CN113567421B

CN113567421B - 一种多标志物定量检测方法

Info

Publication number: CN113567421B
Application number: CN202110818188.0A
Authority: CN
Inventors: 尹彬沣; 万心华; 岳文凯; 杨超; 陈剑
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2021-07-20
Filing date: 2021-07-20
Publication date: 2023-11-17
Anticipated expiration: 2041-07-20
Also published as: CN113567421A

Abstract

本发明公开了一种多标志物定量检测方法，包括以下步骤，同时抽取检测样本和检测抗体进入检测芯片的混合通道，检测样本和检测抗体在混合通道内循环抽吸充分混合，混合结束，混合溶液进入反应通道；静止孵育，与反应通道位置对应的反应层上包被的捕获抗体特异性地吸附抗原，形成捕获抗体‑抗原‑检测抗体这种双抗体夹心结构；将反应过后的溶液抽入废液池；洗涤液将混合通道和反应通道未参与反应的杂质以及未结合的检测抗体冲进废液池；化学发光底物经过混合通道进入反应通道，与检测抗体上标记的酶反应产生化学发光；本发明能实现多个溶液同步进样，检测效率高。

Description

一种多标志物定量检测方法

技术领域

本发明涉及标志物检测技术领域，特别是一种多标志物定量检测方法。

背景技术

即时检验是指在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。与传统实验室设备相比，POCT设备具有设备便携、检测快速、对人员操作技术要求低以及便于维护等多方面优势。尤其对急性病而言，利用POCT技术深入救护车、家庭、社区进行自我早期筛查是保障健康的有力手段。

酶联免疫吸附测定法（ELISA），是一种基于抗原抗体特异性结合这一免疫反应的方法。基于ELISA发展出适用于大分子蛋白的双抗体夹心法、适用于小分子蛋白的竞争法等多种方法。现有技术中，在检测时，需要分步加样，多次洗涤，存在检测时间长、试剂消耗大的问题，对操作人员有很高的技术要求。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有的标志物检测中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种多标志物定量检测方法，其实现同步进样，检测时间短，试剂消耗少，检测效率高。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种多标志物定量检测方法，其包括以下步骤，

同时抽取检测样本和检测抗体进入检测芯片的混合通道，检测样本和检测抗体在混合通道内循环抽吸充分混合，混合结束，混合溶液进入反应通道；

静止孵育，与反应通道位置对应的反应层上包被的捕获抗体特异性地吸附抗原，形成捕获抗体-抗原-检测抗体这种双抗体夹心结构；

将反应过后的溶液抽入废液池；

洗涤液将混合通道和反应通道未参与反应的杂质以及未结合的检测抗体冲进废液池；

化学发光底物经过混合通道进入反应通道，与检测抗体反应产生化学发光。

作为本发明所述多标志物定量检测方法的一种优选方案，其中：所述检测芯片包括芯片组件，所述芯片组件包括第一芯片本体和在第一芯片本体下侧的第二芯片本体，所述第一芯片本体朝下的一端设有若干储液池、一个混合通道和一个反应通道，反应通道远离储液池一端的第一芯片本体上设有第一负压接口，所述第一芯片本体上开有若干与储液池一一对应且连通的进样通气孔，储液池能与混合通道的一端连通，混合通道的另一端与反应通道的一端相接，所述反应通道的另一端与废液池相接，废液池与第一负压接口连通，第一芯片本体和第二芯片本体之间设有与反应通道所在位置对应的反应层。

作为本发明所述多标志物定量检测方法的一种优选方案，其中：所述第一芯片本体上开有使储液池能与混合通道一端连通的上阀孔。

作为本发明所述多标志物定量检测方法的一种优选方案，其中：所述检测芯片还包括控制组件，所述控制组件包括机械阀、连接在一起的第一支撑支架和第二支撑支架，芯片组件支撑在第一支撑支架和第二支撑支架之间，第二芯片本体上开有与上阀孔同轴心的下阀孔，第一支撑支架和第二支撑支架上分别开有第一导向孔和第二导向孔，所述机械阀穿过第一导向孔并压入上阀孔后，机械阀的下端能再依次穿过下阀孔和第二导向孔。

