CN113528432B

CN113528432B - 一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法

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Publication number: CN113528432B
Application number: CN202110813180.5A
Authority: CN
Inventors: 梁洋; 滕春波; 孟博文; 孔德麟
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2021-07-19
Filing date: 2021-07-19
Publication date: 2024-04-19
Anticipated expiration: 2041-07-19
Also published as: CN113528432A

Abstract

一种利用miR‑18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，本发明涉及一种利用miR‑18inhibitor促牛成肌细胞分化的方法，本发明公开了一种新型高效的利用miR‑18inhibitor促牛成肌细胞分化方法，包括牛成肌细胞复苏培养、传代培养以及分化培养技术。本发明通过转染miR‑18抑制剂到牛成肌细胞，培养后利用免疫染色鉴定，荧光定量PCR鉴定等，发现了miR‑18抑制剂有明显促牛成肌细胞分化作用，得到高效率分化结果的方法。本发明应用于促牛成肌细胞分化领域。

Description

一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法

技术领域

本发明涉及一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法。

背景技术

骨骼肌能维持机体正常运动和能量代谢平衡，是哺乳动物中分布最广泛的重要组织器官。探索肌细胞增殖、分化和再生的作用机制，对提高畜牧业生产性能、揭示动物和人类多种肌肉疾病至关重要。在畜牧业生产中，肉牛产业是重要的组成部分，随着国民经济的发展，人们生活条件大幅度改善，对牛肉的需求也逐渐增加。20世纪90年代以来，我国牛肉产量已经成为仅次于美国和巴西的第三大国。虽然我国肉牛存栏量高，但肉牛胴体重的水平远远低于世界平均水平，且需求大于供给，价格不断上涨，影响了人们的消费需求。其中肌肉发育是影响肉牛品质和产量的关键因素，目前的研究并没有完全揭示成肌分化等机制，并且牛成肌细胞系被建立以来，一直缺乏有效的分化手段，分化效率低且参差不齐，因此，发现高效的牛成肌细胞分化方法至关重要。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种促牛成肌细胞分化的方法。

本发明一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法按以下步骤实现：

一、牛成肌细胞传代培养

将牛成肌细胞进行复苏培养，培养至70％-80％细胞融合，进行传代培养；

二、配制转染试剂

取离心管A和B，A管添加50uL Opti-MEM无血清培养基和1.5uLmiR-18抑制剂预混；B管添加50uL Opti-MEM无血清培养基和1uL RNAiMAX，静置5分钟后，把A管内的试剂混匀后加入B中，吹打3次，常温静置20min，得到转染试剂；

三、转染

牛成肌细胞传代培养至第三代，进行铺板传代，添加增殖培养基培养24h，然后换为分化培养基，再加入转染试剂进行转染，转染24h后用分化培养基更换1/2培养基，转染后培养3-7d，即完成利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法。

本发明的有益效果是：通过添加miR-18inhibitor(miR-18抑制剂)能显著提高牛成肌细胞分化效率，不仅高于对照组，而且高于单独添加miR-17、miR-19或miR-17和miR-19联合添加组。转染第七天，miR-18inhibitor组已经显著高于联合转染miR-17+19实验组，一次转染miR-18inhibitor后可以在培养期间(监测7天)一直维持牛成肌细胞分化能力的提高，说明miR-18inhibitor具有长期促分化的作用。

附图说明

图1为牛成肌细胞分化过程示意图；

图2为牛成肌细胞中转染miR-17、miR-18、miR-19及其抑制剂分化效果；

图3为牛成肌细胞中转染miR-17、miR-18、miR-19及其抑制剂7天后的细胞融合率；

图4为牛成肌细胞中转染miR-17、miR-18、miR-19及其抑制剂7天后的细胞分化率；

图5为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor与miR-17+19分化效果；

图6为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor与miR-17+193天后的细胞融合率；

图7为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor与miR-17+193天后的细胞分化率；

图8为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor与miR-17+197天后的细胞融合率；

图9为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor与miR-17+197天后的细胞分化率；

图10为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor后分化标志性基因MYH3检测；

图11为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor后分化标志性基因MYOG检测；

图12为牛成肌细胞转染miR-18inhibitor后分化标志性基因MYOD1检测。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法按以下步骤实现：

