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CN113533735A - 吖啶酯类似物在制备吖啶酯类似物标记抗体中的应用 - Google Patents

吖啶酯类似物在制备吖啶酯类似物标记抗体中的应用 Download PDF

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CN113533735A CN202110783301.6A CN202110783301A CN113533735A CN 113533735 A CN113533735 A CN 113533735A CN 202110783301 A CN202110783301 A CN 202110783301A CN 113533735 A CN113533735 A CN 113533735A
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Boyixin Hangzhou Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明提供了吖啶酯类似物在制备吖啶酯类似物标记抗体中的应用，属于生物医学检测技术领域。本发明中，吖啶酯类似物用于标记抗体，样本中的抗原和酶标抗原竞争结合吖啶酯类似物标记的抗体，形成免疫复合物。该复合物中吖啶酯类似物与酶彼此靠近，在激发液的作用下发光底物吖啶酯类似物被复合物中的酶催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，产生的光子数与样本中抗原的浓度成反比，据此可计算得到样本中抗原的浓度。本申请将吖啶酯类似物用于竞争法检测，检测抗体能够与待测分析物于均相体系中进行免疫反应，不需要微孔板、磁珠或微球作为载体包被抗体，是一种免分离的化学发光技术。

Description

吖啶酯类似物在制备吖啶酯类似物标记抗体中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其涉及吖啶酯类似物在制备吖啶酯类似物标记抗体中的应用。
背景技术
免疫检测(immunodiagnosis)是应用免疫学的理论、技术和方法诊断各种疾病和测定免疫状态。免疫检测试剂在诊断试剂盒中品种最多，广泛应用于医院、血站、体检中心，主要用于肝炎检测、性病检测、肿瘤检测、孕检等。免疫检测的方法包括夹心法、间接法和竞争法。目前的免疫检测主要是竞争法，竞争法的基本原理是：①把抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②把抗原或抗体与某一种酶连接成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或酶标抗体既保留其抗原或抗体的免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。但是抗原或抗体需要结合到固相载体上，操作繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供吖啶酯类似物在制备吖啶酯类似物标记抗体中的应用，将吖啶酯类似物用于竞争法检测中吖啶酯类似物标记抗体，能够摆脱固相载体的限制。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了吖啶酯类似物在制备吖啶酯类似物标记抗体中的应用；
所述吖啶酯类似物的分子结构式如式I所示；
Figure BDA0003158053490000021
本发明还提供了吖啶酯类似物在制备竞争法检测试剂盒中的应用；所述吖啶酯类似物的分子结构式如式I所示；
Figure BDA0003158053490000022
本发明还提供了一种竞争法检测试剂盒，包括吖啶酯类似物标记的抗体、酶标抗原和激发液；
所述吖啶酯类似物的分子结构式如式I所示；
Figure BDA0003158053490000023
优选的，还包括本底抑制剂。
优选的，所述本底抑制剂包括摩尔浓度为20～30mM的羟基二乙胺水溶液。
优选的，所述激发液包括以下浓度的组分：20～30mM tris、0.5～1.5mM对苯基苯酚、0.3～0.8mM EDTA、0.1％～0.3％吐温-20和3～8mM过氧化脲；所述tris的pH值为7.8～8.2。
优选的，所述酶标抗原包括辣根过氧化物酶标记的抗原。
优选的，所述竞争法检测试剂盒包括T3检测试剂盒、T4检测试剂盒、克伦特罗检测试剂盒或莱克多巴胺检测试剂盒。