作为本发明所述多标志物定量检测方法的一种优选方案，其中：所述第一芯片本体上还开有第二负压接口，所述第二负压接口与混合通道的一端相接。

作为本发明所述多标志物定量检测方法的一种优选方案，其中：所述机械阀上设有若干在高度方向上间隔设置的出液通道，所述储液池能经对应的出液通道与混合通道的一端连通，当储液池经出液通道与混合通道刚好连通时，储液池覆盖出液通道的一端，混合通道的一端覆盖出液通道的另一端。

作为本发明所述多标志物定量检测方法的一种优选方案，其中：所述机械阀上设有导向凸起，所述导向凸起与混合通道一端位置对齐时，最下面的出液通道的进液端能与多个储液池对应，最下面的出液通道具有至少两个进液端，当最下面的出液通道下端与第一芯片本体下侧齐平时，至少有两个储液池分别覆盖不同的进液端。

作为本发明所述多标志物定量检测方法的一种优选方案，其中：检测前，将导向凸起与混合通道一端的位置对齐，下压机械阀使其压入上阀孔，当最下面的出液通道被按压至第一芯片本体下侧所在位置时，储液池与出液通道的两个进液端对应，停止下压机械阀，将检测样本、检测抗体、洗涤液和化学发光底物分别注入不同的储液池内，在第一负压接口和第二负压接口处分别连接第一负压泵和第二负压泵。

作为本发明所述多标志物定量检测方法的一种优选方案，其中：混合检测样本和检测抗体时，第一负压泵先动作，将检测样本和检测抗体抽进混合通道内，当抽入的试剂靠近混合通道另一端时，第一负压泵停止动作，第二负压泵工作，将流向混合通道另一端的混合溶液朝着混合通道一端所在方向流动，完成一次循环混合，反复上述步骤，当循环混合次数达到设定的次数阈值时，第二负压泵停止动作，第一负压泵将混合好的溶液吸至反应通道内反应。

作为本发明所述多标志物定量检测方法的一种优选方案，其中：反应结束后，向下按压机械阀，使中间的出液通道与注入有洗涤液的储液池对应，第一负压泵动作，将洗涤液依次经出液通道、混合通道和反应通道后冲进废液池，洗去反应层上未参与反应的杂质及未结合的检测抗体；继续向下按压机械阀，使最上面的出液通道与注入有化学发光底物的储液池对应，第一负压泵动作，将化学发光底物抽入反应通道内，与检测抗体上标记的酶反应，产生化学发光；反应通道上横向的直线微通道与反应层上竖向包被的抗体条带构成发光点阵，测量得到各点的化学发光值。

本发明的有益效果：使用本发明能实现多种标志物的联合同步检测，且能实现同步进样，不同的试剂混合时，通过多次循环混合，使试剂充分混合均匀，避免在混合通道中堵塞，提高检测精度，无需分多次洗涤，试剂损耗少，检测成本低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明的立体结构图。

图2为本发明的爆炸结构图。

图3为本发明中第一芯片本体的立体结构图。

图4为本发明中溶液混合后在混合通道和反应通道内的流速。

图5为本发明中溶液混合过程中在混合通道和反应通道内的浓度变化图。

图6为本发明中溶液混合结束后在混合通道和反应通道内的浓度变化图。

图7为本发明的检测原理说明图。

图8为本发明中反应层捕获抗体包被示意图。

图9为本发明检测cTnI、CK-MB、Myo三种心肌标志物的检测范围曲线图。

图10为本发明中检测cTnI、CK-MB、Myo三种心肌标志物的线性曲线图。

图11为本发明进行cTnI、CK-MB、Myo三种心肌标志物单独检测的发光点阵图。

图12为本发明进行cTnI、CK-MB、Myo三种心肌标志物联合检测的发光点阵图。

图中，100控制组件，101第二支撑支架，101a第二连接孔，101b第二导向孔，102第一支撑支架，102a第一连接孔，102b第一导向孔，103机械阀，103a出液通道，103b导向凸起，104连接销，200芯片组件，201第一芯片本体，201a进样通气孔，201b上阀孔，201c第一负压接口，201d第二负压接口，201e储液池，201e-1第一储液池，201e-2第二储液池，201e-3第三储液池，201e-4第四储液池，201f混合通道，201g反应通道，201g-1连接微通道，201g-2直线微通道，201h废液池，202第二芯片本体，202a下阀孔，203反应层。

