CN113583862A - 一种病原体现场核酸检测的装置及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种病原体现场核酸检测的装置及使用方法，属于实验室用设备技术领域，所述装置包括基座和设置在基座上的核酸提取部、检测部、显示部和控制装置；使用本发明装置结合配套的RPA‑LFD方法，能够快速获得更灵敏、更特异的检测结果；该装置的检测部和显示部均密封，不开盖即可完成扩增反应和检测，可防止高浓度核酸扩增产物导致的污染，实验完成后，可将该装置的检测部和显示部整体丢弃，可降低生物安全风险；该装置可脱离对实验室和贵重仪器的依赖，能够在动物养殖场等场所进行现场核酸提取和检测。

Description

一种病原体现场核酸检测的装置及使用方法

技术领域

本发明属于实验室用设备技术领域，具体地涉及一种病原体现场核酸检测的装置及使用方法。

背景技术

核酸检测技术尤其是近年来发展的实时荧光PCR，灵敏度高，特异性强，目前在临床已经大规模的应用，获得了广泛的认可。但是，由于该方法高度依赖实验室环境，比如核酸提取的过程中需要高速离心机，荧光PCR过程中需要精密的热循环仪，读取结果需要专业的技术人员，核酸提取和PCR所需时间较长，难以满足现场检测的需要。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplication，RPA)是一种新型恒温核酸扩增技术，与PCR相比，操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、无需精密仪器，是一种可以替代PCR的核酸检测技术，是目前最有潜力成为快速分子诊断的工具。RPA与横向流动试纸条(lateral flow dipstick，LFD) 结合(RPA-LFD)是一项将重组酶聚合酶扩增、胶体金标记(三明治夹心法)、分子杂交和侧向流层析等方法相结合的，结果可视化的核酸检测技术。研究中使用nfo为核酸外切酶IV，其检测原理为，首先上游引物和含有3’端生物素 (biotin)标记的下游引物扩增出的扩增子，和含有羧基荧光素(FAM)标记的特异性探针杂交反应，形成5’端为FAM标记，3’端为生物素标记的产物。将该产物加到侧向流动试纸条的样品孔中，通过毛细作用层析至结合垫(固定有标记抗FAM抗体的胶体金颗粒)，该产物中的5’端FAM与抗FAM抗体的胶体金颗粒结合形成复合物，该复合物层析到检测线(T线)时，因T线固定有链霉亲和素(SA)，含有生物素标记的扩增产物被链霉亲和素捕获显红色，没有被捕获的复合物继续向上层析至质控线(C线)时，因C线固定有特异性抗体，被特异性抗体捕获显红色，结果为阳性。该方法15-30分钟即可实现扩增产物的可视化检测，而荧光定量PCR则需要1-2小时，因此，RPA-LFD为实现病原体现场快速检测提供了一种新的方法。

现场核酸检测需要解决三个关键问题，包括：样品准备、扩增及检测，而样品准备是其中最大的挑战。在常规提取核酸的方法中，包括离心柱法和TRIzol 法等，都离不开加热仪器(包括水浴锅或干浴锅)和高速离心机等。而用常规磁珠法来提取核酸时，需要加热仪器、旋转仪和磁力架等。上述方法都难以脱离实验室环境，不易实现现场提取核酸。因此，需要一套简易、便携的装置，满足现场核酸提取的需要。

由于RPA是一种扩增效率不亚于荧光定量PCR的核酸扩增方法，扩增产物浓度非常高，在开管盖﹑取样﹑上样以及样本在侧向流动试纸条上层析的过程中，气体与样本液面摩擦时，容易产生核酸气溶胶污染，在下一次检测时，由于该方法的高灵敏度，极少量的气溶胶分子即可以被扩增出，导致假阳性结果和潜在的生物安全风险。因此，有必要使该扩增反应和检测反应在密闭装置中完成，检测完成后，将反应部分和检测部分整体丢弃处理，以降低假阳性结果和生物安全风险。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种病原体现场核酸提取和检测的装置及使用方法。所述装置结合配套的RPA-LFD方法，能够简单快速地提取核酸，有效防止开管盖造成的假阳性和生物安全风险，快速获得更灵敏、更特异的检测结果；该装置的检测部和显示部均密封，不开盖即可完成扩增反应和检测，可防止高浓度核酸扩增产物导致的污染，实验完成后，可将该装置的检测部和显示部整体丢弃处理，降低生物安全风险；该装置可脱离对实验室和贵重仪器的依赖，能够在动物养殖场等场所进行现场核酸提取和检测。

