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CN113493765A - BsAb体外负载T细胞 - Google Patents

BsAb体外负载T细胞 Download PDF

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CN113493765A
CN113493765A CN202110599841.9A CN202110599841A CN113493765A CN 113493765 A CN113493765 A CN 113493765A CN 202110599841 A CN202110599841 A CN 202110599841A CN 113493765 A CN113493765 A CN 113493765A
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CN
China
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cells
bsab
tumor
cell
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徐健
李陶
张扬
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Zhejiang Shengxi'ao Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Zhejiang Shengxi'ao Medical Technology Co ltd
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Abstract

本发明属于生物医药领域，细胞治疗技术范畴，具体是BsAb体外负载T细胞。包括具体方法为：BsAb的结构设计和优化；BsAb的制备；BsAb的稳定性分析；BsAb的亲和性分析；免疫细胞的培养；BsAb体外负载T细胞；BsAb负载的T细胞对体外肿瘤细胞的杀伤；细胞因子的分泌；原癌基因和抑癌基因的表达；BsAb负载的T细胞对体内肿瘤细胞的杀伤；TaqMan芯片筛查肿瘤组织中免疫相关基因和肿瘤标志物的变化；免疫组化检测肿瘤组织中CD3+T细胞含量。本发明提供一种在前期化学交联制备BsAb基础上，拟构建合成特异的BsAb并增加BsAb对肿瘤细胞相关抗原的亲和力，建立高效简便的BsAb体外负载免疫细胞的方法同时建立操作简便、安全无污染、可重复性强的免疫细胞体外扩增方法的BsAb体外负载T细胞。

Description

BsAb体外负载T细胞
技术领域
本发明属于生物医药领域，细胞治疗技术范畴，具体是BsAb体外负载T细胞。
背景技术
鉴于前期建立化学交联制备BsAb技术基础上，拟开发系列基于基因工程法制备的BsAb，经体外负载自体免疫细胞的肿瘤超早期治疗技术。该技术具有安全可靠、毒副作用低、特异性强等特点，能有效清除微小病灶，防止肿瘤复发，对超早期的癌症治疗提供了重要的干预手段。
自体免疫细胞治疗作为最新的肿瘤免疫治疗技术，已成为一种全新的肿瘤治疗模式，尽管近年来发展迅速，但整体效果依然欠佳。究其原因，主要与肿瘤通过各种机制产生免疫逃逸有关。如肿瘤细胞表达与正常组织细胞相同的抗原而逃避机体免疫系统的识别；通过分泌免疫抑制因子如TGF-β和IL-10等来抑制免疫活性细胞的功能；通过下调TNF-α受体、Fas 受体等来抵抗细胞因子及细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)的抗肿瘤效应等。为了进一步增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤，需要增加免疫细胞的靶向性。
双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)的问世则为自体免疫细胞治疗靶向性问题的解决提供了新的手段。由于BsAb中包含着两种识别不同特异性抗原的Fab段，通过结合效应细胞和肿瘤细胞的表面抗原，延长肿瘤细胞与效应细胞的接触时间，可有效地阻止肿瘤细胞逃逸，增强效应细胞的杀瘤能力，达到选择性杀伤肿瘤的作用。