实施方式

在阐述本发明的技术方案之前，定义本文使用的术语如下：

术语“PC”是指：聚碳酸酯;

术语“PDMS”是指：聚二甲基硅氧烷;

术语“AMI”是指：急性心肌梗死;

术语“cTnI”是指：心肌肌钙蛋白I;

术语“Myo”是指：肌红蛋白;

术语“CK-MB”是指：肌酸激酶同工酶;

术语“HRP”是指：辣根过氧化物酶;

术语“BSA”是指：牛血清白蛋白;

术语“PBST”是指：含有0.05% 吐温20的磷酸盐缓冲液。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例

参照图8，为本发明的第一个实施例，该实施例用于说明捕获抗体的包被与检测芯片的预处理，包括以下步骤，

在反应层203上竖向放置一块具有多直线通道的PDMS微流控芯片，通道宽500 μm，深300 μm ，间距3 mm平行排布，将捕获抗体溶液分别注入通道中，根据检测标志物数量的不同选择不同的通道注入，1小时后用PBST洗涤液清洗反应层203三次，去除未包被成功的捕获抗体，捕获抗体即包被在反应层203上。

在检测芯片组装完成后，向第一个储液池201e内加入50μl 5% BSA溶液，按压机械阀103使最下面的出液通道103a与第一个储液池201e所在高度对应，将BSA溶液抽入出液通道103a中，直至充满整个通道，静止孵育15分钟，以封闭出液通道103a及反应层203上未封闭的空余位点，避免非特异性吸附，最后将BSA溶液全部抽入检测芯片的废液池201h中，将机械阀103恢复原位，至此，芯片的预处理完成。

实施例

为本发明的第二个实施例，该实施例提供了一种多标志物定量检测方法，其检测效率高，耗材少，降低检测成本。

一种多标志物定量检测方法，包括以下步骤，

同时抽取检测样本和检测抗体进入检测芯片的混合通道201f，检测样本和检测抗体在混合通道201f内循环抽吸充分混合，混合结束，混合溶液进入反应通道201g；

静止孵育，与反应通道201g位置对应的反应层203上包被的捕获抗体特异性地吸附抗原，抗原与检测抗体特异性结合，形成捕获抗体-抗原-检测抗体这种双抗体夹心结构；

将反应过后的溶液抽入废液池201h；

洗涤液将混合通道201f和反应通道201g未参与反应的杂质以及未结合的检测抗体冲进废液池201h；

化学发光底物经过混合通道201f进入反应通道201g，与检测抗体反应产生化学发光；

将芯片组件200放入化学发光检测仪器中曝光，反应通道201g横向的直线微通道201g-2与反应层203上竖向包被的抗体条带构成发光点阵，测量得到各点的化学发光值，将他们的平均灰度值减去背景值即可用于样品浓度的计算。

