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CN113544157A - 用于检测或捕获样品中的多肽的抗体和组合物，以及用于检测或捕获样品中的多肽的方法 - Google Patents

用于检测或捕获样品中的多肽的抗体和组合物，以及用于检测或捕获样品中的多肽的方法 Download PDF

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CN113544157A
CN113544157A CN202080019187.3A CN202080019187A CN113544157A CN 113544157 A CN113544157 A CN 113544157A CN 202080019187 A CN202080019187 A CN 202080019187A CN 113544157 A CN113544157 A CN 113544157A
Authority
CN
China
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amino acid
seq
acid sequence
hvr
antibody
Prior art date
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Pending
Application number
CN202080019187.3A
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English (en)
Inventor
松田绘里子
澁谷光子
西馆正修
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Filing date
Publication date
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Abstract

本公开提供了用于检测或捕获样品中的多肽的抗体、组合物，以及用于检测或捕获样品中的多肽的方法。

Description

用于检测或捕获样品中的多肽的抗体和组合物，以及用于检 测或捕获样品中的多肽的方法
技术领域
本发明涉及用于检测或捕获样品中的多肽的抗体和组合物，以及用于检测或捕获样品中的多肽的方法
背景技术
杂交瘤技术使单克隆抗体的生产成为可能，这种单克隆抗体技术已广泛应用于许多科学领域(NPL1)。在取得这一技术成果后，又在治疗性和诊断性抗体领域做出了进一步的努力。自美国首次批准单克隆抗体疗法以来，已经过去了30年(NPL2)。超过30种抗体已获得FDA批准，大量候选抗体正在进行临床和临床前评估。迄今为止，单克隆抗体仍然是标准的治疗分子，并用于各种疾病领域，例如癌症、自身免疫性疾病、呼吸系统疾病、感染性疾病和神经性疾病(NPL3)。
为了增加治疗性抗体的价值，鉴定了许多不同类型的工程化Fc修饰以改善功能，例如用于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性增强、补体依赖性细胞毒性增强、抗体半衰期延长、抗原清除调节和促进重链异二聚化的那些Fc修饰(NPL4)。
已经报道了与工程化Fc区特异性结合但不与野生型Fc结合的抗体(NPL5，PTL1)。事实证明，针对工程化Fc区的抗体对各种目的非常有用。
引用列表
专利文献
[PTL1]WO2017072210A1
非专利文献
[NPL1]Kohler,G.et al.,Nature 256:495-497(1975)
[NPL2]Reichert,J.M.et al.,Curr.Pharm.Biotechnol.9:423-430(2008)
[NPL3]Lagasse HAD et al.F1000Research 2017,6(F1000 Faculty Rev):113
[NPL4]Mimoto et al.,Curr.Pharm.Biotechnol.17:1298-1314(2016)
[NPL5]Yu et al.,Antimicrob Agents Chemother.61(2016)
发明内容
我们提供了一些包含修饰的IgG重链恒定区的抗体，所述修饰的IgG重链恒定区源自人天然存在的IgG中的任何一个恒定区或源自由选自人天然存在IgG中的恒定区中至少两种恒定区获得的嵌合恒定区。抗体包括例如萨特利珠单抗(satralizumab)、奈莫利珠单抗(nemolizumab)、艾美赛珠单抗(emicizumab)、SKY59(可伐利单抗(Crovalimab))、AMY109和GYM329。例如，它们之一中的修饰的IgG重链恒定区包含至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser，331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置都根据EU编号系统编号)组成的组中。本发明提供了特异性结合、检测和/或捕获包含修饰的IgG重链恒定区的多肽或其中的表位的抗体，包含该抗体的组合物以及使用该抗体的方法。
具体而言，本发明涉及以下[1]至[25]。
[1]分离的抗体，所述抗体与修饰的IgG重链恒定区特异性结合，所述修饰的IgG重链恒定区源自人天然存在的IgG中的任何一个恒定区，或者源自由选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区，其中所述修饰的IgG重链恒定区包含至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser，331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置都根据EU编号系统编号)组成的组中。
[2]根据[1]所述的抗体，其中所述抗体基本上不结合所述人天然存在的IgG中的任何一个恒定区和所述由选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区。
[3]根据[1]或[2]所述的抗体，其中所述人天然存在的IgG中的恒定区是由SEQ IDNO:106的氨基酸序列组成的IgG1恒定区，由SEQ ID NO:107的氨基酸序列组成的IgG2恒定区，由SEQ ID NO:108的氨基酸序列组成的IgG3恒定区和由SEQ ID NO:109的氨基酸序列组成的IgG4恒定区。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的抗体，其中所述修饰的重链恒定区源自从人天然存在的IgG1和IgG4中的恒定区获得的嵌合恒定区。
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的抗体，其中所述修饰的IgG重链恒定区包含至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的抗体，其中所述修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg和239位的Lys(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的抗体，其中所述修饰的IgG重链恒定区包括235位的Arg，以及236位的Arg和239位的Lys中的任一个或两者(所有位置均根据EU编号系统编号)。
[8]根据[1]至[7]中任一项所述的抗体，其结合所述修饰的IgG重链恒定区中由氨基酸序列RRGPK(SEQ ID NO:104)或RRGPS(SEQ ID NO:117)组成的部分。
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的抗体，其包括以下(a)至(f)中的任一项：
(a)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列；
(b)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列；
(c)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；
(d)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；
(e)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列；和
(f)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列。
[10]根据[1]至[5]中任一项所述的抗体，其中所述修饰的IgG重链恒定区包含选自由428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中的至少一个。
[11]根据[1]至[5]和[10]中任一项所述的抗体，其中所述修饰的IgG重链恒定区包括428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu，和任选地436位的苏氨酸(所有位置均根据EU编号系统编号)。
[12]根据[1]至[5]、[10]和[11]中任一项所述的抗体，其结合所述修饰的IgG重链恒定区中由氨基酸序列LHEALHAHYTRKE(SEQ ID NO:105)或LHEALHAHTTRKE(SEQ ID NO:118)组成的部分。
[13]根据[1]至[5]和[10]至[12]中任一项所述的抗体，其包括以下(g)至(l)中的任一项：
(g)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；
(h)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列；
(i)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；
(j)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列；
(k)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列；和
(l)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列。
[14]分离的抗体，其结合至与[1]至[13]中任一项的抗体相同的表位。
[15]分离的抗体，其与修饰的IgG重链恒定区特异性结合，其中所述抗体与[1]至[14]中任一项的所述抗体竞争对于所述修饰的IgG重链恒定区的结合，其中所述修饰的IgG重链恒定区源自人天然存在的IgG中的任一个恒定区或源自由选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区，并且所述修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser、331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。
[16]用于检测或捕获样品中的多肽的组合物，其中所述组合物包括[1]至[15]中任一项所述的抗体。
[17]根据[16]所述的组合物，其中所述多肽包括修饰的IgG重链恒定区，所述修饰的IgG重链恒定区源自人天然存在的IgG中的任一恒定区或源自由选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区，其中所述修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser、331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。
[18]根据[16]所述的组合物，其中所述多肽包括由RRGPK(SEQ ID NO:104)组成的氨基酸序列、由RRGPS(SEQ ID NO:117)组成的氨基酸序列，由LHEALHAHYTRKE(SEQ ID NO:105)组成的氨基酸序列，和由LHEALHAHTTRKE(SEQ ID NO:118)组成的氨基酸序列中的任一项。
[19]根据[18]所述的组合物，其中所述多肽包括修饰的IgG重链恒定区，所述修饰的IgG重链恒定区包括由RRGPK(SEQ ID NO:104)组成的氨基酸序列、由RRGPS(SEQ ID NO:117)组成的氨基酸序列、由LHEALHAHYTRKE(SEQ ID NO:105)组成的氨基酸序列和由LHEALHAHTTRKE(SEQ ID NO:118)组成的氨基酸序列中的任一项。
[20]检测或捕获样品中多肽的方法，其中所述方法包括使所述样品与[1]至[15]中任一项所述的抗体或与[16]至[19]中任一项所述的组合物接触。
[21]根据[20]所述的方法，其中所述多肽包括修饰的IgG重链恒定区，所述修饰的IgG重链恒定区源自人天然存在的IgG中的任一恒定区或源自由选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区，其中所述修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser、331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。
[22]根据[20]所述的方法，其中所述多肽包括由RRGPK(SEQ ID NO:104)组成的氨基酸序列、由RRGPS(SEQ ID NO:117)组成的氨基酸序列，由LHEALHAHYTRKE(SEQ ID NO:105)组成的氨基酸序列，和由LHEALHAHTTRKE(SEQ ID NO:118)组成的氨基酸序列中的任一项。