一、牛成肌细胞传代培养

二、配制转染试剂

取离心管A和B，A管添加50uL Opti-MEM无血清培养基和1.5uLmiR-18抑制剂预混；B管添加50uL Opti-MEM无血清培养基和1uLRNAiMAX，静置5分钟后，把A管内的试剂混匀后加入B中，吹打3次，常温静置20min，得到转染试剂；

三、转染

本实施方式通过添加miR-18inhibitor能显著提高牛成肌细胞分化效率，不仅高于对照组，而且高于单独添加miR-17、miR-19或miR-17和miR-19联合添加组。转染第七天，miR-18inhibitor组已经显著高于联合转染miR-17+19实验组，一次转染miR-18inhibitor后可以在培养期间(监测7天)一直维持牛成肌细胞分化能力的提高，说明miR-18inhibitor具有长期促分化的作用。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，牛成肌细胞复苏培养的方法为：取冻存的牛成肌细胞，37度水浴摇晃融化，1000转速离心5min后去除上清，用1mL增殖培养基重悬细胞，接种于6cm细胞培养皿中，补加增殖培养基至3mL，置于37℃培养箱中培养。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是，增殖培养基配方：DMEM高糖细胞培养基(DMEM-HIGH GLUCOSE培养基)+15％胎牛血清(ES-FBS)+10％马血清(HSR)+1％双抗+1％谷氨酰胺替代物。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是，步骤一牛成肌细胞传代培养按照1:2传代。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。

本实施方式中牛成肌细胞传代培养按照1:2传代是指：一个6cm培养皿的细胞，经过消化、离心、重新悬浮后，平均分配到2个6cm培养皿中。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是，步骤一的传代方法为：向装有牛成肌细胞的培养皿加入2mLPBS清洗，清洗2次，然后添加混合溶液A，置于37℃培养箱消化1min，加入1mL增殖培养基，吹打，收集细胞悬液到15mL离心管，1000转速离心5min后去除上清，添加1mL增殖培养基重新悬浮细胞沉淀，按照1:2的比例接种传代，每个6cm培养皿补齐增殖培养基到3mL，37℃5％CO₂培养箱中扩大培养；混合溶液A由200uL的胰酶和1mL的PBS混合而成。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是，步骤三铺板传代方法为：向传代至第三代的牛成肌细胞中加入2mL PBS清洗，清洗两次，然后添加混合溶液A，置于37℃培养箱消化1min，加入1mL增殖培养基吹打，收集细胞悬液到15mL离心管，1000转速离心5min后去除上清，按照每孔传30000个细胞的数量传至24孔板，24孔板全部铺满，每孔添加增殖培养基500uL，置于37℃5％CO₂培养箱中继续培养；混合溶液A由200uL的胰酶和1mL的PBS混合而成。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是，步骤三采用24孔板进行转染时，每孔转染体系为：

其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是，分化培养基为DMEM-HIGH GLUCOSE培养基+2％HSR+1％双抗+1％谷氨酰胺替代物。其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是，双抗为青霉素和链霉素的混合溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。

本实施方式中双抗为青链霉素混合液，青链霉素混合液(100X)(Penicillin-Streptomycin Solution)双抗，是专门用于细胞培养的，可以直接添加到细胞培养液内。青霉素-链霉素溶液(100X)中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。在细胞培养液中推荐的青霉素的工作浓度为100U/mL，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1：

