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CN113574067A - 双功能抗PD-1/SIRPα分子 - Google Patents

双功能抗PD-1/SIRPα分子 Download PDF

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CN113574067A
CN113574067A CN201980092872.6A CN201980092872A CN113574067A CN 113574067 A CN113574067 A CN 113574067A CN 201980092872 A CN201980092872 A CN 201980092872A CN 113574067 A CN113574067 A CN 113574067A
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seq
antibody
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sirpa
heavy chain
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Application number
CN201980092872.6A
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N·普瓦里耶
C·马里
A·莫雷洛
K·比托
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Original Assignee
OSE Immunotherapeutics SA
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Abstract

本发明涉及包含抗PD‑1抗体和SIRPa的双功能分子及其用途。

Description

双功能抗PD-1/SIRPα分子
发明领域
本发明属于免疫治疗领域。本发明提供了一种包含与SIRPa连接的抗PD-1抗体或其抗体片段的双功能分子及其用途。
发明背景
靶向T细胞抑制检查点以使用治疗性抗体解除抑制的方法是一个深入研究的领域(有关评述，请参见Pardoll,Nat Rev Cancer,2012；12:253-264)。靶向适应性免疫的免疫检查点已显示出对抗多种癌症的巨大治疗功效，但其仅在有限比例的患者中显示。先天性骨髓细胞(巨噬细胞、树突状细胞、MDSC、PMN)上的免疫检查点仍然缺乏研究，而这些细胞代表了许多实体瘤中最丰富的免疫细胞类型，并且经常与不良结果相关联。针对先天性(由骨髓细胞介导)和适应性(由T细胞介导)免疫应答两者的免疫检查点疗法的联合在临床前模型中表现出很高的效率，但在临床上仍然是一个挑战。
免疫细胞激活由平衡共刺激和共抑制信号的整合控制。T细胞受体(TCR)介导的T细胞激活由共刺激和共抑制信号两者调节。抗原非依赖性第二信号修饰第一信号，其由抗原肽-MHC复合物与TCR的相互作用提供，从而赋予对应答的特异性。T细胞共刺激和共抑制通路具有广泛的免疫调节功能，控制效应子、记忆和调节T细胞以及初始
Figure BDA0003225628970000011
T细胞。那些通路的治疗调节正在转化为用于治疗癌症的有效新策略(关于综述，请参见Schildberg等，44(5)，Immunity，2016)。正在进行的关于免疫应答调节的研究已经确定了多种免疫通路，可以靶向所述通路以开发癌症疗法。那些分子在本文中称为免疫检查点共激活剂或共抑制剂(参见综述Sharma等，Cell,161(2),2015和Pardoll,Nature ReviewsCancer,12(4),2012)。
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1，也称为CD279)是一种细胞表面蛋白分子，其属于免疫球蛋白超家族。PD-1在T和B淋巴细胞和巨噬细胞上表达，并在细胞命运和分化中发挥作用。特别地，PD-1作为免疫检查点，通过阻止T细胞的激活，在下调免疫系统中发挥重要作用，从而降低自身免疫并促进自我耐受。已鉴定出PD-1的两种配体，即PD-L1和PD-L2，其已被证明在结合至PD-1后可下调T细胞激活(Freeman等，(2000)J Exp Med 192:1027-34；Latchman等，(2001)Nat Immunol 2:261-8；Carter等，(2002)Eur J Immunol 32:634-43)。PD-1与其配体之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少和癌细胞的免疫逃避。特别是，PD1连接减少T细胞上TCR刺激下游的信号，抑制T细胞应答并导致激活和细胞因子产生减少。
使用抗PD1和抗PDL1抑制剂来破坏其相互作用的两种策略在癌症治疗中均取得了成功(Brahmer等，N Eng J Med,366(26),2012；Powles等，Nature,515(7528),2014；Topalian等，N Eng J Med,366(26),2012；Ansell,Curr Opin Hematol,22(4),2015)。然而，肿瘤微环境内免疫抑制性和低刺激性骨髓细胞的积累限制了T细胞应答的效率和免疫疗法的功效，尤其是那些靶向免疫检查点(例如PD-1/PD-L1)的免疫疗法。例如，在胰腺癌、非MSI结直肠癌、胃癌和一些乳腺癌亚型中看到低或无临床响应(Brahmer等，N Engl JMed.，2012年6月28日；366(26):2455-65,Feng等，Cancer Lett.，2017年10月28日；407:57-65，Borcherding等，J Mol Biol.，2018年7月6日；430(14):2014-2029)。多种机制已被描述且可解释该低功效和对PD-1/PD-L1检查点疗法的抗性，例如(1)记忆T细胞的形成受损；(2)T细胞浸润受损；(3)肿瘤特异性T细胞生成不足；(4)T细胞功能不足；和(5)调节性T细胞诱导的免疫抑制微环境。
迄今为止，大多数疗法侧重于刺激适应性免疫系统来攻击癌症，包括靶向PD-1/PD-L1轴以拯救耗竭T细胞并恢复抗肿瘤响应的药剂(Brahmer等，N Eng J Med，366(26)，2012；Topalian等，N Eng J Med，366(26)，2012；Wolchok等，N Engl J Med.，2013年7月11日；369(2)：122-133)。然而，巨噬细胞和其他骨髓免疫细胞也有望作为癌症免疫疗法的效应剂。CD47/信号调节蛋白α(SIRPα)轴是骨髓细胞激活的重要调节剂，并作为骨髓特异性免疫检查点发挥着广泛的作用。
信号调节蛋白α或SIRPa(也称为SIRPα、CD172a或SHPS-1)在淋巴组织中单核细胞、大多数组织巨噬细胞亚群体、粒细胞、树突状细胞亚群体、一些骨髓祖细胞上表达，并以不同水平在神经元上表达，且在大脑中富含突触的区域中具有显著高表达。由骨髓细胞表达的SIRPa与普遍存在的CD47(其在一些癌细胞中过度表达，也在大多数健康细胞中以较低水平广泛表达)的相互作用是骨髓功能的调节中涉及的先天应答的另一重要免疫检查点。CD47与SIRPa相互作用并导致“不要吃我(don’t eat me)”信号传输到吞噬巨噬细胞，然后吞噬细胞离开靶细胞和潜在地肿瘤细胞未受影响。通过靶向CD47的药剂，通过增强巨噬细胞的抗体依赖性吞噬作用而对CD47/SIRPa通路的阻断已被描述为与消耗治疗性抗癌抗体协同作用，以刺激体外癌细胞吞噬作用，并在宽广范围的临床前模型中刺激体内抗肿瘤免疫应答。
发明内容
为了提高抗PD1免疫疗法的功效并克服患者潜在的抗PD-1抗性，开发同样靶向SIRPalpha/CD47的联合治疗可能是一个好策略。因此，本领域仍然非常需要用于安全免疫疗法的新的改善药剂，特别是针对癌症，靶向先天性骨髓免疫细胞，并且对适应性免疫应答(特别是T细胞免疫应答)具有有效的积极影响的安全免疫疗法。本发明人已经用本文公开的发明向前迈出了重要的一步。在具体实施方式的开头处和实施例中特别显示和解释了强烈的有益和出乎意料的效果。
本发明人提供了包含抗hPD-1抗体和人SIRPα的双功能分子，其有望用于多种治疗应用，特别是用于治疗癌症。本发明基于特异性靶向人PD-1的抗体的开发，该抗体显示出对PD-1的高结合亲和性并与其配体PDL-1和/或PD-L2的强烈竞争。出乎意料地，SIRPa的N-端与抗hPD-1抗体Fc区C-端的融合允许以与内源性SIRPa相似的程度保留其对CD47(SIRPa配体)的高亲和力。Fc结构域与SIRPa的融合也增加了产品的半衰期。此外，本文公开的双功能抗PD1-SIRPa分子相比于单独的抗PD-1增强了T细胞的激活(NFAT介导的激活)。特别地，所述抗PD1-SIRPa双功能分子诱导细胞因子(例如IFNγ)分泌反映的初始、部分耗竭亚群的增殖和激活。所述双功能抗PD1-SIRPa分子显示出意料之外的协同作用。这种抗hPD1-SIRPa双功能分子具有克服相关抗性机制并改善抗PD-1免疫疗法的功效的能力。
在第一个方面中，本发明涉及一种双功能分子，其包含：
(a)抗人PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含：
(i)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变结构域(VH)，和
(ii)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变结构域(VL)，和
(b)人SIRPa或其片段或变体，
其中所述抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的C-端末端，优选地通过肽接头，与所述SIRPa或其片段或变体的N端末端共价连接作为融合蛋白。
特别地，所述抗体是嵌合、人源化或人抗体。
优选地，所述SIRPa片段包含SIRPa的胞外结构域或由SIRPa的胞外结构域组成。甚至更优选地，所述SIRPa片段缺乏其胞内部分和任选地其跨膜结构域，优选地其中所述SIRPa包含SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列或其片段，或由SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列或其片段组成。
在一个特别的方面中，所述发明涉及一种双功能分子，其包含抗人PD-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含以下或由以下组成：
(i)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变结构域(VH)，和
(ii)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变结构域(VL)，
其中：
-所述重链CDR1(HCDR1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；
-所述重链CDR2(HCDR2)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；
-所述重链CDR3(HCDR3)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成，其中X1是D或E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N和E；
-所述轻链CDR1(LCDR1)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成，其中X是G或T；
-所述轻链CDR2(LCDR2)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成，
-所述轻链CDR3(LCDR3)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成。
特别地，所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含以下或由以下组成：(a)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的VH，其中X1是D或E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N和E；(b)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成的VL，其中X是G或T。
在一个特别的方面中，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人κ轻链恒定结构域的轻链恒定结构域和来源于人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定结构域的重链恒定结构域，优选地IgGl或IgG4重链恒定结构域。
在一个更特定的方面中，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人κ轻链恒定结构域的轻链恒定结构域和来源于人IgGl重链恒定结构域的重链恒定结构域，其任选地具有选自以下的置换或置换的组合：T250Q/M428L；M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F；E233P/L234V/L235A/G236A+A327G/A330S/P331S；E333A；S239D/A330L/I332E；P257I/Q311；K326W/E333S；S239D/I332E/G236A；N297A；L234A/L235A；N297A+M252Y/S254T/T256E；以及K322A和K444A，优选地选自以下：N297A，其任选地与M252Y/S254T/T256E组合，和L234A/L235A。
在另一个更特定的方面中，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人κ轻链恒定结构域的轻链恒定结构域和来源于人IgG4重链恒定结构域的重链恒定结构域，任选地具有选自以下的置换或置换的组合：S228P；L234A/L235A、S228P+M252Y/S254T/T256E和K444A。
特别地，所述抗PD1抗体选自派姆单抗，纳武单抗，匹地利珠单抗，西米普利单抗，PDR001以及单克隆抗体5C4、17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4。
在另一个方面中，本发明涉及一种分离的核酸序列或分离的核酸分子组，其编码如本文公开的双功能分子；一种载体，其包含如本文公开的核酸或核酸分子组；和/或一种宿主细胞，其包含如本文公开的载体、核酸或核酸分子组。
在另一个方面中，本发明涉及一种用于产生所述双功能分子的方法，其包括培养如本文公开的宿主细胞的步骤和任选地分离所述双功能分子的步骤。
在另一个方面中，本发明涉及一种药物组合物，其包含如本文公开的双功能分子、核酸或核酸分子组、载体或宿主细胞和药学上可接受的载体。
任选地，所述药物组合物还包含另外的治疗剂，所述另外的治疗剂优选地选自以下：烷化剂、血管生成抑制剂、抗体、抗代谢物、抗有丝分裂剂、抗增殖剂、抗病毒剂、极光激酶抑制剂、凋亡促进剂(例如，Bcl-2家族抑制剂)、死亡受体通路激活剂、Bcr-Abl激酶抑制剂、BiTE(双特异性T细胞接合剂)抗体、抗体药物缀合物、生物应答调节剂、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、环氧合酶-2抑制剂、DVD、白血病病毒癌基因同源物(ErbB2)受体抑制剂、生长因子抑制剂、热休克蛋白(HSP)-90抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、激素疗法、免疫药、凋亡蛋白抑制剂(IAP)的抑制剂、嵌入型抗生素、激酶抑制剂、驱动蛋白抑制剂、Jak2抑制剂、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂、microRNA、丝裂原激活的胞外信号调节激酶抑制剂、多价结合蛋白、非甾体抗炎药(NSAID)、聚ADP(二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、铂类化学治疗剂、polo样激酶(Plk)抑制剂、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、受体酪氨酸激酶抑制剂、类视黄醇/类维生素D植物生物碱、小抑制性核糖核酸(siRNA)、拓扑异构酶抑制剂、泛素连接酶抑制剂、低甲基化剂、检查点抑制剂、肽疫苗等、来自肿瘤抗原的表位或新表位、以及这些试剂中的一种或多种的组合。
特别地，所述药物组合物、双功能分子、核酸或核酸分子组、载体或宿主细胞用作药物。
本文发明最终涉及如本文公开的一种药物组合物、双功能分子、核酸或核酸分子组、载体、或宿主细胞，其用作药物。
在一个特别的方面中，如本文公开的药物组合物、双功能分子、核酸或核酸分子组、载体、或宿主细胞，其用于治疗癌症，优选地选自以下的癌症：表达PD-1和/或PD-L1的血液系统恶性肿瘤或实体瘤，如选自以下的癌症：淋巴造血肿瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征和急性髓性白血病，由病毒诱发或与免疫缺陷相关的癌症，如选自以下的癌症：卡波西氏肉瘤(例如，与卡波西氏肉瘤疱疹病毒相关的)；宫颈癌、肛门癌、阴茎癌和外阴鳞状细胞癌和口咽癌(例如，与人乳头瘤病毒相关的)；B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、HHV-8原发性渗出性淋巴瘤、经典霍奇金氏淋巴瘤和淋巴增生性病症(例如，与爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)和/或卡波西氏肉瘤疱疹病毒相关的)；肝细胞癌(例如，与乙型肝炎和/或丙型肝炎病毒相关的)；梅克尔细胞癌(例如，与梅克尔细胞多瘤病毒(MPV)相关的)；和与人免疫缺陷病毒感染(HIV)相关的癌症；以及选自以下的癌症：转移性或非转移性、黑色素瘤、恶性间皮瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、头颈癌、尿道上皮癌、结直肠癌、肝细胞癌、小细胞肺癌、转移性梅克尔细胞癌、胃癌或食道癌和宫颈癌；或者传染病、优选地慢性传染病、甚至更优选地慢性病毒感染，所述传染病优选由选自以下的病毒引起：HIV、肝炎病毒、疱疹病毒、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒脑炎病毒。
优选地，所述癌症是PD-1、PD-L1和/或PD-L2阳性癌症，特别是PD-L1阳性癌症。
任选地，所述双功能分子、所述药物组合物、所述分离的核酸分子或核酸分子组、所述载体、或所述宿主细胞用于与放射疗法或另外的治疗剂联合使用，所述另外的治疗剂优选地选自烷化剂、血管生成抑制剂、抗体、抗代谢剂、抗有丝分裂剂、抗增殖剂、抗病毒剂、极光激酶抑制剂、凋亡促进剂(例如，Bcl-2家族抑制剂)、死亡受体通路激活剂、Bcr-Abl激酶抑制剂、BiTE(双特异性T细胞接合剂)抗体、抗体药物缀合物、生物应答调节剂、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、环氧合酶-2抑制剂、DVD、白血病病毒癌基因同源物(ErbB2)受体抑制剂、生长因子抑制剂、热休克蛋白(HSP)-90抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、激素疗法、免疫药、凋亡蛋白抑制剂(IAP)的抑制剂、嵌入型抗生素、激酶抑制剂、驱动蛋白抑制剂、Jak2抑制剂、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂、microRNA、丝裂原激活的胞外信号调节激酶抑制剂、多价结合蛋白、非甾体抗炎症药物(NSAID)、聚ADP(二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、铂类化学治疗剂、polo样激酶(Plk)抑制剂、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、受体酪氨酸激酶抑制剂、类视黄醇/类维生素D植物生物碱、小抑制性核糖核酸(siRNA)、拓扑异构酶抑制剂、泛素连接酶抑制剂、低甲基化剂、检查点抑制剂、肽疫苗等、来自肿瘤抗原的表位或新表位、以及这些试剂中的一种或多种的组合。
在一个方面中，如本文公开的药物组合物、双功能分子、核酸或核酸分子组、载体或宿主细胞用于抑制T调节细胞的遏制活性、激活T效应细胞和/或刺激初始的部分耗竭T细胞的增殖。
附图说明
图1：抗PD-1抗体相比于抗PD-1/SIRPa双功能分子的结合PD-1的ELISA测定。固化人重组PD-1蛋白，并添加不同浓度的抗PD-1双功能分子。使用与过氧化物酶偶联的抗人Fc抗体进行揭示。使用TMB底物，在450nm处确定比色法。(A)嵌合(●)相比于人源化(■)抗PD1VH-SIRPa抗体的数据。(B)嵌合(●)相比于人源化(■)抗PD1VL-SIRPa抗体的数据。在该实验中，所述双功能分子包含具有如SEQ ID NO:18中公开的重链可变结构域和如SEQ IDNO:28中公开的轻链可变结构域的人源化抗PD1抗体。
图2：抗PD-1/SIRPa双功能分子阻断PD1/PDL1相互作用。竞争PD-1/PD-L1 ELISA测定。固化PD-L1，并添加复合物抗体+生物素化重组人PD-1。测试不同浓度的抗PD-1抗体，并以0.6μg/mL添加rec PD1。以不同的浓度添加抗PD-1抗体(■)或Bicki抗PD1VH-Sirpa(●)或抗PD1VL-Sirpa(o)抗体。用链霉亲和素过氧化物酶进行揭示以检测PD1分子，并使用TMB底物，在450nm处通过比色法进行揭示。在该实验中，所述双功能分子包含具有如SEQ IDNO:53中定义的重链和如SEQ ID NO:54中定义的轻链的嵌合抗PD1抗体。
图3：桥接ELISA结合测定。固化PD1-His重组蛋白，并以系列浓度添加Bicki抗PD1VHSirpa(●)或抗PD1VLSirpa(o)。然后以1μg/mL添加CD47 Fc重组蛋白。使用抗CD47小鼠抗体(克隆B6H12)+与过氧化物酶偶联的抗IgG小鼠抗体进行检测。使用TMB底物，通过450nm比色法揭示ELISA。直方图代表固化在板上的重组rSIRPa蛋白，并且其用作ELISA的阳性对照。在该实验中，所述双功能分子包含具有如SEQ ID NO:53中定义的重链和如SEQ IDNO:54中定义的轻链的嵌合抗PD1抗体。
图4：PD1+CD47+表达T细胞上Bicki抗PD1-SIRPa分子的靶向和结合。用4,5nMBiCKi抗PD-1SIRPa或SIRPa-Fc对仅表达CD47+(灰色柱)或共表达CD47+和PD-1+(黑色柱)的Jurkat细胞进行染色，并用抗IgG-PE(Biolegend，克隆HP6017)揭示。数据代表PD-1+CD47+Jurkat细胞上的荧光中值与PD1-细胞CD47+Jurkat细胞上获得的荧光中值的比率。在该实验中，所述双功能分子包含具有如SEQ ID NO:24中公开的重链可变结构域和如SEQ ID NO:28中公开的轻链可变结构域的人源化抗PD1抗体。
图5：Bicki抗PD1-Sirpa分子通过刺激NFAT信号传导协同增强体外T细胞激活。针对该实验，使用NFAT荧光素酶报告系统进行了promega PD-1/PD-L1生物测定以确定T细胞激活。使用了两个细胞系：(1)效应T细胞(稳定表达PD-1、NFAT诱导的荧光素酶的Jurkat)和(2)激活靶细胞(稳定表达PDL1和设计为以抗原独立性方式激活同源TCR的表面蛋白的CHOK1细胞)。当将细胞共培养时，PD-L1/PD-1相互作用直接抑制TCR介导的激活，从而阻断NFAT激活和荧光素酶活性。添加抗PD-1抗体阻断抑制性信号，导致NFAT激活和荧光素酶合成。在添加BioGloTM荧光素后，用光度计对发光进行定量，并且其反映了T细胞激活。(A)效应报告T细胞系上PD-1和CD47的表达(抗PD-1Pecy7，BD Bioscience克隆EH12.2；抗CD47(克隆B6H12)+抗小鼠IgG AF647)。(B)测试了单独的抗PD1抗体
Figure BDA0003225628970000101
或bicki抗PD1VH-SIRPa抗体(◆)或同种型对照(■)、抗PD-1抗体+同种型对照VH-SIRPa抗体(●)或抗PD1抗体+SIRPaFc(○)的序列稀释。(C)将效应Jurkat细胞与抗CD47阻断抗体(B6H12)(●)一起预孵育或不与阻断抗体(◆)一起预孵育，然后与不同浓度的Bicki抗PD1VH-SIRPa一起孵育。作为基线激活，Jurkat细胞也与单独的抗PD-1抗体一起孵育
Figure BDA0003225628970000111
(D)评估了用IgG4 S228P(◆)或IgG1 N298A(■)构建的Bicki抗PD1VH-SIRPa的功效，并与单独的抗PD-1进行比较
Figure BDA0003225628970000112
(E)在另一个实验中，使用其他抗PD-1骨架测试了Bicki VH SIRPa(○)相比于单独的抗PD-1抗体(●)的协同活性：派姆单抗(左图)和纳武单抗(右图)。(F)测试了另一种bicki抗PD1-I型蛋白抗体(●)并与抗PD1抗体(■)进行了比较。在该实验中，所述双功能分子包含具有如SEQ ID NO:24中公开的重链可变结构域和如SEQ ID NO:28中公开的轻链可变结构域的人源化抗PD1抗体。
图6：Bicki抗PD1-SIRPa分子以与CD28共刺激相似的程度增强T细胞中钙通量信号传导。用Fura-red对CD47+PD1+Jurkat细胞进行染色以使用流式细胞术测量激活后的胞内Ca2+释放。用单独的BiCKI SIRPa(○灰线)或其与CD3(OKT3)刺激的组合(○黑线)刺激T细胞。作为对照，用单独a-CD3(●)或用a-CD3+CD28(■)刺激细胞。(A)图表示4至6次实验的平均值，并且箭头表示刺激物的添加。通过计算BV711(连接的Ca2+)/PercyP5.5 5(游离Ca2+)MFI的比率获得数据。将该比率归一化至未受刺激的(刺激前20秒的平均值)。(B)数据代表计算的曲线下面积(AUC)；每个点代表一个实验。使用配对t检验计算p值(*p<0,05)。在该实验中，所述双功能分子包含具有如SEQ ID NO:24中公开的重链可变结构域和如SEQ ID NO:28中公开的轻链可变结构域的人源化抗PD1抗体。
图7：Bicki抗PD1-SIRPa分子刺激PBMC的增殖和IFNg的分泌。(A)从3个健康供体中分离PBMC，并在同种型对照、抗PD1抗体或Bicki抗PD1VH-SIRPa或抗PD1VL-SIRPa的存在下，用固化CD3抗体(OKT3.3μg/mL)激活。在第6天，通过胸苷掺入3H评估增殖。(B)在单独的PD-1抗体、抗PD1+rSIRPa蛋白、Bicki抗PD1VH-Sirpa或抗PD1VL-Sirpa的存在下，用固化抗CD3抗体(OKT23 1ug/mL)和抗CD28抗体(克隆CD28.2)激活从健康供体中分离的PBMC。在激活后第2天，收集上清液并通过ELISA对IFNg进行定量。数据是3个不同供体的代表。在该实验中，所述双功能分子包含具有如SEQ ID NO:24中公开的重链可变结构域和如SEQ ID NO:28中公开的轻链可变结构域的人源化抗PD1抗体。
图8：Bicki抗PD1-SIRPa分子增强激活的T细胞增殖和IFNg分泌。在抗PD1VH-SIRPa或抗PD1VL-SIRPa的存在下，在CD3/PDL1包被的板上重刺激CD3 CD28预激活的T细胞。(10ug/毫升)。抗PD-1抗体和同种型抗体用作对照。(A)在第6天，通过H3胸苷掺入来评估T细胞增殖。(B)在第6天，收集上清液，并通过ELISA对IFNg分泌进行定量。激活后，收集上清液，并通过ELISA测定对IFNg进行定量。数据是3个不同供体的代表。在该实验中，所述双功能分子包含具有如SEQ ID NO:24中公开的重链可变结构域和如SEQ ID NO:28中公开的轻链可变结构域的人源化抗PD1抗体。
图9：Bicki抗PD1-SIRPa双功能分子增强耗竭T细胞的增殖。每3天在CD3 CD28包被的板(3ug/mL OKT3和3μg/mL CD28.2抗体)上反复刺激人PBMC。在第3次刺激后，在CD3/PD-L1包被的板上重激活T细胞，并与同种型对照或抗PD1、rSIRPa蛋白或Bicki抗PD1-VH-Sirpa抗体一起孵育。在第5天，进行H3掺入测定以确定T细胞增殖。数据以倍数变化表示，代表3个不同的供体(1＝同种型对照)。在该实验中，所述双功能分子包含具有如SEQ ID NO:24中公开的重链可变结构域和如SEQ ID NO:28中公开的轻链可变结构域的人源化抗PD1抗体。
图10：Bicki抗PD1-SIRPa双功能分子增强T细胞到肿瘤中的迁移。通过在低附着板中共培养A549肿瘤细胞、MRC-5成纤维细胞和人单核细胞来生成3D多细胞球体。在第3天，将人T细胞加入孔中，共培养72小时后，通过免疫荧光(抗人CD3+抗驴A488二抗)分析T细胞浸润，并用DAPI核标志物对所有细胞进行染色。通过共聚焦显微镜对荧光信号进行定量并使用FIJI软件进行分析。数据表示浸润至球体/1e6 DAPI+总细胞的CD3+阳性细胞的数量，每个点代表一个球体的分析。在该测定中，用同种型对照(IgG4)或biCKI SIRPa(50nM)处理球体3天。使用Mann Whitney检验确定统计显著性，*p<0.05。在该实验中，所述双功能分子包含具有如SEQ ID NO:24中公开的重链可变结构域和如SEQ ID NO:28中公开的轻链可变结构域的人源化抗PD1抗体。