其中，检测样本为稀释后的血清样本或抗原的标准溶液，检测抗体为与HRP偶联的检测抗体，洗涤液为PBST洗涤液，化学发光底物为Luminol-H₂O₂化学发光底物。

实施例

参照图1～图3，为本发明的第三个实施例，与第一个实施例的不同之处在于，对检测芯片具体结构进行说明，以及使用检测芯片用于实施例2时，对实施例2相关步骤的补充说明。

检测芯片包括芯片组件200，芯片组件200包括第一芯片本体201和在第一芯片本体201下侧的第二芯片本体202，第一芯片本体201朝下的一端设有若干储液池201e、一个混合通道201f和一个反应通道201g，反应通道201g包括若干段相互平行的直线微通道201g-2，相邻两个直线微通道201g-2之间经弧形的连接微通道201g-1连接在一起，首端的直线微通道201g-2经连接微通道201g-1与混合通道201f的另一端相接，反应通道201g远离储液池201e一端的第一芯片本体201上设有第一负压接口201c，第一负压接口201c的直径为1 mm的通孔，贯穿第一芯片本体201，第一芯片本体201上开有若干与储液池201e一一对应且连通的进样通气孔201a，储液池201e由长4 mm，宽3 mm的矩形以及宽度方向上的两个直径为3mm的半圆构成，储液池201e深度为3 mm，总容积约为60 μL，储液池201e能与混合通道201f的一端连通，第一芯片本体201上开有使储液池201e能与混合通道201f一端连通的上阀孔201b，混合通道201f的另一端与反应通道201g的一端相接，混合通道201f一端从外往里逐渐环绕然后再从里往外反向环绕出去到混合通道201f的另一端，从外往里环绕时半径逐渐减小，具体的，混合通道201f的前半部分由以混合通道201f的中心由半径分别为7 mm、5mm、3 mm和1 mm的半圆首尾相连构成，从最里端向外反向绕出时半径逐渐变大，混合通道201f的后半部分由以混合通道201f的中心由半径分别为1 mm、3 mm、5 mm和7 mm的半圆首尾相连构成，反应通道201g的另一端与废液池201h相接，反应通道201g的宽为400 μm，深400 μm，相邻两个直线微通道201g-2之间的间距为3 mm，直线微通道201g-2的长为10 mm，连接微通道201g-1为直径为3 mm的半圆，废液池201h与第一负压接口201c连通，第一芯片本体201和第二芯片本体202之间设有与反应通道201g所在位置对应的反应层203，反应层203是长10 mm，宽10 mm，厚0.1 mm的硅胶板，废液池201h由长为20 mm、宽5 mm的矩形以及宽度方向上的两个直径为5 mm的半圆构成，废液池201h深度为4 mm，总容积约为400 μL，废液池201h用于容纳检测过程中的废液，避免废液外溢污染环境以及仪器，其容积可以承载储液池201e中的所有试剂。

进一步的，检测芯片还包括控制组件100，控制组件100包括机械阀103、连接在一起的第一支撑支架102和第二支撑支架101，芯片组件200支撑在第一支撑支架102和第二支撑支架101之间，第一支撑支架102的两端均开有第一连接孔102a，第二支撑架的两端均开有第二连接孔101a，使用连接销104经第一连接孔102a和第二连接孔101a将第一支撑支架102和第二支撑支架101连接在一起，第二芯片本体202上开有与上阀孔201b同轴心的下阀孔202a，第一支撑支架102和第二支撑支架101上分别开有第一导向孔102b和第二导向孔101b，机械阀103穿过第一导向孔102b并压入上阀孔201b后，机械阀103的下端能再依次穿过下阀孔202a和第二导向孔101b。

进一步的，第一芯片本体201上还开有第二负压接口201d，第二负压接口201d和第一负压接口201c的结构相同，第二负压接口201d与混合通道201f的一端相接，机械阀103上设有若干在高度方向上间隔设置的出液通道103a，储液池201e能经对应的出液通道103a与混合通道201f的一端连通，当储液池201e经出液通道103a与混合通道201f刚好连通时，储液池201e覆盖出液通道103a的一端，混合通道201f的一端覆盖出液通道103a的另一端。

进一步的，机械阀103上设有导向凸起103b，导向凸起103b与混合通道201f一端位置对齐时，最下面的出液通道103a的进液端能与多个储液池201e对应，最下面的出液通道103a具有至少两个进液端，当最下面的出液通道103a下端与第一芯片本体201下侧齐平时，至少有两个储液池201e分别覆盖不同的进液端；通过导向凸起103b和混合通道201f一端的位置设置，实现机械阀103与芯片组件200的安装周向定位，方便安装。

使用检测芯片检测前，将导向凸起103b与混合通道201f一端的位置对齐，下压机械阀103使其压入上阀孔201b，当最下面的出液通道103a被按压至第一芯片本体201下侧所在位置时，装有检测样本和检测抗体的两个储液池201e分别与出液通道103a的两个进液端对应，停止下压机械阀103，将检测样本、检测抗体、洗涤液和化学发光底物分别注入不同的储液池201e内，在第一负压接口201c和第二负压接口201d处分别连接第一负压泵和第二负压泵。

