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CN113615841A - 一种海带中可溶性膳食纤维在制备用于改善便秘的药物和功能性食品中的应用 - Google Patents

一种海带中可溶性膳食纤维在制备用于改善便秘的药物和功能性食品中的应用 Download PDF

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CN113615841A CN202110850167.7A CN202110850167A CN113615841A CN 113615841 A CN113615841 A CN 113615841A CN 202110850167 A CN202110850167 A CN 202110850167A CN 113615841 A CN113615841 A CN 113615841A
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China
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缪锦来
曹峻菡
曲长凤
何英英
郑洲
李江
张丽萍
王凯
王西西
秦玲
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First Institute of Oceanography MNR
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First Institute of Oceanography MNR
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Abstract

本发明公开了一种海带中可溶性膳食纤维在制备用于改善便秘的药物和功能性食品中的应用。本发明从海带残渣中提取可溶性膳食纤维，并构建了便秘小鼠模型，首次验证了海带中可溶性膳食纤维能促进小鼠排便，增加肠道含水率，提高肠道转运速率；上调抗氧化酶水平；平衡肠道神经递质水平；增加厚壁菌门和放线菌门的丰度，抑制了拟杆菌门的丰度，并增加了短链脂肪酸的产生。本发明中的海带中可溶性膳食纤维安全无毒，避免了药物毒副作用的出现，且可被肠道菌群代谢发酵并进一步介导机体抗氧化酶水平、肠神经递质的表达，改善便秘相关症状，具有良好的市场应用前景。

Description

一种海带中可溶性膳食纤维在制备用于改善便秘的药物和功 能性食品中的应用
技术领域
本发明属于食品保健领域，特别涉及一种海带中可溶性膳食纤维在制备用于改善便秘的药物和功能性食品中的应用。
背景技术
便秘的发病机制主要涉及遗传易感性、低纤维和液体摄入、活动量缺乏、激素平衡紊乱、药物副作用。其中，最常见原因包括缺乏纤维及没有摄入足够的饮用水或液体，因此，可以通过膳食干预改变营养摄入和生活习惯来控制和治疗便秘。研究表明，高纤维饮食可增加粪便重量，促进肠道蠕动，减少结肠运输时间，加快排便频率与速度，而低纤维饮食可引起便秘。
传统的膳食纤维（DF）制品主要来源于一些谷物、蔬菜、水果等植食性物质，有关藻类DF通便产品在市面上较少。海带是一种大型食用藻类和工业用藻类，其下脚料中含有丰富的岩藻多糖、纤维素、半纤维素、维生素和矿物质等物质，是生产DF的优质来源。
发明内容
本发明的目的是为了提供了一种海带中可溶性膳食纤维在制备用于改善便秘的药物和功能性食品中的应用，所述可溶性膳食纤维提取自分离褐藻胶后的海带残渣，来源丰富，安全性高，改善便秘效果明显。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种海带中可溶性膳食纤维在制备用于改善便秘的药物和功能性食品中的应用，所述可溶性膳食纤维中单糖组成包括岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、核糖。
进一步的，所述可溶性膳食纤维的提取方法包括以下步骤：
（1）向海带残渣中以1:20-40的料液比加入4-6% NaCl溶液，80-100℃加热6-8 h进行脱钙处理，离心收集沉淀，将沉淀加入纯水加热煮沸30 min；
（2）向步骤（1）的沉淀中以1:20-40的料液比加入5 mol/L NaOH溶液，调节pH至碱性，80-100℃加热6-8 h，离心收集沉淀；
（3）将步骤（2）的沉淀利用HCl调pH至中性，经浓缩、透析，超低温放置后冷冻干燥，得到可溶性膳食纤维。
进一步的，所述步骤（2）中pH调节至13；90℃加热6 h，离心分离沉淀，收集沉淀即为可溶性膳食纤维。
进一步的，所述步骤（3）中调节pH至中性的沉淀经旋蒸浓缩后，于1500 Da透析袋中透析10-12 h，-80℃冰箱中放置12 h后冷冻干燥36 h，得到干燥的可溶性膳食纤维。
进一步的，所述料液比的单位为mg/mL。
进一步的，所述可溶性膳食纤维改善便秘的有效剂量为0.5 g/kg-3.5 g/kg。
进一步的，所述可溶性膳食纤维改善便秘的最有效剂量为3.5 g/kg。