图11：小鼠中Bicki抗PD1-SIRPa双功能分子的药代动力学。给小鼠静脉注射一剂(34.34nM/kg)用IgG1N298A(○)或IgG4 S228P同种型(●)构建的抗PD-1SIRPa。在注射后的多个时间点，通过夹心ELISA评估血清中Bicki的浓度。在该实验中，所述双功能分子包含具有如SEQ ID NO:24中公开的重链可变结构域和如SEQ ID NO:28中公开的轻链可变结构域的人源化抗PD1抗体。
图12：与现有技术相比，Bicki抗PD1-SIRPa双功能分子的作用机制的说明。图的左侧部分说明了现有技术中靶向癌细胞的抗PD-L1-SIRPa双功能分子的机制。图的右侧部分说明了本发明所述的抗PD-1-SIRPa双功能分子的机制，本发明所述的抗PD-1-SIRPa双功能分子靶向T细胞，尤其是相同的T细胞，从而具有协同地重激活耗竭T细胞的能力。
本发明具体实施方式
简介
本发明所述的抗体是双功能的，因为它们结合了特异性抗PD-1作用和与抗PD-1抗体融合的SIRPa的作用。实际上，本发明涉及包含抗PD-1抗体和SIRPa的双功能分子，所述蛋白SIRPa与所述抗PD-1抗体的多肽链(所述抗体的轻链或重链或两者或其任何片段)共价连接。将所述抗PD-1抗体或其片段的链和所述SIRPa制备为融合蛋白。在该特别的方面中，所述SIRPa的N-端末端，任选地通过肽接头，与所述抗PD-1抗体的链或其片段的C-端末端连接。
首先，强调在现有技术中已知SIRPa是抗SIRPa抗体的靶标。这些抗体阻断肿瘤细胞上的CD47与骨髓细胞上的SIRPa之间的相互作用，尤其是巨噬细胞；所述相互作用(在不同细胞之间的所谓的反式相互作用中)诱导巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用的抑制。相反，并不知道本发明所述的双功能蛋白(其包含SIRPa和针对T细胞上表达的配体(尤其是PD-1)的抗体)参与T细胞激活机制。
如具体解释和显示的，特别是本申请的实施例，以及如图12所示，本发明人已获得了出人意料地具有均靶向相同T细胞的强大优势的双功能SIRPa-抗PD-1分子的两者：
-T细胞上的PD-1：所述双功能SIRPa-抗PD-1分子的抗PD1抗体部分；和
-CD47(不是或不仅是肿瘤细胞上的CD47)：所述双功能SIRPa-抗PD-1分子的SIRPa部分。
这种对相同T细胞的双重靶向导致了以前未知的协同作用，如NFAT通路的补充激活所示。由于以下原因，这种能力特别令人感兴趣。
如本领域技术人员已知的，与T细胞耗竭相关，T细胞没有充分清除肿瘤细胞。在临床上使用抗PD-1治疗性化合物以通过抑制PD1-PDL1相互作用(T细胞上的PD1和肿瘤细胞上的PDL1)的抑制作用来激活T细胞。更准确地说，在患有癌症的人中观察到T细胞耗竭。例如，如Jiang,Y.,Li,Y.和Zhu,B(Cell Death Dis 6,e1792(2015))所述，肿瘤微环境中的耗竭T细胞显示过表达的抑制性受体，减少的效应细胞因子的产生和细胞溶解活性，导致癌症消除失败。恢复耗竭T细胞代表了癌症治疗的临床策略。肿瘤微环境中的大多数T细胞耗竭，导致癌症免疫逃避。PD-1是调节T细胞耗竭的主要抑制性受体，高PD-1表达的T细胞失去消除癌症的能力。抗PD-1抗体并不总是足够有效以允许“重”激活耗竭T细胞。因此，这是目前重要的医疗需求。本发明人已经表明，本文公开的双功能抗PD1-SIRPa分子相比于单独的抗PD-1或与SIRPa组合的抗PD-1增强了T细胞(特别是耗竭T细胞)的激活(NFAT介导的激活、钙释放)。特别是，抗PD1-SIRPa双功能分子诱导初始、部分耗竭T细胞亚群的增殖和激活，如细胞因子(例如IFNγ)分泌所反映的。这种抗hPD1-SIRPa双功能分子具有克服相关抗性机制并提高抗PD-1免疫疗法功效的能力。
申请人还表明，双功能抗PD1-SIRPa分子与表达i)PD1和ii)SIRPa受体的单个T细胞的相互作用导致NFAT通路(TCR信号传导)的意外激活，对T细胞(特别是耗竭T细胞)激活有积极作用，促进T细胞消除肿瘤细胞的能力。
这意味着，一方面，BICKI分子的SIRPa就像单独的SIRPa一样靶向SIRPa受体(CD47)，激活该通路；另一方面，BICKI分子的抗PD1部分阻断PD-1。双功能分子靶向相同细胞上的CD47和PD-1。这导致TCR(NFAT)信号传导的协同激活，这在使用单独的抗PD1抗体和SIRPa的组合(抗PD1和SIRPa作为两种单独的化合物施用)时从未观察到。例如，靶向PD-L1的双功能分子无法通过作用于相同细胞来提供这种激活。事实上，本领域已知PD-L1主要在肿瘤细胞上而不是在免疫细胞(如T细胞)上表达。
此外，已经在本发明的特别的人源化抗PD-1以及其他两种抗PD-1参照(即派姆单抗和纳武单抗)中观察到协同作用。双功能抗PD1-SIRPa分子的设计允许相对于其他CD47+细胞，倾向靶向CD47+PD-1+耗竭T细胞至少2倍。双功能抗PD1-SIRPa分子增强了抗PD1作用并强烈表明SIRPa与CD47的结合不仅阻断了“不要吃我”抑制性吞噬信号，而且令人惊讶地促进了CD47依赖性T细胞共刺激。最后，双功能抗PD1-SIRPa分子增强了T细胞向肿瘤微环境中的迁移，从而克服了由缺乏T细胞进入肿瘤微环境中而引起的与抗PD-1单药治疗相关的主要抗性机制之一。
本发明所述的双功能分子具有以下优点中的特定一个或多个：
-其保留其结合PD-1的能力，且在抗PD1抗体的人源化和嵌合形式之间没差异。
-其保留其结合CD47、SIRPa配体蛋白的能力。
-其拮抗PD-1/PD-L1和/或PD-1/PD-L2相互作用。
-其相比于单独的抗PD-1协同增强T细胞的激活(NFAT介导的激活和钙通量刺激)。
-其表现出刺激初始、激活和衰竭T细胞的增殖的协同作用。
-其表现出刺激T细胞分泌IFNg的协同作用。
-其增强T细胞的迁移。
-其表现出良好的线性药代动力学特征。
定义
为了更容易理解本发明，以下定义了某些术语。在整个具体实施方式中阐述了另外的定义。
除非另有定义，本文中使用的所有技术术语、符号和其他科学术语旨在具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或便于参考，本文定义具有普遍理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为代表与本领域通常理解的差异。此处描述或引用的技术和程序通常是本领域技术人员使用常规方法学充分理解和普遍采用的。
如本文所用，术语“信号调节性蛋白α”、“SIRPα”和“SIRPa”“是指受体型跨膜糖蛋白，其是CD47的哺乳动物免疫球蛋白样细胞表面受体。其特别是指，例如在SIRPa受体结合亲和力的标准生物测定或测定中，与野生型哺乳动物SIRPa具有实质性氨基酸序列同一性并具有基本相等的生物活性的SIRPa多肽、其衍生物和类似物。例如，SIRPa是指具有以下氨基酸序列的重组或非重组多肽的氨基酸序列：i)SIRPa多肽的天然或天然存在的等位基因变体，ii)SIRPa多肽的生物活性片段，iii)SIRPa多肽的生物活性多肽类似物，或iv)SIRPa多肽的生物活性变体。SIRPa可以包含其跨膜结构域和/或细胞质结构域或没有其跨膜结构域和/或细胞质结构域。所述SIRPa优选地包含其胞外结构域或由其胞外结构域组成。该分子的替代名称是“酪氨酸蛋白磷酸酶非受体型底物1”和“SHP底物1、“CD172抗原样家族成员A”、“p84”和“巨噬细胞融合受体”。优选地，术语“SIRP”是指人SIRPa。例如，所述人SIRPa氨基酸序列为约504个氨基酸并且具有NP_001035111.1、NP_001035112.1、NP_001317657.1或NP_542970.1的Genbank登录号。优选地，所述人SIRPa是同种型1。甚至更优选地，SIRPa基本上由上述序列的位置31-373的氨基酸(即其胞外结构域)组成。在UniProtKB-P78324中描述了所述人SIRPa。
如本文所用，术语“程序性死亡1”、“程序性细胞死亡1”、“PD1”、“PD-1”、“PDCD1”、“PD-1抗原”、“人PD-1”、“hPD-1”和“hPD-1”可以互换使用，其指程序性死亡-1受体，也称为CD279，并且包括人PD-1的变体和亚型，以及与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。PD-1是免疫应答阈值和外周免疫耐受的关键调节剂。其在激活的T细胞、B细胞、单核细胞和树突状细胞上表达，并与其配体PD-L1和PD-L2结合。人PD-1由PDCD1基因编码。举例而言，人PD-1的氨基酸序列在GenBank登录号NP_005009下公开。PD1具有四种在人类外周血单核细胞(PBMC)上表达的剪接变体。因此，PD-1蛋白包括全长PD-1，以及PD-1的替代剪接变体，如PD-1Aex2、PD-1Aex3、PD-1Aex2,3和PD-1Aex2,3,4。除非另有说明，否则术语包括天然由PBMC表达或由经PD-1基因转染的细胞表达的人PD-1的任何变体和亚型。
如本文所用，术语“抗体”描述了一种免疫球蛋白分子类型，并且以其最广泛的意义使用。特别地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，包含抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。除非特定地指出，否则术语“抗体”包括完整免疫球蛋白以及“抗体片段”或体抗原结合片段”(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其突变体、包含抗体部分的分子、双体、线性抗体、单链抗体和包含具有所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体。优选地，术语“抗体”指人源化抗体。
如本文所用，抗体的“抗原结合片段”指展现对PD-1的抗原结合能力的抗体的一部分，亦即与本发明的抗体的结构的一部分对应的分子，可能呈其天然形式；与对应四链抗体的抗原结合特异性相比，此类片段尤其显示相同或基本上相同的对该抗原的抗原结合特异性。有利地，抗原结合片段具有与对应4链抗体类似的结合亲和性。然而，相对于相应的4链抗体具有降低的抗原结合亲和性的抗原结合片段也包括在本发明内。抗原结合能力可以通过测量抗体与目标片段之间的亲和性来确定。也可以将这些抗原结合片段称为抗体的“功能性片段”。抗体的抗原结合片段是包含其被称为CDR(互补决定区)或其包含抗原识别位点(即，PD1的胞外域)的部分的高变结构域的片段，从而定义抗原识别特异性。
“Fab”片段包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab')片段是通过在F(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处切割二硫键而产生的。抗体片段的其他化学偶联是本领域普通技术人员公知的。Fab和F(ab')2片段缺乏完整抗体的Fc片段，从动物循环中清除得更快，并且可能比完整抗体具有更少的非特异性组织结合(参见例如Wahl等，1983,J.Nucl.Med.24:316)。
“Fv”片段是包含完整靶点识别和结合位点的抗体的最小片段。该区域由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域紧密非共价结合的二聚体组成(VH-VL二聚体)。正是在这种构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以定义VH-VL二聚体表面上的靶点结合位点。通常，六个CDR赋予抗体靶向结合特异性。然而，在一些情况下，即使单个可变结构域(或仅包含对靶点特异的三个CDR的Fv的一半)也可以具有识别和结合靶点的能力，尽管亲和性低于整个结合位点。
“单链Fv”或“scFv”抗体结合片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，其使得scFv能够形成用于靶点结合的所需结构。
“单结构域抗体”由对PD-1表现出足够亲和性的单个VH或VL结构域组成。在一个特定实施方式中，单结构域抗体是骆驼源化抗体(参见，例如，Riechmann,1999,Journal ofImmunological Methods231:25-38)。
就结构而言，抗体可具有通过二硫键互相连接的重链(H)和轻链(L)。有两种类型的轻链λ(λ)和κ(κ)。各重链和轻链包含恒定区和可变区(“结构域”)。轻链和重链可变区包含被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)中断的“框架”区。已定义了框架区和CDR的范围(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，和U.S.Department of Health and Human Services,1991，其通过引用并入本文)。优选地，CDR根据Kabat方法定义。框架区起到形成支架的作用，通过链间非共价相互作用将CDR定位在正确的方向上。CDR主要负责结合抗原表位。每条链的CDR通常称为“互补决定区1”或“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”，从N末端开始依次编号。根据本发明的抗体的VL和VH结构域可以包含四个框架区或“FR”，其在本领域中和本文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“FR2”、“FR3”和“FR4”。这些框架区和互补决定区优选按以下顺序可操作地连接：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(从氨基末端到羧基末端)。如本文所用，术语“抗体框架”指所述可变结构域中的部分(VL和/或VH)，其作为该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。
如本文所用，“抗体重链”指抗体构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种。抗体重链的CDR通常称为“HCDR1”、“HCDR2”和“HCDR3”。抗体重链的框架区通常称为“HFR1”、“HFR2”、“HFR3”和“HFR4”。
如本文所用，“抗体轻链”指抗体构象中存在的两种类型多肽链中较小的一种，κ和λ轻链指两种主要抗体的轻链同种型。抗体轻链的CDR通常称为“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”。抗体轻链的框架区通常称为“LFR1”、“LFR2”、“LFR3”和“LFR4”。
关于抗体与靶分子的结合，术语“结合(bind/binding)”指识别和接触抗原的肽、多肽、蛋白、融合蛋白、分子和抗体(包括抗体片段)。优选地，其指抗原-抗体类型相互作用。术语“特异性结合”、“特异性结合至”、“特异性针对”、“选择性结合”和“选择性针对”特定抗原(例如，PD-1)或特定抗原(例如，PD-1)上的表位"指抗体识别和结合特定抗原，但基本上不识别或结合样品中的其他分子。例如，特异性(或优先)结合至PD-1或PD-1表位的抗体是结合该PD-1表位的抗体，例如，以比结合至其他PD-1表位或非PD-1表位更高的亲和性、亲合力、更容易和/或更长的持续时间。优选地，术语“特异性结合”指抗体和抗原之间以等于或低于10-7M的结合亲和性接触。在某些方面中，抗体以等于或低于10-8M、10-9M或10-10M的亲和性结合。
如本文所用，“PD-1抗体”、“抗PD-1抗体”、“PD-1Ab”、“PD-1特异性抗体”或“抗PD-1Ab”可以互换使用，并且指如本文所述的与PD-1(特别是人PD-1)特异性结合的抗体。在一些实施方式中，抗体结合至PD-1的胞外域。特别地，抗PD-1抗体是能够结合至PD-1抗原的抗体，并抑制PD-1介导的信号传导通路，从而增强免疫应答，如T细胞激活。
如本文所用，术语“双功能分子”、“双功能化合物”、“双功能蛋白”、“Bicki”、“Bicki抗体”、“双功能抗体”和“双功能检查点抑制剂分子”具有相同含义并可互换使用。这些术语是指通过包含至少一个对一个抗原具有特异性的区域(例如来源于抗体的可变区)和至少为多肽的第二区域来识别该抗原的抗体。更具体地，所述双功能分子是抗体或其部分的融合蛋白，优选其抗原结合片段与另一多肽或其多肽片段。
如本文所用，术语“嵌合抗体”指抗体或抗原结合片段，其重链和/或轻链中的一部分来源于一个物种，而所述重链和/或所述轻链的其余部分来源于不同的物种。在说明性实例中，所述嵌合抗体可包含来源于人的恒定区和来源于非人物种(例如小鼠)的可变区。
如本文所用，术语“人源化抗体”旨在指其中来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列的抗体(例如，包含来源于非人抗体的最少序列的嵌合抗体)。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”还指已经历人源化的抗体。人源化抗体通常是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中一个或多个CDR的残基被非人抗体(供体抗体)的至少一个CDR的残基置换，同时保持所需的特异性、亲和性和原始抗体的能力。供体抗体可以是任何适宜的非人抗体，如具有所需特异性、亲和性或生物学效应的小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类抗体。在一些情况下，受体抗体的选定框架区残基被来自供体抗体的框架区残基替代。或者，共同抗体的选定框架区残基被来自人或人源化抗体的框架区残基替代。可以在人框架序列内进行另外的框架区修饰。因此，人源化抗体还可以包含在受体抗体或供体抗体中均未发现的残基。可以进行此类氨基酸修饰以进一步完善抗体功能和/或增加人源化过程。本文中“氨基酸改变”或“氨基酸修饰”指在多肽的氨基酸序列中的改变。“氨基酸修饰”包括在多肽序列中的置换、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸置换”或“置换”是指用另一个氨基酸置换亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。“氨基酸插入”或“插入”是指在亲本多肽序列中的特定位置添加氨基酸。“氨基酸缺失”或“缺失”是指在亲本多肽序列中的特定位置除去氨基酸。氨基酸置换可以是保守的。保守性置换是给定的氨基酸残基被具有类似化学性质(例如，电荷、体积和/或疏水性)的侧链(“疏水基团”)的另一个残基置换。如本文所用，“氨基酸位置”或“氨基酸位置编号”可以互换使用，并且指在氨基酸序列中特定氨基酸的位置，通常用氨基酸的单字母代码指定。氨基酸序列中的第一个氨基酸(即，从N-端开始)应被视为具有位置1。
保守性置换是给定的氨基酸残基被具有类似化学性质(例如，电荷、体积和/或疏水性)的侧链(“R-基团”)的另一个残基置换。在通常情况下，保守性氨基酸置换将基本上不改变蛋白的功能性性质。保守性置换和相应规则在现有技术中有很好的描述。例如，保守性置换可以通过下表中反映的氨基酸组内的置换来定义：
表A–氨基酸残基
氨基酸基团 氨基酸残基
酸性残基 ASP和GLU
碱性残基 LYS、ARG和HIS
亲水性不带电残基 SER、THR、ASN和GLN
脂肪族不带电残基 GLY、ALA、VAL、LEU和ILE
非极性不带电残基 CYS、MET和PRO
芳香族残基 PHE、TYR和TRP
表B-替代保守性氨基酸残基置换组
1 丙氨酸(A) 丝氨酸(S) Thre苏氨酸(T)
2 天冬氨酸(D) 谷氨酸(E)
3 天冬酰胺(N) 谷氨酰胺(Q)
4 精氨酸(R) 赖氨酸(K)
5 异亮氨酸(I) 亮氨酸(L) 甲硫氨酸(M)
6 苯丙氨酸(F) 酪氨酸(Y) 色氨酸(W)
表C–氨基酸残基的其他替代物理和功能分类
Figure BDA0003225628970000221
如本文所用，“分离的抗体”是从其自然环境的组分中分离和/或回收的抗体。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为不存在抗体自然环境的至少一种组分。在一些实施方式中，如通过例如电泳(例如，SDS-PAG、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)在还原或非还原条件下所确定的，抗体纯化至同质性和/或纯度90％、95％或99％。
如本文所用，术语“来源于(derive from/derived from)”指具有来源于母体化合物或蛋白结构的结构的化合物，并且其结构与本文公开的那些足够相似并且基于该相似性，本领域技术人员将预期其表现出与要求保护的化合物相同或相似的性质、活性和效用。例如，来源于小鼠抗体的人源化抗体指与该小鼠抗体共享相似性质，例如，识别相同表位、共享具有参与和/或增加抗体人源化的修饰的残基的相似VH和VL的抗体或抗体片段。
术语“治疗”指旨在改善患者健康状况的任何行为，如疾病或疾病症状的治疗、预防、预防和延缓。其指的是对疾病的治愈性治疗和/或预防性治疗。治愈性治疗被定义为导致治愈的治疗或减轻、改善和/或消除、减轻和/或稳定疾病或疾病的症状或其直接或间接引起的痛苦的治疗。预防性治疗包括导致疾病预防的治疗和减少和/或延迟疾病的进展和/或发生或其发生的风险的治疗。在某些实施方式中，该术语是指改善或根除疾病、病症、感染或与之相关的症状。在其他实施方式中，该术语指最小化癌症的播散或恶化。根据本发明的治疗不一定意味着100％或完全治疗。相反，存在不同程度的治疗，其中本领域普通技术人员认为具有潜在获益或治疗效果。优选地，术语“治疗”指将包含一种或多种活性剂的组合物应用或施用给患有病症/疾病的受试者，例如与由PD-1介导的信号传导通路相关的病症/疾病。
如本文所用，术语“病症”或“疾病”是指由于遗传或发育错误、感染、毒物、营养缺乏或失衡、毒性或不利环境因素的影响而导致身体功能不正常的器官、部分、结构或系统。优选地，这些术语指监控病症或疾病，例如，破坏正常身体或精神功能的疾病。更优选地，术语病症指影响动物和/或人的免疫和/或炎症疾病，如癌症。
如本文所用，术语“免疫疾病”指受试者的病况，其特征在于由受试者对其自身细胞、组织和/或器官的免疫应答引起的细胞、组织和/或器官损伤。术语“炎症疾病”指受试者中以炎症(例如，慢性炎症)为特征的病况。自身免疫性病症可能与炎症相关，也可能无关。据此，炎症可能是也可能不是由自身免疫性病症引起的。
如本文所用，术语“癌症”定义为特征在于异常细胞的快速且不受控制的生长的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。
如本文所用，术语“与PD-1相关联或相关的疾病”、“PD-1阳性癌症”或“PD-1阳性感染性疾病”旨在指由PD-1表达引起或具有PD-1表达的症状和/或特征的癌症或感染性疾病(例如，由病毒和/或细菌引起)，即，由PD-1表达或活性增加或减少引起、引起加重或与其相关的任何病况。
如本文所用，术语“受试者”、“宿主”、“个体”或“患者”指人，包括成人或儿童。
如本文所用，“药物组合物”指一种或多种活性剂的制剂，如包含根据本发明所述的双功能分子与任选地其他化学组分，如生理学上适宜的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进将活性剂施用于生物体。本发明的组合物可以是适合于任何常规给药途径或使用的形式。在一个实施方式中，“组合物”通常指活性剂(例如，化合物或组合物)与天然存在或非天然存在的载体的组合，所述载体是惰性的(例如，检测剂或标签)或活性的，如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等，并且包括药学上可接受的载体。如本文所指，“可接受的载剂”或“可接受的载体”是本领域技术人员公知的可用于配制药物组合物的任何已知化合物或化合物的组合。
如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”指单独或与一种或多种其他活性剂组合，赋予受试者治疗作用所需的活性剂的量，例如，治疗目标疾病或病症或产生所需作用所需的活性剂的量。“有效量”将根据以下而改变：一种或多种药剂、疾病及其严重程度、待治疗的受试者的特征，包括年龄、身体状态、体格、性别和体重、治疗持续时间、伴随疗法的性质(如果有的话)、具体的施用途径以及健康从业者知识和专业知识范围内的类似因素。这些因素是本领域普通技术人员众所周知的，并且可以通过常规实验解决。通常优选使用单个组分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。
如本文所用，术语“药物”指具有治愈或预防病症或疾病的性质的任何物质或组合物。
如本文所用，术语“联合”指使用一种以上的疗法(例如，预防剂和/或治疗剂)。术语“联合”的使用不限制向患有疾病或病症的受试者施用疗法(例如，预防剂和/或治疗剂)的顺序。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸序列”是等同的，并且指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，例如RNA或DNA或其类似物。本发明的核酸(例如，核酸的组分或部分)可以是天然存在的、经修饰或经工程化的、分离的和/或非天然的。工程化的核酸包括重组核酸和合成核酸。“编码抗PD1抗体的分离的核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或单独载体中的此类一个或多个核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类一个或多个核酸分子。如本文所用，术语“核酸构建体”、“质粒”和“载体”是等同的，并且指用于将诸如DNA或RNA的乘客核酸序列转移至宿主细胞中的核酸分子。
如本文所用，术语“宿主细胞”旨在包括可以是或已经是载体、外源性核酸分子和编码本发明抗体构建体的多核苷酸的任何个体细胞或细胞培养物；和/或抗体构建体本身的受体。可通过转化、转染等方式将相应材料引入细胞。术语“宿主细胞”还旨在包括单个细胞的后代或可能后代。宿主细胞包括例如细菌、微生物、植物和动物细胞。
如本文所用，“免疫细胞”指与先天性免疫和适应性免疫相关的细胞，例如，比如来源于骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞)、淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和自然杀伤T细胞(NKT)和髓系来源的细胞(中性粒细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。特别地，免疫细胞可以在包含B细胞、T细胞、特别是CD4+T细胞和CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞、APC细胞、树突状细胞和单核细胞的非详尽性列表中选择。如本文所用，“T细胞”包括例如CD4+T细胞、CD8+T细胞、T辅助1型T细胞、T辅助2型T细胞、T辅助17型T细胞和抑制性T细胞。
如本文所用，术语“T效应细胞”、“T eff”或“效应细胞”描述了一组免疫细胞，其包括若干种对刺激(例如共刺激)积极应答的T细胞类型。其特别包括具有消除抗原功能的T细胞(例如，通过产生调节其他细胞激活的细胞因子或通过细胞毒性活性)。其尤其包括CD4+、CD8+、Treg细胞、细胞毒性T细胞和辅助性T细胞(Th1和Th2)。
如本文所用，术语“调节性T细胞”、“Treg细胞”或“Treg”指调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性和预防自身免疫疾病的T细胞亚群体。Treg具有免疫抑制作用，通常抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖。Treg表达生物标志物CD4、FOXP3和CD25，并且被认为来源于与初始CD4细胞相同的谱系。
术语“耗竭T细胞”指处于功能障碍状态(即“耗竭”)的T细胞群体。T细胞耗竭通过功能的逐渐丧失、转录谱的变化和抑制性受体的持续表达来表征。耗竭T细胞失去其细胞因子产生能力、其高增殖能力和其细胞毒性潜力，最终导致其缺失。耗竭T细胞通常指示较高的CD43、CD69和抑制性受体水平与较低的CD62L和CD127表达的组合。
术语“免疫应答”指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由以上细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)对侵入病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或在自身免疫性或病理性炎症的情况下正常人类细胞或组织进行选择性损害、破坏或使其从人体消除的作用。
如本文所用，术语“拮抗剂”指阻断或降低另一种物质的活性或功能的物质。特别地，该术语指作为参考物质(例如，PD-L1和/或PD-L2)的细胞受体(例如，PD-1)结合的抗体，阻止其产生全部或部分通常的生物学效应(例如，建立免疫抑制性微环境)。可以通过竞争性ELISA评估根据本发明所述的抗体的拮抗剂活性。