[23]根据[22]所述的方法，其中所述多肽包括修饰的IgG重链恒定区，所述修饰的IgG重链恒定区包括由RRGPK(SEQ ID NO:104)组成的氨基酸序列、由RRGPS(SEQ ID NO:117)组成的氨基酸序列、由LHEALHAHYTRKE(SEQ ID NO:105)组成的氨基酸序列和由LHEALHAHTTRKE(SEQ ID NO:118)组成的氨基酸序列中的任一项。
[24]测量样品中第一抗体浓度的方法，其中所述第一抗体能够结合抗原的第一表位，其中所述样品包括所述第一抗体和所述抗原，并且其中所述方法包括
(A)使所述样品与固定有第二抗体的板或珠接触，
(B)在(A)之后使包括所述抗原并且不包括所述第一抗体和所述第二抗体的溶液与所述板或珠接触，和
(C)在(B)之后使用第三抗体检测通过所述第二抗体和所述第一抗体捕获在所述板或珠上的抗原，其中
所述第一抗体包括修饰的IgG重链恒定区，所述修饰的IgG重链恒定区源自人天然存在的IgG中的任一恒定区，或源自由选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区，其中所述修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser、331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中，所述第二抗体是[1]至[15]中任一项所述的抗体，和所述第三抗体能够结合抗原的不同于所述第一表位的第二表位，并且具有其氨基酸序列不同于第一抗体和第二抗体的IgG重链恒定区。
[25]测定样品中抗原浓度的方法，其中所述样品包括所述抗原和能够结合所述抗原的第一表位的第一抗体，其中所述方法包括
(D)使所述样品与固定有第三抗体的板或珠接触，
(E)在(D)之后使包括所述第一抗体且不包括所述抗原和所述第三抗体的溶液与所述板或所述珠接触，和
(F)使用第二抗体检测通过所述第三抗体和所述抗原捕获在所述板或珠上的所述第一抗体，其中
所述第一抗体包括修饰的IgG重链恒定区，所述修饰的IgG重链恒定区源自人天然存在的IgG中的任一恒定区，或者源自由选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区，其中所述修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser、331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中，
所述第二抗体是[1]至[15]中任一项所述的抗体，并且具有其氨基酸序列不同于所述第一抗体和所述第三抗体的IgG重链恒定区，和
所述第三抗体能够结合抗原的不同于所述第一表位的第二表位。
附图说明
[图1]图1说明了实施例2中描述的5种修饰的IgG重链恒定区(SG115、SG115v1、SG115v2、G1m和G4d)的序列比对。人IgG CH种系序列，即IGHG1_01(J00228)和IGHG4_01(K01316)，也进行了比对以进行比较。点表示在该位置与SG115相同的氨基酸。
[图2-1]图2-1和图2-2说明了ELISA中12种抗SG115抗体与5种修饰的IgG重链恒定区(SG115、SG115v1、SG115v2、G1m和G4d)的结合。SKA0009、SKA0016、SKA0046、SKA0052、SKA0054和SKA0127显示出与SG115v1的选择性结合，而SKA0001、SKA0027、SKA0028、SKA0117、SKA0141和SKA0171显示出与SG115v2选择性结合，如实施例2中描述的。
[图2-2]图2-2是图2-1的延续。
[图3]图3说明了Fc突变抗体检测测定法的方案。
[图4]图4说明了抗原检测测定法的方案。
[图5]图5说明了Simoa(注册商标)测定的方案。
[图6]图6说明了人C5从抗hC5抗体解离的传感图，所述抗hC5抗体在pH7.4和pH6.0下被SKA0016和SKA0117捕获。SKA0016和SKA0117均不干扰抗hC5抗体和人C5之间的pH依赖性相互作用。
[图7]图7说明了人Fc受体与被SKA0016捕获的抗hC5抗体结合分析的传感图。SKA0016没有中断hFcRn和抗hC5抗体之间的结合。
具体实施方式
I.定义
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”或“结合活性”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法测量，包括本文所述的那些。下面描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
术语“特异性结合修饰的IgG重链恒定区的分离的抗体，其中所述修饰的IgG重链恒定区源自人天然存在的IgG中的任一恒定区或源自由选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区”，指能够以足够的亲和力结合特定类型的修饰的IgG重链恒定区的抗体，使得该抗体可用作靶向修饰的IgG重链恒定区的检测、捕获或诊断试剂。在一个实施方案中，对于与修饰的IgG重链恒定区特异性结合的抗体，抗体与非修饰的人IgG重链恒定区的结合程度小于与修饰的IgG重链恒定区的结合的约10％，如通过例如放射免疫测定法(RIA)所测量的。在某些实施方案中，结合修饰的IgG重链恒定区的抗体具有1μM或更小、100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、0.1nM或更小、0.01nM或更小、或0.001nM或更小(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，结合修饰的IgG重链恒定区的抗体结合修饰的IgG重链恒定区中的表位。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原-结合活性即可。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五类主要的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几个可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，组成群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然发生突变或在单克隆抗体制备生产过程中出现)之外，此类变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
本文中的术语“恒定区”是抗体中对应于由SEQ ID NO:106的氨基酸序列组成的IgG1恒定区、由SEQ ID NO:107的氨基酸序列组成的IgG2恒定区、由SEQ ID NO:108的氨基酸序列组成的IgG3恒定区和由SEQ ID NO:109的氨基酸序列组成的IgG4恒定区中的任一项的区域。恒定区由CH1区(根据EU编号系统的位置118至215)、铰链区(根据EU编号系统的位置216至230)、CH2区(根据EU编号系统的位置231至340)和CH3区(根据EU编号系统的位置341至446)组成。
术语“Fc区”在本文中用于定义包含至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C-末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所描述的。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如Kindt等，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域来分别筛选互补的VL或VH结构域的文库，从而分离结合特定抗原的抗体。参见，例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。
“框架”或“FR”是指高变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。相应地，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般按以下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上定义的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)的抗体可变结构域的每个区域。通常，抗体包含六个HVR：VH中的三个(H1，H2，H3)和VL中的三个(L1，L2，L3)。本文中的示例性HVR包括：
(a)出现在氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；
(b)出现在氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触(MacCallum等，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)和94-102(H3)。
相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对并在必要时引入空位以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的一部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)软件，或GENETYX(注册商标)(Genetyx Co.,Ltd.)。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经与用户文档一起提交至美国版权局(U.S.Copyright Office，Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南圣弗朗西斯科的Genentech,Inc.公开获得，或者可以从源代码编译。应编译ALIGN-2程序以在UNIX操作系统上使用，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置，不会发生变化。在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的特定％氨基酸序列同一性)如下计算：
100乘以X/Y分数
其中X是在该程序的A和B比对中由序列比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明，本文所用的所有％氨基酸序列同一性的值是使用ALIGN-2计算机程序如上段所述获得的。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”是指这样的抗体：在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原的结合的50％或更多，并且反之，在竞争测定中，参考抗体阻断所述抗体与其抗原的结合的50％或更多。本文提供了示例性竞争测定。
II.抗体
本发明中的抗体是与修饰的IgG重链恒定区特异性结合的分离抗体。
在一个实施方案中，抗体基本上不结合人天然存在的IgG中的恒定区和由选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区。在该实施方案中，抗体与人天然存在的IgG的恒定区和由选自人天然存在的IgG的至少两种IgG组成的嵌合IgG的结合活性低于酶联免疫测定中的检测限。另一方面，抗体与修饰的IgG重链恒定区的结合活性在酶联免疫测定中是可检测的。
在本发明的另一方面，抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体或F(ab')2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体，或本文定义的其他抗体类别或同种型。
A.修饰的IgG重链恒定区
在一个实施方案中，修饰的IgG重链恒定区源自人天然存在的IgG中的任一恒定区，或者源自由选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区。人天然存在的IgG中的恒定区是由SEQ ID NO:106的氨基酸序列组成的IgG1恒定区、由SEQ IDNO:107的氨基酸序列组成的IgG2恒定区、由SEQ ID NO:108的氨基酸序列组成的IgG3恒定区，以及由SEQ ID NO:109的氨基酸序列组成的IgG4恒定区。
在一个实施方案中，修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser、331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。
在进一步的实施方案中，修饰的IgG重链恒定区可以源自嵌合恒定区，该嵌合恒定区是从人天然存在的IgG1和IgG4中的恒定区获得的。在优选的实施方案中，恒定区源自从人天然存在的IgG1和IgG4中的恒定区获得的嵌合恒定区。
在优选的实施方案中，修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸,所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg，和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。
在一个实施方案中，修饰的IgG重链恒定区可以形成二聚体，例如天然存在的IgG中的重链恒定区，或可以形成半聚体，例如Ishino T.等，J.Biol.Chem.288:16259-37(2013)中报道的单体Fc中的重链恒定区。