本发明采用的技术方案为：

一种病原体现场核酸检测的装置，所述装置包括基座和设置在基座上的核酸提取部、检测部、显示部和控制装置；

所述的基座分为提取部基座和检测部基座，提取部基座上由核酸提取部和控制装置组成；检测部基座上由检测部和显示部组成，提取部基座和检测部基座能够自由组合或拆开；

所述的核酸提取部包括支架、磁铁插盒、提取管、管套和磁铁，所述的磁铁插盒设有可开合的盒盖，用于放置磁铁，管套设置在磁铁插盒侧面的中部，管套竖直设置于磁铁插盒外，管套上端设有密封盖，管套能够开闭用于套住提取管且管套能够恒温加热；管套与控制装置有信号连接；磁铁插盒固定在支架上，且能够通过控制装置在支架上翻转；

所述的检测部包括反应箱和设置在反应箱内的圆口切刀、Y型托架、杯状漏斗、检测管、固定环和稀释管；所述反应箱设有能够开合的盖并缺少下底；反应箱设置在检测部基座上，杯状漏斗包括杯状体和漏斗颈，杯状体内设置有2 个Y型托架，Y型托架上方设置有水平放置的圆口切刀，圆口切刀的刀刃呈竖直方向，固定环设置在反应箱内，用于固定检测管和稀释管，当检测管和稀释管通过固定环下端伸入圆口切刀内，通过下压反应箱的盖，检测管和反应管下移，从而使检测管和反应管的下端能够被圆口切刀竖直切断，上端有固定环防止检测管和反应管倾倒，Y型托架接住切掉部分；所述漏斗颈为S型，以增加液体流程，使待检测液和稀释液充分进行稀释；

所述的显示部包括上样孔和结果显示窗口，上样孔正对漏斗颈的出口，结果显示窗口设置在基座中部的凹槽内，结果显示窗口内设置有检测试纸，检测试纸被密封在结果显示窗口内；上样孔内加入的样品层析到结果显示窗口，从而将结果显示出来。

进一步，所述装置还配有电动研磨棒和电动旋转棒。分别用于研磨样品和混匀反应液。

进一步，电动研磨棒和电动旋转棒上设有遮挡板。防止在研磨和搅拌时液体溅出。

进一步，固定环的直径大于检测管和反应管的直径，但小于检测管和反应管盖的直径。

本发明还提供所述装置的使用方法，首先，用磁珠法提取核酸，将样品组织放入提取管内，并充分研磨，加入消化液和蛋白酶K，然后将提取管放入管套内，盖上管套的密封盖，打开控制装置上的管套加热按钮，充分消化；加入磁珠和carrierRNA后，使磁珠和核酸充分混合；将磁铁插进磁铁插盒，此时磁珠被吸附在提取管壁上，弃去液体，取出磁铁，加入漂洗液漂洗磁珠后，再将磁铁插进磁铁插盒，重复2次，最后，加入RNase-Free双蒸水洗脱并管套内加热，于支架上翻转混匀后，将磁铁再次放入磁铁插盒内，将溶液取出至另一提取管，即为核酸样品；然后以提取的核酸为模板在检测管中进行RPA核酸扩增反应，整个反应在核酸提取部进行，反应完毕后，检测管和盛有稀释液的稀释管分别通过固定环插入反应箱中的2个圆口切刀内，稀释管和检测管的下端正对Y型托架，用力下压反应盒的盖，切刀将检测管和稀释管的下端切掉，切掉的部分掉落在Y型托架上，固定环卡在检测管和稀释管的盖上，防止倾倒，检测管和稀释管内的液体流出，流入杯状漏斗的S型弯道，以促使稀释液和扩增产物充分混合，混合物垂直滴入上样孔，经层析作用，在结果显示窗口上显示出来，检测一个样本完毕后，将检测部基座拆掉，整体将包括检测部和显示部的基座密封扔掉，防止气溶胶污染下一批样本检测。

