铂‑艾考糊精‑聚己内酯大分子化合物、纳米载药系统及其应用，该化合物为聚己内酯修饰的艾考糊精‑铂偶联物，艾考糊精‑铂偶联物由羧基化的四价铂化合物通过酯键连接至艾考糊精上形成，聚己内酯通过酯键与艾考糊精偶联；其中，聚己内酯的分子量为1kDa‑10kDa，艾考糊精的分子量为10kDa‑20kDa；聚己内酯在艾考糊精上的接枝率为0.5‑1，铂元素在大分子化合物中的质量百分含量为1％‑5％。本发明化合物包含亲水片段艾考糊精、疏水片段聚己内酯和四价铂，作为肿瘤治疗药物，降低了顺铂的毒副作用，提高了在血液中循环的稳定性，从而提高了铂的生物利用率，大大增强了抗肿瘤效果。

Description

一种铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物、纳米载药系统及 其应用
技术领域
本发明属于纳米载药系统技术领域，更具体地，涉及一种铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物、纳米载药系统及其应用。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康最主要的因素。化疗是目前治疗肿瘤最有效的手段之一。许多常见的化疗药物虽然有一定的治疗效果，但目前上市的大量化疗药物仍存在着极大的缺陷。二价铂类药物对肿瘤的选择性主要来源于肿瘤对营养的高需求，但是这种选择性是非常弱的，其他快速生长的组织(如骨髓，毛囊等)也会因为摄取增多而产生毒性；同时，Pt(Ⅱ)类药物往往通过肾脏清除，因此也会产生一定的肝毒性和肾毒性。此外，Pt(Ⅱ)类药物是不稳定的，它们在血液循环中容易与亲核试剂(尤其是人血清白蛋白)发生反应，导致生物利用率降低和毒副作用的增加。四价铂前药是通过将二价铂氧化加成两个轴向配体而得到的低自旋的正八面体配合物，它的正八面体结构使得四价铂前药不易与其他配体发生反应，但能够被还原试剂还原，释放两个轴向配体，从而释放出原本的二价铂药物。这使得四价铂前药可以在血液循环中保持稳定，而在细胞中迅速转化成二价铂，发挥作用。四价铂配合物可以降低二价铂的毒副作用，但同样是小分子，在进行药物输送时也存在一些问题，如水溶性差，血液清除速度过快，肿瘤部位蓄积不足以及生物利用率低等。
经过近几十年的科技发展，纳米载药系统成为了能够有效解决上述问题的有效手段之一。目前已有多种载药纳米制剂进入市场，另外还有大量纳米制剂处于临床研究及临床前研究阶段。两亲性聚合物载药纳米系统是目前研究比较多的纳米载药系统之一。它能够提供一个疏水的核心增溶疏水性药物分子，同时其亲水的外壳能够降低蛋白吸附，减少网状内皮系统的吞噬清除作用，延长药物在体内的半衰期。但是，目前对铂类纳米载药系统的研究甚少，缺乏解决铂类前药水溶性差、血液中清除速度快而导致生物利用率低等问题的有效方案。
另一方面，纳米载药系统其载药纳米粒径对其抗肿瘤活性有较大的影响，一般而言，粒度较小时，不容易被网状内皮系统吞噬，也更有利于药物穿透肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用，然而现有技术两亲性纳米载药系统纳米药物粒径一般较大，比如本申请发明人所在课题组前期致力于研究的羟乙基淀粉类两亲性纳米载药系统其粒径一般最低也仅能做到200nm左右，导致其用于治疗肿瘤时药物被血液清除速度快、药物利用率欠佳。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物、纳米载药系统及其应用，通过将羧基化的四价铂化合物和聚己内酯分别通过酯键与艾考糊精偶联得到纳米载药系统，旨在解决现有铂类前药水溶性差及在血液中循环稳定性差的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物，该大分子化合物为聚己内酯修饰的艾考糊精-铂偶联物，所述艾考糊精-铂偶联物由羧基化的四价铂化合物通过酯键连接至艾考糊精上形成，所述聚己内酯通过酯键与所述艾考糊精偶联；
其中，所述聚己内酯的分子量为1kDa-10kDa，所述艾考糊精的分子量为10kDa-20kDa；所述聚己内酯在所述艾考糊精上的接枝率为0.5-1，铂元素在所述大分子化合物中的质量百分含量为1％-5％。
按照本发明的另一方面，提供了一种铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物的制备方法，其包括如下步骤：
S1、用双氧水将顺铂氧化为四价铂化合物，再与酸酐混合反应，分离纯化后得到化合物Pt-COOH；
S2、将聚己内酯上的羧基与艾考糊精上的羟基进行酯化反应，分离纯化后得到化合物ICO-PCL；
S3、将步骤S1所述化合物Pt-COOH上的羧基与步骤S2所述化合物ICO-PCL中艾考糊精上的羟基进行酯化反应，分离纯化后得到铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物。
按照本发明的另一方面，提供了本发明所述铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。
按照本发明的另一方面，提供了一种艾考糊精铂前药组装纳米药物，其包括纳米粒，所述纳米粒中包含上述铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物。
优选地，所述纳米粒中包载有光敏剂和/或荧光分子。
优选地，所述光敏剂为1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳酰碘化物。
优选地，所述纳米粒中还包含叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物；
所述叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物为叶酸修饰的艾考糊精-聚己内酯偶联物，所述艾考糊精-聚己内酯偶联物为由聚己内酯通过酯键连接至艾考糊精上形成，所述叶酸通过酯键与所述艾考糊精偶联；其中，所述聚己内酯的分子量为1kDa-10kDa，所述艾考糊精的分子量为10kDa-20kDa；所述聚己内酯在所述艾考糊精上的接枝率为0.5-1，叶酸在所述艾考糊精上的接枝率为5-10。
优选地，所述铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物和所述叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物的质量比为(2-9):1。
优选地，所述铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物和所述叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物的质量比为(2.5-5):1。
优选地，所述铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物和所述叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物的质量比为4:1。
优选地，所述叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物的制备方法包括如下步骤：
Sa、将聚己内酯上的羧基与艾考糊精上的羟基进行酯化反应，分离纯化后得到化合物ICO-PCL；