在一个实施方案中，当修饰的IgG重链恒定区在人修饰的IgG重链中时，人修饰的IgG重链选自由人修饰的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4重链，以及它们的嵌合IgG重链组成的组中。在优选的实施方案中，人IgG重链是人IgG1重链、人IgG4重链或它们的嵌合IgG重链。
B.特异性识别修饰的IgG重链恒定区的CH2区特有的修饰的示例性抗体
235位的Arg、236位的Arg和239位的Lys(所有位置均根据EU编号系统编号)是特异性存在于实施例中使用的SG115和SG115v1的CH2区域中的那些氨基酸。因此，此处示例性抗体中修饰的IgG重链恒定区优选包括至少对应于人天然存在的IgG中的任何一个恒定区或由选自人天然存在的IgG的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区的CH2区的区域。
在一个实施方案中，所述修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg和239位的Lys(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。在该实施方案中，所述修饰的IgG重链恒定区包括235位的Arg，以及236位的Arg和239位的Lys中的任一个或两者(所有位置均根据EU编号系统编号)。
在优选的实施方案中，所述修饰的IgG重链恒定区包括所有这三种突变，或235位的Arg和236位的Arg(所有位置均根据EU编号系统编号)。在那种情况下，抗体结合修饰的IgG重链恒定区中由氨基酸序列RRGPK(SEQ ID NO:104)或RRGPS(SEQ ID NO:117)组成的部分。
在其中抗体特异性结合以下(1)-(3)的方面中：(1)修饰的IgG重链恒定区，其中所述修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg和239位的Lys(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中，(2)修饰的IgG重链恒定区，其包括235位的Arg，以及236位的Arg和239位的Lys中的任一个或两者(所有位置均根据EU编号系统编号)，或(3)在修饰的IgG重链恒定区中由氨基酸序列RRGPK(SEQ IDNO:104)或RRGPS(SEQ ID NO:117)组成的部分，本发明提供了包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下的HVR的抗体：(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:33、34、37、38、39或41的氨基酸序列；(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:45、46、49、50、51或53的氨基酸序列；(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:57、58、61、62、63或65的氨基酸序列；(iv)HVR-L1，其包含SEQ IDNO:69、70、73、74、75或77的氨基酸序列；(v)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:81、82、85、86、87或89的氨基酸序列；和(vi)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:93、94、97、98、99或101的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了抗体，其包含至少一个、至少两个或所有三个选自以下的VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:33、34、37、38、39或41的氨基酸序列；(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:45、46、49、50、51或53的氨基酸序列；和(iii)HVR-H3，其包含SEQID NO:57、58、61、62、63或65的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包括HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:57、58、61、62、63或65的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体包括HVR-H3和HVR-L3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:57、58、61、62、63或65的氨基酸序列，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:93、94、97、98、99或101的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体包括HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:57、58、61、62、63或65的氨基酸序列，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:93、94、97、98、99或101的氨基酸序列，所述HVR-H2包含SEQID NO:45、46、49、50、51或53的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，抗体包括(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:33、34、37、38、39或41的氨基酸序列；(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:45、46、49、50、51或53的氨基酸序列；和(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:57、58、61、62、63或65的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了抗体，其包含至少一个、至少两个或所有三个VL HVR序列，所述VL HVR序列选自(iv)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:69、70、73、74、75或77的氨基酸序列；(v)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:81、82、85、86、87或89的氨基酸序列；和(vi)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:93、94、97、98、99或101的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包括(iv)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:69、70、73、74、75或77的氨基酸序列；(v)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:81、82、85、86、87或89的氨基酸序列；和(vi)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:93、94、97、98、99或101的氨基酸序列。
在另一方面，本发明的抗体包含(I)VH结构域，所述VH结构域包含至少一个、至少两个或所有三个VH HVR序列，所述VH HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:33、34、37、38、39或41的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:45、46、49、50、51或53的氨基酸序列，和(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:57、58、61、62、63或65的氨基酸序列；和(II)VL结构域，所述VL结构域包含至少一个、至少两个或所有三个VL HVR序列，所述VL HVR序列选自(iv)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:69、70、73、74、75或77的氨基酸序列，(v)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:81、82、85、86、87或89的氨基酸序列，和(vi)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:93、94、97、98、99或101的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种抗体，其包含(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:33、34、37、38、39或41的氨基酸序列；(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:45、46、49、50、51或53的氨基酸序列；(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:57、58、61、62、63或65的氨基酸序列；(iv)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:69、70、73、74、75或77的氨基酸序列；(v)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:81、82、85、86、87或89的氨基酸序列；和(vi)HVR-L3，其包含选自SEQ ID NO:93、94、97、98、99或101的氨基酸序列。
在另一方面，本文所述的抗体包括重链可变结构域(VH)序列，所述重链可变结构域序列与SEQ ID NO:9、10、13、14、15或17的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的本文所述抗体保留结合第一修饰的IgG重链恒定区的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:9、10、13、14、15或17中总共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗体包括在SEQ ID NO:9、10、13、14、15或17中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VH包括一个、两个或三个HVR，所述HVR选自：(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:33、34、37、38、39或41的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:45、46、49、50、51或53的氨基酸序列，和(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:57、58、61、62、63或65的氨基酸序列。翻译后修饰包括但不限于通过焦谷氨酰化将重链或轻链N-末端的谷氨酰胺或谷氨酸修饰为焦谷氨酸。
在另一方面，提供了抗体，其中所述抗体包括轻链可变结构域(VL)，所述轻链可变结构域与SEQ ID NO:21、22、25、26、27或29的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗体保留结合第一修饰的IgG重链恒定区的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:21、22、25、26、27或29中总共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗体包括在SEQ ID NO:21、22、25、26、27或29中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VL包括一个、两个或三个HVR，所述HVR选自(iv)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:69、70、73、74、75或77的氨基酸序列；(v)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:81、82、85、86、87或89的氨基酸序列；和(vi)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:93、94、97、98、99或101的氨基酸序列。翻译后修饰包括但不限于通过焦谷氨酰化将重链或轻链N-末端的谷氨酰胺或谷氨酸修饰为焦谷氨酸。
在另一方面，提供了一种抗体，其中所述抗体包括如以上提供的任何实施方案中的VH和如以上提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体分别包括在SEQ IDNO:9、10、13、14、15或17和SEQ ID NO:21、22、25、26、27或29中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。翻译后修饰包括但不限于通过焦谷氨酰化将重链或轻链N-末端的谷氨酰胺或谷氨酸修饰为焦谷氨酸。
