CN113614533A

CN113614533A - 免疫层析测定方法和用于所述方法的测试条

Info

Publication number: CN113614533A
Application number: CN202080023236.0A
Authority: CN
Inventors: 东加奈子; 家治翔平; 森田元喜
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2019-03-25
Filing date: 2020-03-19
Publication date: 2021-11-05
Also published as: US20220221451A1; JPWO2020196298A1; JP7544438B2; EP3951390A1; WO2020196298A1; EP3951390A4

Abstract

本发明的目的在于提供抑制非特异性反应的免疫层析测定方法及在该方法中使用的测试条。该目的可以通过用于分析物的免疫层析测定方法来实现，该方法包括使用包括以下(1)至(3)的测试条：(1)样品垫，含有用于施加生物样品的样品施加区，该生物样品可能含有分析物；(2)不溶性膜，含有至少一个检测区，与分析物具有免疫反应性的结合配偶体固定在所述至少一个检测区上；(3)缀合物，含有与分析物具有免疫反应性的结合配偶体，所述结合配偶体被固定在标记物上；其特征在于缀合物与阴离子表面活性剂一起保留在缀合物固定区中。

Description

免疫层析测定方法和用于所述方法的测试条

技术领域

本发明涉及用于检测分析物例如流感病毒的免疫层析测定方法，以及在该方法中使用的测试条。本发明还涉及抑制在用于检测分析物例如流感病毒的免疫层析测定方法中的非特异性反应的方法。

背景技术

为早期诊断疾病的目的，在患者所在地实时进行POCT(即时检测，point-of-caretesting)，以快速获取对诊断和治疗有用的信息。在POCT中，使用与分析物特异性反应的结合配偶体广泛进行用于检测引起疾病的分析物的免疫测定法。在这些免疫测定法中，免疫层析因其操作简单而被特别广泛使用。然而，在样本中含有诸如具有交叉抗原性的细菌、病毒和蛋白质的污染物的情况下，这种免疫测定法往往伴随着非特异性反应。这是有问题的，因为这种假阳性反应可能会妨碍准确诊断。

为了抑制由于样品中的污染物引起的非特异性反应，已经进行了各种尝试。例如，专利文献1公开了用于免疫层析的试剂组合物，该试剂组合物包含非离子表面活性剂、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液和酪蛋白。然而，仅在组合使用这些物质的情况下证明了非特异性反应的抑制。因此，需要一种即使添加单一物质也能有效抑制由样品中的污染物引起的非特异性反应的技术。

引用列表

专利文献

专利文献1：JP-A-2012-37253

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种抑制非特异性反应的免疫层析测定方法，以及在该方法中使用的测试条。

