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CN113521261B - 一种抗冠状病毒和细菌双重纳米免洗消毒凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗冠状病毒和细菌双重纳米免洗消毒凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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CN113521261B CN202110807519.0A CN202110807519A CN113521261B CN 113521261 B CN113521261 B CN 113521261B CN 202110807519 A CN202110807519 A CN 202110807519A CN 113521261 B CN113521261 B CN 113521261B
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Abstract

本发明公开了一种抗冠状病毒和细菌双重纳米免洗消毒凝胶及其制备方法和应用，纳米免洗消毒凝胶包括以下成分：茶树精油、薄荷精油、溶菌酶、乙醇、卡波姆、甘油、注射用水、粘度调节剂。本发明纳米免洗消毒凝胶中，溶菌酶、薄荷精油等药理活性成分对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌有抑制作用，尤其是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等多种临床耐药菌有抑制作用，茶树精油和乙醇的活性成分对流感病毒、冠状病毒科病毒等具良好的抗病毒效果，因此可作为抗病毒和抗细菌使用。

Description

一种抗冠状病毒和细菌双重纳米免洗消毒凝胶及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及消毒剂技术领域，具体涉及一种抗冠状病毒和细菌双重纳米免洗消毒凝胶，还涉及一种纳米免洗消毒凝胶的制备方法和应用。
背景技术
消毒是预防微生物感染性疾病的重要措施之一。冠状病毒是自然界广泛分布并在近二十年来不断威胁人类健康和社会发展的一大类病毒，由磷脂双分子层囊膜和线性单股正链RNA组成。在目前已知RNA病毒中冠状病毒的基因组最大、形态多样，能感染脊椎动物并与许多疾病有关。冠状病毒感染是引起人类感冒的主要病原之一，此外冠状病毒引起的上呼吸道感染可致严重急性呼吸综合征(SARS)、新型冠状病毒肺炎(2019-nCoV,SARS-CoV-2)或中东呼吸综合征(MERS)甚至死亡。冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒仅感染脊椎动物，如人、鼠、猪、猫、犬、狼、鸡、牛、禽类。禽传染性支气管炎和流感病毒均与2019新型冠状病毒(2019-nCoV,SARS-CoV-2)与严重急性呼吸系统综合症病毒(MERS)均属于冠状病毒。因缺乏有效的特异性抗病毒药物，隔离、对症支持治疗是治疗冠状病毒相关疾病的主要手段。冠状病毒具有很强的传染性，通常呼吸道分泌物排出体外后，经飞沫、排泄物、接触物、气溶胶等途径传播。在缺乏有效的防护下，冠状病毒易造成大规模人群的感染并引起公共卫生事件。因此，快速有效地于体外灭活病毒、阻断病毒传播途径是控制冠状病毒感染疫情的重点之一。冠状病毒通常对热和紫外线敏感，此外传统消毒剂如酒精、含氯消毒剂、过氧化物类都能灭活病毒。但是传统的化学消毒剂具有一定的毒性和很强的刺激性，长期使用易对皮肤组织、呼吸系统等造成损伤，且生产和使用过程中会破坏环境。大量使用化学消毒剂也存在安全隐患，在公共区域大量地喷洒消毒剂如酒精有引发爆炸的风险。含氯或过氧化物类的消毒剂也存在残留问题，对人和环境都有潜在的风险。因此，开发新型绿色环保有效的冠状病毒消毒剂用于阻断病毒传播、保护人类健康是十分必要的。