使用检测芯片混合检测样本和检测抗体时，第一负压泵先动作，将检测样本和检测抗体抽进混合通道201f内，当抽入的试剂靠近混合通道201f另一端时，第一负压泵停止动作，第二负压泵工作，将流向混合通道201f另一端的混合溶液朝着混合通道201f一端所在方向流动，完成一次循环混合；反复上述步骤，当循环混合次数达到设定的次数阈值时，本实施例中次数阈值优选为2次，第二负压泵停止动作，第一负压泵将混合好的溶液吸至反应通道201g内反应，参照图5和图6，可以看出经过不断循环混合后，溶液浓度一致，实现不同样本的均匀混合。

反应结束后，向下按压机械阀103，使中间的出液通道103a与注入有洗涤液的储液池201e对应，第一负压泵动作，将洗涤液依次经出液通道103a、混合通道201f和反应通道201g后冲进废液池201h，洗去反应层203上未参与反应的杂质及未结合的检测抗体；继续向下按压机械阀103，使最上面的出液通道103a与注入有化学发光底物的储液池201e对应，第一负压泵动作，将化学发光底物抽入反应通道201g内，与检测抗体上标记的酶反应，产生化学发光；反应通道201g上的直线微通道201g-2与反应层203上竖向包被的抗体条带构成发光点阵，测量得到各点的化学发光值。

参照图7，（A）芯片的预处理包括再反应层203上包被捕获抗体、使用BSA封闭通道中空余点位和试剂装载；（B）抗原和检测抗体在混合通道201f中混合、反应；（C）反应通道201g中发生特异性免疫反应，捕获抗体与抗原特异性结合；（D）清洗未反应的试剂；（E）添加化学发光底物产生化学发光信号。

检测方法中借助检测芯片进行标志物的检测，实现同步加样，同步加样时，通过循环抽吸混合溶液的方式，使同步加样后的混合溶液混合均匀，提高检测精度；参照图4，使用多物理场模拟仿真软件对混合通道201f、反应通道201g的流体运动的流速进行了模拟，结果表明流体在通道中以10 mm/s的速度均匀运动，没有出现流体堵塞、流速突变、流体分布不均等情况，说明芯片中流体运动稳定。

参照图6，混合通道201f内不断循环抽吸方式及混合通道201f特定结构的情况下，使用多物理场模拟仿真软件对本发明中流体的混合效果进行了模拟，结果表明，两种不同浓度的流体在经过混合通道201f后混合成了均一浓度的流体，说明双螺旋微通道1-4具有良好的混合效果。

使用本发明节约了一次孵育、洗涤的操作，可以在17 min内完成多标志物的定量检测，提高检测效率；实现多个试剂的同步进样混合，通过芯片组件200和检测方法的结合，实现混合溶液的充分均匀混合，混合后的溶液在各个通道内流速均匀，实现多个浓度下的检测，检测更加可靠；适用于大多数标志物的检测，适用范围广。

实施例

为本发明的第四个实施例，本实施例与实施例1～实施例3的不同之处在于，对cTnI、CK-MB、Myo三种心肌标志物进行单独检测的方法，其包括以下步骤，

在反应层203上包被三条cTnI捕获抗体，对芯片进行组装与预处理之后，向第一储液池201e-1加入30 μL cTnI标准样品，向第二储液池201e-2加入30 μL cTnI与HRP偶联的检测抗体，向第三储液池201e-3中加入50 μL PBST洗涤液、向第四储液池201e-4中加入35μL Luminol-H₂O₂化学发光底物，各项试剂加载完成；

在第一负压接口201c和第二负压接口201d处用软管连接负压泵，用于驱动芯片内的流体；

下压机械阀103，使最下面的出液通道103a与储液池201e的高度对应，第一负压泵动作，将第一储液池201e-1和第二储液池201e-2内的试剂抽至混合通道201f内，达到设定的时间后，第一负压泵停止动作，第二负压泵动作，将混合试剂从混合通道201f另一端往混合通道201f一端所在方向抽取，达到设定的时间后，第二负压泵停止动作，反复循环上述操作，直至循环次数达到设定的循环次数阈值时，第二负压泵彻底停止动作，得到混合均匀的样本；