问题的解决方案

本发明人发现，在用于分析物的免疫层析测定方法中，当该方法具有以下配置时，可以有效地抑制非特异性反应，从而完成了本发明。

更具体地说，本发明如下。

<1>用于分析物的免疫层析测定方法，所述方法包括使用包含以下(1)至(3)的测试条：

(1)样品垫，其含有样品施加区，用于施加可能含有分析物的生物样品；

(2)不溶性膜，其含有至少一个检测区，与分析物具有免疫反应性的结合配偶体固定在该至少一个检测区上；和

(3)缀合物，其含有与分析物具有免疫反应性的结合配偶体，所述结合配偶体被固定在标记物上；

其特征在于缀合物与阴离子表面活性剂一起保留在缀合物固定区中。

<2>根据<1>所述的免疫层析测定方法，其中所述分析物是呼吸道病毒。

<3>根据<1>或<2>所述的免疫层析测定方法，其中所述结合配偶体是单克隆抗体。

<4>根据<1>至<3>中任一项所述的免疫层析测定方法，其特征在于，提供缀合物固定区作为在(1)或(2)中所述样品施加区与所述检测区之间的缀合物区。

<5>根据<4>所述的免疫层析测定方法，其中在制备测试条时，以施加到缀合物区的缀合物施加溶液中的浓度计，阴离子表面活性剂的浓度为0.1至10质量％。

<6>根据<1>至<5>中任一项所述的免疫层析测定方法，其中生物样品是呼吸道分泌物。

<7>根据<1>至<6>中任一项所述的免疫层析测定方法，其中呼吸道病毒是乙型流感病毒。

<8>根据<1>至<7>中任一项所述的免疫层析测定方法，其中阴离子表面活性剂是基于聚氧乙烯烷基醚硫酸钠的阴离子表面活性剂。

<9>免疫层析测试条，其包括以下(1)至(3)：

(2)不溶性膜，其含有至少一个检测区，与分析物具有免疫反应性的结合配偶体固定在所述至少一个检测区上；和

(3)缀合物固定区，其含有缀合物以及阴离子表面活性剂。

<10>根据<9>所述的免疫层析测试条，其中分析物是呼吸道病毒。

<11>根据<9>或<10>所述的免疫层析测试条，其中结合配偶体是单克隆抗体。

<12>根据<9>至<11>中任一项所述的免疫层析测试条，其特征在于，提供缀合物固定区作为在(1)或(2)中样品施加区与检测区之间的缀合物区。

<13>根据<9>至<12>中任一项所述的免疫层析测试条，其中在制备测试条时，以施加到缀合物区的缀合物施加溶液中的浓度计，阴离子表面活性剂的浓度为0.1至10质量％。

<14>根据<9>至<13>中任一项所述的免疫层析测试条，其中生物样品是呼吸道分泌物。

<15>根据<9>至<14>中任一项所述的免疫层析测试条，其中呼吸道病毒是乙型流感病毒。

<16>根据<9>至<15>中任一项所述的免疫层析测试条，其中阴离子表面活性剂是基于聚氧乙烯烷基醚硫酸钠的阴离子表面活性剂。

<17>抑制分析物免疫层析测定方法中非特异性反应的方法，所述方法包括使用包含以下(1)至(3)的测试条：

(1)样品垫，其包含样品施加区，用于施加可能含有分析物的生物样品；

(2)不溶性膜，其包含至少一个检测区，与分析物具有免疫反应性的结合配偶体固定在所述至少一个检测区上；和

(3)缀合物固定区，其含有缀合物以及阴离子表面活性剂。

<18>根据<17>所述的抑制非特异性反应的方法，其中分析物是呼吸道病毒。

<19>根据<17>或<18>所述的抑制非特异性反应的方法，其中在制备测试条时，以施加到缀合物区的缀合物施加溶液中的浓度计，阴离子表面活性剂的浓度为0.1至10质量％。

<20>根据<17>至<19>中任一项所述的抑制非特异性反应的方法，其中生物样品是呼吸道分泌物。

<21>根据<17>至<20>中任一项所述的抑制非特异性反应的方法，其中呼吸道病毒是乙型流感病毒。

<22>根据<17>至<21>中任一项所述的抑制非特异性反应的方法，其中阴离子表面活性剂是基于聚氧乙烯烷基醚硫酸钠的阴离子表面活性剂。

发明的有益效果

通过本发明，可以有效抑制分析物免疫层析测定中的非特异性反应。

附图简述

[图1]图1是本发明的一个实施方式中使用的测试条的示意图。

[图2]图2是本发明的一个实施方式中使用的测试条的示意图。

具体实施方式

(分析物)

在本发明中，分析物的例子包括病毒和生理活性物质，例如通常可以使用抗原-抗体反应测量的蛋白质。病毒的例子包括流感病毒如甲型流感病毒和乙型流感病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒。蛋白质的例子包括人血红蛋白、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体和人免疫缺陷病毒抗体。

本发明的分析物优选为呼吸道病毒。本说明书中的呼吸道病毒是引起呼吸道疾病的病毒。本发明中的呼吸道病毒没有限制，只要是能够使用抗原抗体反应进行检测的病毒，呼吸道病毒的例子包括冠状病毒，例如冠状病毒229E、冠状病毒OC43和冠状病毒NL63；流感病毒，例如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒1、副流感病毒2和副流感病毒3；RS病毒，例如RS病毒A和RS病毒B；腺病毒；鼻病毒；偏肺病毒；巨细胞病毒；和博卡病毒。特别地，分析物优选为流感病毒，更优选为乙型流感病毒。最优选地，在多个位置(例如，两个位置)形成稍后描述的检测区以检测甲型流感病毒和乙型流感病毒。

在本说明书中，“呼吸道”是参与呼吸的器官的总称，是指从鼻前庭到肺泡(肺)的器官，包括鼻腔、咽、喉、气管、支气管和细支气管。

(生物样品)