Sb、将叶酸上的羧基与步骤Sa所述化合物ICO-PCL中艾考糊精上的羟基进行酯化反应，分离纯化后得到叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物。
按照本发明的另一方面，提供了一种艾考糊精铂前药组装纳米药物的制备方法，其包括如下步骤：将1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳酰碘化物、铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物和叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物同时溶解于有机溶剂中，经透析后干燥，得到艾考糊精铂前药组装纳米药物。
按照本发明的另一方面，提供了本发明所述艾考糊精铂前药组装纳米药物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。
按照本发明的另一方面，还提供了本发明所述艾考糊精铂前药组装纳米药物在肿瘤成像中的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)艾考糊精是临床上大量使用的腹膜透析液，本发明利用天然来源的、生物相容性优异的艾考糊精作为亲水片段，利用聚己内酯作为亲脂性片段，并结合四价铂前药制备两亲性纳米载药系统，有效降低了二价铂的毒副作用，同时作为大分子化合物，实现了铂在血液环境中的长循环稳定性，使得其能在肿瘤细胞很好地富集，提高了铂的生物利用率，以达到优异的抗肿瘤效果。
(2)本发明通过将聚己内酯和羧基化四价铂通过酯键依次连接到艾考糊精上以制备铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物，能很好地控制大分子化合物的结构组分，控制铂的载药量，同时使得该大分子化合物具有良好的溶解性。
(3)本发明利用铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物可制备得到粒径在70nm左右且分布均一、结构稳定的纳米载药系统，在降低铂类药物毒性的同时，提高了药物在血液中循环的稳定性，从而使得其被肿瘤细胞大量摄取；药物粒径小，相对于现有两亲性药物，更容易穿透肿瘤细胞，而在进入肿瘤细胞后药物又能被快速释放出来，以达到优异的肿瘤治疗效果，与顺铂前药相比，该纳米载药系统杀伤肿瘤细胞的活性显著增强。
(4)本发明通过在纳米药物中包载光敏剂1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳酰碘化物，能够实现对纳米药物在体内代谢的实时监控，同时相比单一的化疗，光敏剂带来的光热效应能够显著增强肿瘤治疗效果。
(5)本发明利用肿瘤细胞叶酸受体的高表达特性，在两亲性聚合物纳米载药系统表面修饰其特异性的配体—叶酸，可以显著地提高药物的肿瘤靶向性，能够快速、大量地将药物递送至肿瘤组织，促进肿瘤细胞对载药纳米粒的摄取，并在肿瘤细胞内高还原性条件下快速释放出药物，降低全身性的毒副作用，增强抗肿瘤疗效。
(6)本发明通过调节艾考糊精铂前药组装纳米药物中铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物和叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物的比例，以组装形成合适粒径、分布均一且更易于被肿瘤细胞摄取的纳米药物。
(7)本发明制备艾考糊精铂前药组装纳米药物的方法简单易行，制备条件温和，成本低，可制备得到结构稳定、肿瘤治疗效果优异的纳米载药系统。
(8)本发明制备的艾考糊精铂前药组装纳米药物，通过体内外肿瘤靶向性及抗肿瘤药效评价，发现其对乳腺癌表现出良好的肿瘤靶向性，其能够快速更多地将药物递送至肿瘤组织，促进乳腺肿瘤细胞对载药纳米粒的摄取，并在肿瘤细胞内快速释放出药物，发挥更好的肿瘤杀伤活性；同时其显著降低了铂类药物的毒性，与顺铂相比，小鼠体重无显著降低，小鼠生存状态良好，显著抑制乳腺癌肿瘤的瘤体积和瘤重；在相同的给药剂量下，该纳米药物显示出了比游离药物和非叶酸靶向载药体系更好的抗肿瘤活性，显著抑制乳腺癌的瘤体积和瘤重，显著抑制乳腺癌中肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡；并且，该纳米药物在近红外激光的照射下能够快速升温，在体内外均能升至43℃，通过温和光热能够显著提高单纯铂类化疗的抗肿瘤效果。
(9)本发明艾考糊精铂前药组装纳米药物由于包载了小分子荧光颗粒，在体内传递药物的同时，还能通过对肿瘤的荧光染色，实现对肿瘤进行活体成像，可使医生能用肉眼直接观察到肿瘤，以确定肿瘤的部位、大小和边界，便于有针对性地进行抗肿瘤治疗。
(10)本发明提出的两亲性大分子，具有良好的生物相容性。利用透析法将荧光小分子化合物1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳酰碘化物包载到聚合物纳米粒的疏水核心，形成粒径在70nm左右且分布均一的载药纳米粒。该载药纳米粒具有良好的稳定性，能够在血液系统长时间循环，通过叶酸的靶向作用，快速特异地富集于肿瘤部位。在叶酸受体的介导下，肿瘤细胞将载药纳米粒摄取入胞。在肿瘤细胞内还原物质的作用下，四价铂还原为二价铂，快速释放出细胞杀伤能力更强的二价铂原药，从而杀伤肿瘤。同时，利用包载的小分子的荧光特性，能够对肿瘤进行活体成像，利用近红外光照射，能够快速升高肿瘤部位的温度，实现荧光成像指导的精确肿瘤的热疗和化疗联合治疗。综上，包载有1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳酰碘化物的基于铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物以及叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物共组装的纳米载药系统具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1制备化合物PtIP和化合物FIP的流程图；
图2为本发明实施例1中艾考糊精、聚己内酯、ICO-PCL、PtIP和FIP的核磁共振H谱(600M)图；
图3为本发明实施例1中顺铂、Pt-COOH和PtIP的X射线衍射光电子能谱图；
图4为本发明实施例1中顺铂、Pt-COOH和PtIP的红外光谱图；
图5为本发明实施例1中通过MTT法检测化合物ICO-PCL和化合物FA-ICO-PCL培养下细胞生存率图；
图6为本发明实施例2中利用动态光散射仪检测不同比例DPtFIP的水合粒径分布图；
图7为本发明实施例2中利用流式细胞仪检测肿瘤细胞对不同比例DPtFIP的细胞摄取情况(内容A)及相对定量检测图(内容B)；
图8为本发明实施例3中利用电镜检测DPtFIP的形貌图；
图9为本发明实施例3中利用动态光散射仪检测PtFIP和DPtFIP纳米粒的水合粒径分布图；
图10为本发明实施例3中利用动态光散射仪检测DIP、DFIP、PtIP、PtFIP、DPtIP和DPtFIP纳米粒两周内的稳定性；
图11为本发明实施例4中DiR、DPtIP和DPtFIP的紫外可见光吸收光谱图；
图12为本发明实施例5中DiR、DPtIP和DPtFIP在不同溶剂中的荧光发射光谱图；
图13为本发明实施例6中PtIP、PtFIP在正常环境和高还原性条件下的药物释放曲线图；
图14为本发明实施例7中在激光照射下不同浓度DPtFIP的升温曲线图(内容A)及热成像图(内容B)；
图15为本发明实施例7中不同激光功率照射下DPtFIP的升温曲线图；