一、牛成肌细胞复苏培养和传代培养

超净台和无菌间用紫外照射灭菌40min，然后关闭紫外设备，打开排风系统，5min后进入无菌间。打开水浴锅，调节水温至37℃，预热增殖培养基。液氮罐中取实验室冻存的牛成肌细胞，37℃水浴快速摇晃融化，1000转速离心5min后去除上清，用1mL增殖培养基重悬细胞，取约1*10⁶个细胞接种于6cm细胞培养皿中，补加增殖培养基至3mL，置于37℃培养箱中培养。观察复苏培养细胞，待细胞80％汇合，取出细胞培养皿，加入2mLPBS清洗2次，去除残留PBS后添加200uL胰酶及1mL的PBS混合溶液，置于37℃培养箱消化1min，加入1mL增殖培养基，轻轻吹打使细胞脱壁，收集细胞悬液到15mL离心管，1000转速离心5min后去除上清，按照1:2的比例接种传代，37℃5％CO₂培养箱中扩大培养。

二、配制转染试剂

取离心管A和B，A管添加50uL Opti-MEM无血清培养基和1.5uLmiRNAs/或miRNAsinhibitor预混；B管添加50uL Opti-MEM无血清培养基和1uL lipofectamine RNAiMAX转染试剂，静置5分钟后，把A管内的试剂混匀后加入B中，吹打3次，常温静置20min，得到转染试剂；

Opti-MEM无血清培养基培养基购自Thermo公司，lipofectamine RNAiMAX转染试剂购自invitrogen公司。miRNAs买自广州市锐博生物科技有限公司，储存浓度：20μM，使用浓度：50nM；用DEPC处理水溶解，分装后置于-20℃冰箱备用；miRNAs inhibitor：购买自广州市锐博生物科技有限公司，储存浓度：20μM，使用浓度：50nM；DEPC处理水溶解，分装后置于-20℃冰箱备用；miR-17、miR-18、miR-19、miR-17inhibitor、miR-18inhibitor和miR-19inhibitor的序列如序列表所示，其中m代表2'-Ome(甲基化修饰)，inhibitor是miRNA成熟体序列的反向互补序列的单链序列，全链甲基化修饰。

三、转染

牛成肌细胞传代培养至第三代，进行铺板传代，即24孔板中每孔传30000个细胞，每孔添加增殖培养基500uL，置于37℃5％CO₂培养箱中继续培养24h，然后换为分化培养基，再加入转染试剂进行转染；其中分化培养基配方：2％HSR，1％双抗，1％谷氨酰胺替代物，DMEM-HIGH GLUCOSE培养基；

转染方案为：

实验组次	对照	miRNA
			1	NC	miR-17
2	NC	miR-18
			3	NC	miR-19
4	NC	miR-17inhibitor
			5	NC	miR-18inhibitor
6	NC	miR-19inhibitor

转染24h后更换1/2分化培养基，即每次吸出250uL，加入新培养基250uL；以后每48h更换1/2分化培养基。转染后3-7天进行MYHC免疫染色进行分化鉴定。牛成肌细胞分化过程示意图如图1所示。

四、牛成肌细胞分化的鉴定

(一)免疫荧光分析

转染后，在第3，第7天取样，进行免疫荧光染色，检测肌肉分化标志物表达情况

1.分化后的细胞孔板用PBS清洗两次，每次5min，常温，静置；

2.吸出PBS后，每孔加入200uL 4％PFA-PBS溶液固定细胞，常温静置20min；

3.弃去PFA溶液，用PBS清洗3次，每次5min，常温，置于摇床上，60转/min；

4.每孔添加0.3％Triton-PBS 200uL，处理17min，常温静置，使抗体进入细胞；

5.弃去triton溶液，用PBS清洗3次，每次5min，常温，置于摇床60转/min；

6.每孔加入10％HSR-PBS溶液200uL进行封闭处理，37℃培养箱静置50min；

7.加入10％HSR-PBS-MYHC一抗溶液300ul进行孵育(MYHC一抗使用浓度1:500，购买于博奥森试剂公司，为兔多抗)，4℃过夜处理；

8.第二天，回收一抗溶液，用PBS清洗3次，每次5min，常温，置于摇床60转/min；

9.添加1％BSA-PBS-Aleax-488二抗溶液300ul(二抗使用浓度1:200，购买于中衫金桥试剂公司，为羊抗兔多克隆绿色荧光二抗)，37℃培养箱孵育1h，避光；