在一个方面，提供了抗体，其中所述抗体与包括以下的抗体竞争结合第一修饰的IgG重链恒定区：(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:33、34、37、38、39或41的氨基酸序列；(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:45、46、49、50、51或53的氨基酸序列；(iii)HVR-H3，其包含SEQID NO:57、58、61、62、63或65的氨基酸序列；(iv)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:69、70、73、74、75或77的氨基酸序列；(v)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:81、82、85、86、87或89的氨基酸序列；和(vi)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:93、94、97、98、99或101的氨基酸序列。
在一个方面，提供了抗体，其中所述抗体与包括以下的抗体结合相同的表位：(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:33、34、37、38、39或41的氨基酸序列；(ii)HVR-H2，其包含SEQ IDNO:45、46、49、50、51或53的氨基酸序列；(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:57、58、61、62、63或65的氨基酸序列；(iv)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:69、70、73、74、75或77的氨基酸序列；(v)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:81、82、85、86、87或89的氨基酸序列；和(vi)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:93、94、97、98、99或101的氨基酸序列。
在其中抗体特异性结合以下(1)-(3)的特定实施方案中：(1)修饰的IgG重链恒定区，所述修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg和239位的Lys(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组，(2)修饰的IgG重链恒定区，其包括235位的Arg，以及236位的Arg和239位的Lys中的任一个或两者(所有位置均根据EU编号系统编号)，或(3)在修饰的IgG重链恒定区中由氨基酸序列RRGPK(SEQ IDNO:104)或RRGPS(SEQ ID NO:117)组成的部分，所述抗体包括以下(a)至(f)中任一项：
(a)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列；
(b)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列；
(c)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；
(d)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；
(e)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列；和
(f)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列。
C.特异性识别修饰的IgG重链恒定区的CH3区特有的修饰的示例性抗体
428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)是特异性存在于实施例中使用的SG115和SG115v2的CH3区域中的那些氨基酸。因此，此处示例性抗体中修饰的IgG重链恒定区优选包括至少对应于人天然存在的IgG中的任何一个恒定区或由选自人天然存在的IgG的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区的CH3区的区域。
在一个实施方案中，所述修饰的IgG重链恒定区包含选自由428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中的至少一个。在该实施方案中，所述修饰的IgG重链恒定区包括428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu，和任选地436位的苏氨酸(所有位置均根据EU编号系统编号)。
在优选的实施方案中，修饰的IgG重链恒定区包括所有这些突变。在那种情况下，该抗体结合修饰的IgG重链恒定区中由氨基酸序列LHEALHAHYTRKE(SEQ ID NO:105)或LHEALHAHTTRKE(SEQ ID NO:118)组成的部分。
在其中抗体特异性结合以下(1)-(3)的方面中：(1)修饰的IgG重链恒定区，其中所述修饰的IgG重链恒定区包括选自由428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中的至少一个，(2)修饰的IgG重链恒定区，其包括428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)，或(3)在修饰的IgG重链恒定区中由氨基酸序列LHEALHAHYTRKE(SEQ ID NO:105)或LHEALHAHTTRKE(SEQ ID NO:118)组成的部分，本发明提供了抗体，其包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR，所述HVR选自：(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32、35、36、40、42或43的氨基酸序列；(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:44、47、48、52、54或55的氨基酸序列；(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:56、59、60、64、66或67的氨基酸序列；(iv)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:68、71、72、76、78或79的氨基酸序列；(v)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:80、83、84、88、90或91的氨基酸序列；和(vi)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:92、95、96、100、102或103的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了抗体，其包含至少一个、至少两个或所有三个VH HVR序列，所述VH HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32、35、36、40、42或43的氨基酸序列；(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:44、47、48、52、54或55的氨基酸序列；和(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:56、59、60、64、66或67的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包括HVR-H3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:56、59、60、64、66或67的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体包括HVR-H3和HVR-L3，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:56、59、60、64、66或67的氨基酸序列，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:92、95、96、100、102或103的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体包括HVR-H3、HVR-L3和HVR-H2，所述HVR-H3包含SEQ ID NO:56、59、60、64、66或67的氨基酸序列，所述HVR-L3包含SEQ ID NO:92、95、96、100、102或103的氨基酸序列，所述HVR-H2包含SEQ ID NO:44、47、48、52、54或55的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，抗体包括(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32、35、36、40、42或43的氨基酸序列；(ii)HVR-H2，其包含SEQ IDNO:44、47、48、52、54或55的氨基酸序列；和(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:56、59、60、64、66或67的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了抗体，其包含至少一个、至少两个或所有三个VL HVR序列，所述VL HVR序列选自(iv)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:68、71、72、76、78或79的氨基酸序列；(v)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:80、83、84、88、90或91的氨基酸序列；和(vi)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:92、95、96、100、102或103的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体包括(iv)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:68、71、72、76、78或79的氨基酸序列；(v)HVR-L2，其包含SEQ IDNO:80、83、84、88、90或91的氨基酸序列；和(vi)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:92、95、96、100、102或103的氨基酸序列。
在另一方面，本发明的抗体包括(I)VH结构域，所述VH结构域包括至少一个、至少两个或所有三个VH HVR序列，所述VH HVR序列选自(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32、35、36、40、42或43的氨基酸序列；(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:44、47、48、52、54或55的氨基酸序列；和(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:56、59、60、64、66或67的氨基酸序列；和(II)VL结构域，所述VL结构域包括至少一个、至少两个或所有三个VL HVR序列，所述VL HVR序列选自(iv)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:68、71、72、76、78或79的氨基酸序列；(v)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:80、83、84、88、90或91的氨基酸序列；和(vi)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:92、95、96、100、102或103的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供抗体，所述抗体包括(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32、35、36、40、42或43的氨基酸序列；(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:44、47、48、52、54或55的氨基酸序列；(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:56、59、60、64、66或67的氨基酸序列；(iv)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:68、71、72、76、78或79的氨基酸序列；(v)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:80、83、84、88、90或91的氨基酸序列；和(vi)HVR-L3，其包含选自SEQ ID NO:92、95、96、100、102或103的氨基酸序列。