BsAb的制备方法主要有三种，分别是化学交联法，杂交瘤细胞法和基因工程法。
作为免疫治疗的新方法，BsAb最初被称为“抗原叉”，早在90年代初，BsAb就是通过化学交联法将两个特异性识别已知肿瘤细胞表面不同抗原决定簇的抗体而构建的。这种BsAb 由于其含有两个能与不同抗原决定簇特异性结合的单克隆抗体，可以同时结合肿瘤细胞相关抗原CD19、HER-2等和血循环免疫效应细胞的受体如Fc gamma RⅠ(CD64)、Fcgamma R Ⅱ(CD32)等，因此它能选择性识别肿瘤细胞，还能将循环血液中的免疫效应细胞(如单核细胞、巨噬细胞、多形核粒细胞、自然杀伤细胞、活化的T细胞等)引至肿瘤组织，并诱导免疫效应细胞产生抗肿瘤活性。化学交联法发展到今天，已经是一种非常成熟的BsAb制备方法，但由于成本较高，难以满足市场需求。
近年来，随着分子技术和基因工程技术的发展，BsAb的研究得到了迅猛的发展。BsAb 的制备也先后出现了更为先进的方法，如杂化杂交瘤细胞法和基因工程法。杂交瘤细胞法由于杂交瘤细胞的筛选比较繁琐，且保种困难，渐为科研人员所淘汰。而基因工程法由于可以对结构进行设计、优化、调整，且可以实现规模化的工业生产，已成为BsAb制备方法的主要发展方向。
近年来，随着分子技术和基因工程技术的发展，BsAb的研究得到了迅猛的发展。BsAb 的制备也先后出现了更为先进的方法，如杂化杂交瘤细胞法和基因工程法。杂交瘤细胞法由于杂交瘤细胞的筛选比较繁琐，且保种困难，渐为科研人员所淘汰。而基因工程法由于可以对结构进行设计、优化、调整，且可以实现规模化的工业生产，已成为BsAb制备方法的主要发展方向，也是所研发的技术。
综上所述，拟开发体外高效扩增NK细胞与转染NKG2D活化NK细胞技术、穿膜肽介导肿瘤抗原多肽致敏转染CD40L的DC疫苗及DC-CTL技术、BsAb体外修饰T细胞肿瘤早期干预技术。以上技术体系中即具有对病变或肿瘤细胞广谱杀伤技术升级版的NK技术，也有安全可靠、毒副作用低、特异性强的DC-CTL和BsAb体外修饰免疫细胞技术，可根据肿瘤高危人群的检测结果，选择适当的免疫技术，能有效清除微小病灶或早期病变细胞和癌细胞，降低癌症的发生率。提供的超早期的癌症治疗重要的干预手段，具有重要的社会意义和经济价值。
BsAb体外负载T细胞技术拟解决的关键问题(1)抗鼠抗体反应，我们拟采用基因工程的方法制备BsAb，通过BsAb体外负载激活T细胞的方式，利用T细胞实现BsAb有效的体内分布，减少BsAb的用量，降低抗鼠抗体反应；(2)实现对肿瘤细胞的选择性杀伤，我们拟利用BsAb对肿瘤相关抗原的特异性，实现T细胞对肿瘤细胞的选择性杀伤，进一步降低毒副作用；(3)双抗对肿瘤的新靶点的设计以及安全性和有效性的评价体系。
发明内容
本发明提供一种在前期化学交联制备BsAb基础上，拟构建合成特异的BsAb并增加BsAb 对肿瘤细胞相关抗原的亲和力，建立高效简便的BsAb体外负载免疫细胞的方法同时建立操作简便、安全无污染、可重复性强的免疫细胞体外扩增方法的BsAb体外负载T细胞。
本发明所采用的技术方案为：BsAb体外负载T细胞，其特征在于：包括具体方法为：
S1：BsAb的结构设计和优化；设计不同构型的单链双特异性抗体，对序列和结构进行优化；
S2：BsAb的制备；所述BsAb的制备方法有杂化杂交瘤技术、化学交联法和基因工程法；
S3：BsAb的稳定性分析；取10ug双抗于4℃放置7天，随后非还原性SDS-PAGE胶检测双抗片段大小；
S4：BsAb的亲和性分析；
S5：免疫细胞的培养；T细胞是体内最主要的免疫细胞，选用T细胞作为效应细胞；
S6：BsAb体外负载T细胞；将BsAb与T细胞共同孵育1h，取约106个细胞，与相应的荧光标记抗原共孵育2h，待BsAb负载的T细胞与相应抗原结合后，洗去游离的抗原，加血清封闭，经温育结合后，洗去多余的血清，并用流式细胞仪计数；
S7：BsAb负载的T细胞对体外肿瘤细胞的杀伤；
S8：细胞因子的分泌；