优选的，所述吖啶酯类似物标记的抗体包括吖啶酯类似物标记的T3单克隆抗体、吖啶酯类似物标记的T4单克隆抗体、吖啶酯类似物标记的克伦特罗单克隆抗体或吖啶酯类似物标记的莱克多巴胺单克隆抗体。
本发明还提供了一种非诊断目的的竞争法检测方法，包括以下步骤：
1)采用吖啶酯类似物标记抗体；
2)将所述标记有吖啶酯类似物的抗体、酶标抗原和待测样本混合，于35～40℃孵育12～15min，得到反应液；
3)在所述反应液中加入激发液，检测自加入激发液后1秒钟内产生的发光信号，根据标准曲线和所述发光信号得到待测样本中的抗原浓度；
所述标准曲线由梯度浓度的定标品所得的发光信号值和定标品所对应的浓度值建立得到；
所述吖啶酯类似物的分子结构式如式I所示；
Figure BDA0003158053490000031
本发明的有益效果：本发明提供了吖啶酯类似物在制备吖啶酯类似物标记抗体中的应用；所述吖啶酯类似物的分子结构式如式I所示；
Figure BDA0003158053490000032
本发明中，吖啶酯类似物用于标记抗体，样本中的抗原和酶标抗原竞争结合吖啶酯类似物标记的抗体，形成免疫复合物。该免疫复合物中吖啶酯类似物与酶彼此靠近，在激发液的作用下发光底物吖啶酯类似物被复合物中的酶催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，产生的光子数与样本中抗原的浓度成反比，据此可计算得到样本中抗原的浓度。本申请将吖啶酯类似物用于竞争法检测，检测抗体能够与待测分析物于均相体系中进行免疫反应，不需要微孔板、磁珠或微球作为载体包被抗体，是一种免分离的化学发光技术。并且本发明的方法操作简单高效，检测用时仅需15min左右，大大缩短了检测时间。吖啶酯类似物能够用于均相、快速、高灵敏度的竞争法检测，与已知竞争法相比更简单化、更高效。此外，本发明中抗体用量少、成本低，生产工艺简单，易于放大生产，并且检测过程便捷对于检测仪器要求低，易于实现全自动化。
附图说明
图1是竞争法检测T3/T4示意图；
图2是竞争法检测T3的标准曲线，其中T3分别稀释在PBS缓冲液和血清中；
图3是竞争法检测T4的标准曲线，其中T3分别稀释在PBS缓冲液和血清中；
图4是免疫竞争法检测CLE的标准曲线，其中CLE分别稀释在PBS缓冲液和尿液中；
图5是免疫竞争法检测RAC的标准曲线，其中RAC分别稀释在PBS缓冲液和尿液中。
具体实施方式
本发明提供了吖啶酯类似物在制备吖啶酯类似物标记抗体中的应用；
所述吖啶酯类似物的分子结构式如式I所示；
Figure BDA0003158053490000041
本发明还提供了吖啶酯类似物在制备竞争法检测试剂盒中的应用；所述吖啶酯类似物的分子结构式如式I所示；
Figure BDA0003158053490000051
在本发明中，所述吖啶酯类似物标记抗体优选为竞争法检测试剂盒中的吖啶酯类似物标记抗体。
本发明还提供了一种竞争法检测试剂盒，包括吖啶酯类似物标记的抗体、酶标抗原和激发液；
所述吖啶酯类似物的分子结构式如式I所示；
Figure BDA0003158053490000052
在本发明中，所述吖啶酯类似物具有光能量转移活性，用于标记抗体和发光检测。
在本发明中，所述吖啶酯类似物来源于常规市售。本发明具体实施过程中，所述吖啶酯类似物购自于美国鲁米根公司。
在本发明中，所述激发液优选的包括以下浓度的组分：20～30mM tris、0.5～1.5mM对苯基苯酚、0.3～0.8mM EDTA、0.1％～0.3％吐温-20和3～8mM过氧化脲；所述tris的pH值为7.8～8.2；更优选的，所述激发液优选的包括以下浓度的组分：22～28mM tris、0.8～1.2mM对苯基苯酚、0.4～0.6mM EDTA、0.15％～0.25％吐温-20和4～6mM过氧化脲；所述tris的pH值为7.8～8.2；最优选的，所述激发液包括以下浓度的组分：25mM tris、1mM对苯基苯酚、0.5mM EDTA、0.2％吐温-20和5mM过氧化脲；所述tris的pH值为8.0。
在本发明只能够，激发液提供了反应物，可以与激发态中间体化合物产生化学发光反应。
本发明中，吖啶酯类似物用于标记抗体，样本中的抗原和酶标抗原竞争结合吖啶酯类似物标记的抗体，形成免疫复合物。该复合物中吖啶酯类似物与酶彼此靠近，在激发液的作用下发光底物被复合物中的酶催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，产生的光子数与样本中抗原的浓度成反比，据此可计算得到样本中抗原的浓度。
在本发明中，所述激发液用于激发发光信号，提高检测灵敏度和重复性。