本发明与现有技术相比的有益效果：

使用本发明装置，可脱离水浴锅、磁力架和旋转仪等多个设备的限制，用一个便携装置现场提取核酸；该装置配套的核酸扩增方法为RPA-LFD，由于该方法的扩增效率高，扩增产物浓度非常高，开管盖极易造成气溶胶污染，该装置的检测部在密闭的反应箱内完成，不开盖即可完成扩增反应和检测；因结果显示部也被透明胶带密封，因此，该装置的检测部和显示部完全密封，可防止高浓度核酸扩增产物导致的假阳性污染，实验完成后，可整体将检测部和显示部丢弃处理，可降低生物安全风险；该装置可脱离对实验室和贵重仪器的依赖，能够在动物养殖场等场所进行现场核酸提取和检测。

附图说明

图1为本发明装置结构示意图：1、控制装置，2、支架，3、磁铁插盒，4、盒盖，5、管套，6、磁铁，7、反应箱，8、圆口切刀，9、Y型托架，10、杯状漏斗，11、检测管，12、稀释管，13、提取部基座，14、上样孔，15、结果显示窗口，16、固定环、17检测部基座。

图2为电动研磨棒的结构示意图；

图3为电动旋转棒的结构示意图；

图4为结果显示窗口的阴性或阳性显示结果。

具体实施方式

下面的通过实施例来对本发明作进一步阐述，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例1

一种病原体现场核酸检测的装置，如图1所示，所述装置包括基座和设置在基座上的核酸提取部、检测部、显示部和控制装置1；

所述的基座分为提取部基座13和检测部基座17，提取部基座上由核酸提取部和控制装置组成；检测部基座上由检测和和显示部组成，提取部基座和检测部基座能够自由组合或拆开；

所述的核酸提取部包括支架2、磁铁插盒3、提取管、管套5和磁铁6，所述的磁铁插盒设有可开合的盒盖4，磁铁插盒用于放置磁铁，管套竖直设置在磁铁插盒外侧的中部，管套设有密封盖，密封盖能够开合用于密封住提取管且管套能够恒温加热；管套与控制装置有信号连接；磁铁插盒固定在支架上，且能够在支架上翻转；磁铁插盒的两侧面各有一个卡口，一侧可悬挂电动研磨棒(带电池，图2)，另一侧可悬挂电动旋转棒(带电池)，如图3所示，该旋转棒的末端呈十字风扇型，用于核酸提取过程中，充分混匀磁珠。电动研磨棒和电动旋转棒上设有遮挡板。防止在研磨和搅拌时液体溅出。

所述的检测部包括反应箱7和设置在反应箱内的圆口切刀8、Y型托架9、杯状漏斗10、检测管11、固定环16和稀释管12；所述反应箱设有能够开合的盖并缺少下底；反应箱设置在检测部基座17上，杯状漏斗包括杯状体和漏斗颈，杯状体内设置有2个Y型托架，Y型托架上方设置有水平放置的圆口切刀，当检测管和稀释管通过圆口切刀放置在杯状漏斗内时，通过下压反应箱的盖，检测管和反应管下移，从而使检测管和反应管的下端能够被圆口切刀切断，上端有固定环防止检测管和反应管倾倒，Y型托架接住切掉部分；所述漏斗颈为S型，以增加液体流程，使待检测液和稀释液充分进行稀释；

所述的显示部包括上样孔14和结果显示窗口15，上样孔正对漏斗颈的出口，结果显示窗口设置在基座中部的凹槽内；结果显示窗口内设置有检测试纸，检测试纸被密封在结果显示窗口内；防止气溶胶污染检测试纸，上样孔内加入的样品层析到结果显示窗口，从而将结果显示出来。

实施例2本实施例应用实施例1所述装置进行检测

将固定有试纸卡的检测部基座和核酸提取支架及反应箱的卡口紧紧卡住，将装置组装好。

第一步先进行核酸的提取：

本实施例选用天根公司的磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒(DP438)中的试剂和操作步骤。