在另一方面，本文所述的抗体包括重链可变结构域(VH)序列，其与SEQ ID NO:8、11、12、16、18或19的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的本文所述抗体保留结合第一修饰的IgG重链恒定区的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:8、11、12、16、18或19中总共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗体包括SEQ ID NO:8、11、12、16、18或19的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VH包括一个、两个或三个HVR，所述HVR选自：(i)HVR-H1，其包含SEQID NO:32、35、36、40、42或43的氨基酸序列，(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:44、47、48、52、54或55的氨基酸序列，和(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:56、59、60、64、66或67的氨基酸序列。翻译后修饰包括但不限于通过焦谷氨酰化将重链或轻链N-末端的谷氨酰胺或谷氨酸修饰为焦谷氨酸。
在另一方面，提供了抗体，其中所述抗体包括轻链可变结构域(VL)，所述VL与SEQID NO:20、23、24、28、30或31的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相对于参考序列的置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗体保留结合第一修饰的IgG重链恒定区的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:20、23、24、28、30或31中总共有1至10个氨基酸被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在HVR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗体包括在SEQ ID NO:20、23、24、28、30或31中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在特定实施方案中，VL包括一个、两个或三个HVR，所述HVR选自(iv)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:68、71、72、76、78或79的氨基酸序列；(v)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:80、83、84、88、90或91的氨基酸序列；和(vi)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:92、95、96、100、102或103的氨基酸序列。翻译后修饰包括但不限于通过焦谷氨酰化将重链或轻链N-末端的谷氨酰胺或谷氨酸修饰为焦谷氨酸。
在另一方面，提供了一种抗体，其中所述抗体包括如以上提供的任何实施方案中的VH和如以上提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体分别包括在SEQ IDNO:8、11、12、16、18或19和SEQ ID NO:20、23、24、28、30或31中的VH序列和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。翻译后修饰包括但不限于通过焦谷氨酰化将重链或轻链N-末端的谷氨酰胺或谷氨酸修饰为焦谷氨酸。
在一个方面，提供了抗体，其中所述抗体与包括以下的抗体竞争结合第一修饰的IgG重链恒定区：(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32、35、36、40、42或43的氨基酸序列；(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:44、47、48、52、54或55的氨基酸序列；(iii)HVR-H3，其包含SEQID NO:56、59、60、64、66或67的氨基酸序列；(iv)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:68、71、72、76、78或79的氨基酸序列；(v)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:80、83、84、88、90或91的氨基酸序列；和(vi)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:92、95、96、100、102或103的氨基酸序列。
在一个方面，提供了抗体，其中所述抗体与包括以下的抗体结合相同的表位：(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32、35、36、40、42或43的氨基酸序列；(ii)HVR-H2，其包含SEQ IDNO:44、47、48、52、54或55的氨基酸序列；(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:56、59、60、64、66或67的氨基酸序列；(iv)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:68、71、72、76、78或79的氨基酸序列；(v)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:80、83、84、88、90或91的氨基酸序列；和(vi)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:92、95、96、100、102或103的氨基酸序列。
在其中抗体与以下(1)-(3)特异性结合的特定实施方案中：(1)修饰的IgG重链恒定区，其包括选自由428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中的至少一个，(2)修饰的IgG重链恒定区，其包括428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)，或(3)修饰的IgG重链恒定区中由氨基酸序列LHEALHAHYTRKE(SEQ ID NO:105)或LHEALHAHTTRKE(SEQ IDNO:118)组成的部分，所述抗体包括以下(g)至(l)中任一项：
(g)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；
(h)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列；
(i)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；
(j)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列；
(k)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列；和
(l)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列。
D.其他实施方案
在一个实施方案中，本发明中的抗体包括与上述部分中提到的任何一种抗体结合相同的表位的抗体，所述上述部分为“A.修饰的IgG重链恒定区”至“C.特异性识别修饰的IgG重链恒定区的CH3区特有的修饰的示例性抗体”。
在一个实施方案中，本发明的抗体包括与修饰的IgG重链恒定区特异性结合的抗体，其中抗体与修饰的IgG重链恒定区的结合与上述部分中提到的抗体竞争，所述上述部分为“A.修饰的IgG重链恒定区”至“C.特异性识别修饰的IgG重链恒定区的CH3区特有的修饰的示例性抗体”。在本实施方案中，修饰的IgG重链恒定区源自人天然存在的IgG中的任一恒定区，或者源自由选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区。修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser、331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。在本实施方案中，本文所指的特异性抗体与上述部分相同。
E.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如，如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述抗体的分离核酸。此类核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了一种或多种包含此类核酸的载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含这种核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包括以下(例如，已用以下转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包括抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp2/0细胞)。在一个实施方案中，提供了制备本文所述抗体的方法，其中所述方法包括在适合表达抗体的条件下培养如上文所提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
对于本文所述抗体的重组生产，分离例如如上所述编码抗体的核酸，并将其插入一种或多种载体中以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序此类核酸。
用于克隆或表达抗体编码载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(也参见Charlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，抗体可以以可溶级分从细菌细胞糊中分离，并可进一步纯化。
除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括糖基化途径已“人源化”的真菌和酵母菌株，从而产生具有部分或完全人的糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，它们可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda)的转染。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚胎肾系(293或293细胞，如Graham等，J.Gen Virol.36:59(1977)所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠滋养细胞(TM4细胞，如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛大鼠肝细胞(buffalo rat liver cells)(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如Mather等，Annals NY Acad.Sci.383：44-68(1982)中所描述的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，例如Y0、NS0和Sp2/0。有关适用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见，例如Yazaki和Wu，分子生物学方法，第248卷(B.K.C.Lo ed.，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003年)。
F.测定
本文提供的抗体可以通过本领域已知的各种测定来鉴定、筛选或表征其物理/化学特性和/或生物活性。
G.结合测定和其他测定
一方面，测试本发明抗体的抗原结合活性，例如通过已知方法如ELISA、Western印迹等。
在另一方面，竞争测定可用于鉴定与实施例中使用的任一抗体(SKA0001、SKA0009、SKA0016、SKA0027、SKA0028、SKA0046、SKA0052、SKA0054、KA0117、SKA0127、SKA0141和SKA0171)竞争对修饰的IgG重链恒定区的结合的抗体，所述修饰的IgG重链恒定区源自人天然存在的IgG中任一恒定区或源自由选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区，其中所述修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser、331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。在某些实施方案中，此类竞争性抗体可结合至与实施例中使用的任一抗体(SKA0001、SKA0009、SKA0016、SKA0027、SKA0028、SKA0046、SKA0052、SKA0054、KA0117、SKA0127、SKA0141和SKA0171)所结合的表位相同的表位(例如，线性或构象表位)。Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”，Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供了用于映射抗体所结合的表位的详细示例性方法。