在本发明中，所述竞争法检测试剂盒优选的还包括本底抑制剂；所述本底抑制剂包括摩尔浓度为20～30mM的羟基二乙胺水溶液。
在本发明中，所述羟基二乙胺水溶液的摩尔浓度优选为25mM。
在本发明中，所述吖啶酯类似物标记的抗体、酶标抗原、激发液和本底抑制剂体积比优选为10：10：10：(0.5～2)，优选为10：10：10：1。
本发明应用具有光能量转移的吖啶酯类似物，通过加入本底抑制剂消除干扰，降低背景信号值。在本发明中，未结合的过量抗体、吖啶酯类似物和过氧化氢酶无需洗涤去除，在本底抑制剂的作用下，不影响化学发光反应和检测结果。
在本发明中，所述酶标抗原优选的包括辣根过氧化物酶标记的抗原。在本发明中，所述抗原优选为T3、T4、克伦特罗小分子标记BSA载体蛋白(CLE-BSA)或莱克多巴胺小分子标记BSA载体蛋白(RAC-BSA)；所述T3、T4、CLE-BSA和RAC-BSA来源于常规市售，在本发明具体实施过程中，所述T3或T4购自于美国sigma公司或上海阿拉丁生化科技股份有限公司。在本发明中，所述酶标抗原优选的采用常规制备方法得到。
在本发明中，所述竞争法检测试剂盒优选的包括T3检测试剂盒、T4检测试剂盒、克伦特罗检测试剂盒或莱克多巴胺检测试剂盒。
在本发明中，所述吖啶酯类似物标记的抗体优选的包括吖啶酯类似物标记的T3单克隆抗体、吖啶酯类似物标记的T4单克隆抗体、吖啶酯类似物标记的克伦特罗单克隆抗体或吖啶酯类似物标记的莱克多巴胺单克隆抗体。
本发明还提供了一种非诊断目的的竞争法检测方法，包括以下步骤：
1)采用吖啶酯类似物标记抗体；
2)将所述标记有吖啶酯类似物的抗体、酶标抗原和待测样本混合，于35～40℃条件下孵育12～15min，得到反应液；
3)在所述反应液中加入激发液，检测自加入激发液后1秒钟内产生的发光信号，根据标准曲线计算样品中抗原浓度；所述标准曲线由梯度浓度的定标品所得的发光信号值和其所对应的浓度值建立得到。
本发明首先采用吖啶酯类似物标记抗体；所述吖啶酯类似物的分子结构式如式I所示；
Figure BDA0003158053490000071
在本发明中，当所述抗体为单克隆抗体、所述单克隆抗体为T3单克隆抗体或T4单克隆抗体时，所述吖啶酯类似物标记的抗体的制备方法包括以下步骤：
S1.将所述吖啶酯类似物溶液、单克隆抗体溶液和硼酸缓冲液混合，进行偶联反应，得到偶联反应溶液；
S2.对所述偶联反应溶液进行透析，收集截留分子量大于7000的部分，得到吖啶酯类似物标记的抗体。
在本发明中，所述吖啶酯类似物溶液的溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺。在本发明中，所述吖啶酯类似物溶液的质量体积浓度优选为0.3～0.8mg/mL，更优选为0.5mg/mL；所述单克隆抗体溶液的质量体积浓度优选为8～12mg/mL，更优选为10mg/mL；所述硼酸缓冲液的摩尔浓度优选为0.03～0.08M，更优选为0.05M；所述吖啶酯类似物溶液、单克隆抗体溶液和硼酸缓冲液的体积比优选为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(6～10)，更优选为1：1：8。
在本发明中，所述偶联反应的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；所述偶联反应的时间优选为0.8～1.2h，更优选为1h；所述偶连反应优选的于旋转的条件下进行，所述旋转的转速优选为20～60r/min，更优选为40r/min。
在本发明中，所述透析的过程优选的包括：将偶联反应溶液加入截留分子量为7000的透析袋中，放于PBS缓冲液中于4℃条件下透析20～30h；所述透气的旗舰更换2～3次PBS缓冲液，得到标记吖啶酯类似物的T3单克隆抗体(T3-A)或标记吖啶酯类似物的T4单克隆抗体(T4-A)；所述透析的时间优选为24h；所述标记吖啶酯类似物的T3单克隆抗体(T3-A)或标记吖啶酯类似物的T4单克隆抗体(T4-A)保存于保存液中；所述保存的温度优选为-20℃；所述保存液优选的在PBS缓冲液的基础上加入有体积浓度为0.05％的Proclin-300。
采用吖啶酯类似物标记抗体后，本发明将所述标记有吖啶酯类似物的抗体、酶标抗原和待测样本混合，于35～40℃条件下孵育12～15min，得到反应液。
在本发明中，所述孵育的温度优选为37℃；所述孵育的时间优选为13min。
得到反应液后，本发明在所述反应液中加入激发液，检测自加入激发液后1秒钟内产生的发光信号，根据标准曲线和所述发光信号得到待测样本中的抗原浓度；所述标准曲线由梯度浓度的定标品所得的发光信号值和其所对应的浓度值建立得到。