S9：原癌基因和抑癌基因的表达；
S10：BsAb负载的T细胞对体内肿瘤细胞的杀伤；
S11：TaqMan芯片筛查肿瘤组织中免疫相关基因和肿瘤标志物的变化；
S12：免疫组化检测肿瘤组织中CD3+T细胞含量。
所述BsAb的亲和性分析具体如下：
A)将双抗与1X106 T细胞共孵育2h，双抗终浓度为10nM浓度和50nM浓度；
B)将双抗孵育后的细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm，5min，弃上清液；
C)用含1％多聚甲醛的PBS室温固定15min，PBS清洗1遍；
D)用生物素标记的羊抗鼠或羊抗人IgG，F(abˊ)2片段的特异性抗体4℃孵育2h，PBS 清洗1遍；
E)加入PE标记的链酶亲和素200ul，吹打混匀，4℃孵育1h，避光；
F)PBS 1ml离心洗涤2次；
G)将细胞重新悬浮于500ulPBS中，混匀，置流式管中，避光，上机检测；
H)双抗与靶细胞的亲和性按相同方法检测。
所述T细胞体外扩增培养方法如下：
A)包被：10ml D-PBS加入包被因子，4℃，避光，过夜包被2个T175培养瓶；或置于37℃培养箱中，至少包被2小时；
B)细胞制备：
a：抽取抗凝外周血100ml，800g，15min室温离心(without breaking)；
b：自体血浆制备：取上清血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后-20℃静置10min；最后4℃，1100g，离心15min，4℃保存备用；
c：取上述离心后下部细胞成分，加D-PBS至50ml，混匀，加到4个装有20ml医疗级淋巴细胞分离液的50ml离心管中，800g，15min室温离心(without breaking)；
d：取细胞层，加入培养基至50ml，600g 10min，弃上清液；
e：分离出的PBMC加入80mlT细胞培养液，制成细胞悬液，加入5ml血浆，加入到弃掉包被液的2个T175培养瓶，每个培养瓶同时加入诱导因子，置于饱和湿度、37℃、5。0％ CO2培养箱中培养；
C)细胞扩增：调整T细胞培养液中各种诱导因子的浓度，加快T细胞的扩增速度，增加T细胞活力。
所述BsAb负载的T细胞对体外肿瘤细胞的杀伤以BsAb负载的T细胞为效应细胞，以癌细胞系作为靶细胞；设单纯T细胞对照组、靶细胞对照组；对各实验组采用t检验，以P<0。05为差异具有统计学意义；
杀伤率(％)＝[1-(实验组OD值-T细胞对照OD值)/靶细胞对照OD值]×100％实验。
所述细胞因子的分泌取对数生长期癌细胞系以105个细胞/孔铺12孔板，第二天加入T 细胞或BsAb负载的T细胞，以效靶比5:1的浓度共同培养4小时，收集上清液，用ELISAKit Human IFN-γ、ELISA Kit Human TNF-α检测细胞IFN-γ、TNF-α分泌水平。
所述原癌基因和抑癌基因的表达是通过肿瘤细胞以每孔2×106个细胞种入6孔板内，第二天分别加入2×107效T细胞、BsAb负载的T细胞(效靶比浓度5：1)，未处理的肿瘤细胞做空白对照，共同培养24小时，弃上清液，PBS漂洗细胞两次，加入TRIZOL1ml，收集细胞裂解液，用总RNA试剂盒提取总RNA，再逆转录为cDNA；以cDNA为模板，qPCR检测相关基因的mRNA表达。
所述BsAb负载的T细胞对体内肿瘤细胞的杀伤取6周龄裸鼠30只，雌雄各半，每只裸鼠右腋下皮下注射1×107各种阳性肿瘤细胞系，随机分成3组：生理盐水对照组，T细胞组和BsAb负载的T细胞组；以BsAb负载的T细胞和T细胞作为效应细胞，尾静脉注射1×107 细胞/次，注射总体积为200ul，每周2次。对照组以相同体积的生理盐水代替。每次治疗前用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积(长度a mm，宽度为b mm，肿瘤体积计算公式＝1/2ab2)；并统计每天死亡数，绘制移植瘤模型鼠的生存率曲线。