本发明中使用的可能含有分析物的生物样品的例子包括主要源自生物体的物质，例如体液；以及通过从这些物质中提取分析物而制备的提取物。源自生物体的物质的具体例子包括血液、尿液、粪便和呼吸道分泌物。在分析物为呼吸道病毒的情况下，生物样品优选为呼吸道分泌物，例如源自鼻孔、鼻腔、咽部、鼻咽部等的鼻涕；痰；或唾液。源自生物体的物质及其提取物可以直接作为样品使用，或者可以用样品稀释剂适当稀释以提供样品。它们也可以被适当地过滤以提供样品。

(阴离子表面活性剂)

在本说明书中，阴离子表面活性剂是指一种表面活性剂，其含有当该表面活性剂溶解在水中时被负离子化的疏水基团。在本说明书中，当表面活性剂溶解在水中时不会离子化的表面活性剂称为非离子表面活性剂；含有当表面活性剂溶解在水中时被正离子化的疏水基团的表面活性剂，称为阳离子表面活性剂；在碱性范围内表现出阴离子表面活性剂性质而在酸性范围内表现出阳离子表面活性剂性质的表面活性剂称为两性表面活性剂。

作为阴离子表面活性剂，可以使用基于磺酸盐的阴离子表面活性剂、基于羧酸盐的阴离子表面活性剂、基于聚氧乙烯烷基醚硫酸钠的阴离子表面活性剂等。更具体地，基于磺酸盐的阴离子表面活性剂的例子包括β-萘磺酸钠-甲醛缩合物(商品名：DEMOL NL)；基于羧酸盐的阴离子表面活性剂的例子包括特殊的聚羧酸盐类聚合物表面活性剂(商品名：DEMOL EP)；基于聚氧乙烯烷基醚硫酸钠的阴离子表面活性剂的例子包括聚氧乙烯十二烷基醚硫酸钠(商品名：EMAL 20C)和聚氧乙烯烷基醚硫酸钠(商品名：EMAL 20CM)。这些阴离子表面活性剂可以单独使用，也可以组合使用两种或更多种。阴离子表面活性剂优选为基于聚氧乙烯烷基醚硫酸钠的阴离子表面活性剂。

只要不损害本发明的效果，除阴离子表面活性剂外，还可以使用其他种类的表面活性剂。优选不使用其他种类的表面活性剂。

在本说明书中，“基于磺酸盐的阴离子表面活性剂”是指作为含有磺酸盐基团(-SO₃H)的物质的盐的表面活性剂；“基于羧酸盐的阴离子表面活性剂”是指作为含有羧酸盐基团(-COOH)的物质的盐的阴离子表面活性剂；“基于聚氧乙烯烷基醚硫酸钠的阴离子表面活性剂”是指具有聚氧乙烯烷基醚硫酸钠化学结构的阴离子表面活性剂。

阴离子表面活性剂的浓度可以根据阴离子表面活性剂和分析物的类型适当调整。例如，从抑制非特异性反应的效果的观点来看，在制备测试条时，在用于施加到缀合物区的缀合物施加溶液中阴离子表面活性剂的浓度为0.001质量％至20质量％，优选0.01质量％至20质量％，更优选0.05质量％至20质量％，还更优选0.1质量％至20质量％，最优选0.5质量％至20质量％。浓度的上限可以是10质量％、8质量％、5质量％、3质量％或2质量％。

(缀合物)

缀合物含有与呼吸道病毒具有免疫反应性的抗体，其中抗体被固定在标记物上。在本说明书中，在样品垫、不溶性膜、缀合物垫、过滤器等中缀合物所固定的部分称为缀合物固定区。关于固定缀合物的缀合物固定区的存在方式，缀合物固定区可以以浸渍在垫中的状态作为缀合物垫存在，与样品垫、第三垫和不溶性膜分开提供(A型)，可以作为样品垫的一部分或不溶性膜的一部分中的缀合物区存在(B型)，或者可以作为与样本混合的缀合物试剂单独存在(C型)。

作为本发明中使用的标记物，可以使用通常用于检测呼吸道病毒的已知标记物。例如，标记物优选胶体金属颗粒，例如胶体金颗粒或胶体铂颗粒；有色乳胶颗粒；磁性粒子等。标记物特别优选胶体金颗粒。

在检测流感病毒的情况下，缀合物优选是其中抗流感病毒单克隆抗体固定在胶体金颗粒上的缀合物。

下面描述一测试条，其中缀合物固定区的存在方式为A型。

从样品流动方向的上游到下游，依次放置样品垫、缀合物垫、第三垫和不溶性膜。每一层被放置成使得该层的至少一部分与上游/下游层重叠。图1图示了具有这种配置的测试条的例子。