如本文所用，术语“分离的”表示所述材料(例如，抗体、多肽、核酸等)与其在自然界中一起存在的其他材料基本上分离或相对于其他材料富集。特别地，“分离的”抗体是一种已经从自然环境的组分鉴别出并分离和/或回收的抗体。例如，分离的抗体被纯化(1)通过Lowry法测定的大于75％的抗体重量，或(2)在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE纯化。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为将不存在抗体自然环境的至少一种组分。然而，通常分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。
如本文所用，术语“和/或”将被视为两个特定特征或组分中的每一个的具体公开，其中包含或不包含另一个。例如，“A和/或BA将被视为(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开，就好像每一个都是单独列出的一样。
术语“一个/一种(a/an)”可以指其修饰的要素中的一个或多个(例如，“一种试剂”可以表示一种或多种试剂)，除非上下文清楚地描述了要素的一个或多个要素。
如本文所用，联合任何和所有值(包括数值范围的下限和上限)的术语“约”指具有高达+/-10％偏差的可接受范围的任何值(例如，+/-0.5％、+/-1％、+/-1.5％、+/-2％、+/-2.5％、+/-3％、+/-3.5％、+/-4％、+/-4.5％、+/-5％、+/-5.5％、+/-6％、+/-6.5％、+/-7％、+/-7.5％、+/-8％、+/-8.5％、+/-9％、+/-9.5％)。在一串值开头的术语“约”的使用修饰所述值的每一个(即，“约1、2和3”指约1、约2和约3)。此外，当本文所述的是值的列表(例如，约50％、60％、70％、80％、85％或86％)使，所述列表包括其所有中间值和分数值(例如，54％、85.4％)。
抗PD-1抗体
根据本发明所述的双功能分子包含第一实体，所述第一实体包含抗hPD-1抗体或其抗原结合片段。
本文提供了一种特别地结合至人PD-1的抗体。在一些方面中，抗体特异性结合至人PD-1，优选人PD-1的胞外结构域。在一些方面中，抗体选择性结合至全长人PD-1、PD-1Aex2、PD-1Aex3、PD-1Aex2,3和PD-1Aex2,3,4的一个或多个。
在一些方面中，抗PD1抗体是分离的抗体，特别是非天然的分离的抗体。此类分离的抗PD1抗体可以通过至少一个纯化步骤制备。在一些实施方式中，分离的抗PD1抗体纯化至以重量计至少80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方式中，分离的抗PD1分离抗体以包含以重量计至少85％、90％、95％、98％、99％至100％抗体的溶液提供，所述重量的其余部分包含溶解在溶剂中的其他溶质的重量。
优选地，此类抗体具有阻断或抑制PD-1与至少一种其配体(例如，PD-L1和/或PD-L2)之间的相互作用。如本文所用，“阻断结合”或“阻断相互作用”或“抑制相互作用”的能力指抗体或抗原结合片段阻止两个分子(例如，PD-1和其配体PD-L1和/或PD-L2)之间的结合相互作用至任何可检测程度的能力。
优选地，所述抗PD1抗体或其抗原结合片段是人PD-L1和/或PD-L2结合至人PD-1的拮抗剂，更优选地人PD-L1和PD-L2结合至PD-1的拮抗剂。
在某些实施方式中，所述抗hPD1抗体或其抗原结合片段抑制PD-1和至少一种其配体(例如，PD-L1和/或PD-L2，优选地PD-L1和PD-L2)之间的结合相互作用至少50％。在某些实施方式中，该抑制可以大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。
根据本发明所述的抗hPD1抗体可以包含任何类别的免疫球蛋白(例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类))，包含来源于靶向人PD-1的非人(例如，小鼠)免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或抗体的其他抗原结合子序列)。优选地，根据本发明所述的抗hPD-1抗体来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，优选地来源于IgG4或IgG1。
在一个实施方式中，抗体的抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述轻链包含可变结构域，所述可变结构域包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；和重链恒定结构域的片段。对于重链恒定结构域的片段，应理解抗原结合片段因此包含完整的重链恒定结构域中的至少一部分。例如，重链恒定结构域可包含重链的至少CH1结构域、或重链的至少CH1和CH2结构域、或重链的至少CH1、CH2和CH3结构域，或者由重链的至少CH1结构域、或重链的至少CH1和CH2结构域、或重链的至少CH1、CH2和CH3结构域组成。重链恒定结构域的片段也可定义为包含所述重链的Fc结构域中的至少一部分。因此，抗体的抗原结合片段包含完整的抗体的Fab部分、完整的抗体的F(ab’)2部分、完整的抗体的Fab’部分。所述重链恒定结构域还可以包含完整的重链恒定结构域或由完整的重链恒定结构域组成，例如在本说明书中说明的，其中描述了若干个完整的重链恒定结构域。在本发明的一个特别的实施方式中，并且当抗体的抗原结合片段包含重链恒定结构域(所述重链恒定结构域包含完整的重链恒定结构域中的一部分或由完整的重链恒定结构域中的一部分组成)的片段时，所述重链恒定结构域片段可以由至少10个氨基酸残基组成；或者可以由10至300个氨基酸残基、特别地210个氨基酸残基组成。
优选地，针对人PD-1的抗体是单克隆抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即构成群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位。优选地，此类单克隆抗体(mAb)来自哺乳动物，例如小鼠、啮齿动物、兔、山羊、灵长类动物、非人灵长类动物或人。制备此类单克隆抗体的技术可以在例如Stites等(编著)，BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(第4版)，Lange Medical Publications,Los Altos,CA，以及其中引用的参考文献；Harlow和Lane(1988)，ANTIBODIES:ALABORATORY MANUAL CSHPress；Goding(1986)MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND PRACTICE(第2版)，Academic Press,New York,NY中找到。
在一个实施方式中，所述抗PD1抗体可以选自如WO2006/121168中描述的派姆单抗(Keytruda-MK-3475)，纳武单抗(Opdivo,MDX-1106,BMS-936558,ONO-4538)，匹地利珠单抗(CT-011)，西米普利单抗(Libtayo)，单克隆抗体5C4、17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4。
在一些实施方式中，本文提供的抗PD1抗体是分离的抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗PD1抗体是嵌合抗体。在一个实例中，所述嵌合抗体包含非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如猴)的可变区)和人恒定区。在另一实例中，所述嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已从亲本抗体的类别或亚类改变。所述嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗hPD1抗体是人源化抗体。人源化抗体通常包含一个或多个可变结构域，其中CDR(或其部分)来源于非人抗体，并且FR(或其部分)来源于人或人源化抗体序列。或者，可以替换一些FR残基以恢复或改善抗体特异性、亲和力和/或人源化。人源化抗体任选地还将包含人或人源化恒定区(Fc)中的至少一部分。抗体人源化的方法是本领域中众所周知的，参见例如Winter和Milstein,Nature,1991,349:293-299；Riechmann等，Nature，332，第323页(1988)；Verhoeyen等，Science，239，第1534页(1988)，Rader等,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,1998,95:8910-8915；Steinberger等，J.Biol.Chem.,2000,275:36073-36078；Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1989,86:10029-10033；Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633；Kashmiri,S.V.等，Methods 36(2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua,W.F.等，Methods 36(2005)43-60(描述“FR重排”)；和Osbourn,J.等，Methods 36(2005)61-68；和Klimka,A.等，Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述FR重排的“引导选择”方法)；和美国专利号5,585,089,5,693,761,5,693,762,5,821,337、,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；和6,180,370。
优选地，针对人PD-1的所述人源化抗体是单克隆抗体。
特别地，人源化抗体是具有至少80％或至少85％、更优选地至少88％、甚至更优选地至少90％的T20人源性评分，最优选地包含在85％和95％之间、优选地在88％和92％之间的T20人源性评分的人源化抗体。
如Gao S H、Huang K、Tu H、Adler A S.，BMC Biotechnology 2013:13:55中所述，通常使用T20评分分析仪来测量“人源性”以定量单克隆抗体可变区的人源性。T20人源性评分是抗体人源化领域中常用的参数，其由Gao等(BMC Biotechnol.,2013,13,55)首先公开。T20人源性评分通常用于在专利申请(例如，WO15161311、WO17127664、WO18136626、WO18190719、WO19060750或WO19170677)中定义人源化抗体的专利申请。
提供基于网络的工具，使用T20截止值人数据库http://abAnalyzer.lakepharma.com计算抗体序列的T20评分。在计算T20评分的过程中，首先给输入VH、VK或VL可变区蛋白序列分配Kabat编号，并鉴定CDR残基。使用blastp蛋白-蛋白BLAST算法比较全长序列或仅框架序列(已除去CDR残基)与相应抗体数据库中的每个序列。分离各配对比较之间的序列同一性，并在分析完数据库中的每个序列之后，基于与输入序列的序列同一性将序列从高到低排序。对前20个匹配序列的同一性百分比取平均值，以获得T20评分。
对于“全人类数据库”中的每种链类型(VH、VK、VL)和序列长度(全长或仅框架)，使用T20评分分析仪用各抗体序列的相应数据库对其进行评分。在排除输入序列本身之后获得前20个匹配序列的T20评分(因为序列1始终是输入抗体本身，所以对序列2至21的同一性百分比取平均值)。将各组的T20评分从高到低排序。对于大部分序列而言，评分减少大致上是线性的；然而，最后～15％抗体的T20评分开始急剧下降。因此，除去最后15％的序列，并使剩余序列形成T20截止值人数据库，其中T20评分截止值表明在新数据库中序列的最低T20评分。
因此，包含于所述双功能分子中的根据本发明所述的人源化抗PD1抗体具有至少80％或至少85％、更优选地至少88％、甚至更优选地至少90％的T20人源化评分，最优选地介于85％与95％之间、优选地88％与92％之间的T20人源化评分。
在一个实施方式中，所述抗PD1抗体可以选自派姆单抗(也称为Keytruda兰博利珠单抗，MK-3475)，纳武单抗(Opdivo,MDX-1106,BMS-936558,ONO-4538)，匹地利珠单抗(CT-011)，西米普利单抗(Libtayo)，西米普利单抗，AUNP12，AMP-224，AGEN-2034，BGB-A317(替雷利珠单抗)，PDR001(斯帕利珠单抗)，MK-3477，SCH-900475，PF-06801591，JNJ-63723283，吉诺珠单抗(CBT-501)，LZM-009，BCD-100，SHR-1201，BAT-1306，AK-103(HX-008)，MEDI-0680(也称为AMP-514)MEDI0608，JS001(参见Si-Yang Liu等，J.Hematol.Oncol.10:136(2017))，BI-754091，CBT-501，INCSHR1210(也称为SHR-1210)，TSR-042(也称为ANB011)，GLS-010(也称为WBP3055)，AM-0001(Armo)，STI-1110(参见WO 2014/194302)，AGEN2034(参见WO 2017/040790)，MGA012(参见WO 2017/19846)，或IBI308(参见WO 2017/024465、WO2017/025016、WO 2017/132825和WO 2017/133540)，描述于WO 2006/121168中的单克隆抗体5C4、17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4。还已知靶向PD-1的双功能或双特异性分子，例如RG7769(Roche)、mAb20717(Xencor)、MEDI5752(AstraZeneca)、FS118(F-star)、SL-279252(Takeda)和XmAb23104(Xencor)。
在一个特定的实施方式中，所述抗PD1抗体可以是派姆单抗(也称为Keytruda兰博利珠单抗，MK-3475)或纳武单抗(Opdivo，MDX-1106，BMS-936558，ONO-4538)。
人源化抗hPD1抗体的一个具体实例在下文中通过其CDR、框架区以及Fc和铰链区来描述。
CDR
“互补决定区”或“CDR”是本领域公知的，指抗体可变区内氨基酸的不连续序列，其赋予抗原特异性和结合亲和性。给定CDR的准确氨基酸序列边界使用多种众所周知方案的任何一种能够容易地确定，包括Kabat等，(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest第5版(1991)“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等，1997,J.Mol.Biol,273:927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等，1996,J.Mol.Biol.262:732-745(“Contact”编号方案)；Lefranc等，Dev.Comp.Immunol.,2003,27:55-77(“IMGT”编号方案)；和Honegge和Pluckthun,J.Mol.Biol,2001,309:657-70(“AHo”编号方案)所述的那些。除非另有说明，否则用于标识本文中特定CDR的编号方案是Kabat编号方案。
在一个实施方式中，所述双功能分子包含人源化抗hPD-1抗体或其抗原结合片段。所述人源化抗体的CDR区可以来源于小鼠抗体并且已经优化以i)提供具有非常高的人源化水平(优于85％)的安全人源化抗体；并ii)提高抗体特性，尤其是在哺乳动物细胞中生产时更高的可制备性和在哺乳动物细胞(例如COS和HCO细胞)中的更高的产量及更高的生产产量，同时保留拮抗剂活性(即对人PD-L1与人PD-1结合的抑制)，因为它们对人PD-1的结合亲和力(KD)小于10-7M，优选地小于10-8M。
在一个非常特别的实施方式中，所述双功能分子包含抗人PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含：
(i)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变结构域，和
(ii)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变结构域，
其中：
-所述重链CDR1(HCDR1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个置换、添加、缺失及其任何组合的修饰；
-所述重链CDR2(HCDR2)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个置换、添加、缺失及其任何组合的修饰；
-所述重链CDR3(HCDR3)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成，其中X1是D或E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N、E；任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:3的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；
-所述轻链CDR1(LCDR1)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成，其中X是G或T，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:12的位置10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；并且
-所述轻链CDR2(LCDR2)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰任何组合；和
-所述轻链CDR3(LCDR3)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:16的位置1和6之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰。
在另一个实施方式中，所述双功能分子包含人源化抗hPD-1抗体或其抗原结合片段，其包含如上指定的HCDR1、HCDR2、LCDR2和LCDR3；所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成，其中X1是D，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N、E；或者X1是E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N、E和S；任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:3的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成，其中X是G或T，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:12的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰。
在另一个实施方式中，所述双功能分子包含人源化抗hPD-1抗体或其抗原结合片段，其包含如上指定的HCDR1、HCDR2、LCDR2和LCDR3，和
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10或11的氨基酸序列或由SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10或11的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10或11的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和
-所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQID NO:13或SEQ ID NO:14的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰。
在另一个实施方式中，所述双功能分子包含人源化抗-hPD-1抗体或其抗原结合片段，其包含如上指定的HCDR1、HCDR2、LCDR2和LCDR3，和
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:4的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:13的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:5的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:13的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:6的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:13的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:7的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:13的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:8的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:13的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:9的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:13的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:10的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:13的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:11的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:13的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:4的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失的修饰及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:14的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:5的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:14的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:6的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:14的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:7的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:14的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:8的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:14的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:9的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:14的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:10的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:14的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
-所述重链CDR3(HCDR3)，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:11的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和所述轻链CDR1(LCDR1)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:14的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰。
在特别的方面中，所述修饰是置换，特别是保守置换。
在一个实施方式中，所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:3的CDR3，其中X1是D或E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N和E；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:12的CDR1(其中X是G或T)、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3。
在一个实施方式中，所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:3的CDR3，其中X1是D，并且X2选自T、H、A、Y、N和E，优选地选自H、A、Y、N和E；或其中X1是E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N、E和S；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:12的CDR1(其中X是G或T)、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3。
在一个实施方式中，所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:3的CDR3，其中X1是D，并且X2选自T、H、A、Y、N和E，优选地选自H、A、Y、N和E；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:12的CDR1(其中X是G或T)、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3。
在一个实施方式中，所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:3的CDR3，其中X1是E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N、E和S；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:12的CDRl(其中X是G或T)、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3。
在另一个实施方式中，所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含以下或基本上由以下组成：(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10或11的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的CDR1、SEQ IDNO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3。
在另一个实施方式中，所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含以下或基本上由以下组成
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:4的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:13的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3；或者
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:5的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:13的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3；或者