在示例性竞争测定中，将固定的修饰的IgG重链恒定区在溶液中孵育，所述溶液包含与修饰的IgG重链恒定区结合的标记抗体和正在测试其与标记抗体竞争结合固定的修饰的IgG重链恒定区的能力的未标记抗体。未标记的抗体可以存在于B细胞或杂交瘤上清液中。作为对照，固定的修饰的IgG重链恒定区在溶液中孵育，所述溶液包含标记的抗体但不包含未标记的抗体。在允许标记抗体与固定的修饰的IgG重链恒定区结合的条件下孵育后，去除过量的未结合抗体，并测量与固定的修饰的IgG重链恒定区相缔合的标记量。如果测试样品中与固定的修饰的IgG重链恒定区相缔合的标记量相对于对照样品显著减少，则表明未标记的抗体与标记的抗体竞争结合固定的修饰IgG重链恒定区。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY)。
III.组合物
一方面，本发明的组合物是用于检测或捕获样品中的多肽的组合物。组合物包括“II.抗体”中描述的任一种抗体。
另一方面，本发明的组合物是用于治疗或预防疾病的组合物。当抗体用于治疗或预防任何疾病时，组合物可以是或包括表达与修饰的IgG重链恒定区特异性结合的“II.抗体“中描述的任一种抗体或其片段的细胞。
在优选的实施方案中，样品中的多肽包括修饰的IgG重链恒定区，所述修饰的IgG重链恒定区源自人天然存在的IgG中的任何一个恒定区或源自选自人天然存在的恒定区的至少两种恒定区的嵌合恒定区。修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser、331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。本文所指的特异性抗体与“II.抗体”中描述的那些相同。
在另一优选的实施方案中，所述多肽包括由RRGPK(SEQ ID NO:104)组成的氨基酸序列、由RRGPS(SEQ ID NO:117)组成的氨基酸序列，由LHEALHAHYTRKE(SEQ ID NO:105)组成的氨基酸序列，和由LHEALHAHTTRKE(SEQ ID NO:118)组成的氨基酸序列中的任一项。由组合物检测或捕获的多肽在其结构方面没有特别限制，只要多肽包括这些氨基酸序列中的任一项或多项即可。多肽优选包括修饰的IgG重链恒定区，所述修饰的IgG重链恒定区包括所述氨基酸序列的任一项或多项。
在一个实施方案中，由组合物检测或捕获的多肽可以是抗体，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子、抗体片段、融合蛋白或包含修饰的IgG重链恒定区或其中的表位的任何其他形式的多肽。
在多肽包括修饰的IgG重链恒定区的情况下，所述修饰的IgG重链恒定区可以包括其他氨基酸置换或修饰，只要其包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser、331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。
IV.方法
一方面，本发明的方法是用于检测或捕获样品中的多肽的方法。所述方法包括使样品与“II.抗体”中描述的任一种抗体或“III.组合物”中描述的任一种组合物接触。
在优选的实施方案中，多肽包括修饰的IgG重链恒定区。修饰的IgG重链恒定区源自人天然存在的IgG中的任一恒定区，或者源自选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区的嵌合恒定区。修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser、331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。
在另一优选的实施方案中，所述多肽包括由RRGPK(SEQ ID NO:104)组成的氨基酸序列、由RRGPS(SEQ ID NO:117)组成的氨基酸序列，由LHEALHAHYTRKE(SEQ ID NO:105)组成的氨基酸序列，和由LHEALHAHTTRKE(SEQ ID NO:118)组成的氨基酸序列中的任一项。方法检测或捕获的多肽在其结构方面没有特别限制，只要多肽包括这些氨基酸序列中的任一项或多项即可。多肽优选包括修饰的IgG重链恒定区，所述修饰的IgG重链恒定区包括这些氨基酸序列中的一项或多项。
在一个实施方案中，由方法检测或捕获的多肽可以是抗体，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子、抗体片段、融合蛋白或包含修饰的IgG重链恒定区或其中的表位的任何其他形式的多肽。
在多肽包括修饰的IgG重链恒定区的情况下，所述修饰的IgG重链恒定区可以包括其他氨基酸置换或修饰，只要其包括选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser、331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中的至少一个氨基酸即可。
图3中举例说明了ELISA方法作为该方法的具体实施方案。“兔抗Fc突变抗体”对应于“II.抗体”中描述的一种抗体，图3A中的“抗hC5抗体”和图3B中的“抗IL-8抗体”对应于包含修饰的IgG重链恒定区的多肽。固定在板上的兔抗Fc-突变抗体捕获样品中图3A中的抗hC5抗体和图3B中的抗IL-8抗体。然后，作为抗hC5抗体的抗原的hC5(人补体5)，结合至与抗hC5抗体所结合的表位不同的表位的“小鼠抗hC5”，和抗小鼠-POD在图3A中按此顺序反应。在图3B中，作为抗IL-8抗体的抗原的IL-8，结合与抗IL-8抗体所结合的表位不同的表位的“小鼠抗IL-8”，以及抗小鼠-POD按此顺序反应。最后，将POD底物添加到板上并测量其发光。在本实施方案中，当样品中存在一定量的包含修饰IgG重链恒定区的多肽时，用光度计检测发光。
在另一个实施方案中，“II.抗体”中描述的抗体可用于检测抗原，例如图4所示的hC5和IL-8。在该实施方案中，“小鼠抗Fc-突变抗体”和“兔抗Fc-突变抗体”对应于“II.抗体”中描述的任一种抗体，并且图4A中的“抗-hC5抗体”和图4B中的“抗IL-8抗体”对应于包含修饰的IgG重链恒定区的多肽。在图4A中，固定在板上的兔抗hC5抗体捕获样品中的hC5。在图4B中，固定在板上的小鼠抗IL-8抗体捕获样品中的IL-8。然后，在图4A中，抗-hC5抗体、小鼠抗Fc-突变抗体和抗-小鼠-POD按此顺序反应。在图4B中，抗IL-8抗体、兔抗Fc突变抗体和抗兔HRP按此顺序反应。最后将POD(过氧化物酶)例如HRP(辣根过氧化物酶)底物添加到板上并测量其发光。在本实施方案中，当样品中存在一定量的hC5或IL-8时，通过光度计检测发光。
上述涉及ELISA方法的实施方案可以用Simoa(注册商标)测定代替。在该测定的一个实施方案中，“II.抗体”中描述的抗体可用于检测抗原，例如IL-8，如图5所示。在该实施方案中，“兔抗Fc-突变抗体”对应于“II.抗体”中描述的抗体之一，并且“抗IL-8抗体”对应于包含修饰的IgG重链恒定区的多肽。固定在珠子上的小鼠抗IL-8抗体捕获样品中的IL-8。然后抗IL-8抗体、生物素化抗Fc-突变抗体和链霉亲和素-β-半乳糖苷酶(SBG(QuanterixCorporation))按此顺序反应。最后，将β-半乳糖苷酶的底物(RGB)加入反应物中并测量其发光。
实施例1
包含恒定区的抗体的制备，所述恒定区包含在Fc区中的多个突变抗体表达和纯化
通过FreeStyle293表达系统表达包含恒定区的抗体，所述恒定区在Fc区中包含多个突变。使用的恒定区(SEQ ID NO:1)在WO2016098356A1中称为SG115。收获的细胞培养液(HCCF)用r蛋白A树脂(MabSelect SuRe,GE)和尺寸排阻色谱(SEC,Superdex200pg,GE)纯化。在SEC过程中，我们将缓冲液更换为20mmol/L组氨酸、150mmol/L精氨酸-天冬氨酸，pH6.0。最后，使用UF(超滤)将抗体浓缩至143mg/mL。
木瓜蛋白酶消化
对于木瓜蛋白酶消化，我们使用了Pierce Fab制备试剂盒(Pierce，货号44985)。木瓜蛋白酶消化过程如下所述。
-用消化缓冲液将抗体浓度调整到8.0mg/mL。
-将0.5mL抗体溶液添加到含有平衡的木瓜蛋白酶树脂的离心柱管中。将顶盖和底塞置于离心柱上。
-将消化反应溶液在37℃下在旋转仪上孵育15小时。
-孵育后，取下底盖，并将离心柱放入微量离心管中。将柱以5000x g离心一分钟。
-将树脂用0.5mL的Dulbecco’s PBS(-)洗涤。将离心柱置于微量离心管中。将柱以5000x g离心1分钟。
-将第4步和第5步的溶液混合作为消化级分。一根柱的总体积为1.0mL。
Fc片段的纯化
用r蛋白A树脂(MabSelect SuRe,GE)和尺寸排阻色谱(SEC,Superdex200pg,GE)纯化木瓜蛋白酶消化的样品。在SEC过程中，我们去除了整个IgG(未消化的分子)并将缓冲液更换为Dulbecco’s PBS(-)。
实施例2
生成识别SG115中的突变的抗体
识别SG115中的突变的抗体，称为“抗SG115抗体”，如下所述制备、选择和测定。
用SG115的Fc片段(50-100微克/剂/兔)皮内免疫十周龄的NZW兔。在2个月内重复给药5次，然后从免疫的兔身上收集血液。根据WO2016098356A1中描述的程序，用细胞分选器分选抗原特异性B细胞，然后铺板和培养。培养后，收集B细胞培养物上清用于进一步分析，并将沉淀物冷冻保存。
使用B细胞培养物上清通过ELISA评估结合SG115的能力。我们测试了与5种修饰的IgG重链恒定区的结合以评估结合特异性：SG115(SEQ ID NO:1)、SG115v1(SEQ ID NO:2)、SG115v2(SEQ ID NO:3)、G1m(SEQ ID NO:4)和G4d(SEQ ID NO:5)。这5种恒定区的序列比对如图1所示。
共筛选了10,560个B细胞系与5种修饰IgG重链恒定区的结合，从中选择186个细胞系并命名为SKA0001-SKA0186，它们与SG115结合但不与G1m和G4d结合，并且也与SG115v1和/或Sg115v2结合。使用ZR-96 Quick-RNA试剂盒(ZYMO RESEARCH，货号R1053)从冷冻保存的细胞沉淀中纯化所选细胞系的RNA。所选细胞系中编码抗体重链可变区的DNA通过逆转录PCR扩增并与编码rbIgGv2重链恒定区(SEQ ID NO:6)的DNA重组。编码抗体轻链可变区的DNA通过逆转录PCR扩增并与编码rbIgk轻链恒定区(SEQ ID NO:7)的DNA重组。抗体在FreeStyleTM 293-F细胞(Invitrogen)中表达并从培养上清液中纯化。通过进一步评估，基于ELISA中的结合能力和特异性，以及重链CDR3的序列多样性，选择出12个克隆。在这些克隆中，6个克隆(SKA0009、SKA0016、SKA0046、SKA0052、SKA0054和SKA0127)显示与SG115v1的选择性结合，但不与SG115v2选择性结合，而其他6个克隆(SKA0001、SKA0027、SKA0028、SKA0117、SKA0141、SKA0171)显示出与SG115v2选择性结合但不与SG115v1选择性结合(图2-1和2-2)。这12种抗体的VH和VL序列列于表1。
[表1]
Figure BDA0003248683120000351
实施例3
通过抗SG115抗体检测样品中的SG115
为检测生物样品中包含含有SG115的Fc区中全部或部分突变的Fc区的抗体(以下也称为“Fc-突变抗体”或“多个Fc-突变抗体”)，评估了上述12种单克隆抗体(以下也称为“抗Fc-突变抗体”或“多个抗Fc-突变抗体”)的有效性。包含SG115的特定抗人C5抗体被用作实施例3-5中的Fc-突变抗体的模型，其在下文中被称为“抗hC5抗体”。
测定程序
96孔免疫板的每孔均包被兔抗Fc-突变抗体，并用封闭缓冲液封闭。将稀释的血清样品添加到板的每个孔中。将重组人C5添加到板的每个孔中。添加小鼠抗-hC5抗体，然后添加抗-小鼠-POD(Jackson ImmunoResearch Inc.)。最后，将POD底物加入板的每个孔中并测量OD。在步骤之间洗涤板。
抗体选择的反应性测试
测试了12种抗Fc-突变抗体。包含SG115的抗hC5抗体用合并的人血清稀释，并使用12种候选兔抗Fc突变抗体进行测量。计算信噪比。测得的OD列于表2中。从每种表位类型中选择三个候选者(总共6个候选者)进行选择性测试(表2)。即，选择SKA0009、SKA0052和SKA0127作为与SG115v1特异性结合的抗体，并选择SKA0117、SKA0141和SKA0171作为与SG115v2特异性结合的抗体。
[表2]
Figure BDA0003248683120000371
抗体选择的选择性测试
使用6种候选抗体作为捕获试剂测量了带有或不带有加标(spiked)抗hC5抗体的10份单独的血清和校准曲线样品。在没有加标抗hC5抗体的情况下，在任何给定的兔抗Fc突变抗体中，所有单个样品的测量浓度均低于定量限(BLQ)。在加标的抗hC5抗体的情况下，在任何给定的兔抗Fc突变抗体中，所有单个样品的测量浓度的相对误差(RE)均在+/-20％以内(表3)。
[表3]
Figure BDA0003248683120000381
BLQ:低于定量限
选择的抗体
根据反应性测试和选择性测试的结果，选择了信噪比最高的SKA0141。
实施例4
评估测量人血清中抗hC5抗体的方法(Fc突变抗体检测测定)
测定方法