消毒剂使用频率较高的主要为碘类、氯类、醇类及胍类等类型。从配伍情况来看，化学消毒剂以单方为主，醇类、胍类和季铵盐类有效成分配伍使用比例较高。目前消毒产品的杀菌成分主要有乙醇、聚维酮碘、洗必泰、三氯生及季铵盐类等。如乙醇(70-80％)类消毒剂，杀菌效果优异，挥发快，但是挥发完后，失去了长效抗抑菌作用，且挥发过程有脱脂作用，对皮肤易造成干燥、皲裂、皮炎、甚至湿疹等损害；聚维酮碘消毒剂，杀菌抗病毒效果好，但是本身为黄褐色，涂在皮肤上呈现出黄色，不适宜日常生活中的卫生消毒。同时上述消毒剂，均不能有效抑制冠状病毒作用。
消毒剂一般用于杀灭传播媒介上病原微生物，使其达到无害化要求，将病原微生物消灭于人体之外，切断传染病的传播途径，达到控制传染病的目的。现有技术中一般使用化学消毒剂，在使用过程中化学消毒剂在杀灭病原菌的同时，对人类、畜禽、环境也存在不同程度的毒副作用，同时常常产生耐药性及药物残留等问题。比如，甲醛的致癌、酚类消毒剂的刺激性、用于饮用水消毒的氯制剂的致突变作用等，同时耐药菌株的出现导致消毒效果下降或失效。因此，克服现有技术的不足，研发出一款天然提取物消毒剂，满足了市场对非化学品消毒剂的迫切需求，对天然消毒剂市场的发展具有重要的推动作用。
发明内容
有鉴于此本发明的目的之一在于提供一种抗冠状病毒和细菌双重纳米免洗消毒凝胶；
本发明的目的之二在于提供一种抗冠状病毒和细菌双重纳米免洗消毒凝胶的制备方法；
本发明的目的之三在于提供抗冠状病毒和细菌双重纳米免洗消毒凝胶的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种抗冠状病毒和细菌双重纳米免洗消毒凝胶，包含下述质量份数的原料：茶树精油0.1-1份、薄荷精油0.1-1份，乙醇60～75份、卡波姆1～10份、水10～40份，粘度调节剂1-15份。
本发明优选的，还包含下述质量份数的原料：溶菌酶0.1-2份。
本发明优选的，还包含下述质量份数的原料：甘油2-5份。
本发明优选的，所述粘度调节剂为5～15份。
本发明优选的，由下述质量份数的原料组成：茶树精油0.5份、薄荷精油0.2份，乙醇68份、卡波姆1份、水23.3份、溶菌酶2份、甘油4份、粘度调节剂1份。
本发明优选的，由下述质量份数的原料组成：茶树精油0.8份、薄荷精油0.3份，乙醇68份、卡波姆8份、水13.9份、溶菌酶2份、甘油2份、粘度调节剂5份。
本发明优选的，由下述质量份数的原料组成：茶树精油1份、薄荷精油0.3份，乙醇68份、卡波姆5份、水8.7份、溶菌酶1份、甘油1份、粘度调节剂15份。
本发明优选的，所述粘度调节剂为羟丙甲纤维素E30、E50、E100或者丙烯酸酯中的至少一种。
本发明优选的，所述纳米抑菌免洗凝胶的pH值为4～10。
2、一种纳米抑菌免洗凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将配方量的薄荷油、茶树精油依次加入体积分数为95％乙醇溶液，搅拌20-30分钟，得到溶液A；
(2)将卡波姆溶解于蒸馏水中，过夜搅拌14-16小时，得到溶液B；
(3)将溶液B加入到溶液A中，搅拌1-2h；
(4)分装至已消毒的包装瓶中，密封，保存。
3、所述纳米免洗消毒凝胶在作为外部消毒剂抗病毒或/和细菌中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了一种纳米抑菌免洗凝胶及其制备方法，该纳米抑菌免洗凝胶包括以下成分：天然澳洲茶树精油及提取物、薄荷精油及提取物、溶菌酶、乙醇、卡波姆、甘油、注射用水、粘度调节剂。该纳米抑菌免洗凝胶稳定性良好，对皮肤无刺激性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌有抑制作用，尤其是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等多种临床耐药菌有抑制作用；本发明的抑菌凝胶中，溶菌酶、薄荷精油等药理活性成分对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌有抑制作用，尤其是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等多种临床耐药菌有抑制作用，茶树精油和乙醇的活性成分对流感病毒、冠状病毒科病毒等具良好的抗病毒效果。本发明中的多种天然提取物的消毒作用相对温和，甘油避免皮肤在消毒时变粗糙，同时使抑菌凝胶具有芳香性；本发明中乙醇、茶树油可渗入细菌和病毒内，凝固细菌和病毒蛋白质，抑制或杀死细菌和病毒；溶菌酶等可破坏细菌细胞壁的通透性，改变细菌细胞膜的完整性，从而使消毒凝胶对革兰阳性菌及阴性菌产生抗菌作用。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为核酸电泳检测纳米消毒剂对H120抗病毒效果(M：Marker；1：阳性对照；2-7依次为75％乙醇，普通免洗凝胶，纳米消毒凝胶处方4，5，10，11。)；