1)将小块肠组织加入200μL组织消化液和20μL蛋白酶K，用电动研磨棒研磨充分。

(1)对不需要研磨的样本，可省去研磨这一步，比如血液样本；

(2)对于有肉眼可见组织块的样本，可放置在核酸提取部的管套中65℃消化30分钟；

(3)对于鼠尾组织，可放置在加热的离心管套中56℃消化过夜。

2)取200μL已处理好的样本溶液转移至1.5mL离心管中；

3)加入15μL磁珠悬浮液，向离心管中加入300μLCarrier RNA工作液，用电动旋转棒旋转混匀10秒钟；

4)室温静置10min，期间，使用控制装置，在磁铁插盒上每隔3分钟旋转混匀10秒钟，使磁珠和核酸充分混合；

5)将离心管放置在管套内，并将磁铁置入磁铁插盒内，静置1分钟，待磁珠完全吸附时小心去除液体；

6)将磁铁取出磁铁插盒，加入500μL漂洗液，用电动旋转棒混匀1分钟；

7)将磁铁置入磁铁插盒，静置1分钟，磁珠吸附后，小心吸去液体；

8)将磁铁取出磁铁插盒，加入500μL漂洗液，用电动旋转棒混匀1分钟；

9)将磁铁置入磁铁插盒，静置1分钟，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。

10)将磁铁置入磁铁插盒，56℃晾干5-10分钟；

11)将磁铁取出磁铁插盒，加入100μLRNase-Free双蒸水，56℃电动旋转棒混匀5分钟；

12)将磁铁置入磁铁插盒，静置2分钟，带磁珠完全吸附后，小心将核酸溶液转移至一个新的离心管中，并保存于适当条件。

此处提取的核酸包括病毒DNA和RNA，如需使用其中的病毒RNA，可用 DNA酶将DNA降解，如需使用其中的病毒DNA进行核酸扩增反应，可直接使用。因本实施例为大鼠细小病毒H1型为DNA病毒，可直接取样本进行后续的核酸扩增反应。

第二步进行扩增反应：

按众测RPA-nfo核酸扩增试剂(试纸条型)使用说明书操作：

1)向装有检测干粉酶制剂的检测管中加入40.9μL A Buffer，4μL引物， 0.6μL探针；

2)向检测管中加入2.0μL经第一步处理得到的待测样本DNA；

3)再向检测管盖上加入2.5μL的B Buffer，盖上管盖，将检测管放进管套，盖紧，通过控制装置翻转核酸提取的支架，充分混匀5-6次；

4)将检测管放入加热管套中，37℃孵育15min；

5)反应结束，共50μL体系。

第三步进行检测：

用另一与上述检测管同样的稀释管加入300μL的PBS，用于稀释核酸扩增产物；

将反应箱的盖子打开，将检测管和稀释管穿过固定环置入圆口切刀内，盖紧盖子，用力下压反应箱的盖，检测管和稀释管的底部被圆口切刀切断，Y型托架将切下的部分托起，检测管和稀释管内的液体流出，流入杯状漏斗的S型弯道，以促使稀释液和扩增产物充分混合，混合物垂直滴入上样孔，经层析作用，5分钟后，或者试纸条上C线和T线同时显红色，为阳性，或者只有C线显红色，T线不显色，结果为阴性，如图4所示，或者C/T线均无，检测失效。

备注：

大鼠细小病毒H1的引物和探针如下：

LRMVF：AGATCTGTACACTGACTCTAGCAAGAACCAA

LRMVR：Biotin-AAATCTATCATTGCACAAGCCATAGCACAAG

LRMVP： FITC-CCTGTAGAATCTTTGCTGAGCATGGCTGGA(THF)CTATATTAAAGTCTG-C3-Spacer

引物和探针由上海闪晶分子生物科技有限公司合成，试纸条购买于 Milenia-biotech的HybriDectect，该公司的试纸条的显示结果的窗口处由透明衔接胶带封住。因此，整个装置属于全密封，检测完成后检测部基座连同检测部和显示部可整体丢弃处理。