所述TaqMan芯片筛查肿瘤组织中免疫相关基因和肿瘤标志物的变化通过移植瘤模型鼠在治疗一个月后，颈椎脱臼处死并收集肿瘤组织。研磨肿瘤组织提取RNA，并反转录为cDNA，以所得到的cDNA为模板，送专业的生物公司进行TaqMan芯片法检测免疫相关基因和肿瘤标志物的表达变化。
所述免疫组化检测肿瘤组织中CD3+T细胞含量将移植瘤模型鼠在治疗一个月后，颈椎脱臼处死并收集肿瘤组织。将肿瘤组织切片成厚度为4μm组织片后进行免疫组化染色。福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织依次浸泡于不同浓度梯度的酒精和二甲苯，置于PH10的柠檬酸盐缓冲液中并加热25分钟以行抗原修复，3％过氧化氢溶液在室温下反应5分钟，1：50 稀释的单克隆CD3抗体在室温下反应60分钟，二抗在室温下反应30分钟，与DAB溶液在室温下反应5分钟，与苏木精溶液染色5分钟，盖玻片后将切片置于奥林帕斯显微镜下进行观察评价。
本发明的有益效果：
一、针对BsAb亲和力的问题，利用密码子优化手段增加BsAb与T细胞和相关抗原的亲和力。
二、BsAb完全由人源化抗体序列设计合成和哺乳细胞蛋白表达系统，降低了抗体的免疫原性。
三、BsAb体外负载T细胞，进一步降低了抗体可能引起的免疫原性反应。
四、采用自体T细胞作为肿瘤早期干预的效应细胞，安全可靠，无毒副作用。
五、在较低效靶比的情况下就能裂解肿瘤细胞，相比于传统的单独使用抗体或单独使用细胞培养体系，BsAb的使用量大幅降低，细胞培养体系缩小，极大地降低肿瘤早期干预成本；。
六、BsAb通过同时识别两个标靶，作为一个媒介连接免疫效应细胞和肿瘤细胞，拉近两者距离，增加肿瘤细胞附近的效应细胞数量，增强对肿瘤细胞的杀伤效率。
七、能极大地增强T细胞分泌IFN-γ、TNF-α等因子的释放、有效地激活补体系统和Fc受体相关的效应系统，增强T细胞的杀瘤能力。
附图说明
图1为本发明BsAb体外负载T细胞的技术路线图。
具体实施方式
BsAb体外负载T细胞，其特征在于：包括具体方法为：
S1：BsAb的结构设计和优化；设计不同构型的单链双特异性抗体，对序列和结构进行优化；
S2：BsAb的制备；所述BsAb的制备方法有杂化杂交瘤技术、化学交联法和基因工程法；由于杂化杂交瘤技术产量低，耗时费力，不易筛选，化学交联法易造成蛋白变性，不能激活抗体，所以我们拟采用基因工程法。为了保证BsAb的功能，我们拟采用真核表达系统进行表达。
S3：BsAb的稳定性分析；取10ug双抗于4℃放置7天，随后非还原性SDS-PAGE胶检测双抗片段大小；
S4：BsAb的亲和性分析；
S5：免疫细胞的培养；T细胞是体内最主要的免疫细胞，选用T细胞作为效应细胞；
S6：BsAb体外负载T细胞；将BsAb与T细胞共同孵育1h，取约106个细胞，与相应的荧光标记抗原共孵育2h，待BsAb负载的T细胞与相应抗原结合后，洗去游离的抗原，加血清封闭，经温育结合后，洗去多余的血清，并用流式细胞仪计数；
S7：BsAb负载的T细胞对体外肿瘤细胞的杀伤；
S8：细胞因子的分泌；
S9：原癌基因和抑癌基因的表达；
S10：BsAb负载的T细胞对体内肿瘤细胞的杀伤；
S11：TaqMan芯片筛查肿瘤组织中免疫相关基因和肿瘤标志物的变化；
S12：免疫组化检测肿瘤组织中CD3+T细胞含量。
所述BsAb的亲和性分析具体如下：
A)将双抗与1X106 T细胞共孵育2h，双抗终浓度为10nM浓度和50nM浓度；
B)将双抗孵育后的细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm，5min，弃上清液；
C)用含1％多聚甲醛的PBS室温固定15min，PBS清洗1遍；
D)用生物素标记的羊抗鼠或羊抗人IgG，F(abˊ)2片段的特异性抗体4℃孵育2h，PBS 清洗1遍；
E)加入PE标记的链酶亲和素200ul，吹打混匀，4℃孵育1h，避光；
F)PBS 1ml离心洗涤2次；
G)将细胞重新悬浮于500ulPBS中，混匀，置流式管中，避光，上机检测；
H)双抗与靶细胞的亲和性按相同方法检测。
所述T细胞体外扩增培养方法如下：
A)包被：10ml D-PBS加入包被因子，4℃，避光，过夜包被2个T175培养瓶；或置于37℃培养箱中，至少包被2小时；
B)细胞制备：