进一步的，所述可溶性膳食纤维能够增加便秘小鼠粪便数量、重量和粪便含水率，进而增强小鼠的排便功能。
进一步的，所述可溶性膳食纤维能够通过增加便秘小鼠肠道含水率以及提高肠道转运速率来促进肠道蠕动和改善肠道转运功能。
进一步的，所述可溶性膳食纤维能够增加血清中超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px的含量，以及增加SCFAs的含量，进而抑制便秘引起的氧化应激水平紊乱。
进一步的，所述SCFAs包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、异己酸。
进一步的，所述可溶性膳食纤维能够下调诱导型一氧化氮合酶iNOS的表达水平，上调肠神经递质乙酰胆碱酯酶AchE、内皮型一氧化氮合酶eNOS、胶质细胞源性神经营养因子GDNF和脑衍生神经营养因子BDNF的表达水平。
进一步的，所述可溶性膳食纤维能够通过减少小鼠肠道内拟杆菌门丰富度，增加厚壁菌门和放线菌门的丰度来调整便秘小鼠的肠道菌群的结构。
进一步的，所述可溶性膳食纤维能够增加科水平上Muribaculaceae、Lachnospiraceae占比，降低Lactobacillaceae、Marinifilaceae、Helicobacteraceae、norank_o__Clostridia_UCG-014占比。
与现有的技术相比，本发明的有益效果和优点在于：
本发明提取的可溶性膳食纤维的原料是分离褐藻胶后的海带残渣，其来源丰富，使用安全。本发明提取的可溶性膳食纤维属于天然活性物质，其中包含多种单糖种类，且经过验证可溶性海带膳食纤维的表面凹凸不平，褶皱增多，不仅能促进吸水膨胀功能，增加膳食纤维在胃肠道中吸收葡萄糖、胆固醇和有害物质的能力，还提高了海带的高附加利用价值，且安全性高、价格低。
本发明经过动物模型实验，验证提取的可溶性膳食纤维能够通过调节肠道神经递质相关基因的表达促进肠道运动，进而在改善小鼠便秘症状和调节肠道菌群及其代谢产物方面有显著的效果，因此，其可作为一种靶向调节肠道菌群及其代谢产物来改善便秘的益生元成分，在成为改善便秘功能食品上具有巨大潜力。
附图说明
图1为海带可溶性膳食纤维的电镜扫描图；
图2为海带可溶性膳食纤维的红外图谱；
图3为便秘小鼠粪便指标图；
图4为便秘小鼠肠道转运速率图；
图5为便秘小鼠肠道含水率图；
图6为便秘小鼠血清SOD和GSH-Px图；
图7为便秘小鼠结肠肠神经递质mRNA相对表达量图；
图8为便秘小鼠结肠肠神经递质蛋白相对表达量图；
图9为便秘小鼠肠道菌群OUT分布图；
图10为便秘小鼠肠道菌群科、门水平群落组成柱形图；
图11为便秘小鼠粪便短链脂肪酸（SCFAs）含量图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进一步的详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实例表述的范围。
实施例1
本发明中可溶性膳食纤维的提取方法包括以下步骤：
（1）按照料液比1:30的比例往海带残渣加入5% NaCl溶液，90℃加热7 h进行脱钙处理；
（2）离心去上清，将沉淀加入适量纯水加热煮沸30 min；
（3）按照料液比1:30的比例往步骤（2）的沉淀中加入5 mol/L NaOH溶液，调节pH至13，90℃加热6 h；
（4）离心，收集沉淀即为SDF；
（5）SDF用HCl调pH至中性，旋蒸浓缩后于1500 Da透析袋中透析10-12 h，-80℃冰箱中放置12 h后冷冻干燥36 h，即可得到干燥的可溶性膳食纤维。
实施例2：海带可溶性膳食纤维（SDF）的基本结构鉴定
1、可溶性海带膳食纤维的分子量分布和和单糖组成
分别使用GPC和HPLC对实施例1制备的可溶性海带膳食纤维的分子量分布和单糖组成进行探究。
完全酸水解：取适量样品于水解管中，加入4mol/L TFA(三氟乙酸) 1mL，于120℃烘箱中水解2h。取出后，氮气吹干；衍生化反应：向吹干后的样品中加1mL 0.5mol/L PMP-甲醇溶液以及0.5 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，70℃水浴60 min，冷却，加0.5 mL 0.3 mol/LHCl溶液后，加0.5 mL氯仿，振荡摇匀后静置20 min，弃去下层，萃取三次，取水层过膜上机。
仪器方法：色谱柱：SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm），流动相：A: 0.1mol/L 0.1M KH2PO4（pH 6.8），B：乙腈，A：B=82：18，流速：1.0 mL/min，柱温为25℃，进样量10 μL，波长为245 nm。
计算公式：X=V×N× (Cx-Co)/m；
式中，V-定容体积、N-稀释倍数、Cx-检测浓度、Co-空白、m-称样量、X-样品浓度。
结果如表1所示，海带可溶性膳食的10种单糖组成为：岩藻糖（39.495%）、半乳糖（17.572%）、葡萄糖（11.897%）、甘露糖（10.088%）、木糖（5.700%）、葡萄糖醛酸（8.892%）、鼠李糖（5.780%）、半乳糖醛酸（0.575%）、阿拉伯糖（<0.001%）、核糖（<0.001%）。