图16为本发明实施例7中不同纳米粒在相同浓度、相同激光功率照射下的升温曲线图；
图17为本发明实施例8中Pt-COOH、PtIP和PtFIP对肿瘤细胞的细胞杀伤力检测图；
图18为本发明实施例9中DPtIP和DPtFIP在有无激光作用下对肿瘤细胞的细胞杀伤力检测图；
图19为本发明实施例10中利用激光共聚焦显微镜检测肿瘤细胞对不同纳米粒的细胞摄取情况；
图20为本发明实施例11中利用流式细胞仪检测肿瘤细胞对不同纳米粒的细胞摄取情况(内容A)及相对定量检测图(内容B)；
图21为本发明实施例12中不同纳米粒在小鼠肿瘤部位富集的活体成像图(内容A)和相对定量检测图(内容B)；
图22为本发明实施例12中不同纳米粒在小鼠各脏器富集的荧光成像图(内容A)和相对定量检测图(内容B)；
图23为本发明实施例13中不同药物处理小鼠后，小鼠肿瘤部位经激光照射后的升温曲线图(内容A)及热成像图(内容B)；
图24为本发明实施例14中小鼠经不同给药处理后体重变化曲线图；
图25为本发明实施例14中小鼠经不同给药处理后瘤体积变化曲线图；
图26为本发明实施例14中小鼠经不同给药处理后离体瘤重变化图；
图27为本发明实施例14中小鼠经不同给药处理后剥离的瘤子大小的图片；
图28为本发明实施例14中小鼠经不同给药处理后对剥离的肿瘤进行的切片染色图片；
图29为本发明实施例14中小鼠经不同给药处理后对剥离的肿瘤进行Ki67染色(内容A)和TUNEL染色(内容B)的荧光强度相对定量检测图；
图30为本发明实施例14中经不同给药处理后的小鼠各脏器的HE染色切片图；
图31为本发明实施例14中分别对经不同给药处理后的小鼠血液中白细胞量、红细胞量、血小板量和血清中肌酐量、谷丙转氨酶量、谷草转氨酶量、肌酐激酶量、尿素氮量的检测图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的一种铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物(本发明中用Pt-ICO-PCL表示，缩写为PtIP)，该大分子化合物为聚己内酯修饰的艾考糊精-铂偶联物，所述艾考糊精-铂偶联物由羧基化的四价铂化合物通过酯键连接至艾考糊精上形成，所述聚己内酯通过酯键与所述艾考糊精偶联；
其中，聚己内酯的分子量为1kDa-10kDa，艾考糊精的分子量为10kDa-20kDa；聚己内酯在艾考糊精上的接枝率为0.5-1；铂元素在该大分子化合物中的质量百分含量(即铂的载药量)为1％-5％。
优选实施例中，聚己内酯的分子量为7.5kDa，艾考糊精的分子量为16kDa，聚己内酯在艾考糊精上的接枝率为0.98，铂元素在该大分子化合物中的质量百分含量为2.5％。
本发明还提供了一种铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物的制备方法，其包括如下步骤：
S1、用双氧水将顺铂氧化为四价铂化合物，再与酸酐混合反应，分离纯化后得到化合物Pt-COOH；
S2、将聚己内酯上的羧基与艾考糊精上的羟基进行酯化反应，分离纯化后得到化合物ICO-PCL；
S3、将步骤S1所述化合物Pt-COOH上的羧基与步骤S2所述化合物ICO-PCL中艾考糊精上的羟基进行酯化反应，分离纯化后得到铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物。
一些实施例中，步骤S1具体为：将顺铂与双氧水混合反应，使顺铂中的二价铂氧化成为四价铂，分离纯化得到四价铂化合物；然后将该四价铂化合物与丁二酸酐发生取代反应，得到中间产物羧基化的四价铂Pt-COOH。
一些实施例中，步骤S2具体为：将聚己内酯、羧基活化试剂以及缚酸剂混合，混合后溶于有机溶剂中，使聚己内酯结构中含有的羧基发生取代反应转化生成活化酯；然后将该活化酯与艾考糊精发生取代反应，通过酯键相连接，得到艾考糊精-聚己内酯(ICO-PCL)。
一些实施例中，步骤S3具体为：将步骤S1中的羧基化的四价铂、羧基活化试剂以及缚酸剂混合，混合后溶于有机溶剂中，使羧基化的四价铂中的羧基发生取代反应转化生成活化酯；然后将该活化酯与步骤S2中间产物ICO-PCL发生取代反应，通过酯键相连接，得到铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物(Pt-ICO-PCL)。
本发明步骤S1、步骤S2和步骤S3可在较宽的温度范围内反应，比如在20℃-60℃。在步骤S2和步骤S3中，所述羧基活化试剂为二环己基碳二亚胺或1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺；所述缚酸剂为4-二甲氨基吡啶、吡啶和三乙胺中的一种或多种；所述有机溶剂为二甲亚砜和/或四氢呋喃。聚己内酯、艾考糊精与羧基化四价铂的投料摩尔比为(2-6):1:(20-40)，优选为(3-5):1:(25-35)，进一步优选为4:1:30。步骤S2和步骤S3的产物通过如下步骤进行分离纯化：将所得产物采用二氯甲烷或甲醇沉淀，将沉淀溶解后用超纯水透析，最后冷冻干燥得到对应产物。
实验发现过大的聚己内酯接枝率会导致制备得到的大分子化合物溶解性降低。缚酸剂也用作催化剂，其用量可与羧基化的四价铂或聚己内酯用量相当，有机溶剂用于溶解原料。同时，经实验发现，如果将羧基化四价铂、聚己内酯同时与艾考糊精混合进行反应，而不是将聚己内酯和羧基化四价铂依次连接到艾考糊精上，这样也会影响制备得到的大分子化合物的溶解性，同时还难以控制大分子化合物上顺铂的载药量。
本发明还提供了上述铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用，所制备的纳米载药系统能显著降低铂类药物的毒副作用，水溶性好，在血液环境中能够维持长时间的稳定，提高了其生物利用率。
本发明提供的一种艾考糊精铂前药组装纳米药物，其包括纳米粒，所述纳米粒中包含上述铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物。
优选地，所述纳米粒中包载有光敏剂和/或荧光分子。这里所述光敏剂可采用任意常规的具有光热效应的光敏剂种类，不局限于卟啉类化合物、酞菁及其衍生物、金丝桃素等。包载有光敏剂的纳米药物可用于光热-化疗联合治疗，抗肿瘤效果更好，且无显著的毒副作用。荧光分子优选发射波长在近红外区域(650nm-900nm)的荧光分子，相比常规可见光检测的荧光分子信噪比更高、穿透性更强、检测灵敏度更高，使得荧光分子的引入能够对肿瘤进行活体成像，分辨率好，这里不局限于二氢卟吩、Cy5荧光染料等。并且可以但不局限于同一分子同时具有光热效应和荧光特性，例如1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳酰碘化物(DiR)、吲哚菁绿和IR-780碘化物。
一些实施例中，所述纳米粒中还包含叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物；所述叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物为叶酸修饰的艾考糊精-聚己内酯偶联物，所述艾考糊精-聚己内酯偶联物为由聚己内酯通过酯键连接至艾考糊精上形成，所述叶酸通过酯键与所述艾考糊精偶联；其中，聚己内酯的分子量为1kDa-10kDa，艾考糊精的分子量为10kDa-20kDa；聚己内酯在艾考糊精上的接枝率为0.5-1，叶酸在艾考糊精上的接枝率为5-10。