10.弃去二抗溶液，PBS清洗3次，每次5min，常温，置于摇床60转/min，避光；

11.加入Hoechst-Water溶液300ul，避光常温孵育5min(Hoechst使用1:1000浓度，购买于中衫金桥)；

12.弃去Hoechst溶液，用PBS清洗3次，每次5min，常温，置于摇床60转/min，避光；

13.倒置荧光显微镜镜检结果。

(二)融合比例分析

根据免疫染色结果，统计分析多核肌管中的细胞核数与总细胞核数比率。

(三)分化效率分析

根据免疫染色结果，统计分析分化的细胞数与总细胞数比率。以上结果采用prism软件进行统计分析。

(四)收集转入miR-18inhibitor后分化第5天的细胞，实时荧光定量PCR(qRT-RCR)分析成肌分化标志性基因MYH3、MYOG、MYOD1的表达情况。

五、分化结果

1.分别在牛成肌细胞中转染miR-17、miR-18、miR-19及其抑制剂，转染后培养7天，利用免疫荧光染色检测分化标志性基因，倒置荧光显微镜观察结果。与对照组相比，miR-17、miR-18inhibitor、miR-19对牛成肌细胞分化均有促进作用，其中miR-18inhibitor处理组分化效果最好(图2)。

2.根据上述免疫染色结果，统计分析多核肌管中的细胞核数与总细胞核数，转入miR-18inhibitor组细胞融合率显著高于其它实验组(p<0.01)；同样根据免疫染色结果，统计分析分化的细胞数与总细胞数比率，转入miR-18inhibitor组，细胞分化率显著高于其它实验组(p<0.01)(图3和4)。

3.由于上述结果显示，miR-17、miR-19、miR-18inhibitor对牛成肌细胞均有促分化效果，为了进一步分析miR-18inhibitor的促分化能力，设置miR-17和miR-19联合添加组，NC组和转染miR-18inhibitor组。结果显示：从转染miRNA后第三天开始，miR-18inhibitor组分化效果与miR-17+19组类似，均显著高于对照组；转染第七天，miR-18inhibitor组已经显著高于联合转染miR-17+19实验组(免疫组化结果、细胞融合结果和细胞分化量化结果一致)(图5-图9)。

4.为了进一步说明miR-18inhibitor对牛成肌细胞促分化效果，在转染的第五天收集miR-18inhibitor处理后的成肌细胞，提取RNA，反转后进行实时荧光定量PCR(qRT-RCR)检测分化标志性基因MYH3、MYOG、MYOD1的表达量。结果显示；牛成肌细胞中转入miR-18inhibitor后，分化标志性基因MYH3、MYOG、MYOD1的表达量均有显著性提高(p<0.01)(图10-12)。

由上述实施例可知，通过添加miR-18inhibitor能显著提高牛成肌细胞分化效率，不仅高于对照组，而且高于单独添加miR-17、miR-19或miR-17和miR-19联合添加组。转染第七天，miR-18inhibitor组已经显著高于联合转染miR-17+19实验组，一次转染miR-18inhibitor后可以在培养期间(监测7天)一直维持牛成肌细胞分化能力的提高，说明miR-18inhibitor具有长期促分化的作用。

序列表

<110>东北林业大学

<120>一种利用miR-18 抑制剂促牛成肌细胞分化的方法

<160> 12

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>miR-18的核苷酸序列。

<400> 1

UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>miR-18 mimic中正义链的核苷酸序列。

<400> 2

UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>miR-18 mimic中反义链的核苷酸序列。

<400> 3

AUUCCACGUAGAUCACGUCUAUC 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>miR-18 inhibitor 的核苷酸序列。