图2为核酸电泳检测纳米消毒剂对NJ02抗病毒效果(1：阳性对照；2-7依次为75％乙醇，普通免洗凝胶，纳米凝胶处方5，4，10，11；M：Marker。)；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、抗冠状病毒和细菌双重纳米免洗消毒凝胶的处方
抗冠状病毒和细菌双重纳米免洗消毒凝胶：茶树精油0.1-1份、薄荷精油0.1-1份，乙醇60～75份、卡波姆1～10份、水10～40份；更优选的，还含有溶菌酶0.1-2份；甘油2-5份；粘度调节剂1-15份，其中粘度调节剂可以为羟丙甲纤维素E30、E50、E100中的至少一种，具体设置处方如表1。
表1、抗冠状病毒和细菌双重纳米免洗消毒凝胶的处方
为方便描述上述处方号后续实施例用实验序号表示。
实施例2、优化的纳米免洗消毒凝胶的制备
纳米抑菌免洗凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将配方量的薄荷油、茶树精油依次加入体积分数为95％乙醇溶液，搅拌20-30分钟，得到溶液A；
(2)将卡波姆溶解于蒸馏水中，过夜搅拌14-16h，得到溶液B；
(3)将溶液B加入到溶液A中，搅拌1-2h；
(4)分装至已消毒的包装瓶中，密封，保存。
如果有溶菌酶，将配方量的溶菌酶在加入茶树精油后加入乙醇溶液中，如果有甘油是在得到溶液B后加入甘油，加入后搅拌20-30分钟，得到溶液C；如果有粘度调节剂，是在分装前加入粘度调节剂，其中粘度调节剂可以为羟丙甲纤维素E30、E50、E100和丙烯酸酯中的至少一种，制得的纳米免洗消毒凝胶pH值为4～10。
上述处方中乙醇含量为68％，茶树油0.5％，薄荷精油0.2％，溶剂为水，效果最佳，命名为免洗消毒凝胶。
实施例2、纳米免洗消毒凝胶的乙醇稳定性
一、器材
1.免洗消毒凝胶(处方1)。
2.气相色谱仪(型号：7890B，编号：LH004)，隔水式恒温培养箱(型号：BSC-250，编号：LH119)，电子天平(型号：XSE105DU，编号：LH022；型号：ME204，编号：LH020)。
3.乙醇(浓度：99.9％)，甲醇(色谱纯)。
4.色谱柱(型号：DB-WAXETR，规格：30m×0.32mm×1.00μm)。
二、方法
1.检测依据：《消毒技术规范》(2002年版)第2.2.1.2.11项第一法和第2.2.3.2项。
2.保存条件：将包装完整的免洗消毒凝胶置37℃恒温培养箱保存90d。
3.标准工作曲线的绘制：配制乙醇浓度为4.004mg/mL～20.02mg/mL的标准系列。在设定色谱条件下分别进行分析，得到线性方程。
4.样品测定：摇匀后，称取37℃恒温下保存90d的样品约1g于50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，测其峰面积。代入线性回归方程，计算样品中乙醇的含量。
5.取同批样品3瓶，每瓶重复测定2次。
6.检测环境温度：20.8℃，相对湿度：48％。
三、结果
1.经标准溶液检测表明，在乙醇浓度在4.004mg/mL～20.02mg/mL时，乙醇浓度与峰面积呈正相关，线性回归方程为Y＝482.48219*X+7.40590，其相关系数r＝0.9999。
2.在环境温度20.8℃，相对湿度48％条件下，经对37℃恒温下保存90d的普通免洗消毒凝胶进行检测，乙醇含量平均值为67.68％(W/W)，与保存前相比较，下降率为1.19％(见表2)。本实施例以茶树油、乙醇(70％)和薄荷制得的普通凝胶作为对照。
表2、乙醇含量稳定性测定结果
四、结论