当含有呼吸道病毒的样品被施加到测试条的样品垫上时，呼吸道病毒经过样品垫流向位于下游的缀合物垫。缀合物垫含有阴离子表面活性剂，并且在阴离子表面活性剂的存在下，呼吸道病毒接触缀合物，并在形成第一复合物(聚集体)的同时穿过该垫。此后，第一复合物穿过放置成与缀合物垫下侧接触的多孔第三垫，随后展开(develop)到不溶性膜中。

在不溶性膜部分，固定了与呼吸道病毒具有免疫反应性的抗体。在此，发生免疫反应使第一复合物结合到与呼吸道病毒具有免疫反应性的抗体，导致形成固定的第二复合物。然后通过检测源自缀合物的信号例如吸光度、反射光、荧光或磁性的装置来检测固定的第二复合物。

下面描述一测试条，其中缀合物固定区的存在方式为B型。

与A型测试条的区别在于样品垫或不溶性膜与缀合物垫一体化。图2图示了测试条的例子，其具有其中样品垫或不溶性膜的一部分由样品施加区和缀合物区构成的配置。

样品施加区是施加含有呼吸道病毒的样品的区域，并且缀合物区是含有缀合物的区域。样品施加区位于缀合物区的上游。

缀合物区形成在样品垫或不溶性膜上，使得缀合物区位于样品施加区的下游。缀合物区含有阴离子表面活性剂。缀合物区优选放置成在垂直于样品展开方向的方向上形成线形，即垂直于连接样品垫中的样品施加区的中心和后文提到的不溶性膜的下游端的中心的线。换言之，线形缀合物区优选放置成在垂直于样品垫和不溶性膜的纵向方向的方向上形成线形。尽管缀合物区可以存在于不溶性膜中，使得缀合物区位于检测区的上游，但优选在样品垫中形成。在这种情况下，样品垫中缀合物区的下游侧不必完全被缀合物区占据，并且缀合物区的下游侧可以具有不含缀合物的多孔材料部分。

本领域技术人员可以将缀合物区的位置适当调整到合适的长度。线形缀合物区的线的中心线优选位于样品垫下游端上游至少3mm处。在本说明书中，缀合物区或检测区的“中心线”是指在垂直于样品垫纵向方向绘制的中心线，而不是在平行于样品垫纵向方向绘制的中心线。

施加到样品施加区的含有呼吸道病毒的样品从上游迁移到下游。在缀合物区，呼吸道病毒和缀合物在阴离子表面活性剂的存在下形成第一复合物。第一复合物进一步向下游迁移。然后第一复合物与固定在检测区的抗体形成第二复合物，该抗体与呼吸道病毒具有免疫反应性。然后通过检测源自缀合物的信号例如吸光度、反射光、荧光或磁性的装置来检测固定到检测区的第二复合物。

下面描述一测试条，其中缀合物固定区的存在方式为C型。

与A型测试条的不同之处在于没有缀合物垫，缀合物作为缀合物试剂单独存在。例如，使用具有过滤器的过滤嘴，所述过滤器中含有缀合物。该过滤嘴还含有阴离子表面活性剂。样品稀释剂和呼吸道病毒穿过过滤嘴，使缀合物与呼吸道病毒结合，从而形成第一复合物(聚集体)。通过将得到的第一复合物施加到与A型相同(除了不存在缀合物垫)的测试条上，可以在检测区中形成第二复合物，与呼吸道病毒具有免疫反应性的抗体固定在该检测区上。然后通过检测源自缀合物的信号例如吸光度、反射光、荧光或磁性的装置来检测固定的第二复合物。

(与呼吸道病毒具有免疫反应性的抗体)

本发明中使用的与呼吸道病毒具有免疫反应性的抗体是能够与呼吸道病毒结合的抗体。与呼吸道病毒具有免疫反应性的抗体被固定到标记物和检测区。尽管固定到标记物和检测区的抗体可以是相同的，但是对于标记物和检测区优选使用不同的抗体。通过使用与固定到标记物的抗体和固定到检测区的抗体不同的抗体，可以抑制在与缀合物结合的呼吸道病毒和检测区内的抗体之间的反应同与缀合物结合的呼吸道病毒和未反应的缀合物之间的反应之间的竞争。此外，可以增加与缀合物结合的呼吸道病毒和检测区中的抗体之间的反应性。因此，免疫层析测试条可以具有良好的灵敏度。不同的抗体是指抗体的类型不同，即抗体识别不同的表位。