优选地，聚己内酯的分子量为7.5kDa，艾考糊精的分子量为16kDa。聚己内酯在艾考糊精上的接枝率为0.98；叶酸在艾考糊精上的接枝率为8。
一些实施例中，铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物和叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物的质量比为(2-9):1，组装形成的纳米药物粒径为60nm-100nm；两者质量比优选为(2.5-5):1，进一步优选为4:1，按该质量比组装形成的纳米药物粒径为70nm左右，其分布均一，较小的粒径在肿瘤细胞中的穿透性更强，更易于被肿瘤细胞摄取。
本发明还提供了一种艾考糊精铂前药组装纳米药物的制备方法，其包括如下步骤：将1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳酰碘化物和铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物同时溶解于有机溶剂中，经透析后干燥，得到艾考糊精铂前药组装纳米药物。
一些实施例中，将1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚碳酰碘化物、铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物和叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物三者同时溶解于有机溶剂中，经透析后干燥，得到艾考糊精铂前药组装纳米药物；其中，所述叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物的制备方法包括如下步骤：
Sa、将聚己内酯上的羧基与艾考糊精上的羟基进行酯化反应，分离纯化后得到化合物ICO-PCL；
Sb、将叶酸上的羧基与步骤Sa所述化合物ICO-PCL中艾考糊精上的羟基进行酯化反应，分离提纯后得到叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物。
一些实施例中，步骤Sa具体为：将聚己内酯、羧基活化试剂以及缚酸剂混合，混合后溶于有机溶剂中，使聚己内酯结构中含有的羧基发生取代反应转化生成活化酯；然后将该活化酯与艾考糊精发生取代反应，通过酯键相连接，得到艾考糊精-聚己内酯(ICO-PCL)。
一些实施例中，步骤Sb具体为：将叶酸、羧基活化试剂以及缚酸剂混合，混合后溶于有机溶剂中，使叶酸中含有的羧基发生取代反应转化生成活化酯；然后将该活化酯与步骤Sa中间产物ICO-PCL发生取代反应，通过酯键相连接，得到叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物(FA-ICO-PCL)。
优选地，所述羧基活化试剂为二环己基碳二亚胺或1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺；所述缚酸剂为4-二甲氨基吡啶、吡啶和三乙胺中的一种或多种；所述有机溶剂为二甲亚砜和/或四氢呋喃。聚己内酯、艾考糊精与叶酸的投料摩尔比为(2-6):1:(20-60)，优选为4:1:40。
本发明还提供了上述艾考糊精铂前药组装纳米药物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。所治疗或预防的癌症类型可以为乳腺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或黑色素瘤。其药物适用剂型广泛，可制成注射剂、粉针剂、口服剂、喷雾剂、胶囊剂或栓剂。在制备的抗癌药物，还可添加药学上可接受的添加剂。
本发明还提供了上述艾考糊精铂前药组装纳米药物在肿瘤成像中的应用。由于该纳米药物中包载了小的荧光颗粒，使得能够同时实现药物传递和肿瘤成像，通过对肿瘤进行染色，可使医生能用肉眼直接观察到肿瘤。
本发明优选实施例中，通过选择艾考糊精为亲水片段，选择聚己内酯为疏水片段，选择叶酸作为肿瘤特异性靶向分子，选择铂作为肿瘤治疗药物，选择DiR作为荧光成像和光热治疗的药物，制备得到包载药物DiR的、粒径在70nm左右、且分布均一、结构稳定的载药纳米粒。与无叶酸靶向的纳米粒相比，该纳米粒显著增加了肿瘤部位纳米粒的富集速度和富集量，促进了肿瘤细胞对纳米粒的摄取，在多种乳腺癌4T1小鼠模型中均显示出了更好的抗肿瘤效果，同时降低了毒副作用。本发明提供的纳米载药体系，通过活体成像系统能够实时对肿瘤进行成像，同时利用激光照射肿瘤部位能够快速升高肿瘤部位的温度，实现光热疗法和化疗的联合治疗，增强抗肿瘤疗效，因此本发明提出的纳米载药体系具有良好的应用前景。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
实施例1化合物PtIP和FIP的制备和验证
本实施例按照如图1所示的流程图制备化合物PtIP，具体操作步骤如下：
(1)称取1g顺铂(Cisplatin，3.33mmol)置于100mL圆底烧瓶中，然后向烧瓶中依次加入35mL 30％双氧水(10倍过量)和25mL超纯水。50℃回流反应1h。待反应完成后，冰浴，重结晶使产物析出，离心收集上清，然后依次用乙醇、乙醚洗三次，经真空干燥后得到的白色固体粉末即为顺铂氧化产物。
(2)准确称取上一步顺铂氧化产物334mg(1mmol)和丁二酸酐100mg(1mmol)加到50mL圆底烧瓶中，然后向圆底烧瓶中加入30mL经分子筛干燥的无水二甲亚砜(DMSO)。45℃搅拌反应12h。反应完成后用大量乙醚(10倍DMSO的量)和少量乙醇沉淀出反应产物，然后9000rpm离心7min收集沉淀。沉淀依次用丙酮、乙醚洗三次，经真空干燥干燥后即可得到顺铂前药(Pt(Ⅳ)-COOH)。
(3)称取1.6g(0.1mmol)艾考糊精(Icodextrin，Mw 16000Da)于25mL圆底烧瓶中，加入4mL事先用分子筛干燥过的二甲亚砜(DMSO)溶解。另称取300mg(0.4mmol)聚己内酯(PCL)、768mg(4mmol)1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(EDCI)和488mg(4mmol)4-二甲氨基吡啶(DMAP)，用2mL二氯甲烷(重蒸除水)溶解。然后将后者溶液滴加到前者溶液中，边加边搅拌，35℃搅拌反应48h。反应完成后，将反应体系滴加到40mL二氯甲烷中沉淀出产物，离心(8000rpm，5min)分离沉淀，并用二氯甲烷洗涤三次。得到的沉淀用DMSO复溶，再用超纯水透析(透析袋截留分子量MWCO：3500)三天，冷冻干燥后即可得到艾考糊精-聚己内酯(ICO-PCL)。
(4)称取步骤(3)的反应产物ICO-PCL 554mg(约为30μmol)于50mL圆底烧瓶中，加入20mL干燥过的DMSO溶解，然后依次加入434mg顺铂前药(1mmol)，768mg EDCI(4mmol)和488mg DMAP(4mmol)，45℃搅拌反应48h。反应完成后，将反应体系滴加到200mL甲醇中沉淀出产物，离心(8000rpm，5min)分离沉淀，得到的沉淀用甲醇洗涤2-3次后用DMSO复溶，然后在超纯水中透析(MWCO：3500Da)三天，冻干，即可得到铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物Pt-ICO-PCL(PtIP)。
本实施例按照如图1所示的流程图还制备化合物FIP，具体操作步骤如下：