经检测，37℃恒温下保存90d的普通免洗消毒凝胶进行检测，乙醇含量平均值为67.68％(W/W)，与保存前相比较，下降率为1.19％；而纳米消毒凝胶中乙醇含量平均值为73.09％(W/W)，与保存前相比较，下降率为0.66％；符合《消毒技术规范》(2002年版)将产品贮存有效期定为2年的规定。
实施例3、纳米免洗消毒凝胶对白色念珠菌的抑菌试验
一、器材
1.试验菌株：白色念珠菌(ATCC 10231)，第5代。
2.抑菌凝胶有效成分及含量：乙醇含量为68.50％(W/W)。
3.磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.03mol/L，pH 7.2)。
4.培养基：沙氏琼脂。
5.载体：20mm×30mm平纹棉布，脱脂后灭菌烘干备用。
6.生物安全柜、培养箱、恒温器、涡旋震荡器、无菌器材和电子计时器等。
二、方法
1.检测依据：GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录C4。
2.白色念珠菌抑菌试验：试验用免洗消毒凝胶，作用时间为2.0min、5.0min、10.0min和20.0min，试验温度为20℃恒温，试验重复3次。
3.检测环境温度：21.0℃～23.0℃，相对湿度：51％～57％。
三、结果
经3次重复试验，在试验温度为20℃恒温条件下，应用免洗消毒凝胶作用2.0min、5.0min、10.0min和20.0min，对载体片上白色念珠菌的抑菌率均为100％(见表3)。
表3.对白色念珠菌的抑菌效果
注：以下普通免洗凝胶为由茶树油、乙醇和薄荷构成的普通凝胶，其茶树油、乙醇和薄荷含量与处方1相同；阴性对照无菌生长。
四、结论
经3次重复试验，在试验温度为20℃恒温条件下，应用免洗消毒凝胶作用2.0min，5.0min，10.0min，20.0min，对载体片上白色念珠菌的抑菌率均＞90％，产品具有较强抑菌作用。符合GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》抑菌合格的规定。
实施例4、纳米免洗消毒凝胶对大肠杆菌的抑菌试验
一、器材
1.试验菌株：大肠杆菌(8099)，第8代。
2.抑菌凝胶有效成分及含量：处方2，乙醇含量为68％(W/W)。
3.磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.03mol/L，pH 7.2)。
4.培养基：营养琼脂。
5.载体：20mm×30mm平纹棉布，脱脂后灭菌烘干备用。
6.生物安全柜、培养箱、恒温器、涡旋震荡器、无菌器材和电子计时器等。
二、方法
1.检测依据：GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录C4。
2.大肠杆菌抑菌试验：试验用免洗消毒凝胶，作用时间为2.0min、5.0min、10.0min和20.0min，试验温度为20℃恒温，试验重复3次。
3.检测环境温度：21.0℃～23.0℃，相对湿度：51％～57％。
三、结果
经3次重复试验，在试验温度为20℃恒温条件下，应用免洗消毒凝胶作用2.0min、5.0min、10.0min和20.0min，对载体片上大肠杆菌的抑菌率均为100％(见表4)。
表4.对大肠杆菌的抑菌效果
四、结论
经3次重复试验，在试验温度为20℃恒温条件下，应用免洗消毒凝胶作用2.0min，5.0min，10.0min，20.0min，对载体片上大肠杆菌的抑菌率均＞90％，产品具有较强抑菌作用。符合GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》抑菌合格的规定。
实施例5、纳米免洗消毒凝胶对金黄色葡萄球菌抑菌试验
一、器材
1.试验菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)，第7代。
2.抑菌凝胶有效成分及含量：处方2，乙醇含量为68％(W/W)。
3.稀释液：磷酸盐缓冲溶液(PBS)，0.03mol/L，pH 7.2。
4.培养基：营养琼脂。
5.载体：20mm×30mm平纹棉布，脱脂后灭菌烘干备用。
6.生物安全柜、培养箱、恒温器、涡旋震荡器、无菌器材和电子计时器等。
二、方法
1.检测依据：GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录C4。