固定到标记物和检测区的抗体优选是单克隆抗体。通过使用单克隆抗体，可以提高反应的特异性。

除了这些抗体的整个分子之外，具有抗原-抗体反应活性的抗体的功能片段同样被视为本发明中的抗体。抗体的功能片段的例子包括通过动物免疫过程获得的那些、使用基因重组技术获得的那些和嵌合抗体。抗体的功能片段的例子包括F(ab’)₂和Fab’。这些功能片段可以通过用蛋白酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)处理抗体来产生。

(样品垫)

样品垫层铺在缀合物垫或后述的不溶性膜上，使得样品垫下游端的下侧与缀合物垫或不溶性膜的上侧接触。构成样品垫的多孔材料的例子包括由无纺纤维制成的垫，例如纸、纤维素混合物、硝酸纤维素、聚酯、丙烯腈共聚物、玻璃和人造丝。垫特别优选由玻璃纤维(玻璃纤维垫)制成。

(第三垫)

在A型测试条中，为了去除生物样品中的非特异性反应物质，将第三垫置于缀合物垫和不溶性膜之间。根据样品等的特性，在必要时优选放置第三垫。第三垫不受限制，只要样品中呼吸道病毒与缀合物的复合物能够穿过第三垫即可。

(不溶性膜)

可用于本发明的不溶性膜含有至少一个检测区，与呼吸道病毒具有免疫反应性的抗体固定在该检测区上。可通过已知方法将与呼吸道病毒具有免疫反应性的抗体固定在不溶性膜上。在用于横向流动免疫层析的试剂的情况下，制备含有预定浓度的抗体的溶液。此后，使用例如具有能够在水平方向移动同时以恒定速率从喷嘴排出溶液的机构的设备，将溶液施加到不溶性膜以形成线形。通过干燥所施加的溶液，可以固定抗体。

可以通过向缓冲液中加入抗体来制备含有预定浓度抗体的溶液。缓冲液的种类的例子包括常规使用的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、tris缓冲液和Good’s缓冲液。缓冲液具有优选为6.0至9.5的pH范围，更优选为6.5至8.5，又更优选为7.0至8.0。缓冲液还可含有：盐，如氯化钠；稳定剂，如糖；保存剂；和防腐剂(antiseptics)，如ProClin。盐的例子不仅包括为了调节离子强度而添加的那些，例如氯化钠，而且包括为了调节缓冲剂的pH而添加的那些，例如氢氧化钠。

在将抗体固定到不溶性膜上之后，可以通过用常规使用的封闭剂的溶液或蒸气包被而将除抗体固定部位以外的部分封闭。

构成可用于本发明的不溶性膜的膜的例子包括已知的膜，所述膜已常规用作免疫层析测试条的不溶性膜。膜的例子包括由纤维所构成的膜，该纤维由聚乙烯；聚对苯二甲酸；尼龙；玻璃；多糖如纤维素或纤维素衍生物；或陶瓷组成。膜的具体例子包括可从Sartorius、Millipore、Toyo Roshi Kaisha,Ltd.、Whatman等商购获得的玻璃纤维滤纸和硝酸纤维素膜。

可用于本发明的免疫层析测试条优选在不溶性膜的下游端设有吸收垫。吸收垫是具有液体吸收能力的部分，该部分通过吸收已经迁移/穿过不溶性膜的样品来控制样品的展开。作为吸收垫，可以使用常规用于免疫层析测试条的公知的吸收垫。例如，可以使用滤纸。

说明书中的非特异性反应是指检测到源自缀合物的信号，因此判断生物样品为阳性，尽管事实上生物样品中不存在或基本上不存在呼吸道病毒作为分析物。

(免疫层析测试条)

在本说明书中，“免疫层析”是指利用诸如纤维素膜的多孔材料的性质的免疫测定法，该性质使测试样本在溶解试剂的同时缓慢地流过(毛细管现象)。在本说明书中，“使用测试条”是指通过使测试条与生物样品接触来检测生物样品中包含的分析物。免疫层析测试条优选放置在固体支持物例如塑料粘合片上。固体支持物由不阻碍样品和缀合物的毛细管流动的物质构成。可以使用粘合剂等将免疫层析测试条固定在固体支持物上。在这种情况下，粘合剂等的组分也由不阻碍样品和缀合物的毛细管流动的物质构成。为增加不溶性膜的机械强度，并防止测定过程中水分蒸发(干燥)，测试条可与聚酯膜等层压。考虑到免疫层析测试条的尺寸、添加样品的方法、添加样品的位置，每个检测区在不溶性膜中形成的位置，信号的检测方法等，免疫层析测试条可以在将测试条储存或安装在适当的容器(外壳)中的状态下使用。在这种状态下储存或安装的测试条被称为“装置”。