第一负压泵动作，将混合均匀的样本抽至反应通道201g内，第一负压泵停止动作，静止孵育15分钟，使混合液在反应通道201g内发生特异性吸附，形成双抗体夹心结构；

之后第一负压泵继续动作，将反应通道201g内的所有液体吸入废液池201h；

下压机械阀103使中间的出液通道103a与储液池201e的位置对应，第一负压泵动作，使第三储液池201e-3内的PBST洗涤液进入通道中，完成约15秒的连续洗涤，直至所有PBST洗涤缓冲液进入废液池201h，可以将未参与反应的杂质以及未结合的与HRP偶联的检测抗体冲进废液池201h；

继续下压机械阀103使最上面的出液通道103a与储液池201e的位置对应，第一负压泵动作，使Luminol-H₂O₂化学发光底物流入反应通道201g，与检测抗体上的HRP反应，随后流入废液池201h；

反应过程结束后，将芯片放入化学发光检测仪中曝光20 s；

其中，与最下面的出液通道103a连通的两个储液池201e分别命名为第一储液池201e-1和第二储液池201e-2，与中间的出液通道103a连通的储液池201e为第三储液池201e-3，与最上面的出液通道103a连通的储液池201e为第四储液池201e-4。

CK-MB、Myo与cTnI的检测方法一致，仅需将标准样品、对应的捕获抗体、对应的与HRP偶联的检测抗体更换为与抗原对应的即可。

cTnI、CK-MB、Myo三种心肌标志物的捕获抗体包被时浓度分别为25 μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL。cTnI、CK-MB、Myo三种心肌标志物与HRP偶联的检测抗体浓度分别为2.4 μg/mL，2 μg/mL，3 μg/mL。

分别对5 pg/mL、10 pg/mL、20 pg/mL、80 pg/mL、320 pg/mL、640 pg/mL、1.28 ng/mL、2.56 ng/mL、5.12 ng/mL、10.24 ng/mL、20.48 ng/mL、40.96 ng/mL这一范围内的cTnI进行检测，结果如图9所示。对各点进行拟合，如图10所示，可得cTnI在20 pg/mL、80 pg/mL、320 pg/mL、640 pg/mL、1.28 ng/mL、2.56 ng/mL这一范围内呈良好的线性关系。

分别对5 pg/mL、10 pg/mL、20 pg/mL、40 pg/mL、80 pg/mL、320 pg/mL、640 pg/mL、2.56 ng/mL、5.12 ng/mL、10.24 ng/mL、20.48 ng/mL、40.96 ng/mL这一范围内的CK-MB进行检测，结果如图9所示；对各点进行拟合，如图10所示，可得CK-MB在80 pg/mL、320 pg/mL、640 pg/mL、2.56 ng/mL、5.12 ng/mL、10.24 ng/mL这一范围内呈良好的线性关系。

分别对50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、400 pg/mL、800 pg/mL、6.4 ng/mL、12.8ng/mL、51.2 ng/mL、102.4 ng/mL、204.8 ng/mL、409.6 ng/mL、819.2 ng/mL、这一范围内的Myo进行检测，结果如图9所示；对各点进行拟合，如图10所示，可得Myo在800 pg/mL、6.4ng/mL、12.8 ng/mL、51.2 ng/mL、102.4 ng/mL、204.8 ng/mL这一范围内呈良好的线性关系。

cTnI、CK-MB与Myo三种心肌标志物单独检测的发光点阵如图11所示。

实施例

为本发明的第五个实施例，与实施例1～4的不同之处在于，本实施例为对cTnI、CK-MB、Myo三种心肌标志物联合检测的方法，具体如下，

在反应层203上包被cTnI、CK-MB、Myo的捕获抗体各一条，对芯片进行组装与预处理之后，向第一储液池201e-1加入30 μL标准样品，其中cTnI、CK-MB、Myo各10 μL；向第二储液池201e-2加入30 μL与HRP偶联的检测抗体，其中cTnI、CK-MB、Myo各自对应的与HRP偶联的检测抗体10 μL，初浓度分别为7.2 μg/mL、6 μg/mL、9 μg/mL；各向第三储液池201e-3中加入50 μL PBST洗涤液、向第四储液池201e-4中加入35 μL Luminol-H₂O₂化学发光底物；