2.金黄色葡萄球菌抑菌试验：试验用免洗消毒凝胶，作用时间为2.0min、5.0min、10.0min和20.0min，试验温度为20℃恒温。试验重复3次。
3.检测环境温度：21.0℃～23.0℃，相对湿度：51％～57％。
三、结果
经3次重复试验，在试验温度为20℃恒温条件下，应用免洗消毒凝胶作用2.0min、5.0min、10.0min和20.0min，对载体片上金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为99.99％、100％、100％、100％(见表5)。
表5.对金黄色葡萄球菌的抑菌效果
四、结论
经3次重复试验，在试验温度为20℃恒温条件下，应用免洗消毒凝胶作用2.0min，5.0min，10.0min，20.0min，对载体片上金黄色葡萄球菌的抑菌率均＞90％，产品具有较强抑菌作用。符合GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》抑菌合格的规定。
实施例6、纳米免洗消毒凝胶对铜绿假单胞菌抑菌试验
一、器材
1.试验菌株：铜绿假单胞菌(ATCC 6538)该菌株为金葡菌菌株的名称，第7代。
2.抑菌凝胶有效成分及含量：处方2，乙醇含量为68％(W/W)。
3.稀释液：磷酸盐缓冲溶液(PBS)，0.03mol/L，pH 7.2。
4.培养基：营养琼脂。
5.载体：20mm×30mm平纹棉布，脱脂后灭菌烘干备用。
6.生物安全柜、培养箱、恒温器、涡旋震荡器、无菌器材和电子计时器等。
二、方法
4.检测依据：GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录C4。
5.铜绿假单胞菌抑菌试验：试验用免洗消毒凝胶，作用时间为2.0min、5.0min、10.0min和20.0min，试验温度为20℃恒温，试验重复3次。
6.检测环境温度：21.0℃～23.0℃，相对湿度：51％～57％。
三、结果
经3次重复试验，在试验温度为20℃恒温条件下，应用免洗消毒凝胶作用2.0min、5.0min、10.0min和20.0min，对载体片上铜绿假单胞菌的抑菌率分别为99.99％、100％、100％、100％(见表6)。
表6.对铜绿假单胞菌的抑菌效果
四、结论
经3次重复试验，在试验温度为20℃恒温条件下，应用免洗消毒凝胶作用2.0min，5.0min，10.0min，20.0min，对载体片上铜绿假胞菌的抑菌率均＞90％，产品具有较强抑菌作用。符合GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》抑菌合格的规定。
实验例7、以鸡胚为宿主的安全性评价
消毒剂处方1-11，和75％乙醇按10倍比稀释后，分别尿囊腔接种10日龄鸡胚，每组20枚，0.1mL/枚接种不同处方的消毒剂，另选一组注射生理盐水作为阴性对照，记录接种后144h鸡胚死亡情况。
检测结果见表7。
表7.消毒剂对鸡胚安全性结果
实验例8、以鸡胚为宿主针对冠状病毒消毒效果评价
依据2002年版国家《消毒技术规范》中2.2.1.10条款规定的病毒灭活试验方法进行。
实验用病毒株：
禽流感病毒(AIV)疫苗株NJ02；鸡传染性支气管炎病毒(IBV)疫苗株H120。
1)取出低温冻存的病毒悬液，低温解冻，用灭菌生理盐水稀释至所需浓度的2倍，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。24小时内照蛋1次，弃去死胚。此后，每4～6小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至120小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置2～8℃冷却4～24h。
2)取待测免洗消毒凝胶，用灭菌水稀释至所需浓度的2倍，尿囊腔接种100μl病毒(最终剂量1000ELD50)与消毒剂混合液1:1的混合液。
3)阳性(病毒)对照组试验中，用无菌去离子水代替消毒剂。
4)病毒灭活效果评价
鸡胚死亡率％＝每组死亡鸡胚数/每组接种鸡胚数×100％
检测结果见表8和表9。
表8.消毒剂对IBV抗病毒(H120)效果