(1)称取1.6g,0.1mmol艾考糊精(Mw 16000Da)于25mL圆底烧瓶中，加入4mL事先用分子筛干燥过的DMSO溶解。另称取相应质量的PCL(300mg，0.4mmol)、EDCI(768mg，4mmol)和DMAP(488mg，4mmol)，用2mL二氯甲烷(重蒸除水)溶解。然后将后者溶液滴加到前者溶液中，边加边搅拌，35℃搅拌反应48h。反应完成后，将反应体系滴加到40mL二氯甲烷中沉淀出产物，离心(8000rpm，5min)分离沉淀，并用二氯甲烷洗涤三次。得到的沉淀用DMSO复溶，再用超纯水透析(透析袋截留分子量MWCO：3500)三天，冷冻干燥后即可得到艾考糊精-聚己内酯(ICO-PCL)。
(2)将529mg叶酸(FA，1.2mmol)、230mg EDCI(1.2mmol)和144mg DMAP(1.2mmol)加到50mL圆底烧瓶中，加入20mL DMSO，45℃加热搅拌使之溶解，待叶酸溶解后，向反应体系中加入554mg ICO-PCL(约为30μmol)。45℃搅拌反应48h，反应完成后，将反应体系滴加到200mL甲醇中沉淀出产物，离心(8000rpm，5min)分离沉淀，得到的沉淀用甲醇洗涤2-3次后用DMSO复溶，然后在超纯水中透析(MWCO：3500Da)三天，冻干，即可得到叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物FA-ICO-PCL(FIP)。
对分离提纯得到的化合物进行核磁共振测试，1H NMR(600MHz)数据如图2所示，PtIP的核磁共振氢谱上既存在艾考糊精葡萄糖环上羟基质子峰，即化学位移为4.5ppm到6ppm之间的多重峰，也能发现化学位移为1ppm到2ppm之间的聚己内酯的亚甲基质子峰，还能发现化学位移为6ppm到7ppm之间的铂上氨基的质子峰，核磁共振谱图证实了PtIP已制备成功。如图2所示，FIP的核磁共振氢谱上既存在艾考糊精葡萄糖环上羟基质子峰，即化学位移为4.5ppm到6ppm之间的多重峰，也能发现化学位移为1ppm到2ppm之间的聚己内酯的亚甲基质子峰，还能发现化学位移为6ppm到8ppm之间叶酸苯环上的质子峰，核磁共振谱图证实了FIP已制备成功。
通过X射线衍射光电子能谱仪检测顺铂、Pt-COOH以及Pt-ICO-PCL中Pt化合价的变化。从如图3所示的XPS谱图上可看出，顺铂为二价铂，外层电子的结合能分别为73eV和76.5eV，顺铂前药中的铂被氧化成了四价，外层电子结合能升高，分别为75.6eV和79.1eV，这与现有文献中报道的相符合。而将顺铂前药接枝到ICO-PCL上以后，结合能在73eV、76eV与79eV处都有吸收峰，这说明Pt-ICO-PCL样品中同时含有二价铂和四价铂，造成这种情况的原因是每个艾考糊精分子上都有一个醛基，有一部分的顺铂前药被醛基还原变成了二价铂。
通过红外光谱仪测定了顺铂、Pt-COOH以及Pt-ICO-PCL对不同波长红外光的吸收情况，从而确定化合物的结构。从图4可以看出，与顺铂相比，Pt-COOH的红外光谱图出现了多个新的吸收峰，其中3450cm-1处出现的弱吸收峰特属于酯键中C＝O键的伸缩振动峰，1350cm-1处的中等吸收峰为羧酸中C-O的伸缩振动峰，900cm-1处中等吸收峰归属于羧酸中-OH的面内弯曲振动峰。这说明顺铂前药较顺铂多了酯键和羧基，据此可以判断丁二酸成功偶联到了顺铂上。与Pt-COOH相比，PtIP在300cm-1-3600cm-1处出现的强吸收峰，说明ICO-PCL成功与Pt-COOH进行了偶联。
通过MTT实验考查ICO-PCL和FA-ICO-PCL的生物相容性。从图5可以看出，化合物ICO-PCL和化合物FA-ICO-PCL均具有很好的生物相容性。
实施例2包载DiR基于PtIP和FIP共组装纳米粒DPtFIP的制备和表征
本实施例利用透析法制备了几种不同Pt-ICO-PCL和FA-ICO-PCL比例的纳米粒，具体操作方法如下：
(1)按照Pt-ICO-PCL与FA-ICO-PCL质量比分别为9:1、8:2和7:3称取两种样品，使两种样品的总质量为5mg。
(2)向步骤(1)中每种配比加入3mL溶有3mgDiR的二甲亚砜溶解，然后再将样品分别加到截留分子量为3500Da的透析袋中。室温条件下，在超纯水中搅拌透析24h，每隔2h更换一次新鲜超纯水，透析完成后收集透析袋中的溶液。少量用超滤(截留分子量为10KDa)浓缩使最终体积为5mL；大部分冷冻干燥待用。
利用动态光散色粒度仪检测几种样品的粒径分布，结果如图6所示。结果显示，三种不同比例的纳米粒粒径均在60nm-100nm之间，分布均一。
通过体外细胞摄取优化纳米粒配比。将三阴性乳腺癌4T1细胞按照1×104个细胞每孔的密度接种到4块6孔板中，过夜；分别用含有PBS、9:1、8:2和7:3三种不同配比的含有相同DiR量的DPtFIP细胞培养液孵育细胞2h；然后用胰酶消化细胞，用流式细胞仪对细胞进行检测。结果如图7所示，从结果看出，配比为8:2的纳米粒相较9:1和7:3的纳米粒，更易于被肿瘤细胞摄取，因此载药纳米粒中PtIP与FIP的质量配比优选为8:2。
实施例3不包载DiR和包载DiR基于PtIP、FIP共组装纳米粒PtFIP和DPtFIP的制备本实施例利用透析法制备PtIP和FIP质量比为8:2的DPtFIP，具体操作方法如下：
(1)分别称取以下不同配比的样品：
配比a(用于制备PtIP)：称取5mg Pt-ICO-PCL；
配比b(用于制备PtFIP)：按照Pt-ICO-PCL与FA-ICO-PCL质量比为8:2称取两种化合物，使两种化合物的总质量为5mg；
配比c(用于制备DPtIP)：称取5mg Pt-ICO-PCL，再称取DiR300μg；
配比d(用于制备DPtFIP)：按照Pt-ICO-PCL与FA-ICO-PCL质量比为8:2称取两种化合物，使两种化合物的总质量为5mg，再称取DiR 300μg；
配比e(用于制备DIP)：称取5mg ICO-PCL，再称取DiR300μg；
配比f(用于制备DFIP)：称取5mgFA-ICO-PCL，再称取DiR 300μg。
(2)向步骤(1)中每种配比加入3mL二甲亚砜溶解，然后再将样品分别加到截留分子量为3500Da的透析袋中。室温条件下，在超纯水中搅拌透析24h，每隔2h更换一次新鲜超纯水，透析完成后收集透析袋中的溶液。少量用超滤(截留分子量为10KDa)浓缩使最终体积为5mL。大部分冷冻干燥待用。
取DPtFIP分散液20μL滴于通网上，用0.1％磷钨酸染色，室温下自然干燥后，用透射电子显微镜(TEM,H-700FA，HITACHI)观察其形貌，加速电压为20KV-125KV。由图8大致可以看出，DPtFIP的粒径不大于100nm。
利用动态光散色粒度仪检测了制备得到的PtFIP和DPtFIP的粒径分布，结果如图9所示。并连续两周每天利用动态光散色粒度仪检测DIP、PtIP、DPtIP、DFIP、PtFIP和DPtFIP的粒径，结果如图10所示。实验结果表明，PtIP、DPtIP、DFIP、PtFIP和DPtFIP粒径均在60-100nm之间，DIP粒径约150nm，上述样品在两周内均能保持稳定，无明显的团聚或解聚现象发生。
实施例4DPtIP和DPtFIP纳米粒的紫外-可见光吸收光谱检测
分别用超纯水和二甲亚砜配置0.5mg/mL的DPtIP和DPtFIP的水溶液和二甲亚砜溶液。用二甲亚砜作为参比，利用紫外-可见光分光光度计测定了两种样品的吸收光谱，扫描波长范围为300nm-850nm，扫描步长为1nm，结果如图11所示。