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:6的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:13的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3；或者
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:7的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:13的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3；或者
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:8的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:13的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3；或者
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:9的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:13的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3；或者
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:10的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:13的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3；或者
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:11的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:13的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3；或者
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:4的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:14的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3；或者
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:5的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:14的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3；或者
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:6的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:14的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3；或者
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:7的CDR3；(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:14的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3；或者
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:8的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:14的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3；或者
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:9的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:14的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3；或者
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:10的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:14的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3；或者
(i)重链，其包含SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:11的CDR3；和(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:14的CDR1、SEQ ID NO:15的CDR2和SEQ ID NO:16的CDR3。
框架
在一个实施方式中，根据本发明所述的抗PD1抗体或抗原结合片段包含框架区，特别是重链可变区框架区(HER)HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，以及轻链可变区框架区(LFR)LFR1、LFR2、LFR3和LFR4。
优选地，根据本发明所述的抗PD1抗体或抗原结合片段包含人或人源化框架区。出于本文目的的“人受体框架”是包含来源于如以下所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架。来源于人免疫球蛋白框架或人共有框架的人受体框架可以包含其相同氨基酸序列，或其可以包含氨基酸序列变化。在一些实施方式中，氨基酸变化的数量是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少或者2个或更少。在一些实施方式中，VL受体人框架在序列上等同于VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列。“人共有框架”是代表一系列人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常出现的氨基酸残基的框架。
特别地，抗PD1抗体或抗原结合片段包含重链可变区框架区(HFR)HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，其分别包含SEQ ID NO:41、42、43和44的氨基酸序列，其任选地具有一个、两个或三个选自HFR3(即，SEQ ID NO:43)的位置27、29和32之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰。优选地，抗PD1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:41的HFR1、SEQ ID NO:42的HFR2、SEQ ID NO:43的HFR3和SEQ ID NO:44的HFR4。
或者或另外地，抗PD1抗体或抗原结合片段包含轻链可变区框架区(LFR)LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，其分别包含SEQ ID NO:45、46、47和48的氨基酸序列，其任选地具有一个、两个或三个选自一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰。优选地，人源化抗PD1抗体或抗原结合片段包含SEQ ID NO:45的LFR1、SEQ ID NO:46的LFR2、SEQ ID NO:47的LFR3和SEQ ID NO:48的LFR4。
VH-VL
根据本发明所述的抗hPD1抗体的VL和VH结构域可以包含被三个互补决定区中断的四个框架区，优选按以下顺序可操作地连接：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(从氨基末端到羧基末端)。
在第一实施方式中，包含于双功能分子中的抗人PD-1人源化抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成，其中X1是D或E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N和E；其任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:17的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；
(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成，其中X是G或T，其任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:26的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰。
在第二实施方式中，包含于所述双功能分子中的所述抗人PD-1人源化抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由其SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成，其中X1是D，并且X2选自T、H、A、Y、N，E，优选地选自H、A、Y、N、E；或者X1是E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N、E和S；任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:17的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；
(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成，其中X是G或T，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:26的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰。
在第三实施方式中，包含于所述双功能分子中的所述抗人PD-1人源化抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成，其中X1是E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N、E和S；任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:17的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；
(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成，其中X是G或T，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:26的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰。
在另一个实施方式中，包含于所述双功能分子中的所述抗人PD-1人源化抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24或25的氨基酸序列或由SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24或25的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个分别选自SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24或25的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；
(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由SEQID NO:27或SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ IDNO:27或SEQ ID NO:28的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰。
在另一个实施方式中，包含于所述双功能分子中的所述抗人PD-1人源化抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:18的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:27的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的置一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:19的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:27的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:20的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:27的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:21的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:27的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:22的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:27的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:23的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:27的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:24的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:27的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:25的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:27的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列或由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:18的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:28的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:19的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:28的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:20的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:28的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:21的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:28的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:22的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:28的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:23的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:28的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列或由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:24的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:28的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:25的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:28的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰。
在特别的方面中，所述修饰是置换，特别是保守置换。
CH-CL
在一个实施方式中，所述重链(CH)和轻链(CL)包含如上所述的VL和VH序列。
在特别的实施方式中，包含于所述双功能分子中的所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35或36的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35或36的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个分别选自SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35或36的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由SEQ ID NO:37或SEQ IDNO:38的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰。
在另一个实施方式中，包含于所述双功能分子中的所述抗人PD-1人源化抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:29的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:29的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:37的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:30的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:30的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:30的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:37的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:31的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成，其任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:31的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成，其任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:37的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:32的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成，其任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:32的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成，其任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:37的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:33的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:37的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:34的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:34的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:37的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:35的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:35的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:35的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:37的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:36的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:36的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:37的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:29的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:29的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:38的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:30的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:30的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:30的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:38的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:31的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:31的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:38的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:32的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:32的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:38的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:33的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:33的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:38的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:34的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:34的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:38的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:35的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:35的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:35的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:38的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；或者
(a)重链，其包含选自SEQ ID NO:36的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:36的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)轻链，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:38的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰。
优选地，所述修饰是置换，特别是保守置换。
Fc和铰链区
几项开发治疗性抗体的研究导致对Fc区进行工程化，以优化抗体特性，从而生成更适合其所需药理学活性的分子。抗体的Fc区介导其血清半衰期和效应功能，如补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP)。位于CH2和CH3结构域之间的界面上的若干突变，如T250Q/M428L和M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F，已显示增加与FcRn结合的亲和性并增加IgG1在体内的半衰期。然而，增加FcRn结合与改善半衰期之间未必总是直接相关。改善治疗性抗体的有效性的一种方法是增加其血清持久性，从而允许更高的循环水平、减少施用频率和降低剂量。工程化Fc区可能是所需的，以降低或增加抗体的效应功能。对于靶向细胞表面分子(特别是免疫细胞上的那些)的抗体，需要消除效应功能。而相反的是，对于意欲用于肿瘤学用途的抗体，增加效应功能可改善治疗活性。四种人IgG同种型以不同亲和性结合激活Fcγ受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)、抑制性FcγRIIb受体和补体的第一组分(C1q)，产生极为不同的效应功能。IgG与FcγR或C1q的结合取决于位于铰链区和CH2结构域中的残基。CH2结构域的两个区对于FcγR和C1q结合而言是关键的，并在IgG2和IgG4中具有独特序列。
根据本发明所述的抗体任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)、通常哺乳动物免疫球蛋白恒定区、甚至更优选的人或人源化免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区中的至少一部分。优选地，Fc区是本文所述的抗hPD-1抗体中的一部分。包含于本发明所述的双功能分子中的所述抗hPD1抗体或其抗原结合片段可包含免疫球蛋白的恒定区，或所述恒定区的片段、类似物、变体、突变体或衍生物。正如本领域技术人员所熟知的，重链恒定结构域的IgG同种型的选择集中在是否需要特定功能以及是否需要适宜的体内半衰期。例如，为选择性根除癌细胞而设计的抗体通常需要活性同种型，该同种型允许补体激活和通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用介导的效应物介导的细胞杀伤。人IgG1和IgG3(半衰期更短)同种型两者符合这些标准，特别是人IgG1同种型(野生型和变体)。特别地，取决于重链恒定结构域的IgG同种型(特别是人野生型和变体IgG1同种型)，本发明所述的抗hPD1抗体可以通过CDC、ADCC和/或ADCP机制对表达PD-1的细胞是细胞毒性的。实际上，可结晶片段(Fc)区与多种辅助分子相互作用，以介导间接效应功能，如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在优选的实施方式中，所述恒定区来源于人免疫球蛋白重链，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他类别。在一个进一步的方面中，所述人恒定区选自以下：IgG1、IgG2、IgG2、IgG3和IgG4。优选地，包含在根据本发明所述的双功能分子中的抗hPD1抗体包含IgG1或IgG4 Fc区。