表9.消毒剂对H9型AIV抗病毒(NJ02)效果
实验例9、荧光定量PCR检测消毒剂对H120的消毒效果
1)建立实时荧光定量RT-PCR方法
根据IBV的基因组序列设计特异性引物，RT-PCR方法扩增目的片段制备质粒标准品，并进行特异性、敏感性和重复性进行检测，建立针对IBV的荧光定量PCR检测方法。
根据NCBI上查找的IBV H120病毒株序列，利用引物设计软件Primer5.0设计了两对引物，引物序列如表10所示。
表10、IBV H120病毒株序列引物
从冻存的病毒液中提质粒标准品浓度为460ng/μL,经公式计算得到质粒标准品拷贝数为1.44×1011，所用公式如下：
Copies/ml(拷贝数)＝(6.02×1023拷贝数/摩尔)×(标准品浓度)/(MW g/mol)
质粒标准品10倍比稀释后按480GreenⅠMaster说明书进行qPCR反应，以标准品拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线。绘制的标准曲线特异性和重复性良好，灵敏度可达到15个拷贝数，标准曲线方程为Y＝-3.550X+36.47，E值为0.913，R2＝0.997。
2)最小病毒检测量的确定
将H120病毒原液(原来病毒含量为10-6EID50)以PBS缓冲液进行梯度稀释至4、8、16、32、100、1000、10000倍。分别取4、8、16、32、100、1000、10000倍病毒稀释液各200μL提取RNA，用下游引物进行反转录合成cDNA，然后进行荧光定量PCR，设置无菌去离子水为阴性对照，体系20μL，最终确定H120的最低检测浓度。结果表明，最低检测浓度为1000倍数。
纳米免洗消毒凝胶分别进行10倍稀释后取190μL分别与10μL冠状病毒H120株(原来病毒含量为10-6EID50)1000倍稀释的病毒液作用，涡旋30s，静置5min。上述样品用SimplyP病毒DNA/RNA提取试剂盒(BioFlux)提取RNA。之后将RNA反转录成cDNA，以cDNA作为样品，无菌去离子水作为阴性对照，进行实时荧光定量PCR，通过Ct值确定纳米免洗消毒剂对H120病毒的灭活效果。
检测结果
纳米免洗消毒凝胶对鸡传染性支气管炎病毒杀灭试验结果，见表11。
表11.纳米免洗消毒凝胶对鸡传染性支气管炎病毒(H120)杀灭试验结果
实验例10、荧光定量PCR检测消毒剂对H9亚型禽流感病毒NJ02消毒效果
1.引物的设计与优化
根据NCBI上公布的AIV NJ02病毒株序列，使用Primer Premier 5.0软件，设计了两对特异性引物，引物的序列见表12。
表12.AIV NJ02病毒株引物序列
2.病毒核酸的提取及目的片段的扩增
从冻存的AVI NJ02株的病毒液中提取RNA，RT-PCR扩增目的片段，将得到的特异性良好的目的基因连入pMD18-T载体构建质粒标准品，测序结果显示该序列与IBV H120株同源性100％。经测定质粒标准品浓度为398ng/μL，经公式计算得到质粒标准品拷贝数为1.3×1011，所用公式如下：
copies/ml(拷贝数)＝(6.02×1023拷贝数/摩尔)×(标准品浓度)/(MW g/mol)
质粒标准品10倍比稀释后按480GreenⅠMaster说明书进行qPCR反应，
以标准品拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线。绘制的标准曲线特异性和重复性良好，灵敏度可达到13个拷贝数，标准曲线方程为Y＝-Y＝-3.437X+43.53，E值为0.954，R2＝0.998。
3.病毒处理及最低检测浓度的确定
消毒剂分别进行10倍倍稀释后取190μL分别与10μL禽流感病毒(原来病毒含量为10-9EID50)500倍稀释，5000倍稀释的病毒液作用，涡旋30s，静置5min。上述样品提取RNA，反转录cDNA作为模板进行荧光定量PCR检测。
病毒稀释：将病毒原液用PBS分别稀释至4、8、16、32、100、1 000和10 000倍；
病毒核酸提取：分别取200μL上述稀释的病毒液，按照核酸提取试剂盒说明书提取；
cDNA的合成：分别取稀释后的NJ02 200μL样品提取RNA，用下游引物反转录得到cDNA，-20℃保存；