紫外-可见光光谱结果显示，游离的DiR(二甲亚砜中，10μg/mL)在756nm处有最大吸收，DPtIP与DPtFIP(二甲亚砜中)同样在756nm处有最大吸收，并且在600nm-800nm范围内三者几乎重合，这说明DiR的确已经成功包载进DPtIP和DPtFIP纳米粒中。
实施例5DPtIP和DPtFIP纳米粒的荧光发射光谱检测
分别用超纯水和二甲亚砜配置0.5mg/mL的DPtIP和DPtFIP的水溶液和二甲亚砜溶液。利用荧光光谱仪测定了两种样品在DMSO和水中的荧光光谱，激发波长为750nm，发射光谱扫描范围为760nm-850nm，结果如图12所示。
从荧光光谱来看，DPtIP与DPtFIP在水中几乎没有荧光，而在DMSO中荧光强度与相同浓度DiR相仿。这说明DiR包载进纳米粒中后处于聚集状态，荧光淬灭，而在二甲亚砜中，DPtIP和DPtFIP纳米粒都处于完全溶解状态，DiR荧光没有发生淬灭。
实施例6检测PtIP和PtFIP纳米粒在PBS和DTT中的释放情况
本实施例检测了PtIP和PtFIP纳米粒分别在PBS溶液和10mM二硫苏糖醇(DTT)溶液中的释放情况，具体操作方法如下：
(1)配置两种释放介质。5g吐温-80加到1000mL PBS中溶解得到含0.5％吐温-80的PBS溶液，取出500mL，加入0.77g DTT，超声溶解，可以得到10mM的DTT溶液。
(2)用含有0.5％吐温-80的PBS溶液配置10mg/mL的PtIP和PtFIP溶液各7mL。两种样品溶液中铂的浓度都在200μg/mL左右。
(3)将两种样品分别加到事先煮好的透析袋(MWCO：3500Da)中，每个透析袋加1mL，每个样品加6个透析袋。将装有两种样品的透析袋密封后均分别放到事先装有29mL不同释放介质的50mL离心管中。
(4)将离心管放置在37℃摇床孵育，转速为200rpm。分别在第0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h从每个离心管中取出2mL释放液，同时补加2mL对应的释放介质。
(5)将取出的2mL加到不同的玻璃样品瓶中，另取2mL超纯水加到另外的样品瓶中作为空白对照，然后向每个样品瓶中加入2mL硝酸和0.1mL高氯酸。在电加热板上300℃左右消解2h后，加一定量2％的稀硝酸溶液溶解，然后用2％稀硝酸将每个样品和空白对照都定容到10mL。通过电感耦合等离子体发射光谱仪检测，检测释放液中铂的浓度，结果如图13所示。
结果显示，PtIP和PtFIP两种纳米粒在PBS中缓慢释放，并且在72h内，两种纳米粒Pt的释放效率分别只有39.5％和37.4％；而PtIP和PtFIP纳米粒在10mM的DTT中的释放速率明显加快，12h的释放效率就分别达到了61.1％和51.1％，72h的释放效率更是达到了89.7％和81.0％。纳米粒在PBS中缓慢释放归因于酯键在水中的水解作用，而纳米粒在10mMDTT中快速、大量的释放归因于DTT还原四价铂为二价。纳米粒在还原介质中的还原响应性释药有利于保证药物在储存和血液循环中的相对稳定，而在进入细胞后被快速、大量释放出来，从而达到良好的治疗效果。
实施例7不同样品在不同条件下的体外升温效果检测
将冻干的DPtFIP纳米粒溶于超纯水，按照DiR的浓度分别稀释为一系列浓度的样品：40μg/mL，20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，0μg/mL。取1mL于1.5mL EP管中，808激光器用1.5W/cm2功率进行照射，用热成像仪检测EP管内液体温度变化，每30s记录一次温度，连续记录360s的温度变化，室温25℃，结果如图14所示。
将冻干的DPtFIP纳米粒溶于超纯水，按照DiR的浓度稀释为20μg/mL。准备多管1mL样品于1.5mL EP管中，808激光器分别用1.5W/cm2、1W/cm2、0.75W/cm2和0.5W/cm2功率进行照射，用热成像仪检测EP管内液体温度变化，每30s记录一次温度，连续记录360s的温度变化，室温25℃，结果如图15所示。
将DiR、DIP、DFIP、DPtIP和DPtFIP纳米粒分别溶于超纯水，按照DiR的浓度稀释为20μg/mL。取1mL样品于1.5mL EP管中，808激光器用1.5W/cm2的功率进行照射，用热成像仪检测EP管内液体温度变化，每30s记录一次温度，连续记录360s的温度变化，室温25℃，结果如图16所示。
结果显示，浓度为20μg/mL、激光功率为1.5W/cm2时，DPtFIP表现出较好的体外升温能力；DIP、DFIP、DPtIP和DPtFIP均较游离DiR的体外升温效果更好。
实施例8Pt-COOH、PtIP和PtFIP的体外抗肿瘤活性检测
本实施例利用MTT法分别检测Pt-COOH、PtIP和PtFIP的体外抗肿瘤活性，具体操作方法如下：
先进行细胞预处理。将生长状态良好的4T1细胞经消化、离心收集后稀释成5×104个/mL的细胞悬液，然后铺到96孔板中，每孔100μL，培养箱孵育过夜使之贴壁。按照Pt浓度20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0μg/mL，分别配置含Pt-COOH、PtIP和PtFIP的全培养基。将96孔板中的旧培养基吸去，并加入配置好的含Pt的新培养基200μL，每组加一列(6孔)。空白对照及无细胞对照加入新的全培养基。然后放入培养箱孵育24h。孵育完成后每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液(用无菌PBS配置)。再将96孔板放入培养箱孵育。MTT孵育4h后吸去96孔板中培养基并加入150μL二甲亚砜，37℃放置30min，使形成的甲瓒完全溶解。最后利用酶标仪检测吸光度，检测波长为492nm，结果如图17所示。
结果显示，PtIP和PtFIP相较于Pt-COOH，杀伤肿瘤细胞的活性显著增强；有叶酸靶向纳米粒PtFIP的肿瘤细胞杀伤活性显著强于无叶酸靶向的PtIP，细胞杀伤活性增强1倍。
实施例9DPtIP和DPtFIP的体外抗肿瘤活性检测
本实施例利用MTT法分别检测DPtIP和DPtFIP的体外抗肿瘤活性，并检测了激光照射对其抗肿瘤活性的影响，具体操作方法如下：
先进行细胞预处理。将生长状态良好的4T1细胞经消化、离心收集后稀释成5×104个/mL的细胞悬液，然后铺到96孔板中，每孔100μL，培养箱孵育过夜使之贴壁。按Pt浓度为20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0μg/mL，分别配置含DPtIP和DPtFIP的培养基溶液，对应DiR浓度为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0μg/mL。将96孔板中的旧培养基吸去，并加入配置好的含DPtIP和DPtFIP的新培养基200μL，每组加一列6孔。空白对照及无细胞对照加入新的全培养基。DPtIP与DPtFIP各加两块96孔板，一块板不做处理，另一块板在给药2h后给与808nm激光照射，功率为1.5W/cm2，每孔照射3min。孵育完成后每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液(用无菌PBS配置)。再将96孔板放入培养箱孵育。MTT孵育4h后吸去96孔板中培养基并加入150μL二甲亚砜，37℃放置30min，使形成的甲瓒完全溶解。最后利用酶标仪检测吸光度，检测波长为492nm，结果如图18所示。
结果显示，有叶酸靶向纳米粒DPtFIP、DPtFIP+Laser的肿瘤细胞杀伤活性显著强于无叶酸靶向的DPtIP、DPtIP+Laser；加了激光光照DPtFIP+Laser、DPtIP+Laser的细胞杀伤要分别强于未加激光照射的DPtFIP、DPtIP。