在一个特别的方面中，所述人源化抗PD1抗体包含人IgGl Fc区，任选地具有选自以下的置换或置换的组合：T250Q/M428L；M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F；E233P/L234V/L235A/G236A+A327G/A330S/P331S；E333A；S239D/A330L/I332E；P257I/Q311；K326W/E333S；S239D/I332E/G236A；N297A；L234A/L235A；N297A+M252Y/S254T/T256E；K322A和K444A，优选地选自以下：N297A，其任选地与M252Y/S254T/T256E组合，和L234A/L235A。
更优选地，所述人源化抗hPD1抗体包含IgG4 Fc区，任选地具有选自以下的置换或置换的组合：S228P；L234A/L235A、S228P+M252Y/S254T/T256E和K444A。甚至更优选地，所述抗hPD1抗体包含具有稳定所述IgG4的S228P的IgG4 Fc区。
在一个实施方式中，所述抗PD1抗体包含截短的Fc区或Fc区的片段。在一个实施方式中，所述恒定区包含CH2结构域。在另一个实施方式中，所述恒定区包含CH2和CH3结构域或包含铰链-CH2-CH3。替代地，所述恒定区可以包含铰链区、CH2结构域和/或CH3结构域的全部或一部分。优选地，所述恒定区包含来源于人IgG4重链的CH2和/或CH3结构域。
在一些实施方式中，所述恒定区包含来源于人IgG4重链的CH2和/或CH3结构域。
在另一个实施方式中，所述恒定区包含CH2结构域和铰链区的至少一部分。所述铰链区可以来源于免疫球蛋白重链，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他类别。优选地，所述铰链区来源于人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他适宜类别，突变的或未突变的。更优选地，所述铰链区来源于人IgG1重链。在一个实施方式中，所述恒定区包含来源于第一抗体同种型的CH2结构域和来源于第二抗体同种型的铰链区。在一个特定实施方式中，所述CH2结构域来源于人IgG2或IgG4重链，而所述铰链区来源于改变的人IgG1重链。
在一个实施方式中，所述恒定区包含降低对Fc受体的亲和性减少Fc效应功能的突变。例如，所述恒定区可以包含消除IgG重链恒定区内的糖基化位点的突变。
在另一个实施方式中，所述恒定区包含CH2结构域和铰链区的至少一部分。铰链区可以来源于免疫球蛋白重链，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他类别。优选地，铰链区来源于人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其他适宜类别。IgG1铰链区具有三个半胱氨酸，其中两个参与免疫球蛋白两条重链之间的二硫键。这些相同的半胱氨酸允许在Fc部分之间形成有效且一致的二硫键。因此，本发明的优选铰链区来源于IgG1，更优选地，来源于人IgG1。在一些实施方式中，人IgG1铰链区内的第一半胱氨酸突变成另一氨基酸，优选丝氨酸。IgG2同种型铰链区具有四个二硫键，在重组系统的分泌过程中，这些二硫键往往会促进寡聚化和可能不正确的二硫键。适宜的铰链区可以来源于IgG2铰链；前两个半胱氨酸各自优选突变为另一种氨基酸。已知IgG4的铰链区无法有效地形成链间二硫键。然而，针对本发明的适宜的铰链区可以来源于IgG4铰链区，优选地包含增强来源于重链的部分之间的二硫键的正确形成的突变(Angal S,等，(1993)Mol.Immunol.,30:105-8)。更优选地，铰链区来源于人IgG4重链。
在一个实施方式中，所述恒定区包含来源于第一抗体同种型的CH2结构域和来源于第二抗体同种型的铰链区。在一个特定实施方式中，CH2结构域来源于人IgG4重链，而铰链区来源于改变的人IgG1重链。
根据本发明，所述恒定区可以包含CH2和/或CH3结构域和铰链区，其来源于不同抗体同种型，即，杂交恒定区。例如，在一个实施方式中，恒定区包含来源于IgG2或IgG4的CH2和/或CH3结构域和来源于IgG1的突变铰链区。或者，将来自另一IgG亚类的突变铰链区用于杂交恒定区中。例如，可以使用允许两个重链之间有效二硫键键合的IgG4铰链的突变形式。突变铰链还可以来源于IgG2铰链，其中前两个半胱氨酸各突变成另一氨基酸。已在美国专利公开号20030044423中描述了此类杂交恒定区的组装，其公开的内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，所述恒定区可以包含具有下表D所述的突变之一或其任何组合的CH2和/或CH3。
Figure BDA0003225628970000631
Figure BDA0003225628970000641
表D：抗体的适宜的人工程化Fc结构域。重链恒定区中残基的编号基于EU编号(Edelman,G.M.等，Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969)；www.imgt.org/ IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs)。
在某些实施方式中，可以将氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中以产生Fc区变体。在某些实施方式中，Fc区变体具有一些但并不是所有的效应功能。此类抗体可能是有用的，例如，在抗体的体内半衰期重要但某些效应功能不必要或有害的应用中。效应功能的实例包括补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体引导的补体介导的细胞毒性(ADCC)。改变效应功能的大量置换或置换或缺失是本领域公知的。
在一个实施方式中，所述恒定区包含降低对Fc受体的亲和性或降低Fc效应功能的突变。例如，所述恒定区可以包含消除IgG重链恒定区内糖基化位点的突变。优选地，CH2结构域包含消除CH2结构域内糖基化位点的突变。
靠近Fc部分与非Fc部分的结合处的氨基酸的改变可显著增加Fc分子的血清半衰期(PCT公开号WO 01/58957)。因此，本发明的蛋白或多肽的连接区可以包含相对于免疫球蛋白重链和促红细胞生成素的天然存在的序列优选位于连接点的约10个氨基酸内的改变。这些氨基酸变化能够引起疏水性增加。在一个实施方式中，所述恒定区来源于C-端赖氨酸残基被替代的IgG序列。优选地，IgG序列的C-端赖氨酸被非赖氨酸(例如丙氨酸或亮氨酸)替代，以进一步增加血清半衰期。
在某些实施方式中，可以改变抗体以增加、降低或消除其糖基化的程度。
在一个实施方式中，根据本发明所述的抗hPD1具有SEQ ID NO.39或52的重链恒定结构域和/或SEQ ID.40的轻链恒定结构域，特别是SEQ ID NO.39或52的重链恒定结构域和SEQ ID.40的轻链恒定结构域。
在另一个实施方式中，根据本发明所述的抗hPD1具有SEQ ID NO:52的重链恒定结构域和/或SEQ ID.40的轻链恒定结构域，特别是SEQ ID NO:52的重链恒定结构域和SEQID.40的轻链恒定结构域。
Figure BDA0003225628970000651
表E：适于根据本发明所述的人源化抗体的重链恒定结构域和轻链恒定结构域的实例。
人IgG的所有亚类带有在循环中裂解的抗体重链的C-端赖氨酸残基(K444)。这种血液中裂解可通过释放SIRPa来损害双功能分子的生物活性。为了规避这个问题，在IgG1或IgG4结构域中的K444氨基酸可以被丙氨酸置换以减少蛋白水解裂解，其为常用于抗体的突变。然后，在一个实施方式中，所述抗PD1抗体包含至少一个由K444A组成的其他氨基酸置换。
在一个实施方式中，所述抗PD1抗体在IgG的C-端结构域包含另外的半胱氨酸残基以产生另外的二硫键，并且潜在地限制双功能分子的灵活性。
肽接头
本发明包括双功能分子，其可包含所述抗PD-1抗体或其片段与SIRPa之间的肽接头。所述肽接头通常具有足够的长度和柔韧性以保证与其之间的接头相连的两个蛋白元件在空间上有足够的自由度以发挥其功能并避免α螺旋和β折叠的形成对所述重组双功能分子的稳定性的影响。
在本公开的一个方面中，所述抗hPD1抗体优选地通过肽接头与SIRPa连接。换言之，本发明涉及一种双功能分子，其包含如本文详述的抗PD1抗体或其抗原结合片段的双功能分子，其链，例如轻链或重链或其片段，优选地重链或其片段，通过肽接头与SIRPa连接。如本文所用，术语“接头”指连接SIRPa和所述抗PD-1免疫球蛋白序列部分的至少一个氨基酸的序列。这种接头可用于防止空间位阻。所述接头的长度通常为3-44个氨基酸残基。优选地，所述接头具有3-30个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述接头具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基。
在一个实施方式中，本发明涉及一种双功能分子，其包含如上定义的抗PD-1抗体或其抗原结合片段和SIRPa，其中所述抗体的链，例如轻链或重链，优选地重链，甚至更优选地重链或轻链的C-端通过肽接头与SIRPa连接，优选地与SIRPa的N-端连接。
在一个特别的方面中，本发明涉及一种双功能分子，其包含如上定义的抗hPD-1抗体或其抗原结合片段，其中SIRPa优选地通过肽接头与所述抗体的重链的C-端末端(例如，所述重链恒定结构域的C-端末端)连接。
在一个实施方式中，本发明涉及一种双功能分子，其包含如上定义的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其中SIRPa优选地通过肽接头与所述抗体的轻链的C-端末端(例如，所述轻链恒定结构域的C-端末端)连接。
所述接头序列可以是天然存在的序列或非天然存在的序列。如果用于治疗目的，所述接头优选地在向其施用所述双功能分子的受试者中是非免疫原性的。一组有用的接头序列是来源于如WO 96/34103和WO 94/04678所述的重链抗体的铰链区的接头。其他实例是聚丙氨酸接头序列。接头序列的其他优选实例是不同长度的Gly/Ser接头，包括(Gly4Ser)4、(Gly4Ser)3、(Gly4Ser)2、Gly4Ser、Gly3Ser、Gly3、Gly2ser和(Gly3Ser2)3，特别是(Gly4Ser)3。
在一个实施方式中，包含于所述双功能分子中的所述接头选自(Gly4Ser)4、(Gly4Ser)3、(Gly4Ser)2、Gly4Ser、Gly3Ser、Gly3、Gly2ser和(Gly3Ser2)3，优选是(Gly4Ser)3。
在一个实施方式中，本发明涉及一种双功能分子，其包含如上定义的抗PD-1抗体或其片段，其中所述抗体或其片段通过接头序列与SIRPa连接，所述接头序列优选地选自(GGGGS)3、(GGGGS)4、(GGGGS)2、GGGGS、GGGS、GGG、GGS和(GGGS)3，甚至更优选地选自(GGGGS)3。
优选地，所述抗PD-1抗体的重链，优选地所述抗PD-1抗体的重链的C-端，通过柔性(Gly4Ser)3接头与SIRPa的N-端遗传融合。在融合连接处，所述抗体重链的C-端赖氨酸残基可以突变为丙氨酸以减少蛋白水解裂解。
优选地，所述抗PD-1抗体的重链，优选地所述抗PD-1抗体的轻链的C-端，通过柔性(Gly4Ser)3接头与SIRPa的N-端遗传融合。在融合连接处，所述抗体轻链的C-端赖氨酸残基可以突变为丙氨酸以减少蛋白水解裂解。
SIRPa分子
根据本发明所述的双功能分子包含另外的或第二实体，所述另外的或第二实体包含SIRPa或其片段或变体。
优选地，所述SIRPa蛋白为优选地人SIRPa或其片段和变体。在一个实施方式中，所述双功能分子包含约504个氨基酸的经典野生型SIRPa人蛋白，优选地所述野生型人SIRPa蛋白的胞外结构域(例如，由来自所述野生型人SIRPa的位置31至373的氨基酸组成)，任选地，具有另外的N-端甲硫氨酸残基(SEQ ID NO:51)。优选地，所述SIRPa蛋白是SEQ ID NO:51的蛋白。所述SIRPa可以缺乏其跨膜结构域和/或细胞质结构域。优选地，所述SIRPa蛋白由其胞外结构域组成，甚至更优选地基本上由所述野生型人SIRPa的31至373个氨基酸组成。
SIRPa蛋白的“变体”被定义为通过一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列。所述变体可以具有“保守”修饰或“非保守”修饰。此类修饰可包括氨基酸置换、缺失和/或插入。可以使用本领域众所周知的计算机程序，例如用于分子建模或用于产生比对的软件，找到确定哪些和多少氨基酸残基可以被置换、插入或删除而不破坏生物特性(例如活性、结合能力和/或结构)的指导。在一个特定方面，本发明中包括的变体SIRPa蛋白具体包括相比于野生型SIRPa保留了基本相等的生物特性的SIRPa蛋白。在另一个方面，本发明中包括的变体SIRPa蛋白具体包括相比于野生型SIRPa不保留基本相等的生物特性(例如活性、结合能力和/或结构)的SIRPa蛋白。SIRPa的变体还包括改变的SIRPa多肽序列(例如氧化、还原、脱氨基化或截短形式)。特别地，保留与全长SIRPa蛋白相当的生物特性的SIRPa的截短形式或片段包括在本发明的范围内。在一个实施方式中，所述SIRPa是其任何生物活性片段。SIRPa的变体更优选地包括由天然多态性产生的天然等位基因变体，包括SNP、剪接变体等。
最常见的人SIRPa变体是SIRPa v1和SIRPa v2(登录号NP_542970(P78324)和CAA71403)。SIRPa家族可以分为这两个亚群；即SIRPa v1亚型家族和SIRPa v2亚型家族。这些系列分别包括SIRPa亚型2(标识符：P78324-2)和SIRPa亚型4(标识符：P78324-4)。在一个实施方式中，SIRPa变体选自SIRPa亚型2(P78324-2)和SIRPa亚型4(P78324-4)。
变体SIRPa蛋白还包括与野生型SIRPa具有至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽。
在一个实施方式中，SIRPα的变体是SIRPγ，其通常呈现出与野生型SIRPa 55％序列同一性。如本文所用，术语“SIRPγ”，“SIRPg”和“SIRPγ”可互换使用。例如，在UniProtKB-Q9P1W8中描述了人SIRPg氨基酸序列。
SIRPγ具有相似的胞外结构，但具有提供不同类型的信号的不同的细胞质区域。实际上，SIRPα和SIRPγ包含3个Ig样胞外结构域：Ig样V型，其由氨基酸32-137(结构域D1)编码；Ig样C1 1型，其由位置148-247处的氨基酸编码(结构域D2)；Ig样C1 2型，其由位置254-348处的氨基酸(结构域D3)编码。
然后，在一个实施方式中，所述SIRPa变体包含i)SIRPg的D1结构域、SIRPg的D2和D3结构域；ii)SIRPg的D1和D2结构域和SIRPa的D3结构域；iii)SIRPg的D1结构域、SIRPg的D2结构域和SIRPg的D3结构域；iv)SIRPg的D1结构域、SIRPg的D2和D3结构域；v)SIRPa的D1和D2结构域和SIRPg的D3结构域；或vi)SIRPa的D1结构域、SIRPg的D2结构域和SIRPa的D3结构域。
根据本发明所述的优选的SIRPa是人SIRPa多肽，其包含如SEQ ID No:51、US20160319256、WO 2013109752或WO2016024021所述的氨基酸序列及其任何天然变体和同源物，或由如SEQ ID No:51、US20160319256、WO 2013109752或WO2016024021所述的氨基酸序列及其任何天然变体和同源物组成。
在一些实施方式中，所述SIRPα变体构建体在患病部位(例如，在肿瘤部位比在非患病部位)具有优先活性。在一些实施方式中，所述SIRP-α变体包含一个或多个氨基酸置换，其中组氨酸残基或其他氨基酸允许SIRP-a变体构建体在患病部位优先结合。
在一个特别的实施方式中，所述SIRPα由SIRPα的胞外结构域的截短或片段组成，其具体地包含结合区或与CD47相互作用的接触残基组内的氨基酸或由结合区或与CD47相互作用的接触残基组内的氨基酸组成。
在一个实施方式中，所述SIRPα蛋白的亲和力可以使用体外测定来测量。优选地，与野生型人SIRPa相比，根据本发明所述的SIRPa变体相比于野生型人SIRPa保持了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％的对CD47的亲和力，相比于野生型SIRPa保持了优选地至少80％、90％、95％和甚至更优选地99％的对CD47的亲和力。
本发明还提供了包含SIRPa蛋白的双功能分子，所述SIRPa蛋白相比于野生型SIRPa蛋白(例如，如WO 2013109752所述的)对CD47具有增强的亲和力。在某些实施方式中，所述SIRP-α变体构建体对患病细胞(例如，肿瘤细胞)上的CD47具有更高的结合亲和力。在一些实施方式中，所述SIRP-α变体在酸性pH(例如，低于pH 7左右)和/或在缺氧条件下比生理条件下(例如，如US 20160319256所述的)以更高的亲和力结合CD47。
在一个方面中，用于本发明中的SIRPa多肽是重组SIRPa。如本文所用，术语“重组”是指所述多肽是从重组表达系统，即从宿主细胞(例如，微生物或昆虫或植物或哺乳动物)的培养物或从经工程化已获得编码SIRPa多肽的核酸分子的转基因植物或动物中获得的，或来源于重组表达系统，即来源于宿主细胞(例如，微生物或昆虫或植物或哺乳动物)的培养物或来源于经工程化已获得编码SIRPa多肽的核酸分子的转基因植物或动物。优选地，所述重组SIRPa是人重组SIRPa(例如在重组表达系统中产生的人SIRPa)。
双功能分子或“Bicki”
本发明特别提供了一种双功能分子，其包含以下或由以下组成：抗hPD1抗体或其抗体片段和如上文公开的SIRPa，抗hPD1抗体或其抗体片段，所述抗hPD1抗体或其抗体片段，优选地通过肽接头与SIRPa共价连接，特别地作为融合蛋白。
特别地，根据本发明所述的双功能分子包含两个实体：第一实体，其包含抗hPD1抗体或其片段，或基本上由抗hPD1抗体或其片段组成；第二实体，其包含SIRPa、更优选地人SIRPa、甚至更优选地人SIRPa亚型1的胞外结构域，或基本上由SIRPa、更优选地人SIRPa、甚至更优选地人SIRPa亚型1的胞外结构域组成，这两个实体任选地通过肽接头连接。
特别地，根据本发明所述的双功能分子包含一、二、三或四个SIRPa的分子。特别地，所述双功能分子可仅包含一个仅与所述抗PD-1抗体的一条轻链或重链连接的SIRPa的分子。所述双功能分子还可包含与所述抗PD-1抗体的轻链或重链连接的两个SIRPa的分子。所述双功能分子还可包含两个SIRPa的分子，第一分子与抗PD-1抗体的轻链连接，第二分子与所述抗PD-1抗体的重链连接。所述双功能分子还可以包含三个SIRPa分子，其中两个与所述抗PD-1抗体的轻链或重链连接，最后一个与所述抗PD-1抗体的另一条链连接。最后，所述双功能分子还可以包含四个SIRPa分子，两个分子与所述抗PD-1抗体的轻链连接，两个分子与所述抗PD-1抗体的重链连接。因此，所述双功能分子包含一至四个如本文公开的SIRPa分子。
在一个实施方式中，仅一条轻链包含一个SIRPa分子(例如所述双功能分子包含一个SIRPa分子)，仅一条重链包含一个SIRPa分子(例如所述双功能分子包含一个SIRPa分子)，每条轻链包含一个免疫治疗剂分子(例如所述双功能分子包含两个SIRPa分子)，每条重链包含一个SIRPa分子(例如所述双功能分子包含两个SIRPa分子)，仅一条轻链和仅一条重链包含一个SIRPa分子(例如所述双功能分子包含两个SIRPa分子)，每条轻链包含一个SIRPa分子，且仅一条重链包含一个SIRPa分子(例如，所述双功能分子包含三个SIRPa分子)，每条重链包含一个SIRPa分子，仅一条轻链包含一个SIRPa分子(例如所述双功能分子包含三个SIRPa分子)，或者轻链和重链均包含一个SIRPa分子(例如所述双功能分子包含四个SIRPa分子)。
在一个实施方式中，根据本发明所述的双功能分子包含以下或由以下组成：
(a)抗人PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含(i)重链，和(ii)轻链；和
(b)人SIRPa或其片段或变体，
其中所述抗体重链和/或轻链或其片段优选地通过肽接头，与SIRPa共价连接作为融合蛋白。
优选地，根据本发明所述地双功能分子包含以下或由以下组成：
(a)人源化抗人PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含(i)重链，和(ii)轻链；和
(b)人SIRPa或其片段或变体，
其中所述抗体重链或轻链或其片段通过肽接头，与SIRPa共价连接，优选地作为融合蛋白。
优选地，这种双功能分子包含至少一个连接SIRPa的N-端与所述抗人PD-1抗体的重链或轻链或两者的C-端的肽接头，所述肽接头优选地选自(GGGGS)3、(GGGGS)4、(GGGGS)2、GGGGS、GGGS、GGG、GGS和(GGGS)3，甚至更优选地是(GGGGS)3。
优选地，所述SIRPa的N-端末端通过至少一个肽接头，与所述抗人PD-1抗体的重链或轻链或两者的C-端末端连接。替代地，SIRPa的C-端末端通过至少一个肽接头，与所述抗人PD-1抗体的重链或轻链或两者的N-端末端连接。
在一个实施方式中，根据本发明所述的双功能分子包含以下或由以下组成：
(a)抗人PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含(i)重链，和(ii)轻链，
(b)人SIRPa或其片段或变体，和
(c)连接SIRPa的N-端末端与所述抗人PD-1抗体的重链或轻链或两者的C-端末端的肽接头，所述肽接头优选地选自(GGGGS)3、(GGGGS)4、(GGGGS)2、GGGGS、GGGS、GGG、GGS和(GGGS)3，甚至更优选地是(GGGGS)3。
更具体地，所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段可以是如上文“抗PD-1”部分公开的任何抗体，并且人SIRPa、其片段或变体可以是上文“SIRPa分子”部分公开的任何SIRPa。
在特别的实施方式中，根据本发明所述的双功能分子包含以下或由以下组成：
(a)抗人PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含：
(i)重链可变结构域，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，和
(ii)轻链可变结构域，其包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，
其中：
-所述重链CDR1(HCDR1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:1的位置3之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；
-所述重链CDR2(HCDR2)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:2的位置13、14和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；
-所述重链CDR3(HCDR3)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成，其中X1是D或E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N和E；任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:3的位置2、3、7和8之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；
-所述轻链CDR1(LCDR1)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成，其中X是G或T，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:12的位置5、6、10、11和16之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；
-所述轻链CDR2(LCDR2)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；并且
-所述轻链CDR3(LCDR3)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:16的位置1、4和6之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；和(b)SEQ ID No:51的人SIRPa或其片段或变体，
其中所述抗体重链和/或轻链或其片段，优选地通过肽接头，与所述SIRPa共价连接作为融合蛋白。
优选地，所述肽接头选自(GGGGS)3、(GGGGS)4、(GGGGS)2、GGGGS、GGGS、GGG、GGS和(GGGS)3，甚至更优选地为(GGGGS)3。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种双功能分子，其包含以下或由以下组成：
(a)人源化抗hPD1抗体，其包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成，其中X1是D或E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N、E；任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:17的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成，其中X是G或T，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:26的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰，和
(b)SEQ ID No:51的人SIRPa或其变体，
(c)肽接头，其选自(GGGGS)3、(GGGGS)4、(GGGGS)2、GGGGS、GGGS、GGG、GGS和(GGGS)3，甚至更优选地为(GGGGS)3，在所述抗hPD1抗体的轻链和/或重链与所述人SIRPa或其变体之间。
优选地，SIRPa的N-端末端，通过至少一个肽接头，与所述抗人PD1抗体的重链或轻链或两者的C-端末端连接。替代地，SIRPa的C-端末端，通过至少一个肽接头，与所述抗人PD1抗体的重链或轻链或两者的N-端末端连接。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种双功能分子，其包含以下或由以下组成：
(a)人源化抗hPD1抗体，其包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成，其中X1是D或E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N、E；任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:17的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成，其中X是G或T，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:26的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰，和
(b)SEQ ID No:51的人SIRPa或其变体，
其中所述抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的C-端末端，优选地通过(GGGGS)3肽接头，与SIRPa的N-端末端共价连接以形成融合蛋白。
在优选实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链的C-端末端与SIRPa的N-端末端共价连接以形成融合蛋白。优选地，仅所述抗体或其抗原结合片段的重链与SIRPa共价连接。
在一个特别的实施方式中，本发明涉及一种双功能分子，其包含以下或由以下组成：
(a)人源化抗hPD1抗体，其包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成，其中X1是D或E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N、E；任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:17的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成，其中X是G或T，任选地具有一个、两个或三个选自SEQ ID NO:26的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰，和
(b)SEQ ID No:51的人SIRPa或其变体，