在本发明中，检测T3的计算公式为：y＝2.64594-0.59938x(r2＝0.95552)；检测T4的计算公式为：y＝3.34862-0.49008x(r^2＝0.92875)，其中y表示发光信号值以10为底的对数，x表示标准品的浓度以10为底的对数。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中竞争法检测T3/T4示意图参见图1。
实施例中所述吖啶酯类似物的分子结构式如式I所示，购自于美国鲁米根公司；
Figure BDA0003158053490000091
实施例1
辣根过氧化物酶与三碘甲状腺原氨酸(T3)偶联，T3单克隆抗体与吖啶酯类似物偶联，用于免疫竞争法检测。依次进行以下步骤：
1.辣根过氧化物酶偶联T3
将1μg三碘甲状腺原氨酸衍生物(T3-NHS)加入1ml 10mM碳酸缓冲液(PH8.0)中，再加入100μg辣根过氧化物酶，置于37℃避光轻轻搅拌2h。将上述反应液加入SUPERDEX 200凝胶过滤柱纯化，收集纯化的HRP与T3物酶偶联产物(HRP-T3)，最后用保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
2.T3单克隆抗体偶联吖啶酯类似物
将1mg发光底物吖啶酯类似物(A)在2ml DMF中溶解，取溶解的吖啶酯类似物100μl加入100μl浓度为10mg/ml的T3单克隆抗体中，然后加入0.05M硼酸缓冲液800μl，室温旋转反应1h。将反应溶液1ml加入截留分子量为7000的透析袋中，放于PBS缓冲液中4℃透析1天，期间更换3次PBS缓冲液，即可得到连接吖啶酯类似物的T3单克隆抗体(T3-A)，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
3.检测
配制激发液：25mM tris(pH 8.0)，1mM对苯基苯酚，0.5mM EDTA，0.2％吐温-20和5mM过氧化脲。
配制本底抑制剂：25mM羟基二乙胺溶液于去离子水中。
T3样品：取T3标准品用PBS缓冲液(PH＝7.4)稀释至不同浓度值100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml，4℃保存，作为定标品。另取T3标准品用T3阴性血清稀释至100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml。
加样检测：采用竞争法，用PBS缓冲液将上述制备的HRP-T3和T3-A分别稀释15000倍和2000倍，检测时HRP-T3，T3-A，待测样品分别加100μl，另外加入10μl本底抑制剂于透明反应管中。37℃孵育15min后，加入100μl激发液立即启动检测。
检测T3的计算公式为：y＝2.64594-0.59938x(r2＝0.95552)，其中y表示发光信号值以10为底的对数，x表示标准品的浓度以10为底的对数。
检测结果：
如图2，应用吖啶酯类似物免分离化学发光免疫竞争法检测T3，PBS梯度稀释的T3最低检测限为0.01ng/ml，与在血清中检测的灵敏度基本相同。线性范围为3个数量级。
实施例2
辣根过氧化物酶与甲状腺素(T4)偶联，T4单克隆抗体与吖啶酯类似物偶联，用于免疫竞争法检测。依次进行以下步骤：
1.辣根过氧化物酶偶联T4
将1μg甲状腺素衍生物(T4-NHS)加入1ml 10mM碳酸缓冲液(PH8.0)中，再加入100μg辣根过氧化物酶，置于37℃避光轻轻搅拌2h。将上述反应液加入SUPERDEX 200凝胶过滤柱纯化，收集纯化的HRP与T4物酶偶联产物(HRP-T4)，最后用保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
2.T4单克隆抗体偶联吖啶酯类似物
将1mg发光底物吖啶酯类似物(A)在2ml DMF中溶解，取溶解的吖啶酯类似物100μl加入100μl浓度为10mg/ml的T4单克隆抗体中，然后加入0.05M硼酸缓冲液800μl，室温旋转反应1h。将反应溶液1ml加入截留分子量为7000的透析袋中，放于PBS缓冲液中4℃透析1天，期间更换3次PBS缓冲液，即可得到连接吖啶酯类似物的T3单克隆抗体(T3-A)，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
3.检测
配制激发液：25mM tris(pH 8.0)，1mM对苯基苯酚，0.5mM EDTA，0.2％吐温-20和5mM过氧化脲。
配制本底抑制剂：25mM羟基二乙胺溶液于去离子水中。