反应过程结束后，将芯片放入化学发光检测仪中曝光20 s；

反应通道201g的三条横向直线微通道201g-2与反应层203上的三条竖向捕获抗体带交叉，cTnI、CK-MB、Myo每种标志物各有三个检测点，共生成九个检测点，对图像进行处理，得到各点的化学发光值，将它们的平均灰度值减去背景值即可用于样品浓度的计算。

cTnI、CK-MB与Myo三种心肌标志物联合检测的发光点阵如图12所示。

不难发现，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，对本发明进行简单改变，例如改变芯片结构，改变反应层材料，改变检测的标志物，改变试剂种类及用量均可以达成预期目的，对本发明进行轻易更改和变动都处于本发明的保护范围之内。

重要的是，应注意，在多个不同示例性实施方案中示出的本申请的构造和布置仅是例示性的。尽管在此公开内容中仅详细描述了几个实施方案，但参阅此公开内容的人员应容易理解，在实质上不偏离该申请中所描述的主题的新颖教导和优点的前提下，许多改型是可能的（例如，各种元件的尺寸、尺度、结构、形状和比例、以及参数值（例如，温度、压力等）、安装布置、材料的使用、颜色、定向的变化等）。例如，示出为整体成形的元件可以由多个部分或元件构成，元件的位置可被倒置或以其它方式改变，并且分立元件的性质或数目或位置可被更改或改变。因此，所有这样的改型旨在被包含在本发明的范围内。可以根据替代的实施方案改变或重新排序任何过程或方法步骤的次序或顺序。在权利要求中，任何“装置加功能”的条款都旨在覆盖在本文中所描述的执行所述功能的结构，且不仅是结构等同而且还是等同结构。在不背离本发明的范围的前提下，可以在示例性实施方案的设计、运行状况和布置中做出其他替换、改型、改变和省略。因此，本发明不限制于特定的实施方案，而是扩展至仍落在所附的权利要求书的范围内的多种改型。

此外，为了提供示例性实施方案的简练描述，可以不描述实际实施方案的所有特征（即，与当前考虑的执行本发明的最佳模式不相关的那些特征，或与实现本发明不相关的那些特征）。

应理解的是，在任何实际实施方式的开发过程中，如在任何工程或设计项目中，可做出大量的具体实施方式决定。这样的开发努力可能是复杂的且耗时的，但对于那些得益于此公开内容的普通技术人员来说，不需要过多实验，所述开发努力将是一个设计、制造和生产的常规工作。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种多标志物定量检测方法，其特征在于：其包括以下步骤，

同时抽取检测样本和检测抗体进入检测芯片的混合通道（201f），检测样本和检测抗体在混合通道（201f）内循环抽吸充分混合，混合结束，混合溶液进入反应通道（201g）；