其中所述抗体或其抗原结合片段的重链的C-端末端，优选地通过(GGGGS)3肽接头，与SIRPa的N-端末端共价连接以形成融合蛋白。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种双功能分子，其包含以下或由以下组成：
(a)人源化抗hPD1抗体，其包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24或25的氨基酸序列或由SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24或25的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个分别选自SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24或25的位置7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106和112之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰；
(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成，任选地具有一个、两个或三个选自SEQID NO:27或SEQ ID NO:28的位置3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99和105之外的任何位置处的一个或多个置换、一个或多个添加、一个或多个缺失及其任何组合的修饰，
(b)SEQ ID No:51的人SIRPa或其变体，
其中所述抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的C-端末端，优选地通过(GGGGS)3肽接头，与SIRPa的N-端末端共价连接以形成融合蛋白。
所述双功能分子与其特定靶标的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白印迹测定来确认。这些测定中的每一个通常通过使用对感兴趣的复合物具有特异性的标记试剂(例如，抗体)来检测特别感兴趣的蛋白-抗体复合物的存在。例如，可以使用例如识别并特异性结合SIRPa或SIRPa的受体的酶联抗体或抗体片段来检测所述抗hPD-1抗体/SIRPa复合物。
在一些实例中，本文所述的双功能分子抑制所述PD-1信号传导通路至少20％、至少40％、至少50％、至少75％、至少90％、至少100％，或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。
优选地，此类双功能分子具有阻断或抑制PD-1与其配体(例如PD-L1和/或PD-L2)之间相互作用的能力。在某些实施方式中，所述双功能分子抑制PD-1与其配体(例如PD-L1和/或PD-L2)之间的结合相互作用至少50％。在某些实施方式中，该抑制可以大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。
在一些实例中，本文所述的双功能分子抑制或降低所述PD-1信号传导通路至少20％、至少40％、至少50％、至少75％、至少90％、至少100％，或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。
在一些实例中，本文所述的双功能分子刺激IFNγ分泌。
在一些实例中，本文所述的双功能分子阻断CD47表达细胞(例如肿瘤细胞)与SIRPa表达细胞(例如抗原呈递细胞(APC)(例如巨噬细胞))之间的相互作用。
在一些实例中，本文所述的双功能分子遏制或降低SIRPa/CD47信号传导通路至少10％、至少20％、至少40％、至少50％、至少75％、至少90％、至少100％，或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或至少1000倍。
在另一实例中，本文所述的双功能分子增强T细胞的激活、刺激T细胞的IFNg分泌和/或刺激免疫细胞(例如T细胞)的增殖。
在另一实例中，本文所述的双功能分子诱导细胞因子分泌，和/或初始、部分耗竭T细胞亚群的增殖。
双功能分子的制备-编码所述双功能分子的核酸分子、包含其的重组表达载体和宿主细胞
为了产生本发明所述的双功能分子，本发明所述的抗hPD1抗体与SIRPa功能性连接。
所述双功能分子的两个实体都在同一载体中编码并作为融合蛋白产生。因此，本文还公开了编码本文所述的双功能分子中的任一个的核酸、载体(例如表达载体)或包含这些核酸的重组病毒、和包含所述核酸和/或载体的宿主细胞。
为了生产由哺乳动物细胞以稳定形式分泌的双功能融合蛋白，根据本发明，将编码所述双功能分子的核酸序列亚克隆到通常用于转染哺乳动物细胞的表达载体中。用于生产包含抗体序列的分子的一般技术描述于Coligan等(编著),Current protocols inimmunology，第10.19.1-10.19.11页(Wiley Interscience 1992)(其内容通过引用并入本文)中和来自W.H.Freeman和Company的“Antibody engineering:apractical guide”(1992)中，其中与分子生产相关的评述散布在各个文本中。
通常，该方法包括以下步骤：
(1)用编码本发明所述的重组双功能分子的多核苷酸或其变体或包含所述多核苷酸的载体来转染或转化合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养所述宿主细胞；和
(3)任选地从所述培养基或宿主细胞中分离或纯化所述蛋白。
本发明进一步涉及编码上述双功能分子的核酸、包含本发明所述的核酸的载体(优选表达载体)、用本发明所述的载体或直接用编码所述重组双功能分子的序列来转化的基因工程化宿主细胞、和用于通过重组技术来生产本发明所述的蛋白的方法。
下文更具体地描述了所述核酸、所述载体和所述宿主细胞。
核酸序列
本发明还涉及一种核酸分子，其编码如上文定义的双功能分子；或一种核酸分子组，其编码如上文定义的双功能分子。
抗体DNA序列可以例如由合成免疫球蛋白的细胞的RNA扩增，使用PCR利用克隆的免疫球蛋白合成，或通过编码已知的信号肽氨基酸序列的寡核苷酸合成。优选地，对于VH和/或CH，信号肽包含选自SEQ ID NO:49的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成；和/或对于VL和/或CL，信号肽包含选自SEQ ID NO:50的氨基酸序列或由选自SEQID NO:50的氨基酸序列组成。特别地，信号肽在CH、VH、CL和/或VL的N-端。
此类核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。使用常规程序可以容易地分离和测序此类核酸。
特别地，编码如上文定义的双功能分子的所述核酸分子包含：
-编码如本文公开的抗hPD-1抗体的可变重链结构域的第一核酸分子，其任选地具有SEQ ID NO.49的肽信号，和
-编码如本文公开的抗hPD-1抗体的可变轻链结构域的第二核酸分子，其任选地具有SEQ ID NO:50的肽信号，和
-第三核酸，其编码SIRPa或其变体、优选地人SIRPa、甚至更优选地所述人SIRPa亚型1的胞外结构域或其变体，任选地通过编码接头的核酸，与所述第一核酸或所述第二核酸或两者可操作地连接。
在一个实施方式中，编码如上文定义的双功能分子的所述核酸分子包含：
-第一核酸分子，其编码SEQ ID NO:17的可变重链结构域，其中X1是D或E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N和E；任选地具有SEQ ID NO.49的肽信号，和
-第二核酸分子，其编码SEQ ID NO:26的可变轻链结构域，其中X是G或T；任选地具有SEQ ID NO:50的肽信号，和
-第三核酸，其编码SEQ ID No:51的人SIRPa或其变体，任选地通过编码接头的核酸，与所述第一核酸或所述第二核酸或两者可操作地连接的所述免疫治疗剂。
优选地，编码如上定义的双功能分子的核酸分子包括：
-第一核酸分子，其编码SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24或25中所示的氨基酸序列的可变重链结构域；任选地具有SEQ ID NO.49的肽信号，和
-第二核酸分子，其编码SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列的可变轻链结构域；任选地具有SEQ ID NO.50的肽信号，和
-第三核酸，其编码SEQ ID No:51的人SIRPa或其变体，任选地通过编码多肽接头的核酸，与所述第一核酸或所述第二核酸或两者可操作地连接。
在一个非常特别的实施方式中，编码可变重链结构域的所述核酸分子具有SEQ IDNO:55中所示的序列，和/或编码可变轻链结构域的所述核酸分子具有SEQ ID NO:56中所示的序列。
可操作地连接是指所述核酸编码包含可变重链或轻链结构域、任选的肽接头、和SIRPa的蛋白融合体。优选地，所述接头选自(GGGGS)3、(GGGGS)4、(GGGGS)2、GGGGS、GGGS、GGG、GGS和(GGGS)3，甚至更优选地是(GGGGS)3。
在一个实施方式中，核酸分子是分离的、特别是非天然的核酸分子。
编码根据本发明所述的双功能分子的核酸分子或核酸分子组优选地包含在载体或载体组中。
载体
在另一个方面中，本发明涉及包含如上文定义的核酸分子或核酸分子组的载体。
如本文所用，“载体”是用作载剂的核酸分子，其将遗传物质转移至细胞中。术语“载体”包含质粒、病毒、粘粒和人工染色体。在通常情况下，工程化的载体包含复制原点、多克隆位点和选择性标志物。载体本身通常是一个核苷酸序列，通常是一个DNA序列，其包含一个插入片段(转基因)和一个更大的序列，作为载体的“骨架”。除了转基因插入物和骨架之外，现代载体可能还包含其他特征：启动子、遗传标志物、抗生素抗性、报告基因、靶向序列、蛋白纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体特定用于在目标细胞中表达转基因，并且通常具有控制序列。
在一个实施方式中，所述抗PD1抗体的重链编码序列和轻链编码序列和/或恒定区包含在一个表达载体中。重链编码序列和轻链编码序列的每一者可以可操作地连接至适宜启动子，所述重链和/或所述轻链与本文发明所述的免疫治疗剂可操作地连接。或者，重链和轻链两者的表达可以由相同启动子驱动。在另一个实施方式中，抗体的重链和轻链中的每一者克隆至单独载体中，所述重链和轻链中的一者或两者，所述重链和/或所述轻链与根据本发明所述的免疫治疗剂可操作地连接。在后一种情况下，编码重链和轻链的表达载体可以共转染至一个宿主细胞中以表达这两条链，这两条链可以在体内或体外进行组装以形成完整抗体。或者，可以将编码重链和编码轻链的表达载体引入不同宿主细胞中以表达重链和轻链两者，然后可以将其在体外纯化和组装以形成完整抗体。
本领域技术人员可以将编码人源化抗PD-1抗体或其抗体片段的核酸分子克隆至载体中，然后转化进入宿主细胞。因此，本发明还提供了一种重组载体，其包含编码本发明的抗PD-1抗体或其片段的核酸分子。在一个优选的实施方式中，表达载体还包含启动子和编码分泌信号肽的核酸序列，以及任选地包含至少一种用于筛选的抗药基因。
适宜的表达载体通常包含(1)编码细菌复制原点和抗生素抗性标志物的原核DNA元件，以提供表达载体在细菌宿主中的生长和选择；(2)控制转录起始的真核DNA元件，如启动子；和(3)控制转录物加工的DNA元件，如转录终止/聚腺苷酸化序列。
可使用本领域技术人员公知的方法构建包含本文所述抗双功能分子的核酸序列和用于转录/翻译的适宜调控组分的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。DNA序列与表达载体中的适当启动子有效连接，以指导mRNA的合成。表达载体还可以包含用于启动翻译、转录终止子等的核糖体结合位点。
可以使用多种技术将表达载体引入宿主细胞，包括磷酸钙转染、脂质体介导的转染、电穿孔等。优选地，对转染细胞进行选择和增殖，其中将表达载体稳定整合至宿主细胞基因组中以产生稳定的转化体。在以下中描述了用于将载体引入真核细胞中的技术和用于使用显性可选择标记物选择稳定转化体的技术：Sambrook,Ausubel,Bebbington,“Expression of Antibody Genes in Nonlymphoid Mammalian Cells,”2METHODS:Acompanion to methods in enzymology 136(1991)，和Murray(编著)，Gene transfer andexpression protocols(Humana Press1991)。在以下中描述了适宜的克隆载体：Sambrook等(编著)，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，第二版(Cold Spring HarborPress 1989)(下文称为“Sambrook”)；Ausubel等(编著)，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(Wiley Interscience 1987)(下文称为“Ausubel”)；和Brown(编著)，MOLECULAR BIOLOGY LABFAX(Academic Press 1991)。
宿主细胞
在另一个方面中，本发明涉及包含如上文定义地载体或核酸分子或核酸分子组的宿主细胞，其用于双功能分子产生目的。
如本文所用，术语“宿主细胞”旨在包括可以是或曾经是载体、外源核酸分子和编码本发明抗体构建体的多核苷酸和/或抗体构建体或双功能分子本身的受体的任何个体细胞或细胞培养物。可以通过转化、转染等方式将相应物质引入细胞。术语“宿主细胞”还旨在包括单个细胞的后代或可能后代。适宜宿主细胞包括原核细胞或真核细胞，并且还包括但不限于细菌、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞，如昆虫细胞和哺乳动物细胞，例如，小鼠、家兔、猕猴或人。
在一个实施方式中，宿主细胞包含(例如，经转化具有)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列和/或抗体的恒定区，或(2)第一载体，其包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸，和第二载体，其包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。
在另一个实施方式中，宿主细胞包含(例如，已用以下转化)载体，所述载体包含所述双功能分子的两个实体。优选地，宿主细胞包含(例如，已用以下转化)载体，所述载体包含编码如本文公开的抗hPD-1抗体的可变重链结构域的第一核酸分子和编码如本文公开的抗hPD-1抗体的可变轻链结构域的第二核酸分子，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子与编码SIRPa或其变体的第三核酸可操作地连接。
本文还提供了一种人源化抗PD1抗体的生产方法。该方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上文所提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。特别地，为了重组生产人源化抗PD1抗体，分离编码抗体(例如，如上文所述的)的核酸，并插入一个或多个载体，以进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。
本发明所述的双功能分子优选地在真核细胞(例如哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞或酵母细胞)中表达。哺乳动物细胞是特别优选的真核宿主，因为哺乳动物细胞提供适宜的翻译后修饰，如糖基化。优选地，此类适宜的真核宿主细胞可以是真菌，如毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；昆虫细胞，如东方粘虫(Mythimna separate)；植物细胞，如烟草，和哺乳动物细胞，如BHK细胞、293细胞、CHO细胞、NSO细胞和COS细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是具有SV40基因的CV-1来源细胞(COS细胞)、由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(293或293细胞，如例如在Graham,F.L.等，J.Gen Virol.36(1977)59-74中描述的)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(TM4细胞，如例如在Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的)；人肾上皮细胞(HEK细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如例如在Mather,J.P.等，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中描述的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR"CHO细胞(Urlaub,G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，如Y0、NSO和Sp2/0。对于适于生产抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(编著)，Humana Press,Totowa,NJ(2004),pp.255-268。例如，适于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。
特别地，本发明的宿主细胞选自以下：CHO细胞、COS细胞、NSO细胞和HEK细胞。
对于哺乳动物宿主，表达载体的转录和翻译调控信号可以来源于病毒来源，如腺病毒、牛乳头瘤病毒、猿猴病毒等，其中调控信号与具有高表达水平的特定基因相关。适宜的转录和翻译调控序列也可以从哺乳动物基因获得，如肌动蛋白、胶原蛋白、肌球蛋白和金属硫蛋白基因。
可以使用多种方法鉴定生产根据本发明所述的双功能分子的稳定转化体。鉴定出分子生产细胞之后，将宿主细胞在适合其生长和双功能分子表达的条件(例如，温度、培养基)下培养。然后，通过本领域公知的任何方法分离和/或纯化人源化抗体。这些方法包括但不限于常规复性处理、蛋白沉淀剂(例如盐沉淀)处理、离心、通过渗透的细胞裂解、超声、超速离心、分子筛层析法或凝胶层析法、吸附层析法、离子交换层析法、HPLC、任何其他液相层析法及其组合。如例如Coligan所描述的，双功能分子分离技术可以特别地包括使用蛋白A琼脂糖的亲和层析法、体积排阻层析法和离子交换层析法。优选地将蛋白A用于分离本发明所述的双功能分子。
药物组合物及其施用方法
本发明还涉及一种药物组合物，其包含本文所述的双功能分子中的任一个，如上文所述的核酸分子、核酸分子组、载体和/或宿主细胞，优选地为活性成分或化合物。可以将制剂灭菌，且如有需要与如药学上可接受的载体和赋形剂的辅助剂混合，所述辅助剂不与本发明所述的双功能分子，核酸、载体和/或宿主细胞有害地相互作用。任选地，药物组合物还可以包含如下文详细描述的另外的治疗剂。
优选地，本发明所述的药物组合物可以包含如本文所述的双功能分子，如上文所述的核酸分子、核酸分子组、载体和/或宿主细胞，与一种或多种如下文所述的药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、盐和抗氧化剂组合。理想地，使用不会不利地影响根据本发明所述的双功能分子的所需免疫增强作用的药学上可接受的形式。为了便于施用，可以将如本文所述的双功能分子制成供体内施用的药物组合物。在本领域中已描述了制备此类组合物的方法(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins，第21版(2005))。
特别地，可以将根据本发明所述的药物组合物制成任何常规施用途径，包括局部、肠内、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下或眼内施用等。优选地，将根据本发明所述的药物组合物配制成用于肠内或肠胃外施用途径。用于肠胃外施用的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，其还可以包含缓冲剂、稀释剂和其他适宜的添加剂，例如但不限于渗透促进剂、载体(carder)化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
药物组合物可以通过将具有所需纯度的试剂与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编著(1980))混合来制备，其呈冻干制剂或水溶液形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对受体是无毒的，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯等烷基酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属配合物(例如，Zn-蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN TM、PLURONICS TM或聚乙二醇(PEG)。
固体药学上可接受的载剂可以包括一种或多种物质，其还可以作为调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、染料、填充剂、助流剂、压缩助剂、惰性粘合剂、甜味剂、防腐剂、染料、包衣或片剂崩解剂。适宜的固体载剂包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡和离子交换树脂。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于本发明所述的药物组合物中。
根据本发明所述的双功能分子可以溶解或混悬在药学上可接受的液体载剂中，如水、有机溶剂、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其类似物、两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪及其适宜混合物。液体载体可以包含其他适宜的药物添加剂，如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、润湿剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。用于口服和肠内施用的液体载体的适宜实例包括水(部分包含上述添加剂，例如，纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇类(包括一元醇和多元醇，例如，二醇)及其衍生物和油(例如，分馏椰子油和花生油)。对于肠胃外施用而言，载剂还可以是油性酯，如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体载剂可用于经肠施用的无菌液体形式组合物。用于加压组合物的液体载剂可以是卤代烃或其他药学上可接受的推进剂。
本发明所述的药物组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”指保留母体化合物的所需生物活性并且不产生任何不希望的毒理学作用的盐。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来源于无毒无机酸，如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等，以及来源于无毒有机酸，如脂肪族一元和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸等。碱加成盐包括来源于碱金属或碱土金属的那些，如钠、钾、镁、钙等，以及来源于无毒有机胺，如Ν,Ν'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的那些。
本发明所述的药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
为了便于递送，可以将所述双功能分子中的任一个或其编码核酸与伴侣剂(chaperon agent)缀合。伴侣剂可以是天然存在的物质，如蛋白(例如，人血清白蛋白、低密度脂蛋白或球蛋白)、碳水化合物(例如，葡聚糖、支链淀粉、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)或脂质。其也可以是重组或合成分子，如合成聚合物，例如，合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚赖氨酸(PLL)、聚L天冬氨酸、聚L谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙二醇)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物和聚磷嗪。在一个实施方式中，所述伴侣剂是胶束、脂质、纳米颗粒或微球。用于制备此类胶束、脂质体、纳米颗粒或微球的方法是本领域众所周知的。参见例如美国专利5,108,921；5,354,844；5,416,016；和5,527,5285。
药物组合物在生产和贮存条件下通常必需是无菌和稳定的。可以将药物组合物制成溶液、微乳、脂质体或其他适合高药物浓度和/或适合注射的有序结构。可以保持适当的流动相，例如，通过使用包衣，如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持所需粒径和通过使用表面活性剂。
在一个实施方式中，药物组合物是可注射组合物，其可以包含各种载体，如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可以通过滴注法给药，由此输注包含抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理学上可接受的赋形剂可以包含例如5％右旋糖、0.9％盐水、林格氏溶液或其他适宜赋形剂。肌内制剂，例如，抗体的适宜可溶性盐形式的无菌制剂，可以在药物赋形剂中溶解并施用，如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物掺入适当的溶剂中制备，根据需要，将上述一种或多种成分组合，然后进行灭菌微滤。通常，分散剂是通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备的，所述载体包含碱性分散介质和来自上文列举的那些所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何额外的所需成分的粉末。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶来实现。
可以通过灭菌程序和包含各种抗菌剂和抗真菌剂，例如氯丁醇、山梨酸苯酚等来确保防止微生物的存在。在组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠等也可能是所需的。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来实现。
本领域技术人员将理解，本发明的制剂可以与人血液等渗，即本发明的制剂具有与人血液基本相同的渗透压。此类等渗制剂通常具有从约250mOSm至约350mOSm的渗透压。等渗性可以通过例如蒸汽压或冰冻型渗透压计来测量。通过使用张力调节剂来调节制剂的张力。“张力调节剂”是那些药学上可接受的惰性物质，其可以加入到制剂中以提供制剂的等渗性。适用于本发明的张力调节剂包括但不限于糖类、盐类和氨基酸。
可以配制根据本发明所述的药物组合物以在施用后基本上立即或在施用后的任何预定时间或时间段释放活性成分(例如，本发明所述的双功能分子)。在一些方面中，药物组合物可以采用延时释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得组合物的递送发生在待治疗部位的致敏之前并且有足够的时间引起待治疗部位的致敏。可以使用本领域公知的方法来防止或最小化组合物的释放和吸收，直到其到达靶组织或器官，或确保组合物的定时释放。这样的系统可以避免组合物的重复给药，从而增加受试者和医生的便利性。
可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和特定的给药方式而变化。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的组合物的量。
受试者、方案和施用
本发明涉及如本文所述的双功能分子；编码其的核酸或载体，宿主细胞或药物组合物，核酸，载体或宿主细胞，其用作药物，或用于治疗疾病或用于在受试者中施用或用作药物。在下文的“方法和用途”部分更具体地描述了治疗的实例。其还涉及本发明的药物组合物、核酸、载体或宿主细胞或者包含抗PD1抗体或其抗体片段和SIRPa的双功能分子在制备用于在受试者中治疗疾病的药物中的用途。最后，其涉及用于在受试者中治疗疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的药物组合物或包含抗PD1抗体或其抗体片段和SIRPa的双功能分子。在下文的“方法和用途”部分更具体地描述了治疗的实例。