在本说明书中，免疫层析测定方法是指利用免疫层析的测定方法。

(其他)

适当时，可以通过修改或改变实施例中描述的方法来制备免疫层析测试条。

实施例

下面通过实施例具体描述本发明。然而，这些并不限制本发明的范围。在说明中，除非另有说明，“％”表示“质量％”。

[抗流感病毒单克隆抗体的制备]

以下试验中所用的抗甲型流感病毒单克隆抗体和抗乙型流感病毒单克隆抗体是通过使用重组流感核蛋白作为抗原，通过本领域技术人员生产单克隆抗体所常规使用的方法对小鼠进行免疫获得的。

[测试条制备实施例1]免疫层析测试条的制备

1)胶体金颗粒标记的抗流感病毒单克隆抗体(缀合物)的制备

制备含有浓度为100μg/mL的抗甲型流感病毒单克隆抗体的PBS和含有浓度为100μg/mL的抗乙型流感病毒单克隆抗体的PBS。向20mL 1OD/mL胶体金颗粒溶液中加入1mL各抗体溶液，并将所得混合物在室温下搅拌10分钟。向胶体金颗粒/抗甲型流感病毒单克隆抗体混合物和金胶体颗粒/抗乙型流感病毒单克隆抗体混合物每种中加入2mL 10％牛血清白蛋白(BSA)溶液，将每种得到的混合物搅拌5分钟，然后在10℃以10,000rpm离心45分钟以获得沉淀物(缀合物)。向获得的每种缀合物中加入缀合物稀释缓冲液(由Scripps制造)，并将缀合物悬浮在其中。

2)样品垫的制备

将上述1)中制备的各缀合物与含有1.33％酪蛋白和4％蔗糖(pH 7.5)的溶液混合到8至20OD/mL的浓度，以制备缀合物溶液。将各种浓度的阴离子表面活性剂添加到该缀合物溶液中。用缀合物溶液浸泡具有28mm总长度的玻璃纤维垫，从而形成具有4mm线宽的线。通过在70℃加热30分钟来干燥垫，以提供含有缀合物区的样品垫。

3)固定抗流感病毒单克隆抗体的不溶性膜(抗体固定化膜)的制备

将浓度分别调整为0.75mg/mL、1.0mg/mL和0.75mg/mL的抗甲型流感病毒单克隆抗体、抗乙型流感病毒单克隆抗体和抗小鼠IgG抗体，与磷酸盐缓冲液一起施加到硝酸纤维素膜(孔径，8μm)的短侧端，以在垂直于不溶性膜的纵向方向的方向上形成线。此后，将膜在70℃干燥45分钟以提供抗体固定膜。施加这些线，使得在组装测试条时，抗甲型流感病毒单克隆抗体(c1)、抗乙型流感病毒单克隆抗体(c2)和对照抗体(c3)从上游侧以此顺序排列。

4)免疫层析测试条的制备

将2)中制备的样品垫层铺在3)中得到的不溶性膜上，制备免疫层析测试条。

[实施例1]

使用在测试条制备实施例1中制备的免疫层析测试条进行甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测试验。

1.测试方法

(1)样品

来自未感染流感的健康受试者的鼻粘液与样品稀释剂混合，以提供每种样品。

(2)程序

将135μL在(1)中制备的各样品分装到试管中，将免疫层析测试条插入试管中，5、15、30和45分钟后目视判断检测区中抗体固定膜上测试线A和B是否存在显色。

2.测试结果

测试线B是否存在显色的判断结果如表1至3所示，该线指示乙型流感病毒的检测。

[表1]

[表2]

[表3]