表1：海带可溶性膳食的分子量分布
Figure DEST_PATH_IMAGE002
2、可溶性海带膳食纤维的电镜扫描
在带有双面胶的载物台上均匀放置适量的干燥可溶性海带膳食纤维样本，使用离子溅射镀膜的方法在表面镀金后取出放置于扫描电子显微镜下进行扫描观察，将电压设为5Kv，放大倍数为150X。
可溶性海带膳食纤维的电镜扫描结果如图1所示，左列为可溶性海带膳食纤维，右列为原料海带渣，从150倍到500倍的图中可知可溶性海带膳食纤维的表面凹凸不平，褶皱增多，粒度明显低于海带渣。膳食纤维的粒度决定比表面积，比表面积大增加与水亲和能力，促进吸水膨胀功能，凹凸不平表面增加膳食纤维在胃肠道中吸收葡萄糖、胆固醇和有害物质的能力。
3、可溶性海带膳食纤维的红外光谱
取干燥样品2 mg和KBr（光谱级）100 mg研磨，研磨后压成透明的薄片，使用空白KBr作为背景，扫描次数为20次和分辨率为4 cm-1，扫描范围4000-400 cm-1。
结果如图2所示，红外谱图中3431.09处出现强峰，说明有O-H键的伸缩震动，并且该峰较圆润说明存在分子间和分子内的氢键作用，在1631.62处的强峰表明有C=O的伸缩震动，2920.12和2850.67出现峰说明该峰表明有甲基的C-H的伸缩震动，1261.56处的峰表明有C-H的变角运动，这些都是典型的糖类特征吸收峰。
实施例3
72只雄性ICR小鼠适应性喂养7 d后按照体重随机分成9组，每组12只，分别为正常组（NC）、模型组（MC）、西沙比利组（PC）、SDF低、中、高剂量组（L-SDF、M-SDF、H-SDF）。适应性喂养7 d后开始进行受试物灌胃干预实验，干预方案见表2。从第8 d开始，除NC组之外的其余各组小鼠每天上午9时灌胃3 mg/kg Lop，1 h后灌胃不同的受试物，持续7 d。每日观察小鼠粪便状态，包括粪便数量、粪便湿重、粪便干重等指标。末次进食后小鼠禁食不禁水过夜，隔天采取眼窝取血后脱颈椎方式处死小鼠。
表2:便秘模型实验干预方案
时间/分组 1 2 3 4 5 6 7 (天)
NC组 灌胃0.1 mL/10 g生理盐水
MC组 灌胃3 mg／kg Lop+1 h后灌胃生理盐水
PC组 灌胃3 mg/kg Lop+1 h后灌胃0.25 g/kg西沙比利
L-SDF组 灌胃3 mg/kg Lop+1 h后灌胃0.5 g/kg SDF
M-SDF组 灌胃3 mg/kg Lop+1 h后灌胃1.5 g/kg SDF
H-SDF组 灌胃3 mg/kg Lop+1 h后灌胃3.5 g/kg SDF
实验结果如图3显示：SDF促进便秘小鼠1 h 排便数量和粪便重量以及粪便含水率，进而增强小鼠排便功能。
实施例4
实验分组与灌胃剂量同实施例3。在小鼠麻醉前1 h给予5％炭末-10％阿拉伯胶半固体糊(1 mL/100 g体重)，30 min后处死小鼠，剖开腹腔，留取血液标本待血清学检测。测量幽门至直肠距离及碳末的前端至幽门的距离，用以下列公式计算碳末推进百分率：
碳末推进率（%）=碳末前沿至幽门距离/幽门至直肠距离×100%
实验结果如图4显示：SDF能改善肠道转运功能，促进肠转运速率。
实施例5
实验分组与灌胃剂量同实施例3。实验进行7 d后，小鼠禁食不禁水12h后测定小鼠最后空腹体重以及小鼠体长（从鼻尖至肛门长度）并记录。分离出便秘小鼠的小肠（空肠、回肠和结肠）称重部分肠系，40℃干燥5 h，再次称重，用以下公式计算肠道含水率：
肠道含水率（%）=(肠道湿重-肠道干重)/肠道湿重×100%
实验结果如图5显示：SDF可增加肠道的含水量，促进肠道蠕动。
实施例6
实验分组与灌胃剂量同实施例3。将干预7 d后的小鼠，空腹12 h后，乙醚麻醉后眼眶取血，全血室温静置30 min后，在4℃、7500 rpm/min条件下离心15 min，血清分离，根据试剂盒说明书检测超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量。
实验结果如图6显示：SDF能够通过增强SOD和GSH-Px的活性，进而增强机体抗氧化能力，抑制便秘引起的氧化应激水平紊乱。
实施例7
实验分组与灌胃剂量同实施例3。实验进行7 d后，分别取出100 mg的小肠组织按照Transzol的方法说明提取总RNA，使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix试剂盒将总RNA反转录为cDNA用于实时荧光定量PCR检测肠神经递质关键基因： AchE、iNOS、eNOS、BDNF、GDNF的mRNA的表达量。
实验结果如图7显示：SDF下调肠神经递质iNOS mRNA表达水平，上调AchE、eNOS、BDNF和GDNF的mRNA表达水平。
实施例8
实验分组与灌胃剂量同实施例3。实验结束后，分别取出0.1 g结肠组织提取蛋白，蛋白免疫印迹法检测炎症因子AchE、iNOS、eNOS、BDNF和GDNF的蛋白表达水平。
实验结果如图8显示：SDF下调肠神经递质iNOS蛋白表达水平，上调AchE、eNOS、BDNF和GDNF蛋白表达水平。