待治疗的受试者可以是人，特别是处于产前阶段的人、新生儿、儿童、婴儿、青少年或成人、特别是至少30岁、40岁的成人、优选地至少50岁的成人、另外更优选地至少60岁的成人、甚至更优选地至少70岁的成人。
特别地，受试者患有可能涉及PD-1/PDL-1通路，特别是其中表达、特别是过表达PD-1的配体(例如，PDL-1和/或PDL-2)或PD-1中的至少一种的疾病。优选地，受试者患有癌症、甚至更优选地患有PD1、PD-L1和/或PD-L2阳性癌症或PD-1阳性癌症。疾病和癌症的实例在下文“方法和用途”部分更具体地描述。
在一个特别的实施方式中，在施用根据本发明所述的包含抗PD1抗体或其抗体片段和SIRPa的双功能分子或根据本发明所述的药物组合物之前，受试者已接受至少一线治疗，优选地若干线治疗。
可使用本领域普通技术人员公知的常规方法向受试者施用双功能分子或本文公开的药物组合物，其取决于要质量的疾病类型或疾病部位。该组合物可以通过常规途径施用，例如，口服、肠胃外、肠内、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔、阴道或通过植入的储库施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、肿瘤内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输液技术。当肠胃外给药时，本发明所述的药物组合物优选通过静脉内给药途径施用。当经肠施用时，本发明所述的药物组合物优选通过口服给药途径施用。该组合物也可以局部施用。
根据本发明所述的药物组合物或双功能分子的药物组合物的形式、施用途径和施用剂量可由本领域技术人员根据感染的类型和严重程度以及患者，特别是其年龄、体重、性别和一般身体状况进行调整。本发明的组合物可以多种方式给药，这取决于需要局部治疗还是全身治疗。
优选地，用所述双功能分子或用根据本发明所述的药物组合物进行的治疗定期施用，优选地，在每天、每周或每月之间，更优选地，在每天与每周、每两周、每三周或每四周之间。在一个特别的实施方式中，治疗一天施用若干次，优选地一天2次或3次。
用所述双功能分子或用根据本发明所述的药物组合物进行的治疗的持续时间优选地介于1天至20周之间、更优选地介于1天至10周之间、另外更优选地介于1天至4周之间、甚至更优选地介于1天至2周之间。或者，治疗可持续至与疾病持续一样长。
本文公开的双功能分子可以在约1ng/kg体重至约30mg/kg体重、1μg/kg至约20mg/kg、10μg/kg至约10mg/kg、或从100μg/kg至5mg/kg的范围内的有效剂量，任选地每一周、两周、三周或四周，优选地通过肠胃外或口服施用，特别是通过静脉内或皮内施用提供。
通常，本文公开的双功能分子可以在约1mg/kg体重至约20mg/kg体重，有利地2至约10mg/kg，和特别地3、4、5、6、7mg/kg的范围内的有效剂量提供，所述范围对抗体安全施用而言是适宜的，且对临床需求而言是令人满意的。
特别地，根据本发明所述的双功能分子可以低于治疗剂量施用。如本文所用，术语“亚治疗剂量”指低于通常用于治疗疾病的有效单一疗法剂量水平的剂量，或当前通常不用于使用抗hPD1抗体进行有效单一疗法的剂量。
方法和用途
在治疗疾病中的用途
本发明所述的双功能分子、核酸、载体、宿主细胞、组合物和方法具有多种体外和体内效用和应用。例如，本文所述的双功能分子、核酸、载体、宿主细胞和/或药物组合物可以用作治疗剂、诊断剂和医学研究。特别地，本文提供的任何双功能分子、核酸分子、核酸分子组、载体、宿主细胞或药物组合物可以用于治疗方法中和/或用于治疗目的。特别地，本文提供的双功能分子、核酸、载体或药物组合物可以用于治疗任何疾病或病况，所述疾病或病况优选地涉及PD-1，例如癌症、自身免疫疾病和感染，或者与免疫缺陷相关的其他疾病，例如T细胞功能障碍。甚至更优选地，本发明涉及一种在有需要的受试者中治疗选自以下的疾病和/或病症的方法：癌症、感染性疾病和慢性感染，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如上文定义的双功能分子或药物组合物。在下文中更明确地描述了此类疾病的实例。
特别地，根据本发明所述的双功能分子被称为“双功能检查点抑制剂”，因为其靶向PD-1/PD-L1/PD-L2和SIRPa通路。
本发明特别涉及双功能分子，编码其的核酸、核酸组或载体，或者包含其的药物组合物用于治疗能够通过抑制PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合；和/或通过抑制CD47与SIRPa的结合而预防或治疗的病变、疾病和/或病症。
因此，本文公开了用于治疗特别与PD-1和/或PD-1/PD-L1和/或PD-1/PD-L2信号传导通路相关的疾病的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效量的本文所述的双功能分子或药物组合物中的任一个。还必须考虑患者的生理数据(例如，年龄、体型和体重)和施用途径来确定合适的剂量，以便给予患者治疗有效量。
本文公开了用于治疗疾病(特别是与SIRPa/CD47通路相关的)的另外的或替代的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效量的本文公开的双功能分子或药物组合物中的任一个。
在另一个方面中，可以例如在体内向受试者施用本文所述的双功能分子以增强免疫，优选地以治疗病症和/或疾病。因此，在一个方面中，本发明提供了一种改变受试者的免疫应答的方法，其包括向受试者施用本发明所述的双功能分子、核酸、载体或药物组合物，以使得在受试者中的免疫应答被改变。优选地，免疫应答被增强、增加、刺激或上调。所述双功能分子或药物组合物可以用于在需要治疗的受试者中增强免疫应答。如T细胞激活。免疫应答增强可以导致PD-L1和/或PD-L2和/或CD47与SIRPa的结合的抑制，从而减少免疫抑制环境，刺激人T细胞的增殖和/或激活和/或人PBMC的IFNγ分泌。
本发明特别地提供了一种在受试者中增强免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的双功能分子、核酸、载体或包含其的药物组合物中的任一个，以使得在所述受试者中的免疫应答是增强的。
在一些实施方式中，本文所述的双功能分子的量在抑制PD-1信号传导中是有效的(例如，与对照相比，降低PD-1信号传导至少20％、30％、50％、80％、100％、200％、400％或500％)。在其他实施方式中，本文所述的双功能分子的量在激活免疫应答中是有效的(例如，与对照相比，激活至少20％、30％、50％、80％、100％、200％、400％或500％)。
在一些实施方式中，本文所述的双功能分子的量在抑制人PD-L1和/或PD-L2与人PD-1的结合中是有效的(例如，与对照相比，抑制结合至少20％、30％、50％、80％、100％、200％、400％或500％)。
在一些实施方式中，本文所述的双功能分子的量足以具有人PD-L1和/或PD-L2与人PD-1结合的拮抗剂活性(例如，相比于对照，抑制结合至少20％、30％、50％、80％、100％、200％、400％或500％)。
在一些实施方式中，本文所述的双功能分子的量有效遏制SIRPa/CD47信号传导(例如，相比于对照，减少SIRPa/CD47信号传导至少20％、30％、50％、80％、100％、200％、400％或500％)。在一些实施方式中，本文所述的双功能分子的量有效激活免疫应答(例如，相比于对照，至少20％、30％、50％、80％、100％、200％、400％或500％)。
在一些实施方式中，本文所述的双功能分子的量有效抑制肿瘤细胞表达的CD47与APC表达的人SIRPa的结合，例如，相比于对照条件(即，不用本发明所述的双功能分子)，抑制所述结合至少20％、30％、50％、80％、100％、200％、400％或500％。
在一些实施方式中，本文所述的双功能分子的量足以具有CD47结合的竞争性活性，特别是与表达SIRPa的人免疫细胞(例如巨噬细胞)的竞争，例如，相比于对照条件(即，不用本发明所述的双功能分子)，抑制CD47与SIRPa阳性细胞之间的结合至少20％、30％、50％、80％、100％、200％、400％或500％。
本发明还涉及如本文所述的用于在受试者中治疗病症和/或疾病和/或用作药物或疫苗的双功能分子、编码其的核酸或载体、或包含其的药物组合物。其还涉及如本文所述的双功能分子、编码其的核酸或载体、或包含其的药物组合物在制备用于在受试者中治疗病症和/或疾病的药物中的用途。最后，其涉及用于在受试者中治疗疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明所述的药物组合物或双功能分子。
本文公开了治疗患有疾病和/或病症的患者的方法，其包括：(a)识别需要治疗的患者；和(b)向所述患者施用治疗有效量的本文所述的双功能分子、核酸、载体或药物组合物中的任一个。
需要治疗的受试者可以是患有、有风险患有或怀疑患有与PD-1介导的信号传导通路相关的疾病的人。可以通过常规医学检查来识别这样的患者。例如，可以通过检查此类受试者是否携带PD-1、PD-L1和/或PD-L2阳性细胞来识别适合所述治疗的受试者。优选地，“PD-L1阳性细胞”或“PD-L2阳性肿瘤细胞”旨在指代肿瘤细胞群体，其中PD-L1或PD-L2分别在至少10％(优选地至少20％、30％、40％或50％)的肿瘤细胞中表达。
在一个实施方式中，需要治疗的受试者是患有、怀疑患有或有风险患有疾病的患者，所述疾病优选地为PD-1、PDL1和/或PDL2阳性疾病，甚至更优选为其中PD-1和/或至少一种PD-1配体过表达的疾病。在这样的受试者中，由于根据本发明所述的双功能分子或药物组合物的施用，PD-1/PD-L1和/或PD-1/PD-L2相互作用的破坏可以增强所述受试者的免疫应答。在一些实施方式中，本文所述的人源化抗PD-1抗体或药物组合物中的任一个可用于治疗PD-1阳性细胞。
-癌症
本领域公知，抗体对PD-1的阻断能够增强患者中针对癌细胞的免疫应答。因此，在一个方面中，本发明提供了一种双功能分子或药物组合物，其用于治疗患有癌症的受试者的用途，其包括向个体施用有效量的所述双功能分子或药物组合物，其能够激活耗竭T细胞，且优选地能够破坏或抑制PD1/PD-L1和/或PD1/PD-L2相互作用，且优选地能够至少部分阻止、破坏或抑制受试者中天然发生的CD47/SIRPa相互作用。
在一个实施方式中，需要治疗的受试者是患有、疑似患有或处于疾病(优选地PD-1阳性癌症，甚至更优选地，其中PD-1表达或过表达的癌症)风险中的患者。在一些实施方式中，本文所述的抗PD-1抗体或药物组合物中任一个可以用于治疗PD-1阳性肿瘤细胞。例如，可以通过考察此类患者是否携带PD-1阳性肿瘤细胞来鉴定适于所述治疗的患者。
在另一个实施方式中，受试者是患有、疑似患有或处于癌症(优选地PD-L1和/或PD-L2阳性癌症)进展风险中的患者。在一些实施方式中，本文所述的双功能分子或药物组合物中的任一个能够用于治疗PD-L1和/或PD-L2阳性肿瘤。例如，可以通过考察此类患者是否携带PD-L1和/或PD-L2阳性癌细胞来鉴定适于所述治疗的人类患者。
在另一个实施方式中，受试者是患有、疑似患有或处于癌症进展(优选地CD47阳性癌症)风险中的患者。在一些实施方式中，本文所述的双功能分子或药物组合物中的任一个能够用于治疗CD47阳性肿瘤。例如，可以通过考察此类患者是否携带CD47阳性癌细胞来鉴定适于所述治疗的人类患者。
在其他方面中，提供了一种双功能分子或药物组合物，其用于治疗癌症、优选地PD-1、CD47、PD-L1和/或PD-L2阳性癌症、甚至更优选地其中PD-1、CD47、PD-L1和/或PD-L2过表达的癌症。
在另一个实施方式中，本发明提供了如本文公开的双功能分子或药物组合物在制备用于在受试者中治疗癌症(例如抑制肿瘤细胞(优选地PD-1、CD47、PD-L1或PD-L2阳性肿瘤细胞)生长的药物的用途。
在本公开内容的一个方面中，待治疗的癌症与耗竭T细胞相关。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗癌症(例如用于抑制受试者中肿瘤细胞生长)的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明所述的双功能分子或药物组合物。特别地，本发明涉及使用双功能分子治疗受试者从而抑制癌细胞的生长。
可以使用本文提供的双功能分子来治疗的任何适宜癌症可以是造血系统癌症或实体癌。此类癌症包括癌瘤、宫颈癌、结肠直肠癌、食管癌、胃癌、胃肠癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、胶质瘤、间皮瘤、黑色素瘤、胃癌、尿道癌、环境诱发的癌症以及所述癌症的任何组合。本发明还用于治疗转移性癌症，特别是表达PD-L1的转移性癌症(Iwai等，(2005)Int.Immunol.17:133-144)。此外，本发明包括难治性或复发性恶性肿瘤。
在一个特别的方面中，癌症是高表达PD-1和/或PD-L1的血液系统恶性肿瘤或实体瘤。此类癌症可以选自以下：淋巴造血系统肿瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓性白血病。
在一个特别的方面中，癌症是由病毒诱导的或与免疫缺陷相关的癌症。此类癌症可以选自以下：卡波西氏肉瘤(例如，与卡波西氏肉瘤疱疹病毒相关)；宫颈、肛门、阴茎和外阴鳞状细胞癌以及口咽癌(例如，与人乳头瘤病毒相关)；B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、HHV-8原发性渗出性淋巴瘤、经典霍奇金氏淋巴瘤和淋巴增生性病症(例如，与爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)和/或卡波西氏肉瘤疱疹病毒相关的)；肝细胞癌(例如，与乙型肝炎和/或丙型肝炎病毒相关的)；梅克尔细胞癌(例如，与梅克尔细胞多瘤病毒(MPV)相关的)；和与人免疫缺陷病毒感染(HIV)相关的癌症。
优选地，待治疗或预防的癌症选自以下：转移性或非转移性黑色素瘤、恶性间皮瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、头颈癌、尿道上皮癌、结肠直肠癌、肝细胞癌、小细胞肺癌、转移性梅克尔细胞癌、胃癌或胃食管癌和宫颈癌。
优选的治疗癌症包括通常对免疫疗法起应答的癌症。或者，优选的治疗癌症是对免疫疗法无应答的癌症。
举例而言且不希望受到理论束缚，用抗癌抗体或抗癌免疫缀合物或其他导致癌细胞死亡的当前抗癌疗法进行治疗将加强由PD-1介导的免疫应答。因此，过度增殖性疾病(例如，癌症肿瘤)的治疗可包括如本文公开的双功能分子与抗癌治疗的组合，同时或顺序或其任何组合，这可能会增强宿主的抗肿瘤免疫应答。优选地，可以将所述双功能分子与其他免疫原性药剂、标准癌症治疗或如下文所述的其他抗体联合使用。
-感染性疾病
本发明所述的双功能分子、核酸、核酸组、载体、宿主细胞或药物组合物用于治疗已暴露于特定毒素或病原体的患者。因此，本发明的一个方面提供了一种在受试者中治疗感染性疾病的方法，其包括向所述受试者施用根据本发明所述的双功能分子或者包含其的药物组合物，优选地以使得所述受试者的感染性疾病得到治疗。
可以使用本文提供的双功能分子、核酸、核酸组、载体、宿主细胞或药物组合物来治疗任何适宜的感染。
引起可由本发明方法治疗的感染的致病性病毒的一些实例包括HIV、肝炎(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、爱泼斯坦巴尔病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和虫媒脑炎病毒。
特别地，本发明所述的双功能分子或药物组合物用于治疗患有慢性病毒感染的患者，此类感染由选自以下的病毒引起：逆转录病毒、指环病毒、圆环病毒、疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、多瘤病毒BK、多瘤病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹1型(HSV-1)、腺病毒、单纯疱疹2型(HSV-2)、卡波西氏氏肉瘤疱疹病毒(KSHV)、乙型肝炎病毒(HBV)、GB病毒C、乳头瘤病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、丁型肝炎病毒(HDV)、人T细胞白血病病毒1型(HTLV1)、异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMLV)、风疹病毒、德国麻疹、细小病毒B19、麻疹病毒、柯萨奇病毒。
引起可由本发明方法治疗的感染的致病性细菌的一些实例包括衣原体、立克次体细菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和链球菌、克雷伯菌、变形杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团菌、白喉、沙门氏菌、杆菌、霍乱、破伤风、肉毒杆菌、炭疽、鼠疫、钩端螺旋体病和莱姆病细菌。
引起可由本发明方法治疗的感染的致病性真菌的一些实例包括念珠菌属(白色念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌等)、新型隐球菌、曲霉属(烟曲霉、黑曲霉等)、毛霉菌目(毛霉菌属、犁头霉属、根霉属)、申基孢子丝菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和荚膜组织胞浆菌。
引起可由本发明方法治疗的感染的致病性寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴、大肠蠕虫、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴虫属、蓝氏贾弟鞭毛虫、隐孢子虫属、卡氏肺囊虫、间日疟原虫、小巴贝斯虫、布氏锥虫、克氏锥虫、多诺瓦利什曼原虫、刚地弓形虫和巴西日圆线虫。
在所有上述方法中，所述双功能分子可与诸如细胞因子治疗(例如，干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)的其他形式的免疫疗法或增强肿瘤抗原呈递的任何疗法联合。
联合疗法
特别地，根据本发明所述的双功能分子可以与一些其他潜在的策略相结合，以克服临床开发中或已经上市药物的免疫逃避机制(参见，Antonia等，Immuno-oncologycombinations:a review of clinical experience and future prospects.Clin.CancerRes.Off.J.Am.Assoc.Cancer Res.20,6258–6268,2014的表1)。这种与根据本发明所述的双功能分子的组合可特别用于：
1-逆转适应性免疫的抑制(阻断T细胞检查点通路)；
2-开启适应性免疫(使用激动剂分子(特别是抗体)促进T细胞共刺激受体信号传导)；
3-改善先天性免疫细胞的功能；
4-激活免疫系统(增强免疫细胞效应功能)，例如通过基于疫苗的策略。
因此，本文还提供了用于与如本文所述的PD-1信号传导和/或SIRPa信号传导相关的任何疾病的联合疗法，其使用如本文所述的双功能分子或包含其的药物组合物中的任一个以及合适的第二药剂。在一个方面中，所述双功能分子和所述第二药剂可存在于如上文所述的药物组合物中。或者，如本文所用，术语“联合疗法”或“联合的疗法”包括以顺序方式施用这些药剂(例如，如本文所述的双功能分子和另外或第二适宜治疗剂)，即，其中每种治疗剂在不同时间施用，以及这些治疗剂或至少两种药剂以基本上同时的方式施用。顺序或基本上同时施用每种药剂可以通过任何适当途径实现。药剂可以通过相同途径或通过不同途径施用。例如，第一药剂(例如，双功能分子)可以口服施用，且另一治疗剂(例如，抗癌剂、抗感染剂或免疫调节剂)可以静脉内施用。或者，所选组合的药剂可以通过静脉内注射施用，而组合的其他药剂可以口服施用。
在另一个方面中，本发明涉及一种治疗手段，特别是组合产品手段，其包含作为活性成分的：如上文定义的双功能分子和另外的治疗剂，其中所述活性成分被配制用于单独、顺序或联合疗法，尤其是组合或顺序使用。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“顺序”指以规则顺序或次序为特征，例如，如果给药方案包括施用双功能分子和另外的或第二药剂，则顺序给药方案可以包括在施用第二药剂之前、同时、基本同时或之后施用本发明所述的双功能分子，但两种药剂将以规则顺序或次序施用。除非另有说明，否则术语“单独”指将一个与另一个分开。除非另有说明，否则术语“同时”指同时发生或完成，即本发明所述的药剂同时施用。术语“基本上同时”指药剂在彼此相隔几分钟内(例如，彼此相隔15分钟内)施用，并且旨在包括联合施用和连续施用，但如果施用是连续的，但是，如果施用是连续的，则其在时间上只间隔很短的时间(例如，医生分别施用两种化合物所需的时间)。
应当理解，如本文所述的任何组合可以以任何顺序用于治疗本文所述的病症或疾病。可以基于多种因素来选择本文所述的组合，这些因素包括但不限于抑制或预防目标疾病进展的效用、减轻组合的另一种药剂的副作用的效用，或减轻与目标疾病相关的症状的效用。例如，本文所述的联合疗法可以降低与组合的每个单独成员相关的任何副作用。
本发明还涉及一种用于在受试者中治疗疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的双功能分子或药物组合物和治疗有效量的另外的或第二治疗剂。
当本文所述的双功能分子或药物组合物与另外的治疗剂共同使用时，所述双功能分子、所述组合物或所述另外的或第二药剂的亚治疗剂量，或两者的亚治疗剂量，可用于治疗受试者，优选患有或有风险发生与由PD-1和/或SIRPa介导的细胞信号传导相关的疾病或病症的受试者。
在WO 2018/053106第36-43页中提供了另外的或第二治疗剂的具体实例。
在一个方面中，所述另外的或第二治疗剂可在包含以下的非详尽列表中选择：烷化剂、血管生成抑制剂、抗代谢物、抗有丝分裂剂、抗增殖剂、抗病毒剂、极光激酶抑制剂、凋亡促进剂(例如，Bcl-2家族抑制剂)、死亡受体通路激活剂、Bcr-Abl激酶抑制剂、BiTE(双特异性T细胞接合剂)抗体、抗体药物缀合物、生物应答调节剂、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、环氧合酶-2抑制剂、DVD、白血病病毒癌基因同源物(ErbB2)受体抑制剂、生长因子抑制剂、热休克蛋白(HSP)-90抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、激素疗法、免疫药、凋亡蛋白抑制剂(IAP)的抑制剂、嵌入型抗生素、激酶抑制剂、驱动蛋白抑制剂、Jak2抑制剂、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂、microRNA、丝裂原激活的胞外信号调节激酶抑制剂、多价结合蛋白、非甾体抗炎药(NSAID)、聚ADP(二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、铂类化学治疗剂、polo样激酶(Plk)抑制剂、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、受体酪氨酸激酶抑制剂、类视黄醇/类维生素D植物生物碱、小抑制性核糖核酸(siRNA)、拓扑异构酶抑制剂、泛素连接酶抑制剂、低甲基化剂、检查点抑制剂、肽疫苗等、来自肿瘤抗原的表位或新表位以及这些药剂的一种或多种的组合。
例如，所述另外的治疗剂可以选自以下：化学疗法、放射疗法、靶向疗法、抗血管生成剂、低甲基化剂、癌症疫苗、来自肿瘤抗原的表位或新表位、骨髓检查点抑制剂、其他免疫疗法和HDAC抑制剂。
在一个优选的实施方式中，所述第二治疗剂选自以下：化学治疗剂、放射疗法药剂、免疫治疗剂、细胞疗法药剂(例如CAR-T细胞)、抗生素和益生菌。所述免疫治疗剂还可以是抗体靶向肿瘤抗原，特别地选自以下：抗Her2、抗EGFR、抗CD20、抗CD19、抗CD52。
在一个实施方式中，本发明涉及如上文定义的联合疗法，其中所述第二治疗剂特别地选自以下：治疗性疫苗、免疫检查点阻断剂或激活剂、特别是适应性免疫细胞(T和B淋巴细胞)和抗体-药物缀合物。优选地，用于与根据本发明所述的抗hPD-1抗体或其片段或者药物组合物共同使用的适宜药剂包括结合至共刺激受体(例如，OX40、CD40,、ICOS、CD27、HVEM或GITR)的抗体、诱导免疫原性细胞死亡的药剂(例如，化学治疗剂、放射性治疗剂、抗血管生成剂或用于靶向疗法的药剂)、抑制检查点分子(例如，CTLA4、LAG3、TIM3、B7H3、B7H4、BTLA或TIGIT)的药剂、癌症疫苗、调节免疫抑制酶(例如，IDO1或iNOS)的药剂、靶向Treg细胞的药剂、用于过继性细胞疗法的药剂或调节髓系细胞的药剂。
在一个实施方式中，本发明涉及如上文定义的联合疗法，其中所述第二治疗剂是选自以下的适应性免疫细胞(T和B淋巴细胞)的免疫检查点阻断剂或激活剂：抗CTLA4、抗CD2、抗CD28、抗CD40、抗HVEM、抗BTLA、抗CD160、抗TIGIT、抗TIM-1/3、抗LAG-3、抗2B4和抗OX40、抗CD40激动剂、CD40-L、TLR激动剂、抗ICOS、ICOS-L和B细胞受体激动剂。
在一个实施方式中，所述第二治疗剂是靶向肿瘤抗原的抗体，特别地选自以下：抗Her2、抗EGFR、抗CD20、抗CD19抗CD52。
联合疗法还依赖于施用双功能分子与手术、化学疗法(例如，如多西他赛或达卡巴嗪)、放射疗法、免疫疗法(例如，如靶向CD40、CTLA-4的抗体)、基因靶向和调节和/或其他药剂(例如免疫调节剂、血管生成抑制剂)及其任何组合的组合。
试剂盒
本文所述的任何抗体或组合物可以包括在本发明提供的试剂盒中。本公开内容特别提供了用于增强免疫应答和/或治疗与PD-1信号传导、SIRPa/CD47信号传导相关的疾病(例如，癌症和/或感染)的试剂盒。
在本发明的背景下，术语“试剂盒”指包装在容器(container/recipient)或其他中的两种或更多种组分(其中之一对应于本发明所述的双功能分子、核酸分子、载体或细胞)。因此，可以将试剂盒描述为足以达成某一目标的一组产品和/或用具，其可作为单个单元销售。
特别地，根据本发明所述的试剂盒可以包含：
-如上定义的双功能分子，
-与SIRPa或其变体连接的抗hPD1抗体或其抗原结合片段
-编码所述双功能分子的核酸分子或核酸分子组，
-包含所述核酸分子或核酸分子组的载体，和/或
-包含所述载体或核酸分子或核酸分子组的细胞。
因此，在合适的容器手段中，所述试剂盒可以包含本发明所述的药物组合物和/或双功能分子和/或宿主细胞，和/或编码本发明所述的核酸分子和/或核酸分子的载体，和/或本发明所述的酸分子或相关试剂。在一些实施方式中，可以提供从个体获取样品和/或测定样品的手段。在某些实施方式中，所述试剂盒包含细胞、缓冲剂、细胞培养基、载体、引物、限制性酶、盐等。试剂盒还可以包含用于容纳无菌、药学上可接受的缓冲剂和/或其他稀释剂的构件。
容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在一个实施方式中，本发明涉及如上文定义的用于单剂量施用单元的试剂盒。本发明所述的试剂盒可以包含包含干燥/冻干双功能分子的第一容器和包含水性制剂的第二容器。在本发明的某些实施方式中，提供了包含单室和多室预充式注射器(例如，液体注射器和冻干物注射器)的试剂盒。
本发明所述的试剂盒在适宜包装中。适宜包装包括单不限于小瓶、瓶子、罐、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料瓶)等。还涉及与特定装置如吸入器、鼻内施用装置(例如，雾化器)或输液装置如微型泵联合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进入孔(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有皮下注射针可穿刺的塞子的小瓶)。容器也可以具有无菌进入孔(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有皮下注射针可穿刺的塞子的小瓶)。所述组合物中的至少一种活性剂是本文所述的双功能分子，其包含与SIRPa或其变体连接的抗hPD-1抗体。
还可以将在根据本发明所述的试剂盒中包含的组合物配制成注射器相容性组合物。在这种情况下，容器构件本身可以是注射器、吸管和/或其他此类设备，从这些装置可以将制剂施用于身体的感染区域，和/或甚至应用于和/或与试剂盒的其他组分混合。试剂盒的组分可替代地以干燥粉末的形式提供。当试剂和/或组分以干燥粉末形式提供时，可以通过添加适宜溶剂重构可溶性组分。设想溶剂也可以提供在另一种容器装置中并且适合于施用。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于治疗癌症或感染性疾病的另外的药剂，并且所述另外的药剂可以与所述双功能分子或本发明所述的试剂盒的其他组分联合使用，或者可以单独提供在试剂盒中。特别地，本文所述的试剂盒可以包含一种或多种另外的治疗剂，如在上文所述的“联合疗法”中所描述的那些。试剂盒可以针对个体的特定癌症进行定制，并且包含用于个体的如上文所描述的对应的第二癌症疗法。