EMULGEN、AMIET、EMAL、AMPHITOL和QUARTAMIN是注册商标。

在表1至表3中，“-”表示测试线B没有显色。测试线B指示乙型流感病毒的检测。因此，“-”指示不存在假阳性结果。“+”表示线显色，指示假阳性结果的出现。添加阴离子表面活性剂的样品均未在乙型流感病毒检测中示出非特异性反应，但所有添加了除阴离子表面活性剂以外的表面活性剂的样品均在乙型流感病毒检测中示出非特异性反应。所测样品在甲型流感病毒检测中均未示出非特异性反应。因此表明，向样品稀释剂中添加阴离子表面活性剂能够防止乙型流感病毒检测中的非特异性反应。

[实施例2]

1.测试方法

除了使用不同类型和浓度的表面活性剂外，以与实施例1相同的方式进行甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测试验。

2.测试结果

指示乙型流感病毒检测的测试线B是否存在显色的判断结果如表4和表5所示。

[表4]

[表5]

在表4和表5中，“-”表示测试线B没有显色。测试线B指示乙型流感病毒的检测。因此，“-”指示不存在假阳性结果。“+”表示线显色，指示假阳性结果的出现。检测样品均未示出乙型流感病毒的非特异性反应。

因此发现，即使在表面活性剂的浓度低的情况下，阴离子表面活性剂对于抑制在乙型流感病毒检测中发生的非特异性反应也是有效的。所测样品均未在甲型流感病毒检测中显示出非特异性反应。

工业适用性

通过本发明，可以提供抑制非特异性反应的免疫层析测定方法以及在该方法中使用的测试条。

附图标记列表

(a)塑料粘合片

(b)不溶性膜

(c1)测试线A

(c2)测试线B

(c3)对照线

(d)缀合物垫

(e)样品垫

(f)吸收垫

(g)第三垫

(h)缀合物区

(i)膜

Claims

1.用于分析物的免疫层析测定方法，所述方法包括使用包含以下(1)至(3)的测试条：

(2)不溶性膜，其含有至少一个检测区，与所述分析物具有免疫反应性的结合配偶体固定在所述至少一个检测区上；和

(3)缀合物，其含有与所述分析物具有免疫反应性的结合配偶体，所述结合配偶体被固定在标记物上；

其特征在于，所述缀合物与阴离子表面活性剂一起保留在缀合物固定区中。

2.根据权利要求1所述的免疫层析测定方法，其中所述分析物是呼吸道病毒。

3.根据权利要求1或2所述的免疫层析测定方法，其中所述结合配偶体是单克隆抗体。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫层析测定方法，其特征在于，提供所述缀合物固定区作为在(1)或(2)中的所述样品施加区与所述检测区之间的缀合物区。

5.根据权利要求4所述的免疫层析测定方法，其中在制备所述测试条时，以施加至所述缀合物区的缀合物施加溶液中的浓度计，所述阴离子表面活性剂的浓度为0.1至20质量％。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫层析测定方法，其中所述生物样品是呼吸道分泌物。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫层析测定方法，其中所述呼吸道病毒是乙型流感病毒。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫层析测定方法，其中所述阴离子表面活性剂是基于聚氧乙烯烷基醚硫酸钠的阴离子表面活性剂。

9.免疫层析测试条，其包括以下(1)至(3)：

(3)缀合物固定区，其含有缀合物以及阴离子表面活性剂。

10.根据权利要求9所述的免疫层析测试条，其中所述分析物是呼吸道病毒。

11.根据权利要求9或10所述的免疫层析测试条，其中所述结合配偶体是单克隆抗体。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的免疫层析测试条，其特征在于，提供所述缀合物固定区作为在(1)或(2)中所述样品施加区与所述检测区之间的缀合物区。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的免疫层析测试条，其中在制备所述测试条时，以施加于所述缀合物区的缀合物施加溶液中的浓度计，所述阴离子表面活性剂的浓度为0.1至20质量％。

14.根据权利要求9至13任一项所述的免疫层析测试条，其中所述生物样品是呼吸道分泌物。

15.根据权利要求9至14中任一项所述的免疫层析测试条，其中所述呼吸道病毒是乙型流感病毒。

16.根据权利要求9至15中任一项所述的免疫层析测试条，其中所述阴离子表面活性剂是基于聚氧乙烯烷基醚硫酸钠的阴离子表面活性剂。

17.抑制分析物的免疫层析测定方法中非特异性反应的方法，所述方法包括使用包含以下(1)至(3)的测试条：

(3)缀合物固定区，其含有缀合物和阴离子表面活性剂。

18.根据权利要求17所述的抑制非特异性反应的方法，其中所述分析物是呼吸道病毒。