静止孵育，与反应通道（201g）位置对应的反应层（203）上包被的捕获抗体特异性地吸附抗原，形成捕获抗体-抗原-检测抗体这种双抗体夹心结构；

将反应过后的溶液抽入废液池（201h）；

洗涤液将混合通道（201f）和反应通道（201g）未参与反应的杂质以及未结合的检测抗体冲进废液池（201h）；

化学发光底物经过混合通道（201f）进入反应通道（201g），与检测抗体反应产生化学发光；

所述检测芯片包括芯片组件（200）和控制组件（100），所述芯片组件（200）包括第一芯片本体（201）和在第一芯片本体（201）下侧的第二芯片本体（202），所述第一芯片本体（201）朝下的一端设有若干储液池（201e）、一个混合通道（201f）和一个反应通道（201g），反应通道（201g）远离储液池（201e）一端的第一芯片本体（201）上设有第一负压接口（201c），所述第一芯片本体（201）上开有若干与储液池（201e）一一对应且连通的进样通气孔（201a），储液池（201e）能与混合通道（201f）的一端连通，混合通道（201f）的另一端与反应通道（201g）的一端相接，所述反应通道（201g）的另一端与废液池（201h）相接，废液池（201h）与第一负压接口（201c）连通，第一芯片本体（201）和第二芯片本体（202）之间设有与反应通道（201g）所在位置对应的反应层（203），所述第一芯片本体（201）上开有使储液池（201e）能与混合通道（201f）一端连通的上阀孔（201b）；所述控制组件（100）包括机械阀（103）、连接在一起的第一支撑支架（102）和第二支撑支架（101），芯片组件（200）支撑在第一支撑支架（102）和第二支撑支架（101）之间，第二芯片本体（202）上开有与上阀孔（201b）同轴心的下阀孔（202a），第一支撑支架（102）和第二支撑支架（101）上分别开有第一导向孔（102b）和第二导向孔（101b），所述机械阀（103）穿过第一导向孔（102b）并压入上阀孔（201b）后，机械阀（103）的下端能再依次穿过下阀孔（202a）和第二导向孔（101b），所述机械阀（103）上设有若干在高度方向上间隔设置的出液通道（103a），所述储液池（201e）能经对应的出液通道（103a）与混合通道（201f）的一端连通，当储液池（201e）经出液通道（103a）与混合通道（201f）刚好连通时，储液池（201e）覆盖出液通道（103a）的一端，混合通道（201f）的一端覆盖出液通道（103a）的另一端。

2.如权利要求1所述的多标志物定量检测方法，其特征在于：所述第一芯片本体（201）上还开有第二负压接口（201d），所述第二负压接口（201d）与混合通道（201f）的一端相接。

3.如权利要求1或2所述的多标志物定量检测方法，其特征在于：所述机械阀（103）上设有导向凸起（103b），所述导向凸起（103b）与混合通道（201f）一端位置对齐时，最下面的出液通道（103a）的进液端能与多个储液池（201e）对应，最下面的出液通道（103a）具有至少两个进液端，当最下面的出液通道（103a）下端与第一芯片本体（201）下侧齐平时，至少有两个储液池（201e）分别覆盖不同的进液端。

4.如权利要求3所述的多标志物定量检测方法，其特征在于：检测前，将导向凸起（103b）与混合通道（201f）一端的位置对齐，下压机械阀（103）使其压入上阀孔（201b），当最下面的出液通道（103a）被按压至第一芯片本体（201）下侧所在位置时，储液池（201e）与出液通道（103a）的两个进液端对应，停止下压机械阀（103），将检测样本、检测抗体、洗涤液和化学发光底物分别注入不同的储液池（201e）内，在第一负压接口（201c）和第二负压接口（201d）处分别连接第一负压泵和第二负压泵。

5.如权利要求1或2所述的多标志物定量检测方法，其特征在于：混合检测样本和检测抗体时，第一负压泵先动作，将检测样本和检测抗体抽进混合通道（201f）内，当抽入的试剂靠近混合通道（201f）另一端时，第一负压泵停止动作，第二负压泵工作，将流向混合通道（201f）另一端的混合溶液朝着混合通道（201f）一端所在方向流动，完成一次循环混合，反复上述步骤，当循环混合次数达到设定的次数阈值时，第二负压泵停止动作，第一负压泵将混合好的溶液吸至反应通道（201g）内反应。

6.如权利要求3所述的多标志物定量检测方法，其特征在于：反应结束后，向下按压机械阀（103），使中间的出液通道（103a）与注入有洗涤液的储液池（201e）对应，第一负压泵动作，将洗涤液依次经出液通道（103a）、混合通道（201f）和反应通道（201g）后冲进废液池（201h），洗去反应层（203）上未参与反应的杂质及未结合的检测抗体；继续向下按压机械阀（103），使最上面的出液通道（103a）与注入有化学发光底物的储液池（201e）对应，第一负压泵动作，将化学发光底物抽入反应通道（201g）内，与检测抗体上标记的酶反应，产生化学发光；反应通道（201g）上横向的直线微通道（201g-2）与反应层（203）上竖向包被的抗体条带构成发光点阵，测量得到各点的化学发光值。