T4样品：取T4标准品用PBS缓冲液(PH＝7.4)稀释至不同浓度值1000ng/ml，100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，4℃保存，作为定标品。另取T4标准品用T4阴性血清稀释至1000ng/ml，100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml。
加样检测：采用竞争法，用PBS缓冲液将上述制备的HRP-T4和T4-A分别稀释20000倍和4000倍，检测时HRP-T4，T4-A，待测样品分别加100μl，另外加入10μl本底抑制剂于透明反应管中。37℃孵育15min后，加入100μl激发液立即启动检测。
检测T4的计算公式为：y＝3.34862-0.49008x(r2＝0.92875)，其中y表示发光信号值以10为底的对数，x表示标准品的浓度以10为底的对数。
检测结果：
如图3，应用吖啶酯类似物免分离化学发光免疫竞争法检测T4，PBS梯度稀释的T4最低检测限为1ng/ml，与在血清中检测的灵敏度基本相同。线性范围为3个数量级。
实施例3
辣根过氧化物酶与克伦特罗小分子标记BSA载体蛋白(CLE-BSA)偶联，克伦特罗(CLE)单克隆抗体与吖啶酯类似物偶联，用于免疫竞争法检测。依次进行以下步骤：
2.辣根过氧化物酶偶联CLE-BSA
将1μg CLE-BSA加入1ml 10mM碳酸缓冲液(PH8.0)中，再加入100μg辣根过氧化物酶，置于37℃避光轻轻搅拌2h。将上述反应液加入SUPERDEX200凝胶过滤柱纯化，收集纯化的HRP与CLE-BSA物酶偶联产物(HRP-CLE)，最后用保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
2.CLE单克隆抗体偶联吖啶酯类似物
将1mg发光底物吖啶酯类似物(A)在2ml DMF中溶解，取溶解的吖啶酯类似物100μl加入100μl浓度为10mg/ml的CLE单克隆抗体中，然后加入0.05M硼酸缓冲液800μl，室温旋转反应1h。将反应溶液1ml加入截留分子量为7000的透析袋中，放于PBS缓冲液中4℃透析1天，期间更换3次PBS缓冲液，即可得到连接吖啶酯类似物的CLE单克隆抗体(CLE-A)，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
3.检测
配制激发液：25mM tris(pH 8.0)，1mM对苯基苯酚，0.5mM EDTA，0.2％吐温-20和5mM过氧化脲。
配制本底抑制剂：25mM羟基二乙胺溶液于去离子水中。
CLE样品：取CLE标准品用PBS缓冲液(PH＝7.4)稀释至不同浓度值100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml，4℃保存，作为定标品。另取CLE标准品用CLE阴性猪尿液稀释至100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml。
加样检测：采用竞争法，用PBS缓冲液将上述制备的HRP-CLE和CLE-A分别稀释10000倍和1500倍，检测时HRP-CLE，CLE-A，待测样品分别加100μl，另外加入10μl本底抑制剂于透明反应管中。37℃孵育15min后，加入100μl激发液立即启动检测。
根据每个浓度的定标品所得的发光信号值和其所对应的CLE浓度值，建立相应的检测CLE计算公式为：y＝2.94479-0.50971x(r2＝0.94310)，其中y表示发光信号值以10为底的对数，x表示标准品的浓度以10为底的对数。
检测结果：
如图4，应用吖啶酯类似物免分离化学发光免疫竞争法检测CLE，PBS梯度稀释的CLE最低检测限为0.01ng/ml，与在尿液中检测的灵敏度基本相同。线性范围为3个数量级。
实施例4
辣根过氧化物酶与莱克多巴胺小分子标记BSA载体蛋白(RAC-BSA)偶联，莱克多巴胺(RAC)单克隆抗体与吖啶酯类似物偶联，用于免疫竞争法检测。依次进行以下步骤：
3.辣根过氧化物酶偶联RAC-BSA
将1μg RAC-BSA加入1ml 10mM碳酸缓冲液(PH8.0)中，再加入100μg辣根过氧化物酶，置于37℃避光轻轻搅拌2h。将上述反应液加入SUPERDEX200凝胶过滤柱纯化，收集纯化的HRP与RAC-BSA物酶偶联产物(HRP-RAC)，最后用保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
2.RAC单克隆抗体偶联吖啶酯类似物