荧光定量PCR：反应体系同表1.11，反应程序同表1.12，将无菌水为阴性对照，确定NJ02的最低检测浓度。
4.NJ02病毒的灭活试验
NJ02病毒处理：以PBS将NJ02病毒原液分别稀释1000倍待用；
纳米消毒剂处理：10种消毒剂均以PBS作10倍稀释；
分别取(2)中10倍稀释的消毒剂190L，其中分别加入(1)中稀释的NJ02病毒液10L，用涡旋仪涡旋30s，静置5min；
设置阳性对照：分别取(1)中各稀释度的NJ02 10L，其中分别加入PBS 190L。用涡旋仪涡旋30s，静置5min；
完成步骤(4)后，按Simply P病毒DNA/RNA提取试剂盒提取RNA。
反转录合成cDNA链；
分别以合成的cDNA作为模板，进行荧光定量PCR检测。每种cDNA的反应体系都是20L，以无菌水(20L)设置阴性对照。
检测结果
纳米免洗消毒凝胶对禽流感病毒杀灭试验结果见表13。
表13.纳米免洗消毒凝胶对禽流感病毒杀灭试验结果
实验例11、消毒剂对H9禽流感病毒(NJ02株)的血凝抑制效果
取出低温冻存的病毒悬液，低温解冻，用灭菌生理盐水稀释至所需浓度的2倍，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。24小时内照蛋1次，弃去死胚。此后，每4～6小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至120小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置2～8℃冷却4～24小时。
2.将冷却的鸡胚取出，称重并记录，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部位卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚液。用1％的鸡红细胞悬液测定鸡胚尿囊液的血凝价。
检测结果
检测消毒剂对H9型禽流感病毒(NJ02株)的血凝抑制结果，见表14。
表14.血凝检测结果：血凝价(ln值)
序号 血凝1 血凝2 血凝3 平均值
1 10 10 11 10.33
2 10 11 11 10.67
3 10 10 11 10.33
4 10 10 9 9.67
5 9 10 9 9.33
6 9 10 7 8.67
7 10 9 9 9.33
8 7 8 6 7.00
9 9 8 9 8.67
10 9 8 10 9.00
11 3 6 6 6
普通免洗凝胶 10 9 9 9.67
75％乙醇 10 10 10 10.00
阳性对照 10 11 12 11.00
阴性对照 0 0 0 0
相对阳性对照和75％乙醇相比，部分纳米消毒剂对冠状病毒科NJ02有明显低血凝效价，且处方10和11效果最优，而75％的乙醇对NJ02血凝效价无明显影响，无抗病毒效果。
实验例12、消毒剂对冠状病毒H120株和NJ02的核酸破坏效果
消毒剂对鸡传染性支气管炎病毒H120和NJ02株的核酸破坏效果，见图1和图2。
上述结果充分显示部分纳米消毒剂核酸电泳无明显条带，表明纳米消毒剂可对H120和NJ02有较好的破坏作用。
实施例13、免洗消毒凝胶多次完整皮肤刺激试验
一、器材和动物
1.受试样品：免洗消毒凝胶(有效成分：处方11)。
2.动物：新西兰兔3只，雌性，体重1.8kg～2.2kg，由重庆力诺德科技有限责任公司提供，普通级动物，动物生产许可证号SCXK(渝)2019-0001，质量合格证号2020-11。饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供，生产许可证号SCXK(京)2019-0003，质量合格证号1112622000038715。动物房温度18℃～26℃，相对湿度40％～70％。12h照明，12h黑暗。动物自由摄食，自由饮水。
二、方法
1.检测依据：《消毒技术规范》(2002年版)第2.3.3.3.3项。
2.受试样品配制：使用随机选择纳米凝胶样品原形。
3.染毒方法：在试验前24h，用电推刀将新西兰兔背部脊柱两侧的被毛去掉，面积约3cm×3cm。次日将样品原形0.5mL涂在2.5cm×2.5cm左侧皮肤上，右侧作为空白对照，在涂抹后4h，用温水清洗，除去残留受试样品。每天涂抹一次，方法同前述，连续涂抹14d。为了便于受试样品的涂抹和结果观察，必要时剃毛。