实施例10利用激光共聚焦显微镜检测肿瘤细胞对不同纳米粒的体外摄取
本实施例利用激光共聚焦显微镜研究4T1细胞对不同载药纳米粒的摄取情况，具体操作方法如下：
将生长状态良好的4T1细胞消化收集后铺到confocal皿中，每皿铺5×104个细胞，培养箱孵育过夜使之贴壁。然后用无血清培养基配置DPtIP和DPtFIP溶液，使最终DiR浓度为5μg/mL。另用含100μg/mL的叶酸的无血清培养基配置DPtFIP溶液，同样使DiR浓度为5μg/mL。向预先处理好的4T1细胞中分别加入1mL含纳米粒的培养基，然后放在培养箱中孵育2h。孵育完成后每皿加入1mL 4％多聚甲醛固定15min。然后吸去多聚甲醛，加入1mL 10μg/mLDAPI进行染色。15min后吸去DAPI并用PBS洗涤三次。使用激光共聚焦显微镜检测4T1细胞中DiR荧光强度，结果如图19所示。
4T1细胞对有叶酸靶向DPtFIP纳米粒的摄取强于无叶酸靶向DPtIP纳米粒，由于游离的叶酸与DPtFIP竞争靶向4T1细胞，因此4T1细胞对有叶酸共孵育的DPtFIP+FA的摄取低于无叶酸共孵育的DPtFIP，说明纳米粒上连接的叶酸靶向分子增强了肿瘤细胞对纳米粒的摄取。
实施例11利用流式细胞仪检测肿瘤细胞对DPtFIP纳米粒的体外摄取
本实施例利用流式细胞仪研究4T1细胞对DPtFIP纳米粒的摄取情况，具体操作方法如下：
预先准备好空白培养基，含有DiR、DPtIP、DPtFIP以及DPtFIP+100μg/mL叶酸的培养基，使最终DiR的浓度为1μg/mL。生长状态良好的4T1细胞消化后收集并计数，然后将其接种到6孔板中，每孔接种5×105个细胞，接种15个孔。5％二氧化碳培养箱37℃孵育过夜。向6孔板中分别加入空白1640培养基、DiR和三种纳米粒溶液，每孔加1mL，每个样品加三个重复孔。37℃孵育2h后，吸去样品，用PBS冲洗三次，每孔加0.5mL胰酶消化3min。消化完成后加含血清培养基终止消化，1200rpm离心3min收集细胞。收集好的细胞再用PBS洗涤2-3次。最后收集到的细胞加入200μL PBS吹散备用。通过流式细胞仪检测DiR的荧光强度，结果如图20所示。
结果显示，4T1细胞对有叶酸靶向DPtFIP纳米粒的摄取强于无叶酸靶向DPtIP纳米粒，4T1细胞对有叶酸共孵育的DPtFIP+FA的摄取低于无叶酸共孵育的DPtFIP。与实施例10的结果一致，说明叶酸靶向分子增强了肿瘤细胞对纳米粒的摄取。
实施例12纳米粒的体内荧光成像及药物组织分布研究
购买BALB/c雌鼠，六周龄，体重在15g-17g之间。在实验室动物房适应性饲养一周后，将小鼠右后肢周围毛发剃干净。培养4T1细胞，等到细胞数量足够且处于对数期时，消化、离心收集细胞。用PBS洗涤一次后重新用PBS重悬，配置成107个/mL的细胞悬液，置于冰盒中待用。使用注射器在每只小鼠右后肢上方皮下注射100μL细胞悬液。注射完成后继续饲养即可。肿瘤体积计算公式为：V＝(L×W^2)/2，其中V表示肿瘤体积，L表示肿瘤的长径，W表示短径。待到肿瘤体积达到300mm3后，将荷瘤小鼠随机分为3组，每组5只。分别尾静脉给与游离DiR、DPtIP和DPtFIP纳米粒溶液(用PBS或者生理盐水配置)，给药剂量按照DiR计算为1mg/kg。在给药前和给药后第0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h和48h将小鼠麻醉，通过小动物活体成像仪对小鼠进行荧光成像并检测荧光强度，荧光通道选择ICG通道，745nm激发，830nm发射，结果如图21所示。为了进一步研究纳米药物在体内的分布行为，在给药后48h，处死小鼠并取出心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，使用小动物活体成像仪进行荧光成像并检测荧光强度，结果如图22所示。
结果显示，DiR赋予了纳米粒活体成像的能力，能够实时对肿瘤进行成像。如图21所示，三组小鼠肿瘤部位的荧光强度都是随给药时间增加而增强，DiR在1h后就无明显变化，而DPtIP与DPtFIP组在给药后24h出现荧光最大值。因此在进行光热实验时选取的照射时间点除DiR是给药后1h外，其他都是给药后24h。在采集荧光照片的各个时间点上，DiR组小鼠的荧光都很弱，在荧光照片上几乎没有任何表现。这主要是因为DiR是小分子，直接注射到体内很容易直接在经过肝脏或肾脏时被清除，血液循环半衰期很短，故只有少量DiR能到达肿瘤部位产生荧光。与DiR组相比，DPtIP与DPtFIP两组在肿瘤部位富集更多，48h时的平均荧光强度分别是DiR组的13.3倍和25.3倍。这主要是因为表面亲水使得纳米粒的血液循环时间增加，并且在实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability andretention effect，EPR)影响下，纳米粒在肿瘤部位富集增多。与DPtIP相比，DPtFIP组在肿瘤部位的富集更多，在给药后48h肿瘤部位平均荧光强度是DPtIP组的1.9倍。这主要是由两方面造成的：第一，叶酸的靶向作用使得DPtFIP纳米粒在肿瘤部位有更多的富集；第二，DPtIP带正电荷，容易被调理作用清除，而DPtFIP更加接近中性，因此具有更长的血液半衰期。图22中A和B分别展示了给药后48h取出的各组小鼠各个器官的荧光照片以及对各个器官荧光半定量的结果，从结果可以看出，较DiR和DPtIP组而言，DPtFIP组纳米粒具有在肿瘤部位更高的富集，分别是DiR和DPtIP组的17倍和2倍。以上的结果表明，相较于DiR和DPtIP而言，DPtFIP纳米粒在肿瘤部位有着更高的富集，这意味着DPtFIP纳米粒具有更高的成像敏感度和更好的成像效果。
实施例13纳米粒的体内光热效果检测
购买BALB/c雌鼠，六周龄，体重在15g-17g之间。在实验室动物房适应性饲养一周后，将小鼠右后肢周围毛发剃干净。培养4T1细胞，等到细胞数量足够且处于对数期时，消化、离心收集细胞。用PBS洗涤一次后重新用PBS重悬，配置成107个/mL的细胞悬液，置于冰盒中待用。使用注射器在每只小鼠右后肢上方皮下注射100μL细胞悬液。注射完成后继续饲养即可。肿瘤体积计算公式为：V＝(L×W^2)/2，其中V表示肿瘤体积，L表示肿瘤的长径，W表示短径。待肿瘤长到200mm3左右，随机将小鼠分6组，每组3只。分别尾静脉给与生理盐水(Saline)、DiR、DPtIP和DPtFIP，给药剂量按DiR计算为1.25mg/kg。除DiR为给药后1h外其他组给药24h后给与激光照射，激光功率为1.5W/cm2，照射5min，在此期间用手持式热成像仪记录肿瘤部位温度随时间变化情况，结果如图23所示。
结果显示，DiR赋予了纳米粒产生光热的能力，能够实时对肿瘤进行光热治疗。使用808激光器，在1.5W/cm2功率下照射肿瘤部位5min，DiR及纳米粒瘤内升温曲线如图23中A所示。生理盐水组肿瘤部位温度大约升高了3℃，这主要归因于动物组织对近红外光的吸收；游离DiR组肿瘤部位温度从31.5℃左右升高到了38.4℃左右，远高于生理盐水组，这表明游离DiR组也会有较少一部分富集在肿瘤部位并产生光热效果；由于DPtIP较DPtFIP纳米粒在肿瘤部位富集要少，DPtIP纳米粒的升温效果较DPtFIP纳米粒差，DPtIP组肿瘤部位在5min内可以升温到41.8℃左右，而DPtFIP则可以升高到43.5℃左右。纳米粒在肿瘤部位的升温能力强于游离的DiR，有叶酸靶向DPtFIP在肿瘤部位的升温能力强于无叶酸的DPtIP。