a：抽取抗凝外周血100ml，800g，15min室温离心(without breaking)；
b：自体血浆制备：取上清血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后-20℃静置10min；最后4℃，1100g，离心15min，4℃保存备用；
c：取上述离心后下部细胞成分，加D-PBS至50ml，混匀，加到4个装有20ml医疗级淋巴细胞分离液的50ml离心管中，800g，15min室温离心(without breaking)；
d：取细胞层，加入培养基至50ml，600g 10min，弃上清液；
e：分离出的PBMC加入80mlT细胞培养液，制成细胞悬液，加入5ml血浆，加入到弃掉包被液的2个T175培养瓶，每个培养瓶同时加入诱导因子，置于饱和湿度、37℃、5。0％ CO2培养箱中培养；
C)细胞扩增：调整T细胞培养液中各种诱导因子的浓度，加快T细胞的扩增速度，增加T细胞活力。
所述BsAb负载的T细胞对体外肿瘤细胞的杀伤以BsAb负载的T细胞为效应细胞，以癌细胞系作为靶细胞；设单纯T细胞对照组、靶细胞对照组；对各实验组采用t检验，以P<0。05为差异具有统计学意义；
杀伤率(％)＝[1-(实验组OD值-T细胞对照OD值)/靶细胞对照OD值]×100％实验。
所述细胞因子的分泌取对数生长期癌细胞系以105个细胞/孔铺12孔板，第二天加入T 细胞或BsAb负载的T细胞，以效靶比5:1的浓度共同培养4小时，收集上清液，用ELISAKit Human IFN-γ、ELISA Kit Human TNF-α检测细胞IFN-γ、TNF-α分泌水平。
所述原癌基因和抑癌基因的表达是通过肿瘤细胞以每孔2×106个细胞种入6孔板内，第二天分别加入2×107效T细胞、BsAb负载的T细胞(效靶比浓度5：1)，未处理的肿瘤细胞做空白对照，共同培养24小时，弃上清液，PBS漂洗细胞两次，加入TRIZOL1ml，收集细胞裂解液，用总RNA试剂盒提取总RNA，再逆转录为cDNA；以cDNA为模板，qPCR检测相关基因的mRNA表达。
所述BsAb负载的T细胞对体内肿瘤细胞的杀伤取6周龄裸鼠30只，雌雄各半，每只裸鼠右腋下皮下注射1×107各种阳性肿瘤细胞系，随机分成3组：生理盐水对照组，T细胞组和BsAb负载的T细胞组；以BsAb负载的T细胞和T细胞作为效应细胞，尾静脉注射1×107 细胞/次，注射总体积为200ul，每周2次。对照组以相同体积的生理盐水代替。每次治疗前用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积(长度a mm，宽度为b mm，肿瘤体积计算公式＝1/2ab2)；并统计每天死亡数，绘制移植瘤模型鼠的生存率曲线。
所述TaqMan芯片筛查肿瘤组织中免疫相关基因和肿瘤标志物的变化通过移植瘤模型鼠在治疗一个月后，颈椎脱臼处死并收集肿瘤组织。研磨肿瘤组织提取RNA，并反转录为cDNA，以所得到的cDNA为模板，送专业的生物公司进行TaqMan芯片法检测免疫相关基因和肿瘤标志物的表达变化。
所述免疫组化检测肿瘤组织中CD3+T细胞含量将移植瘤模型鼠在治疗一个月后，颈椎脱臼处死并收集肿瘤组织。将肿瘤组织切片成厚度为4μm组织片后进行免疫组化染色。福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织依次浸泡于不同浓度梯度的酒精和二甲苯，置于PH10的柠檬酸盐缓冲液中并加热25分钟以行抗原修复，3％过氧化氢溶液在室温下反应5分钟，1：50 稀释的单克隆CD3抗体在室温下反应60分钟，二抗在室温下反应30分钟，与DAB溶液在室温下反应5分钟，与苏木精溶液染色5分钟，盖玻片后将切片置于奥林帕斯显微镜下进行观察评价。
一、针对BsAb亲和力的问题，利用密码子优化手段增加BsAb与T细胞和相关抗原的亲和力。
二、BsAb完全由人源化抗体序列设计合成和哺乳细胞蛋白表达系统，降低了抗体的免疫原性。
三、BsAb体外负载T细胞，进一步降低了抗体可能引起的免疫原性反应。
四、采用自体T细胞作为肿瘤早期干预的效应细胞，安全可靠，无毒副作用。