4.观察与评价：在每次涂抹后24h观察皮肤反应并评分，评分标准及刺激强度分级参照《消毒技术规范》(2002年版)2.3.3“皮肤刺激试验”中表2-11和表2-12。
三、试验结果
每次给药后24h观察皮肤局部反应，14d内3只新西兰兔染毒侧皮肤与对照侧皮肤均未见异常(见表15)。
表15.新西兰兔多次完整皮肤刺激反应评分结果
四、结论
使用免洗消毒凝胶进行新西兰兔多次完整皮肤刺激试验，总积分平均值即刺激指数为0，刺激强度属无刺激性，符合《消毒技术规范》(2002年版)合格的要求。
通过大规模筛选，我们以耐药金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞等广谱耐药细菌，用冠状病毒流感病毒、肾传支病毒为模型，选择荧光定量PCR、细胞黏附、鸡胚实验成功筛选出抗细菌和冠状病毒有效成分的茶树油和乙醇。通过利用纳米技术，制备出质量稳定的一种新型抗冠状病毒纳米免洗消毒剂，并通过抑菌实验、皮肤刺激实验、荧光定量PCR、细胞黏附、鸡胚实验等表明，新型抗冠状病毒纳米免洗消毒剂可以有效抑制细菌和病毒的生长，具有良好的抗菌、抗病毒双重效果。通过大规模筛选，我们以耐药金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞等广谱耐药细菌，用冠状病毒流感病毒、肾传支病毒为模型，选择荧光定量PCR、细胞黏附、鸡胚实验成功筛选出抗细菌和冠状病毒有效成分的茶树油和乙醇。通过利用纳米技术，制备出质量稳定的一种新型抗冠状病毒纳米免洗消毒剂，并通过抑菌实验、皮肤刺激实验、荧光定量PCR、细胞黏附、鸡胚实验等表表明，新型抗冠状病毒纳米免洗消毒剂可以有效抑制细菌和病毒的生长，具有良好的抗菌、抗病毒双重效果。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 四川美嘉龙生物科技有限公司
重庆闻达生物科技有限公司
<120> 一种抗冠状病毒和细菌双重纳米免洗消毒凝胶及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctggcatgct tcaacagcat tc 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagccagggc tctaacttct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgtgtcggc tagttcctac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attgggcgtc ttgaataggg 20

Claims (1)

1.一种纳米免洗消毒凝胶在制备抗鸡传染性支气管炎病毒和禽流感病毒的外部消毒剂中的应用，其特征在于，所述纳米免洗消毒凝胶由下述质量份数的原料组成：茶树精油0.8份、薄荷精油0.3份，乙醇68份、卡波姆 8份、水13.9份、溶菌酶2份、甘油2份、粘度调节剂5份；或所述纳米免洗消毒凝胶由下述质量份数的原料组成：茶树精油0.5份、薄荷精油0.2份，乙醇68份、卡波姆 1份、水9.3份、溶菌酶2份、甘油4份、粘度调节剂15份；所述粘度调节剂为羟丙甲纤维素E30、E50、E100或者丙烯酸酯中的至少一种；所述纳米免洗消毒凝胶的pH值为4~10；
所述纳米免洗消毒凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将配方量的溶菌酶先加入茶树精油中，然后再将薄荷精油、茶树精油依次加入体积分数为95%乙醇溶液中，搅拌20-30分钟，得到溶液A；
（2）将卡波姆溶解于蒸馏水中，过夜搅拌14-16h，得到溶液B；
（3）向溶液B中加入甘油，搅拌得到溶液C；
（4）将溶液C加入到溶液A中，搅拌1-2h；加入粘度调节剂混匀；
（5）分装至已消毒的包装瓶中，密封，保存。
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GR01 Patent grant
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