将1mg发光底物吖啶酯类似物(A)在2ml DMF中溶解，取溶解的吖啶酯类似物100μl加入100μl浓度为10mg/ml的RAC单克隆抗体中，然后加入0.05M硼酸缓冲液800μl，室温旋转反应1h。将反应溶液1ml加入截留分子量为7000的透析袋中，放于PBS缓冲液中4℃透析1天，期间更换3次PBS缓冲液，即可得到连接吖啶酯类似物的RAC单克隆抗体(RAC-A)，最后用1ml保存液(PBS+0.05％Proclin-300)置于-20℃保存。
3.检测
配制激发液：25mM tris(pH 8.0)，1mM对苯基苯酚，0.5mM EDTA，0.2％吐温-20和5mM过氧化脲。
配制本底抑制剂：25mM羟基二乙胺溶液于去离子水中。
RAC样品：取RAC标准品用PBS缓冲液(PH＝7.4)稀释至不同浓度值100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml，4℃保存，作为定标品。另取RAC标准品用RAC阴性猪尿液稀释至100ng/ml，10ng/ml，1ng/ml，0.1ng/ml，0.01ng/ml。
加样检测：采用竞争法，用PBS缓冲液将上述制备的HRP-RAC和RAC-A分别稀释18000倍和1800倍，检测时HRP-RAC，RAC-A，待测样品分别加100μl，另外加入10μl本底抑制剂于透明反应管中。37℃孵育15min后，加入100μl激发液立即启动检测。
根据每个浓度的定标品所得的发光信号值和其所对应的RAC浓度值，建立相应的检测RAC计算公式为：y＝3.07006-0.45831x(r2＝0.92930)，其中y表示发光信号值以10为底的对数，x表示标准品的浓度以10为底的对数。
检测结果：
如图5，应用吖啶酯类似物免分离化学发光免疫竞争法检测RAC，PBS梯度稀释的RAC最低检测限为0.01ng/ml，与在尿液中检测的灵敏度基本相同。线性范围为3个数量级。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.吖啶酯类似物在制备吖啶酯类似物标记抗体中的应用；所述吖啶酯类似物的分子结构式如式I所示；
Figure FDA0003158053480000011
2.吖啶酯类似物在制备竞争法检测试剂盒中的应用；所述吖啶酯类似物的分子结构式如式I所示；
Figure FDA0003158053480000012
3.一种竞争法检测试剂盒，包括吖啶酯类似物标记的抗体、酶标抗原和激发液；
所述吖啶酯类似物的分子结构式如式I所示；
Figure FDA0003158053480000013
4.根据权利要求3所述的竞争法检测试剂盒，其特征在于，还包括本底抑制剂。
5.根据权利要求4所述的竞争法检测试剂盒，其特征在于，所述本底抑制剂包括摩尔浓度为20～30mM的羟基二乙胺水溶液。
6.根据权利要求3所述的竞争法检测试剂盒，其特征在于，所述激发液包括以下浓度的组分：20～30mM tris、0.5～1.5mM对苯基苯酚、0.3～0.8mM EDTA、0.1％～0.3％吐温-20和3～8mM过氧化脲；所述tris的pH值为7.8～8.2。
7.根据权利要求3所述的竞争法检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗原包括辣根过氧化物酶标记的抗原。
8.根据权利要求3所述的竞争法检测试剂盒，其特征在于，所述竞争法检测试剂盒包括T3检测试剂盒、T4检测试剂盒、克伦特罗检测试剂盒或莱克多巴胺检测试剂盒。
9.根据权利要求3所述的竞争法检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯类似物标记的抗体包括吖啶酯类似物标记的T3单克隆抗体、吖啶酯类似物标记的T4单克隆抗体、吖啶酯类似物标记的克伦特罗单克隆抗体或吖啶酯类似物标记的莱克多巴胺单克隆抗体。
10.一种非诊断目的的竞争法检测方法，包括以下步骤：
1)采用吖啶酯类似物标记抗体；
2)将所述标记有吖啶酯类似物的抗体、酶标抗原和待测样本混合，于35～40℃孵育12～15min，得到反应液；
3)在所述反应液中加入激发液，检测自加入激发液后1秒钟内产生的发光信号，根据标准曲线和所述发光信号得到待测样本中的抗原浓度；
所述标准曲线由梯度浓度的定标品所得的发光信号值和定标品所对应的浓度值建立得到；
所述吖啶酯类似物的分子结构式如式I所示；
Figure FDA0003158053480000021
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