与本文所述的双功能分子或药物组合物的使用相关的说明书通常包括关于剂量、给药方案、预期治疗的施用途径、用于重构所述双功能分子的手段和/或稀释本发明所述的双功能分子的手段的信息。在本发明所述的试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装说明书上的书面说明(例如，以传单或说明书形式包含在试剂盒中的纸页)。在一些实施方式中，所述试剂盒可以包含根据本文所述的任何方法使用的说明书。所包含的说明书可以包括对施用包含所述双功能分子的药物组合物以增强免疫应答和/或治疗如本文所述的疾病的描述。该试剂盒还可以包含基于鉴定个体是否患有与PD-1信号传导相关的疾病(例如，本文所述的那些)来选择适合治疗的个体的描述。
实施例
下列附图和实施例旨在为本领域普通技术人员提供如何制作和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人视为其发明的范围，也不旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。虽然已经参照本发明的具体实施方式描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变并且可以被等价物替换。此外，可以进行许多修改以使特定情况、材料、物质组成、工艺、一个或多个工艺步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改都旨在在所附权利要求的范围内。
双功能分子(Bicki)
包含抗PD-1抗体和人SIRPa的双功能分子，所述蛋白与所述抗PD-1抗体的多肽链(所述抗体的轻链(抗PD1VL-SIRPa抗体)或重链(抗PD1VH-SIRPa抗体))共价连接。
实施例1：双功能分子抗PD-1-SIRPa在与PD1结合上的作用及其在PD1-PDL1相互作 用上的拮抗能力
评估了Bicki分子与PD1重组分子结合的能力，并通过ELISA进行了Bicki分子对PD1-PDL1相互作用的抑制功效。结果呈现于图1和2中。Bicki抗PD1-Sirpa分子(其中SIRPa与抗体的重链或轻链融合)不改变与PD1的结合。Bicki抗PD1-Sirpa分子相比于单独的抗PD1抗体仍然能够抑制PD1-PDL1相互作用。没有在与抗体的重链或轻链融合的Bicki分子之间观察到显著差异。
通过表面等离子共振实验(Biacore测定)确认了这些数据，使用了传感器芯片上的抗人Fc抗体捕获单独的抗PD-1或双功能分子。然后，添加不同浓度的PD-1重组蛋白(6,25至100nM)以测量亲和力。单独的抗PD-1相比于抗PD1-Sirpa双功能分子(3,83nM)表现出与类似的与PD-1的高亲和力(其KD为3,46nM)。
实施例2：与Bicki抗PD1-Sirpa分子的CD47的结合
通过ELISA评估了Bicki抗PD1-Sirpa分子与CD47(SIRPa配体)结合的能力。图3呈现的结果显示Bicki抗PD1-Sirpa分子保留了其结合SIRPa配体(即CD47)的能力。出乎意料地，已观察到Bicki抗PD1VH-Sirpa分子相比于Bicki抗PD1VL-Sirpa分子具有更高的功效。
实施例3：分子BiCKI SIRPa在表达受体CD47和PD1两者的T细胞上的结合。
评估了BiCKI SIRPa通过结合相同细胞上的CD47和PD-1蛋白来靶向T细胞的能力。将仅表达CD47受体或共表达PD-1和CD47蛋白的Jurkat细胞与BiCKI SIRPa分子或SIRPa-Fc分子一起孵育。用抗人IgG Fc-PE揭示所述结合。图4确认了BiCKI SIRPa作用于相同T细胞上的机制，因为所述分子相比于仅表达CD47的细胞以高2倍的功效结合表达CD47+PD-1+的细胞。这些实验表明，双功能Bicki SIRPa分子被设计为相对于其他CD47+细胞，优先地靶向CD47+PD-1+耗竭的T细胞。
实施例4：Bicki抗PD1-Sirpa分子对PBMC和T细胞增殖和激活的体外和离体功效
进行了测量T细胞激活的体外生物测定以比较Bicki抗PD1-Sirpa分子与单独的抗PD-1。首先，通过在生物测定中使用的T细胞系上的FAC测量了PD1和CD47的表达。图5A显示了细胞表面上PD1和CD47分子两者的良好表达。出乎意料地，在图5B中，发明人观察到Bicki抗PD1-Sirpa分子(EC50＝0.6nM)比单独的抗PD1抗体(EC50＝5nM)诱导更好的NFAT TCR介导的激活(图5B)。以出乎意料的方式，发明人还观察到，Bicki SIRPa相比于抗PD-1+同种型SIRPa的组合在激活NFAT信号传导方面更有效，证明了Bicki分子中抗PD-1与SIRPa的融合实现了激活T细胞的协同作用。这种作用需要激活CD47介导的信号传导，因为使用CD47阻断抗体(克隆B6H12)完全消除了BiCKI SIRPa的协同作用(图5B)。通过靶向PD-1受体，Bicki分子的抗PD-1结构域允许SIRPa的交联，和随后T细胞上CD47分子的聚类。CD47介导的信号传导增强了抗PD-1作用，导致更好的T细胞激活。如图5D所示，在用IgG1 N298A或IgG4S228P同种型构建的Bicki SIRPa分子中观察到相似的协同作用。
发明人已经构建了具有其他抗PD-1骨架(派姆单抗或纳武单抗)的Bicki SIRPa分子。图5E显示这些Bicki分子相比于单独的抗PD-1具有相似的协同作用，表明本发明可适用于其他抗PD-1骨架。还使用在其重链上与另一种1型蛋白融合的Bicki抗PD1进行了生物测定。图5的部分F表明对照抗PD1和Bicki抗PD1VH-I型蛋白在NFAT激活上几乎没有差异，表明观察到的增强效果是针对Bicki SIRPa分子的，不适用于任何Bicki分子。
在另一生物测定中，发明人评估了Bicki SIRPa分子在T细胞中刺激钙信号的功效，其是激活T细胞效应子功能的另一种必需介导子。图6A和B显示，Bicki SIRPa分子以与CD28刺激相似的程度增强了由aCD3刺激诱导的钙信号。有趣的是，单独的Bicki SIRPa分子没有作用(图6A)，表明Bicki SIRPa分子作为共刺激信号，且只会促进TCR接合的T细胞激活。
总之，这些结果表明，Sirpa与抗PD1抗体融合的双功能分子增强抗PD1作用，并强烈表明SIRPa在CD47上的结合不仅阻断了“不要吃我(don’t EAT-ME)”抑制性吞噬信号，而且还促进了CD47依赖性T细胞共刺激。对人PBMC和T细胞进行了离体测定以研究Bicki抗PD1-Sirpa分子对增殖和激活的功效。结果呈现于图7和8中。这些结果清楚且令人惊讶地表明，Bicki抗PD1-Sirpa分子增加了如IFNg分泌所反映的人PBMC增殖和激活，而单独使用抗PD1或使用抗PD1与另外的重组人SIRPa蛋白的组合时情况并非如此，证实了将抗PD1上的SIRPa融合到Bicki分子中以增加T细胞增殖和激活的协同作用。人T细胞的结果证实，Bicki抗PD1-Sirpa分子相比于单独的抗PD1能更好地增强T细胞增殖和激活T细胞。特别是，相比于单独的抗PD1分子(<500pg/ml)，Bicki抗PD1-Sirpa分子诱导的IFNg分泌量(在各种临床试验中预测抗PD1功效的关键观察决定因素)非常高(>10000pg/ml)。
图9证实了在慢性抗原刺激后刺激衰竭的人T细胞增殖的有效协同作用。实际上，SIRPa重组蛋白或单独的抗PD-1相比于同种型对照不诱导T细胞增殖，而出乎意料地，Bicki抗PD1-Sirpa分子强烈刺激衰竭T细胞的增殖。该差异突出了双功能抗体相比于使用两个单独分子的联合治疗的优势。本发明所述的Bicki抗PD1-Sirpa分子将分子停靠在PD1+细胞聚类SIRPa分子上，从而刺激CD47信号传导进入T细胞中和T细胞增殖。
实施例5：Bicki抗PD1-Sirpa分子增强T细胞至肿瘤中的迁移
使用基于3D肿瘤球体的测定研究了T细胞的迁移。通过将A549肿瘤细胞与成纤维细胞和单核细胞共培养来产生肿瘤球体以模拟实体肿瘤微环境的复杂性。将人T细胞加至孔中，并通过免疫荧光和共聚焦显微镜分析评估了T细胞至肿瘤球体中的迁移。图10显示，用BiCKI SIRPa分子的治疗相比于同种型对照治疗增加了进入肿瘤中的T细胞/肿瘤细胞的数量。肿瘤微环境中T细胞的缺乏是抗PD-1单药治疗相关的主要抗性机制之一。这些数据表明BiCKi SIRPa分子可以通过增强T细胞至肿瘤微环境中的迁移来克服这种抗性。
实施例6：Bicki抗PD1 SIRPa分子在体内的药代动力学特性
为了分析Bicki分子的药代动力学，BalbcRJ(雌性6-9周)用单剂量的BiCKi SIRPa分子对BalbcRJ(雌性6-9周)进行了眼眶内处理。通过ELISA，使用固化抗人轻链抗体(克隆NaM76-5F3)评估了血浆中的Bicki分子浓度，并添加了包含抗PD-1抗体的稀释血清。用过氧化物酶标记的驴抗人IgG(Jackson Immunoresearch；USA；目录号709-035-149)进行了检测，并通过常规方法显示。
在该测定中，测试了两种不同的Bicki SIRPa分子并比较了(1)具有IgG1 N298A同种型且在Fc和SIRPa结构域之间有GGGGS接头的BiCKI SIRPa分子和(2)具有IgG4 S228P和GGGGSGGGGSGGGGS接头的BiCKI SIRPa分子。观察到两种分子的线性药代动力学特征具有相似的吸收相(图11)。在注射后15分钟时，两种构建都获得了约200nM的Cmax。然而，出乎意料地，具有GGGS和IgG1同种型的biCKI SIRPa分子相比于用IgG4骨架和长接头构建的BiCKISIRPa分子描绘出较低的消除/分布相。这些数据表明，将IgG1 N298A与短接头一起用于Bicki SIRPa构建可延长体内药物暴露，并随之增强药物的治疗功效。
材料和方法
结合PD1的ELISA和桥接ELISA测定
对于结合PD1的ELISA测定，将重组hPD1(Sino Biologicals,Beijing,China；目录号10377-H08H)在碳酸盐缓冲液(pH 9.2)中以0.5μg/ml固化在塑料上，并添加纯化抗体以测量结合。在孵育和洗涤后，添加过氧化物酶标记的驴抗人IgG(Jackson Immunoresearch；USA；目录号709-035-149)，并通过常规方法揭示。
对于桥接ELISA测定，使用了类似的方法。固化重组hPD1，并在序列稀释下添加纯化的双功能抗体。孵育和洗涤后，然后以1μg/mL的浓度添加CD47fc重组蛋白(SinoBiologicals，目录号12283-H02H)。使用抗CD47特异性小鼠抗体(克隆B6H12)和过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG抗体(目录号715-036-151)来进行检测。使用常规方法来进行揭示。
ELISA拮抗剂：PDL1与人源化抗PD1之间的竞争
通过PD-1:PD-L1抑制剂筛选ELISA测定对(AcroBiosystems；USA；目录号EP-101)进行竞争ELISA测定。在该测定中，将重组hPDL1在PBS pH 7.4缓冲液中以2μg/ml固化在塑料上。在37℃下将纯化抗体(不同浓度)与0.66μg/ml最终(固定浓度)生物素化人PD1(AcroBiosystems；USA；目录号EP-101)混合2小时以测量竞争性结合。在孵育和洗涤后，添加过氧化物酶标记的链霉亲和素(Vector laboratoring；USA；目录号SA-5004)以检测生物素-CD47Fc结合，并通过常规方法揭示。
IFNγ分泌和T细胞增殖测定
将从健康供体中分离的外周血单核细胞或纯化T细胞用于实验。
对于使用初始PBMC的实验，在抗CD3+/-CD28(克隆OKT3和CD28.2,3ug/mL)包被的板上将PBMC与同种型对照(B12G4M)、抗PD-1、抗PD-1+rSIRPa(Sino Biologicals，目录号11612-H08H)、BiCKI抗PD-1VH SIRPa或BiCKI抗PD-1VH SIRPa一起孵育。通过ELISA在第2天收获的上清液中定量IFNg(人IFNg ELISA集，BD Bioscience，USA，目录号555142)。在第6天通过H3胸苷掺入来评估增殖。用抗CD3(克隆OKT3，3ug/mL，有或没有抗CD28(克隆CD28.2，3ug/mL)刺激T细胞。
对于使用激活T细胞的实验，首先在抗CD3/CD28包被的板(各为3ug/mL)上刺激T细胞。刺激后24小时，在存在同种型对照、抗PD-1或BiCKI VH SIRPa和BiCKI VL SIRPA(10ug/mL)的情况下，在抗CD3(克隆OKT3，2μg/mL)+重组人PD-L1(Sinobiological，目录号10084-H02H，5ug/mL)上对T细胞进行收集、计数和重刺激。在第6天，通过H3胸苷掺入来评估T细胞增殖，并收集上清液以定量IFNg分泌。
对于使用长期刺激的PBMC的实验，每3天在CD3 CD28包被的板(OKT3为3ug/mL，和CD28.2抗体为3ug/mL)上反复刺激人PBMC。第3次刺激后，将T细胞与同种型对照或抗PD-1、重组SIRPa蛋白或BiCKI抗PD-1VH SIRPa(5ug/mL)一起孵育。在第5天进行H3掺入试验以确定T细胞增殖。
使用Promega的基于细胞的生物测定进行的T细胞激活测定
使用Promega PD-1/PD-L1试剂盒(目录号J1250)测试了抗PD-1抗体恢复T细胞激活的能力。使用两种细胞系(1)效应T细胞(稳定表达PD-1、NFAT诱导的荧光素酶的Jurkat)和(2)激活靶细胞(稳定表达PDL1和设计为以抗原独立性方式刺激同源TCR的表面蛋白的CHO K1细胞。当细胞共培养时，PD-L1/PD-1相互作用抑制TCR介导的激活，从而阻断NFAT激活和荧光素酶活性。抗PD-1抗体的添加阻断PD-1介导的抑制信号，导致NFAT激活和荧光素酶合成和生物发光信号的发射。按照制造商的建议进行实验。测试了PD-1抗体的序列稀释。在PD-L1+靶细胞、PD-1效应细胞和抗PD-1抗体共培养后四小时，将BioGloTM荧光素底物加入孔中，并使用TecanTM光度计读取板。
钙通量测定
在HBSS培养基中，在37C下，用Fura-red(Thermofisher，#F3021，5uM)对CD47+PD1+Jurkat细胞进行染色30分钟，然后用补充有HEPES(10mM)、BSA 1％和CaCl2(1mM)的HBSS培养基洗涤两次并使用相同介质重悬。在LSR FAC上采集1分钟以设置荧光背景后，将Bicki抗PD1-SIRPa抗体单独(45nM 10ug/mL)或与CD3抗体(克隆OKT3，10X 10ug/mL)混合添加到细胞上。计算每秒采集的BV711/PercP5.5 MFI比率并对应于刺激前的MFI(平均为20秒)归一化至1。使用Graph pad软件计算并报告每次刺激的AUC(曲线下面积)。
biCKI Sirpa的体内药代动力学
为了分析药代动力学，向BalbcRJ(雌性6-9周龄)眼眶内注射单剂量的分子。通过ELISA，使用固化抗人轻链抗体(克隆NaM76-5F3)来测定血浆中药物浓度。使用过氧化物酶标记的驴抗人IgG(Jackson Immunoresearch；USA；目录号709-035-149)来进行检测，并通过常规方法揭示。
3D球体迁移测定
在96孔U型底低附着板(6055330Perkin Elmer)中建立3D细胞培养物，并分别为A549、MRC-5和新鲜单核细胞以5000、1500和10000个细胞/孔接种。形成球体并在完全RPMI中与GM-CSF(10ng/ml)一起孵育。用同种型(IgG4)或BICKI-Sirpr(50nM)处理细胞3天。在第3天，将250 000个T细胞/孔添加到球体上。共培养72小时后，在室温下，在PFA 4％中固定球体15分钟，在PBS中洗涤3次，并在4℃的PBS-FBS-EDTA缓冲液中保持到染色为止。然后，在PBS-0.5％Triton中透化球体，在室温下在PBS-0.1％Triton-1％BSA中的1小时饱和步骤后，将球体与一级兔抗人CD3(A045229-2；6μg/ml，在4C下染色)一起孵育，然后在室温下将其与二级驴抗兔A488抗体(10μg/ml)和DAPI(10μg/ml)一起孵育2小时。使用A1RSi共聚焦显微镜(Nikon)进行荧光检测，并通过FIJI软件，使用morpholibJ、LoG和3D套件插件来分析共聚焦z切片图像。
抗体和双功能分子
以下抗体和双功能分子已用于本文公开的不同实验中：派姆单抗(Keytrudra，Merck)、纳武单抗(Opdivo，Bristol-Myers Squibb)，并且本文公开的双功能分子包含抗PD1人源化抗体或抗PD1嵌合抗体，所述抗PD1人源化抗体包含如SEQ ID NO:19、22或24定义的重链可变结构域和如SEQ ID NO:28定义的轻链可变结构域，所述抗PD1嵌合抗体包含如SEQ ID NO:53定义的重链和如SEQ ID NO:54定义的轻链。
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Claims (22)

1.一种双功能分子，其包含：
(a)抗人PD-1抗体或其抗原结合片段，其包含：
(i)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变结构域(VH)，和
(ii)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变结构域(VL)，和
(b)人SIRPa或其片段或变体，
其中所述抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的C-端末端，优选地通过肽接头，与所述SIRPa或其片段或变体的N端末端共价连接作为融合蛋白。
2.根据权利要求1中任一项所述的双功能分子，其中所述抗体是嵌合、人源化或人抗体。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的双功能分子，其中所述SIRPa片段包含SIRPa的胞外结构域或由SIRPa的胞外结构域组成。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的双功能分子，其中所述SIRPa片段缺乏其胞内部分和任选地缺乏其跨膜结构域，优选地其中所述SIRPa包含SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列或其片段，或由SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列或其片段组成。
5.根据权利要求1-4所述的双功能分子，其中所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含：
(i)包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变结构域(VH)，和
(ii)包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链可变结构域(VL)，
所述重链CDR1(HCDR1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；
-所述重链CDR2(HCDR2)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；
-所述重链CDR3(HCDR3)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成，其中X1是D或E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N和E；
-所述轻链CDR1(LCDR1)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成，其中X是G或T；
-所述轻链CDR2(LCDR2)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成，
-所述轻链CDR3(LCDR3)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成。
6.根据权利要求1-5所述的双功能分子，其中所述抗人PD-1抗体或其抗原结合片段包含(a)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的VH，其中X1是D或E，并且X2选自T、H、A、Y、N、E和S，优选地选自H、A、Y、N和E；(b)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成的VL，其中X是G或T。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的双功能分子，其中所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人κ轻链恒定结构域的轻链恒定结构域和来源于人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定结构域的重链恒定结构域，优选地来源于IgGl或IgG4重链恒定结构域。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的双功能分子，其中所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人κ轻链恒定结构域的轻链恒定结构域和来源于人IgGl重链恒定结构域的重链恒定结构域，其任选地具有选自以下的置换或置换的组合：T250Q/M428L；M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F；E233P/L234V/L235A/G236A+A327G/A330S/P331S；E333A；S239D/A330L/I332E；P257I/Q311；K326W/E333S；S239D/I332E/G236A；N297A；L234A/L235A；N297A+M252Y/S254T/T256E；K322A和K444A，优选地选自以下：N297A，其任选地与M252Y/S254T/T256E组合，和L234A/L235A。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的双功能分子，其中所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人κ轻链恒定结构域的轻链恒定结构域和来源于人IgG4重链恒定结构域的重链恒定结构域，任选地具有选自以下的置换或置换的组合：S228P；L234A/L235A、S228P+M252Y/S254T/T256E和K444A。
10.根据权利要求1-4所述的双功能分子，其中所述抗PD1抗体选自派姆单抗，纳武单抗，匹地利珠单抗，西米普利单抗，PDR001以及单克隆抗体5C4、17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4。
11.一种分离的核酸分子或分离的核酸分子组，其编码根据权利要求1-10中任一项所述的双功能分子。
12.一种载体，其包含根据权利要求11所述的核酸或核酸分子组。
13.一种宿主细胞，其包含根据权利要求12所述的载体或根据权利要求11所述的核酸或核酸分子组。
14.一种用于产生根据权利要求1-10中任一项所述的双功能分子的方法，其包括培养根据权利要求13所述的宿主细胞的步骤和任选地分离所述双功能分子的步骤。
15.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的双功能分子、根据权利要求11所述的核酸或核酸分子组、根据权利要求12所述的载体或根据权利要求13所述的宿主细胞和药学上可接受的载体。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中其还包含另外的治疗剂，所述另外的治疗剂优选地选自以下：烷化剂、血管生成抑制剂、抗体、抗代谢物、抗有丝分裂剂、抗增殖剂、抗病毒剂、极光激酶抑制剂、凋亡促进剂(例如，Bcl-2家族抑制剂)、死亡受体通路激活剂、Bcr-Abl激酶抑制剂、BiTE(双特异性T细胞接合剂)抗体、抗体药物缀合物、生物应答调节剂、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、环氧合酶-2抑制剂、DVD、白血病病毒癌基因同源物(ErbB2)受体抑制剂、生长因子抑制剂、热休克蛋白(HSP)-90抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、激素疗法、免疫药、凋亡蛋白抑制剂(IAP)的抑制剂、嵌入型抗生素、激酶抑制剂、驱动蛋白抑制剂、Jak2抑制剂、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂、microRNA、丝裂原激活的细胞外信号调节激酶抑制剂、多价结合蛋白、非甾体抗炎药(NSAID)、聚ADP(二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、铂类化学治疗剂、polo样激酶(Plk)抑制剂、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、受体酪氨酸激酶抑制剂、类视黄醇/类维生素D植物生物碱、小抑制性核糖核酸(siRNA)、拓扑异构酶抑制剂、泛素连接酶抑制剂、低甲基化剂、检查点抑制剂、肽疫苗等、来自肿瘤抗原的表位或新表位、以及这些试剂中的一种或多种的组合。
17.根据权利要求15或16所述的药物组合物、或根据权利要求1-10中任一项所述的双功能分子、或根据权利要求11所述的核酸或核酸分子组、或根据权利要求12所述的载体、或根据权利要求13所述的宿主细胞，其用作药物。
18.根据权利要求17所述的药物组合物、双功能分子、核酸或核酸分子组、载体、或宿主细胞，其用于治疗癌症。
19.根据权利要求18所述的药物组合物、双功能分子、核酸或核酸分子组、载体、或宿主细胞，其中所述癌症选自以下：表达PD-1和/或PD-L1的血液系统恶性肿瘤或实体瘤，如选自以下的癌症：淋巴造血肿瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、骨髓增生异常综合征和急性髓性白血病，由病毒诱发或与免疫缺陷相关的癌症，如选自以下的癌症：卡波西氏肉瘤(例如，与卡波西氏肉瘤疱疹病毒相关的)；宫颈癌、肛门癌、阴茎癌和外阴鳞状细胞癌和口咽癌(例如，与人乳头瘤病毒相关的)；B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、HHV-8原发性渗出性淋巴瘤、经典霍奇金氏淋巴瘤和淋巴增生性病症(例如，与爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)和/或卡波西氏肉瘤疱疹病毒相关的)；肝细胞癌(例如，与乙型肝炎和/或丙型肝炎病毒相关的)；梅克尔细胞癌(例如，与梅克尔细胞多瘤病毒(MPV)相关的)；和与人免疫缺陷病毒感染(HIV)相关的癌症；以及选自以下的癌症：转移性或非转移性、黑色素瘤、恶性间皮瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、头颈癌、尿道上皮癌、结直肠癌、肝细胞癌、小细胞肺癌、转移性梅克尔细胞癌、胃癌或食道癌和宫颈癌。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的药物组合物、双功能分子、核酸或核酸分子组、载体、或宿主细胞，其用于与放射疗法或另外的治疗剂联合使用，所述另外的治疗剂优选地选自烷化剂、血管生成抑制剂、抗体、抗代谢剂、抗有丝分裂剂、抗增殖剂、抗病毒剂、极光激酶抑制剂、凋亡促进剂(例如，Bcl-2家族抑制剂)、死亡受体通路激活剂、Bcr-Abl激酶抑制剂、BiTE(双特异性T细胞接合剂)抗体、抗体药物缀合物、生物应答调节剂、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、细胞周期抑制剂、环氧合酶-2抑制剂、DVD、白血病病毒癌基因同源物(ErbB2)受体抑制剂、生长因子抑制剂、热休克蛋白(HSP)-90抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、激素疗法、免疫药、凋亡蛋白抑制剂(IAP)的抑制剂、嵌入型抗生素、激酶抑制剂、驱动蛋白抑制剂、Jak2抑制剂、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂、microRNA、丝裂原激活的细胞外信号调节激酶抑制剂、多价结合蛋白、非甾体抗炎症药物(NSAID)、聚ADP(二磷酸腺苷)-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、铂类化学治疗剂、polo样激酶(Plk)抑制剂、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物、受体酪氨酸激酶抑制剂、类视黄醇/类维生素D植物生物碱、小抑制性核糖核酸(siRNA)、拓扑异构酶抑制剂、泛素连接酶抑制剂、低甲基化剂、检查点抑制剂、肽疫苗等、来自肿瘤抗原的表位或新表位、以及这些试剂中的一种或多种的组合。
21.根据权利要求17所述的药物组合物、双功能分子、核酸或核酸分子组、载体、或宿主细胞，其用于治疗传染病、优选地慢性传染病、甚至更优选地慢性病毒感染。
22.根据权利要求21所述的药物组合物、双功能分子、核酸或核酸分子组、载体、或宿主细胞，其中所述传染病由选自以下的病毒引起：HIV、肝炎病毒、疱疹病毒、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒脑炎病毒。
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