实施例9
实验分组与灌胃剂量同实施例3。实验结束前一天，将小鼠分别放入干净无菌的鼠笼中，收集小鼠粪便,。通过DNA抽提、设计合成引物接头、PCR扩增与产物纯化、PCR产物定量与均一化、构建PE文库等流程进行16S rRNA V3-V4区扩增，测序平台为Illumina。按照97%相似性对非重复序列进行OTU聚类，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行物种组成分析。
实验结果如图9和10显示：SDF能调整便秘小鼠的肠道菌群的OUT分布，减少拟杆菌门丰富度，增加厚壁菌门和放线菌门的丰度，主要增加科水平上Muribaculaceae、Lachnospiraceae占比，降低Lactobacillaceae、Marinifilaceae、Helicobacteraceae、norank_o__Clostridia_UCG-014占比。
实施例10
实验分组与灌胃剂量同实施例3，实验结束前一天，将小鼠分别放入干净无菌的鼠笼中，收集小鼠粪便。首先精确称取一定质量的样本，于低温环境下加入提取液进行代谢物萃取处理。配制不同浓度的标准溶液，在同一条件下对标准溶液和待测样品进行GC-MS上机检测，根据标准曲线计算出检测样品的目标物质的浓度，最终换算得到样品浓度。
实验结果如图11显示：SDF增加短链脂肪酸水平，比如乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、异己酸，进而参与便秘的机制调控。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种海带中可溶性膳食纤维在制备用于改善便秘的药物和功能性食品中的应用，其特征在于：所述可溶性膳食纤维中单糖组成包括岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、核糖。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述可溶性膳食纤维的提取方法包括以下步骤：
（1）向海带残渣中以1:20-40的料液比加入4-6% NaCl溶液，80-100℃加热6-8 h进行脱钙处理，离心收集沉淀，将沉淀加入纯水加热煮沸30 min；
（2）向步骤（1）的沉淀中以1:20-40的料液比加入5 mol/L NaOH溶液，调节pH至碱性，80-100℃加热6-8 h，离心收集沉淀；
（3）将步骤（2）的沉淀利用HCl调pH至中性，经浓缩、透析，超低温放置后冷冻干燥，得到可溶性膳食纤维。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述步骤（2）中pH调节至13；90℃加热6 h，离心分离沉淀，沉淀即为可溶性膳食纤维。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述步骤（3）中调节pH至中性的沉淀经旋蒸浓缩后，于1500 Da透析袋中透析10-12 h，-80℃冰箱中放置12 h后冷冻干燥36 h，得到干燥的可溶性膳食纤维。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述可溶性膳食纤维改善便秘的有效剂量为0.5 g/kg-3.5 g/kg。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述可溶性膳食纤维能够增加便秘小鼠粪便数量、重量和粪便含水率，进而增强小鼠的排便功能。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述可溶性膳食纤维能够通过增加便秘小鼠肠道含水率以及提高肠道转运速率来促进肠道蠕动和改善肠道转运功能。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述可溶性膳食纤维能够增加血清中超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px的含量，以及增加SCFAs的含量，进而抑制便秘引起的氧化应激水平紊乱。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述可溶性膳食纤维能够下调诱导型一氧化氮合酶iNOS的表达水平，上调肠神经递质乙酰胆碱酯酶AchE、内皮型一氧化氮合酶eNOS、胶质细胞源性神经营养因子GDNF和脑衍生神经营养因子BDNF的表达水平。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述可溶性膳食纤维能够通过减少小鼠肠道内拟杆菌门丰富度，增加厚壁菌门和放线菌门的丰度来调整便秘小鼠的肠道菌群的结构。
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Title
张丽萍: "海带膳食纤维降脂减肥功效及作用机制研究" *

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