将96孔免疫板包被兔抗Fc-突变抗体(SKA0141)，并用封闭缓冲液封闭。将包括抗hC5抗体的稀释的血清样品添加到板的每个孔中。将重组人C5添加到板的每个孔中。添加小鼠抗hC5单克隆抗体，然后添加抗-小鼠-POD(Jackson ImmunoResearch Inc.)。最后，将POD底物添加到板的每个孔中并测量OD。在步骤之间洗涤板。
方法评价
测试了再现性。批内准确度(RE)和精密度(CV)分别为-16.3％至-5.1％和1.6％至4.4％(表4)。批间准确度(RE)和精密度(CV)分别为-10.1％至-4.0％和2.7％至6.9％(表5)。
[表4]
Figure BDA0003248683120000391
[表5]
Figure BDA0003248683120000392
测试了选择性。在没有加标抗hC5抗体的情况下，所有单个样品的测量浓度均为BLQ。在使用加标的抗hC5抗体的情况下，所有单个样品的测量浓度的RE为-15.2％至2.2％(表6)。
[表6]
Figure BDA0003248683120000401
测试了稀释线性。可以在50,000倍的稀释因子下测量到每毫升1毫克抗hC5抗体，并且未观察到前带效应。(表7)
[表7]
Figure BDA0003248683120000402
ALQ:高于定量限
测试了来自C5的干扰。未观察到来自C5的干扰(表8)。
[表8]
Figure BDA0003248683120000411
建立了使用抗Fc突变抗体测量人血清中Fc突变抗体的方法。该测定的方案如图3所示。
实施例5
我们还尝试建立一种测定方法，用于检测生物样品中被Fc突变抗体识别的抗原。抗-hC5抗体也被用作该评估中Fc突变抗体的模型。
评估测量人血清中C5的方法(抗原检测测定)
测定方法
将96孔免疫板包被兔抗Fc-单克隆抗体，并用封闭缓冲液封闭。将稀释的血清样品添加到板的每个孔中。将抗hC5抗体添加到板的每个孔中。将通过将SKA0141中的Fc区替换为小鼠Fc区而获得的小鼠抗Fc-突变抗体添加到板的每个孔中，然后添加抗小鼠-POD(Jackson ImmunoResearch Inc.)。最后，将POD底物添加到板的每个孔中并测量OD。在步骤之间洗涤板。
方法评价
测试了再现性。批内准确度(RE)和精密度(CV)分别为-8.2％至4.2％和2.3％至6.2％(表9)。批间准确度(RE)和精密度(CV)分别为-6.8％至1.3％和3.5％至6.2％(表10)。
[表9]
Figure BDA0003248683120000421
*将重组人C5加标到C5耗尽的血清中。
Figure BDA0003248683120000422
合并的人血清(内源人C5)。浓度为批间再现性测试中的平均测量浓度。
Figure BDA0003248683120000423
将重组人C5加标到合并的人血清中。浓度是内源人C5浓度(89.1μg/mL)+加标重组人C5浓度(65.0μg/mL)。
[表10]
Figure BDA0003248683120000431
*将重组人C5加标到C5耗尽的血清中。
Figure BDA0003248683120000432
合并的人血清(内源人C5)。浓度为批间再现性测试中的平均测量浓度。
Figure BDA0003248683120000433
将重组人C5加标到合并的人血清中。浓度是内源人C5浓度(89.1μg/mL)+加标重组人C5浓度(65.0μg/mL)。
测试了平行度。十份单独的血清从325倍到2600倍连续稀释并测量。在任何稀释因子中，测量的浓度都得到恢复(表11)。
[表11]
Figure BDA0003248683120000441
测试了稀释线性。可以在26,000倍的稀释因子下测量到每毫升1130毫克C5，并且未观察到前带效应。(表12)
[表12]
Figure BDA0003248683120000442
ALQ:高于定量限
测试了来自抗hC5抗体的干扰。未观察到来自抗hC5抗体的干扰(表13)。
[表13]
Figure BDA0003248683120000451
建立了使用抗Fc突变抗体测量人血清中抗原的方法。该测定的方案如图4所示。
实施例6
评估测量人血浆中抗IL-8抗体的方法(Fc突变抗体检测测定)
测定方法
包括修饰的IgG重链恒定区(其中所述修饰的IgG重链恒定区包含SG115 Fc区中的部分突变)(SEQ ID NO:110)的特异性抗人IL-8抗体用作实施例6-8中Fc-突变抗体的模型，它被称为“抗IL-8抗体”。
将96孔免疫板包被兔抗Fc-突变抗体之一(SKA0117)，并用封闭缓冲液封闭。将稀释的血浆样品添加到板的每个孔中。将重组人IL-8(SEQ ID NO:111)添加到板的每个孔中。添加小鼠抗IL-8单克隆抗体(重链可变区，SEQ ID NO:112；轻链可变区，SEQ ID NO:113；重链恒定区，SEQ ID NO:114；轻链恒定区，SEQ ID NO:115)，然后添加抗小鼠-POD(JacksonImmunoResearch Inc.)。最后，将POD底物添加到板的每个孔中并测量OD。在步骤之间洗涤板。
方法评价
测试了再现性。测量了已知浓度的抗IL-8抗体(50.0ng/mL(REP-LL)、100ng/mL(REP-L)、400ng/mL(REP-M)、2400ng/mL(REP-H)、和3200ng/mL(REP-UL))。批内准确度(RE)和精密度(CV)分别为-14.2％至-9.7％和4.9％至7.3％(表14)。
[表14]
Figure BDA0003248683120000461
批间准确度(RE)和精密度(CV)分别为-10.3％至-6.6％和7.0％至10.1％(表15)。
[表15]
Figure BDA0003248683120000471
测试了选择性。在没有加标抗IL-8抗体的情况下(SEL-O或SEL-EM-O)，所有个体样品的测量浓度均为BLQ。使用加标抗IL-8抗体(50.0ng/mL(SEL-LL或SEL-EM-LL))的情况下，所有个体样品的测量浓度的RE为-23.2％至-4.3％(表16)。
[表16]
Figure BDA0003248683120000481
*低于定量下限
测试了稀释线性。可以在10,000倍的稀释因子下测量到每毫升1.6毫克的抗IL-8抗体，并且未观察到前带效应(表17)。
[表17]
Figure BDA0003248683120000482
定量范围：在测定孔中1.00ng/mL至64.0ng/mL
*高于定量上限
测试了来自IL-8的干扰。高达50.0ng/mL的IL-8在抗IL-8抗体浓度为2400ng/mL时不会干扰测定，并且高达1.00ng/mL的IL-8在抗IL-8抗体浓度为50.0ng/mL时不干扰测定(表18)。
[表18]
Figure BDA0003248683120000491
证实了测量血浆中抗IL-8抗体的方法的有效性。
实施例7
评估使用ELISA测量人血浆中IL-8的方法(抗原检测测定)
测定方法
用封闭缓冲液封闭后，将96孔链霉亲和素免疫板包被生物素化小鼠抗IL-8单克隆抗体。将抗IL-8抗体添加到96孔聚丙烯板中的稀释血浆样品中(反应溶液)。孵育后，将反应溶液转移到链霉亲和素板的每个孔中。添加一种兔抗Fc突变抗体(SKA0001)，然后添加抗兔HRP(Southern Biotechnology Associates Inc.)。最后，将POD底物添加到板的每个孔中并测量OD。在步骤之间洗涤链霉亲和素板。
方法评价
测试了再现性。批内准确度(RE)和精密度(CV)分别为-6.4％至-1.9％和1.5％至2.9％(表19)。
[表19]
Figure BDA0003248683120000501
定量范围之外的转化值(血浆中低于100pg/mL，血浆中高于3200pg/mL)包括在计算中。
日内再现性的结果用作日间再现性第一次测定的结果。
CV：变异系数
RE：相对误差
批间准确度(RE)和精密度(CV)分别为-8.0％至2.1％和3.0％至5.2％(表20)。
[表20]
Figure BDA0003248683120000511
测试了稀释线性。可以在20,000倍的稀释因子下测量到每毫升1毫克IL-8(加标的)，并且未观察到前带效应(表21)。
[表21]
合并的人血浆中加标的浓度：1000ng/mL
Figure BDA0003248683120000521
ALQ：高于定量上限(＞640pg/mL)
CV：变异系数
RE：相对误差
测试了来自抗IL-8抗体的干扰。未观察到来自抗IL-8抗体(血浆中100μ/mL)的干扰(表22)。
[表22]
批号190702
Figure BDA0003248683120000531
差异％＝(添加IS的样品的转化值-无IS样品的转化值)/无IS样品的转化值x100
IS：干扰物质
ND：未检测
下划线：低于定量下限(血浆中＜100pg/mL)
NA：不适用
证实了使用ELISA测量人血浆中IL-8的方法的有效性。
实施例8
评估使用Simoa(注册商标)(Simoa(注册商标)测定)测量人血浆中IL-8的方法
测定程序
使用Simoa(注册商标)系统(Quanterix Corporation)自动进行测定。将稀释的样品、抗IL-8抗体和包被在珠子上的小鼠抗IL-8单克隆抗体混合。将珠子装载到阵列盘的微孔中。将生物素化的抗Fc突变抗体(SKA0028)添加到圆盘中，然后添加链霉亲和素-β-半乳糖苷酶，SBG(Quanterix Corporation)。最后，加入β-半乳糖苷酶的底物RGB，并测量荧光强度。
方法评价
测试了再现性。批内精密度(CV)为1.3％至14.3％(表23)。
[表23]
Figure BDA0003248683120000541
批间精密度(CV)分别为8.6％至24.7％(表24)。
[表24-1]
Figure BDA0003248683120000551
[表24-2]
Figure BDA0003248683120000561
测试了平行度。三份单独的血浆从20倍到40倍连续稀释并测量。在任何稀释因子中，测量的浓度都得到恢复(表25)。
[表25]
Figure BDA0003248683120000571
测试了稀释线性。可以在50,000倍的稀释因子下测量到每毫升3.48毫克IL-8，并且未观察到前带效应。(表26)。
[表26]
Figure BDA0003248683120000572
-：不适用
*：考虑在运行间精密度中确定的血浆(批号PLA022A100E001)中内源IL-8浓度来计算理论浓度。
测试了来自抗IL-8抗体的干扰。未观察到来自抗IL-8抗体(血浆中100μg/mL)的干扰(表27)。
[表27]
Figure BDA0003248683120000581
证实了使用Simoa(注册商标)测定测量人血浆中IL-8的方法的有效性。
实施例9
显示选择性结合SG115v1的抗Fc-突变抗体针对抗hC5抗体的亲和力评估。
在pH 7.4下显示与SG115v1选择性结合的抗Fc-突变抗体(SKA0009、SKA0016、SKA0046、SKA0052、SKA0054和SKA0127)针对抗hC5抗体的KD值是在25℃使用Biacore T200仪(GE Healthcare)确定的。
使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将小鼠抗兔IgG(Fc)抗体(以下称为抗兔IgG)(Abbexa)固定到CM5传感器芯片的流动池(FC)1和2上。对于抗兔IgG的固定，使用HBS-EP+，pH7.4(GE Healthcare)缓冲液作为运行缓冲液。固定后，将运行缓冲液改为磷酸盐pH7.4缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，其含有150mM NaCl和0.05w/v％P-20，pH 7.4)。每个抗Fc-突变抗体被抗兔IgG捕获到传感器芯片的FC2上。调整待捕获的抗Fc-突变抗体的量，使共振单位(RU)数为100。以0、50、100、200、400和800nM以10微升/分钟注射抗hC5抗体。每个循环后，传感器表面用10mM甘氨酸-HCl，pH2.0再生，其以30微升/分钟的流速注入。KD值使用BiacoreT200评估软件2.0版(GE Healthcare)获得。缔合速率(ka)、解离速率(kd)和解离常数(KD)显示在表28中。
[表28]
Figure BDA0003248683120000591
*：由于解离速度慢，数据可靠性可能较低
实施例10
显示选择性结合SG115v1的抗Fc-突变抗体针对抗IL-8抗体的亲和力评估。
为了确认对SG115v1表现出选择性结合的抗Fc-突变抗体的结合能力，抗Fc-突变抗体在pH 7.4下针对抗IL-8抗体的KD值是在25℃使用Biacore T200仪(GE Healthcare)确定的。抗IL-8抗体的Fc区序列与抗hC5抗体的Fc区序列高度相似。
使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将抗兔IgG(Abbexa)固定到CM5传感器芯片的FC1和2上。对于抗兔IgG的固定，使用HBS-EP+，pH7.4(GE Healthcare)缓冲液作为运行缓冲液。固定后，将运行缓冲液改为磷酸盐pH7.4缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，其含有150mM NaCl和0.05w/v％P-20，pH 7.4)。每个抗Fc-突变抗体由抗兔IgG捕获到传感器芯片的FC2上。调整待捕获的抗Fc-突变抗体的量，使共振单位(RU)数为100。以0、100、400和800nM以10微升/分钟注射抗IL-8抗体。每个循环后，传感器表面用10mM甘氨酸-HCl，pH2.0再生，其以30微升/分钟的流速注入。KD值使用Biacore T200评估软件2.0版(GE Healthcare)获得。