实施例14不同纳米粒的体内抗肿瘤药效评价实验
购买BALB/c雌鼠，六周龄，体重在15g-17g之间。在实验室动物房适应性饲养一周后，将小鼠右后肢周围毛发剃干净。培养4T1细胞，等到细胞数量足够且处于对数期时，消化、离心收集细胞。用PBS洗涤一次后重新用PBS重悬，配置成107个/mL的细胞悬液，置于冰盒中待用。使用注射器在每只小鼠右后肢上方皮下注射100μL细胞悬液。注射完成后继续饲养即可。肿瘤体积计算公式为：V＝(L×W^2)/2，其中V表示肿瘤体积，L表示肿瘤的长径，W表示短径。待肿瘤长到100mm3左右，将小鼠随机分为9组，每组8只，分别给与(1)生理盐水，(2)DiR，(3)顺铂，(4)DIP(DiR@ICO-PCL)，(5)DFIP(DiR@FA-ICO-PCL)，(6)PtIP，(7)PtFIP，(8)DPtIP和(9)DPtFIP。通过尾静脉给药，给药剂量为铂2.5mg/kg，DiR 1.25mg/kg。每三天给一次药，一共给四次药，并在第一次给药后进行光照，DiR组在给药后1h光照，DIP、DFIP、DPtIP和DPtFIP在给药后24h进行光照，光照功率为1.5W/cm2，光照时间为10min。在实验过程中，每两天测量一次小鼠体重和肿瘤体积，结果分别如图24和图25所示。在给药后第14天处死小鼠，剥离肿瘤，并对离体肿瘤称重和拍照，结果分别如图26和图27所示。将肿瘤用4％的多聚甲醛固定，用石蜡包埋切片，进行HE染色、Ki67和TUNEL免疫荧光染色，结果如图28所示；并对Ki67和TUNEL切片中的平均荧光强度进行定量，结果如图29所示。将心、肝、脾、肺、肾分别用4％的多聚甲醛固定，用石蜡包埋切片，进行HE染色如图30所示。小鼠处死后，每只小鼠需收集两份全血，一份测定血常规(抗凝)指标，另一份检测血生化(不抗凝)指标。测定血常规的全血可以直接用血细胞分析仪检测，测定血生化指标的全血则要在4℃放置过夜后，3000rpm离心5min，收集血清后，再利用相应的试剂盒检测，结果如图31所示。
从图24可看出，顺铂的毒性很大，在给完药后，顺铂组小鼠体重急剧下降；到第八天顺铂组小鼠体重已经从16g左右下降到了12g左右，平均下降超过了25％，毛发竖立无光泽，不饮食。从动物实验伦理的角度考虑，我们在第八天处死了顺铂组小鼠。由于顺铂组小鼠体重下降太多，机体无法提供营养，肿瘤生长停滞，但这并不能反映顺铂的药效，故在本发明中不对顺铂的药效进行比较。结合图25至图27看出，即便游离DiR组肿瘤部位温度只能升高到38℃左右，但光热仍能发挥一定的疗效，其肿瘤抑制率为18.4％；与生理盐水组相比，单独的化疗(PtIP和PtFIP)药效比较有限，其肿瘤抑制率分别为33.3％和33.6％；由于控制光热升温不超过45℃，单独的光热(DIP和DFIP)治疗效果也并不显著，肿瘤抑制率分别只有30.3％和38.6％；相较于单一疗法而言，光热-化疗联合治疗则可以显著地增强抗肿瘤疗效，DPtIP与DPtFIP组的肿瘤抑制率分别达到了55.3％和80.7％。
图28的染色结果显示，DPtIP和DPtFIP组肿瘤表现出了更大的肿瘤坏死面积。通过Ki67染色和TUNEL染色相对定量考察肿瘤部位细胞增殖情况，结合图29看出，DPtIP和DPtFIP组具有最低的Ki67荧光，表明肿瘤内部细胞增殖最弱；DPtFIP具有最高的TUNEL荧光，表明肿瘤内部细胞凋亡最强。上述结果一致表明，DPtFIP组具有最好的抗肿瘤效果。
通过HE染色切片评价不同药物对小鼠各个脏器的损伤情况，图30结果显示，顺铂对小鼠的心、肝、脾、肺、肾均造成了严重的损伤；其他药物对小鼠的各个脏器未表现出明显的损伤，无显著的毒性。
图31结果同样表明，除顺铂组外的其他各组对小鼠均未造成显著的毒性。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物，其特征在于：该大分子化合物为聚己内酯修饰的艾考糊精-铂偶联物，所述艾考糊精-铂偶联物由羧基化的四价铂化合物通过酯键连接至艾考糊精上形成，所述聚己内酯通过酯键与所述艾考糊精偶联；
其中，所述聚己内酯的分子量为1kDa-10kDa，所述艾考糊精的分子量为10kDa-20kDa；所述聚己内酯在所述艾考糊精上的接枝率为0.5-1，铂元素在所述大分子化合物中的质量百分含量为1％-5％。
2.一种权利要求1所述的铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、用双氧水将顺铂氧化为四价铂化合物，再与酸酐混合反应，分离纯化后得到化合物Pt-COOH；
S2、将聚己内酯上的羧基与艾考糊精上的羟基进行酯化反应，分离纯化后得到化合物ICO-PCL；
S3、将步骤S1所述化合物Pt-COOH上的羧基与步骤S2所述化合物ICO-PCL中艾考糊精上的羟基进行酯化反应，分离纯化后得到铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物。
3.权利要求1所述的铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。
4.一种艾考糊精铂前药组装纳米药物，其特征在于：包括纳米粒，所述纳米粒中包含如权利要求1所述的铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物。
5.根据权利要求4所述的艾考糊精铂前药组装纳米药物，其特征在于：所述纳米粒中包载有光敏剂和/或荧光分子。
6.根据权利要求4所述的艾考糊精铂前药组装纳米药物，其特征在于：所述纳米粒中还包含叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物；
所述叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物为叶酸修饰的艾考糊精-聚己内酯偶联物，所述艾考糊精-聚己内酯偶联物为由聚己内酯通过酯键连接至艾考糊精上形成，所述叶酸通过酯键与所述艾考糊精偶联；其中，所述聚己内酯的分子量为1kDa-10kDa，所述艾考糊精的分子量为10kDa-20kDa；所述聚己内酯在所述艾考糊精上的接枝率为0.5-1，叶酸在所述艾考糊精上的接枝率为5-10。
7.根据权利要求6所述的艾考糊精铂前药组装纳米药物，其特征在于：所述铂-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物和所述叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物的质量比为(2-9):1，优选为(2.5-5):1。
8.根据权利要求6所述的艾考糊精铂前药组装纳米药物，其特征在于，所述叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物的制备方法包括如下步骤：
Sa、将聚己内酯上的羧基与艾考糊精上的羟基进行酯化反应，分离纯化后得到化合物ICO-PCL；
Sb、将叶酸上的羧基与步骤Sa所述化合物ICO-PCL中艾考糊精上的羟基进行酯化反应，分离纯化后得到叶酸-艾考糊精-聚己内酯大分子化合物。
9.权利要求4-8任一所述的艾考糊精铂前药组装纳米药物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。
10.权利要求5所述的艾考糊精铂前药组装纳米药物在肿瘤成像中的应用。
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