<400> 4

mCmUmAmUmCmUmGmCmAmCmUmAmGmAmUmGmCmAmCmCmUmUmA 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>miR-19的核苷酸序列。

<400> 5

UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>miR-19 mimic中正义链的核苷酸序列。

<400> 6

UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>miR-19 mimic中反义链的核苷酸序列。

<400> 7

ACACGUUUAGGUACGUUUUGACU 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>miR-19 inhibitor 的核苷酸序列。

<400> 8

mUmCmAmGmUmUmUmUmGmCmAmUmGmGmAmUmUmUmGmCmAmCmA 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>miR-17 的核苷酸序列。

<400> 9

CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG 23

<210>10

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>miR-17 mimic中正义链的核苷酸序列。

<400> 10

CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>miR-17 mimic 中反义链的核苷酸序列。

<400> 11

GUUUCACGAAUGUCACGUCCAUC 23

<210>12

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>miR-17 inhibitor 的核苷酸序列。

<400> 12

mCmUmAmCmCmUmGmCmAmCmUmGmUmAmAmGmCmAmCmUmUmUmG 23

Claims

1.一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，其特征在于它按以下步骤实现：

一、牛成肌细胞传代培养

将牛成肌细胞进行复苏培养，培养至70％-80％细胞融合，进行传代培养；其中牛成肌细胞传代培养按照1:2传代；

二、配制转染试剂

三、转染

牛成肌细胞传代培养至第三代，进行铺板传代，添加增殖培养基培养24h，然后换为分化培养基，再加入转染试剂进行转染，转染24h后用分化培养基更换1/2培养基，转染后培养3-7d，即完成利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法；其中分化培养基为DMEM-HIGHGLUCOSE培养基+2％马血清+1％双抗+1％谷氨酰胺替代物。

2.根据权利要求1所述的一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，其特征在于牛成肌细胞复苏培养的方法为：取冻存的牛成肌细胞，37度水浴摇晃融化，1000转速离心5min后去除上清，用1mL增殖培养基重悬细胞，接种于6cm细胞培养皿中，补加增殖培养基至3mL，置于37℃培养箱中培养。

3.根据权利要求2所述的一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，其特征在于增殖培养基配方：DMEM高糖细胞培养基+15％胎牛血清+10％马血清+1％双抗+1％谷氨酰胺替代物。

4.根据权利要求1所述的一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，其特征在于步骤一的传代方法为：向装有牛成肌细胞的培养皿加入2mL PBS清洗，清洗2次，然后添加混合溶液A，置于37℃培养箱消化1min，加入1mL增殖培养基，吹打，收集细胞悬液到15mL离心管，1000转速离心5min后去除上清，添加1mL增殖培养基重新悬浮细胞沉淀，按照1:2的比例接种传代，每个6cm培养皿补齐增殖培养基到3mL，37℃、5％CO₂培养箱中扩大培养；混合溶液A由200uL的胰酶和1mL的PBS混合而成。

5.根据权利要求1所述的一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，其特征在于步骤三铺板传代方法为：向传代至第三代的牛成肌细胞中加入2mL PBS清洗，清洗两次，然后添加混合溶液A，置于37℃培养箱消化1min，加入1mL增殖培养基吹打，收集细胞悬液到15mL离心管，1000转速离心5min后去除上清，按照每孔传30000个细胞的数量传至24孔板，24孔板全部铺满，每孔添加增殖培养基500uL，置于37℃5％CO₂培养箱中继续培养；混合溶液A由200uL的胰酶和1mL的PBS混合而成。

6.根据权利要求5所述的一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，其特征在于步骤三采用24孔板进行转染时，每孔转染体系为：1.5μL miR-18抑制剂，1μLRNAiMAX，100μL Opti-MEM无血清培养基。

7.根据权利要求1所述的一种利用miR-18抑制剂促牛成肌细胞分化的方法，其特征在于双抗为青霉素和链霉素的混合溶液。