ka、kd和KD列于表29中。虽然抗hC5抗体中根据EU编号系统239位的氨基酸从Ser突变为Lys，但抗IL-8抗体中相应位置的氨基酸未突变。在这种情况下，抗Fc-突变抗体可以与抗IL-8抗体结合。这意味着SG115v1中抗hC5抗体和抗IL-8抗体共有的两个突变，即L235R和G236R(两个位置均根据EU编号系统编号)，对抗Fc-突变抗体与SG115v1的选择性结合是必不可少。
[表29]
Figure BDA0003248683120000601
*：由于解离速度慢，数据可靠性可能较低
实施例11
显示选择性结合SG115v2的抗Fc-突变抗体针对抗DENV E蛋白抗体的亲和力评估。
在pH 7.4下显示与SG115v2选择性结合的抗Fc-突变抗体(SKA0001、SKA0027、SKA0028、SKA0117、SKA0141和SKA0171)针对抗DENV E蛋白抗体(其包括修饰的IgG重链恒定区(SEQ ID NO:116)作为Fc突变抗体)的KD值是在25℃使用Biacore T200仪(GEHealthcare)确定的。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将抗兔IgG固定到CM5传感器芯片的FC3和4上。对于抗兔IgG的固定，使用HBS-EP+，pH7.4(GE Healthcare)缓冲液作为运行缓冲液。固定后，将运行缓冲液改为磷酸盐pH7.4缓冲液。每个抗体由抗兔IgG捕获到传感器芯片的FC4上。调整待捕获的抗Fc-突变抗体的量，使共振单位(RU)数为100。以0、12.5、50和400nM以10微升/分钟注射抗DENV E蛋白抗体。每个循环后，传感器表面用10mM甘氨酸-HCl，pH2.0再生，其以30微升/分钟的流速注入。KD值使用Biacore T200评估软件2.0版(GEHealthcare)获得。ka、kd和KD示于表30中。
[表30]
Figure BDA0003248683120000611
*：由于解离速度慢，数据可靠性可能较低
实施例12
使用SKA0016和SKA0117作为捕获分子评估抗hC5抗体对人C5的亲和力。
使用Biacore T200仪(GE Healthcare)在37℃下测定了抗hC5抗体在pH 7.4时针对人C5的KD值。使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)将SKA0016固定到CM5传感器芯片的FC1和2上，将SKA0117固定到CM5传感器芯片的FC3和4上。对于SKA0016和SKA0117的固定，使用HBS-EP+，pH7.4(GE Healthcare)缓冲液作为运行缓冲液。固定后，将运行缓冲液改为磷酸盐pH7.4缓冲液。抗hC5抗体被SKA0016和SKA0117捕获到传感器芯片的FC2和FC4上。调整待捕获的抗hC5抗体的量，使共振单位(RU)数为35。以0、2、4、8、16和32nM以10微升/分钟注射人C5。在每个循环中，传感器表面用100mM甘氨酸-HCl，pH2.0，然后是25mM NaOH再生，两者均以30微升/分钟的流速注入。KD值是使用Biacore T200评估软件，2.0版(GE Healthcare)获得的。ka、kd和KD列于表31中。
[表31]
捕获分子 ka(1/Ms) kd(1/s) K<sub>D</sub>(M)
SKA0016 6.33×10<sup>5</sup> 1.13×10<sup>-4</sup> 1.78×10<sup>-10</sup>
SKA0117 6.51×10<sup>5</sup> 1.23×10<sup>-4</sup> 1.88×10<sup>-10</sup>
实施例13
使用SKA0016和SKA0117作为固定分子，对抗hC5抗体对人C5的pH依赖性相互作用 进行定性分析。
使用Biacore T200仪(GE Healthcare)在37℃评估了抗hC5抗体与人C5在pH7.4和pH6.0下的pH依赖性相互作用。抗hC5抗体被捕获到在实施例12中制备的CM5芯片的FC2和FC4上。调整待捕获的抗hC5抗体的量，使共振单位(RU)数为35。为了确认在pH7.4下抗hC5抗体与人C5之间的缔合，将32nM的人C5注射到磷酸盐pH 7.4缓冲液中的所有FC中。然后在作为运行缓冲液的磷酸盐pH 7.4缓冲液或磷酸盐pH6.0缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，含有150mM NaCl和0.05w/v％P-20，pH 6.0)中监测解离阶段。在监测解离阶段后，通过注入100mM Gly-HCl，pH2.0然后是25mM NaOH来再生传感器芯片，两者均以30微升/分钟的流速注入。使用Biacore T200评估软件版本2.0，通过比较pH 7.4和pH 6.0下传感图的解离阶段来分析抗hC5抗体与人C5的pH依赖性相互作用。FC2上的传感图减去FC1，FC4的传感图减去FC3，并且每个传感图通过将人C5结合响应(在人C5注射结束前5秒)调整为值“100”来标准化。
无论捕获分子如何，在pH6.0条件下，人C5从抗hC5抗体的解离速度比pH7.4更快(图6；抗hC5抗体由(a)SKA0016和(b)SKA0117固定)。因此，认为SKA0016和SKA0117均可有效监测抗hC5抗体与人C5之间的pH依赖性相互作用。
实施例14
评估人Fc受体(hFcRn)与被SKA0016捕获的抗hC5抗体之间的结合。
使用Biacore T200仪(GE Healthcare)评估人FcRn是否可以与由SKA0016捕获的抗hC5抗体在pH 6.0结合。抗hC5抗体被SKA0016捕获到FC2上，其中所述SKA0016通过与实施例9中相同的程序固定到CM5芯片上。磷酸盐pH6.0缓冲液用作运行缓冲液。调整待捕获的抗hC5抗体的量，使得共振单位(RU)的数量为400。hFcRn以0、26.3、52.5、105、210和420nM以10微升/分钟的速度以单次循环动力学方式注入。传感器表面用100mM甘氨酸-HCl,pH2.0，然后是25mM NaOH再生，两者均以30微升/分钟的流速注入。使用Biacore T200评估软件2.0版(GE Healthcare)确认了hFcRn结合响应的增加。
图7显示了FC1(虚线)和FC2(实线)的传感图。从FC2传感图(实线)可以看出hFcRn的结合响应以浓度依赖性方式增加。SKA0016没有中断hFcRn和抗hC5抗体之间的结合。然而，hFcRn似乎与SKA0016的Fc区域结合，因为FC1的传感图也显示了结合响应的增加(虚线)。这种不期望的人FcRn与捕获分子的结合可以通过将废止与人FcRn的结合的氨基酸置换引入SKA0016来解决。
Figure IDA0003248683170000011
Figure IDA0003248683170000021
Figure IDA0003248683170000031
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Figure IDA0003248683170000051
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Claims (15)

1.分离的抗体，所述抗体与修饰的IgG重链恒定区特异性结合，所述修饰的IgG重链恒定区源自人天然存在的IgG中的任何一个恒定区，或者源自由选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区，其中所述修饰的IgG重链恒定区包含至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser，331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置都根据EU编号系统编号)组成的组中。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体基本上不结合所述人天然存在的IgG中的任何一个恒定区和所述由选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述人天然存在的IgG中的恒定区是由SEQ IDNO:106的氨基酸序列组成的IgGl恒定区，由SEQ ID NO:107的氨基酸序列组成的IgG2恒定区，由SEQ ID NO:108的氨基酸序列组成的IgG3恒定区和由SEQ ID NO:109的氨基酸序列组成的IgG4恒定区。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中所述修饰的IgG重链恒定区源自嵌合恒定区，所述嵌合恒定区获得自人天然存在的IgG1和IgG4中的恒定区。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述修饰的IgG重链恒定区包含至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg和239位的Lys(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中所述修饰的IgG重链恒定区包括235位的Arg，以及236位的Arg和239位的Lys中的任一个或两者(所有位置均根据EU编号系统编号)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体，其结合所述修饰的IgG重链恒定区中由氨基酸序列RRGPK(SEQ ID NO:104)或RRGPS(SEQ ID NO:117)组成的部分。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体，其包括以下(a)至(f)中任一项：
(a)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列；
(b)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列；
(c)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列；
(d)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列；
(e)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列；和
(f)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述修饰的IgG重链恒定区包含选自由428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中的至少一个。
11.根据权利要求1至5和10中任一项所述的抗体，其中所述修饰的IgG重链恒定区包括428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu，和任选地436位的苏氨酸(所有位置均根据EU编号系统编号)。
12.根据权利要求1至5、10和11中任一项所述的抗体，其结合所述修饰的IgG重链恒定区中由氨基酸序列LHEALHAHYTRKE(SEQ ID NO:105)或LHEALHAHTTRKE(SEQ ID NO:118)组成的部分。
13.根据权利要求1至5和10至12中任一项所述的抗体，其包括以下(g)至(l)中任一项：
(g)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；
(h)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列；
(i)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；
(j)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列；
(k)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列；和
(l)可变区，其包括
HVR-H1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，
HVR-H2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列，
HVR-H3，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，
HVR-L1，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列，
HVR-L2，其包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列，和
HVR-L3，其包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列。
14.分离的抗体，其结合至与权利要求1至13中任一项所述的抗体相同的表位。
15.分离的抗体，其与修饰的IgG重链恒定区特异性结合，其中所述抗体与权利要求1至14中任一项的所述抗体竞争对于所述修饰的IgG重链恒定区的结合，其中所述修饰的IgG重链恒定区源自人天然存在的IgG中的任一恒定区或源自由选自人天然存在的IgG中的恒定区的至少两种恒定区获得的嵌合恒定区，并且所述修饰的IgG重链恒定区包括至少一个氨基酸，所述至少一个氨基酸选自由235位的Arg、236位的Arg、239位的Lys、327位的Gly、330位的Ser、331位的Ser、428位的Leu、434位的Ala、438位的Arg和440位的Glu(所有位置均根据EU编号系统编号)组成的组中。
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