Claims (5)

1.一种病原体现场核酸检测的装置，其特征在于所述装置包括基座和设置在基座上的核酸提取部、检测部、显示部和控制装置；

所述的基座分为提取部基座和检测部基座，提取部基座上由核酸提取部和控制装置组成；检测部基座上由检测部和显示部组成，提取部基座和检测部基座能够自由组合或拆开；

所述的核酸提取部包括支架、磁铁插盒、提取管、管套和磁铁，所述的磁铁插盒设有可开合的盒盖，用于放置磁铁，管套设置在磁铁插盒侧面的中部，管套竖直设置于磁铁插盒外，管套上端设有密封盖，管套能够开闭用于套住提取管且管套能够恒温加热；管套与控制装置有信号连接；磁铁插盒固定在支架上，且能够通过控制装置在支架上翻转；

所述的检测部包括反应箱和设置在反应箱内的圆口切刀、Y型托架、杯状漏斗、检测管、固定环和稀释管；所述反应箱设有能够开合的盖并缺少下底；反应箱设置在检测部基座上，杯状漏斗包括杯状体和漏斗颈，杯状体内设置有2个Y型托架，Y型托架上方设置有水平放置的圆口切刀，圆口切刀的刀刃呈竖直方向，固定环设置在反应箱内，用于固定检测管和稀释管，当检测管和稀释管通过固定环下端伸入圆口切刀内，通过下压反应箱的盖，检测管和反应管下移，从而使检测管和反应管的下端能够被圆口切刀竖直切断，上端有固定环防止检测管和反应管倾倒，Y型托架接住切掉部分；所述漏斗颈为S型，以增加液体流程，使待检测液和稀释液充分进行稀释；

所述的显示部包括上样孔和结果显示窗口，上样孔正对漏斗颈的出口，结果显示窗口设置在基座中部的凹槽内，结果显示窗口内设置有检测试纸，检测试纸被密封在结果显示窗口内；上样孔内加入的样品层析到结果显示窗口，从而将结果显示出来。

2.根据权利要求1所述的一种病原体现场核酸检测的装置，其特征在于所述装置还配有电动研磨棒和电动旋转棒。

3.根据权利要求1所述的一种病原体现场核酸检测的装置，其特征在于电动研磨棒和电动旋转棒上设有遮挡板。

4.根据权利要求1所述的一种病原体现场核酸检测的装置，其特征在于固定环的直径大于检测管和反应管的直径，但小于检测管和反应管盖的直径。

5.权利要求1-4所述装置的使用方法，其特征在于具体的方法如下：

首先，用磁珠法提取核酸，将样品组织放入提取管内，并充分研磨，加入消化液和蛋白酶K，然后将提取管放入管套内，盖上管套的密封盖，打开控制装置上的管套加热按钮，充分消化；加入磁珠和carrierRNA后，使磁珠和核酸充分混合；将磁铁插进磁铁插盒，此时磁珠被吸附在提取管壁上，弃去液体，取出磁铁，加入漂洗液漂洗磁珠后，再将磁铁插进磁铁插盒，重复2次，最后，加入RNase-Free双蒸水洗脱并置于管套内加热，于支架上翻转混匀后，将磁铁再次放入磁铁插盒内，将溶液取出至另一提取管，即为核酸样品；然后以提取的核酸为模板在检测管中进行RPA核酸扩增反应，整个反应在核酸提取部进行，反应完毕后，检测管和盛有稀释液的稀释管分别通过固定环插入反应箱中的2个圆口切刀内，稀释管和检测管的下端正对Y型托架，用力下压反应盒的盖，切刀将检测管和稀释管的下端切掉，切掉的部分掉落在Y型托架上，固定环卡在检测管和稀释管的盖上，防止倾倒，检测管和稀释管内的液体流出，流入杯状漏斗的S型弯道，以促使稀释液和扩增产物充分混合，混合物垂直滴入上样孔，经层析作用，在结果显示窗口上显示出来，检测一个样本完毕后，将检测部基座拆掉，整体将包括检测部和显示部的基座密封扔掉，防止气溶胶污染下一批样本检测。

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