五、在较低效靶比的情况下就能裂解肿瘤细胞，相比于传统的单独使用抗体或单独使用细胞培养体系，BsAb的使用量大幅降低，细胞培养体系缩小，极大地降低肿瘤早期干预成本；。
六、BsAb通过同时识别两个标靶，作为一个媒介连接免疫效应细胞和肿瘤细胞，拉近两者距离，增加肿瘤细胞附近的效应细胞数量，增强对肿瘤细胞的杀伤效率。
七、能极大地增强T细胞分泌IFN-γ、TNF-α等因子的释放、有效地激活补体系统和Fc受体相关的效应系统，增强T细胞的杀瘤能力。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.BsAb体外负载T细胞，其特征在于：包括具体方法为：
S1：BsAb的结构设计和优化；设计不同构型的单链双特异性抗体，对序列和结构进行优化；
S2：BsAb的制备；所述BsAb的制备方法有杂化杂交瘤技术、化学交联法和基因工程法；
S3：BsAb的稳定性分析；取10ug双抗于4℃放置7天，随后非还原性SDS-PAGE胶检测双抗片段大小；
S4：BsAb的亲和性分析；
S5：免疫细胞的培养；T细胞是体内最主要的免疫细胞，选用T细胞作为效应细胞；
S6：BsAb体外负载T细胞；将BsAb与T细胞共同孵育1h，取约106个细胞，与相应的荧光标记抗原共孵育2h，待BsAb负载的T细胞与相应抗原结合后，洗去游离的抗原，加血清封闭，经温育结合后，洗去多余的血清，并用流式细胞仪计数；
S7：BsAb负载的T细胞对体外肿瘤细胞的杀伤；
S8：细胞因子的分泌；
S9：原癌基因和抑癌基因的表达；
S10：BsAb负载的T细胞对体内肿瘤细胞的杀伤；
S11：TaqMan芯片筛查肿瘤组织中免疫相关基因和肿瘤标志物的变化；
S12：免疫组化检测肿瘤组织中CD3+T细胞含量。
2.根据权利要求1所述的BsAb体外负载T细胞，其特征在于：所述BsAb的亲和性分析具体如下：
A将双抗与1X106 T细胞共孵育2h，双抗终浓度为10nM浓度和50nM浓度；
B将双抗孵育后的细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm，5min，弃上清液；
C用含1％多聚甲醛的PBS室温固定15min，PBS清洗1遍；
D用生物素标记的羊抗鼠或羊抗人IgG，Fabˊ2片段的特异性抗体4℃孵育2h，PBS清洗1遍；
E加入PE标记的链酶亲和素200ul，吹打混匀，4℃孵育1h，避光；
F PBS 1ml离心洗涤2次；
G将细胞重新悬浮于500ulPBS中，混匀，置流式管中，避光，上机检测；
H双抗与靶细胞的亲和性按相同方法检测。
3.根据权利要求1所述的BsAb体外负载T细胞，其特征在于：所述T细胞体外扩增培养方法如下：
A包被：10ml D-PBS加入包被因子，4℃，避光，过夜包被2个T175培养瓶；或置于37℃培养箱中，至少包被2小时；
B细胞制备：
a：抽取抗凝外周血100ml，800g，15min室温离心without breaking；
b：自体血浆制备：取上清血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后-20℃静置10min；最后4℃，1100g，离心15min，4℃保存备用；
c：取上述离心后下部细胞成分，加D-PBS至50ml，混匀，加到4个装有20ml医疗级淋巴细胞分离液的50ml离心管中，800g，15min室温离心without breaking；
d：取细胞层，加入培养基至50ml，600g 10min，弃上清液；
e：分离出的PBMC加入80mlT细胞培养液，制成细胞悬液，加入5ml血浆，加入到弃掉包被液的2个T175培养瓶，每个培养瓶同时加入诱导因子，置于饱和湿度、37℃、5；0％CO2培养箱中培养；
C细胞扩增：调整T细胞培养液中各种诱导因子的浓度，加快T细胞的扩增速度，增加T细胞活力。
4.根据权利要求1所述的BsAb体外负载T细胞，其特征在于：所述BsAb负载的T细胞对体外肿瘤细胞的杀伤以BsAb负载的T细胞为效应细胞，以癌细胞系作为靶细胞；设单纯T细胞对照组、靶细胞对照组；对各实验组采用t检验，以P<0；05为差异具有统计学意义；杀伤率％＝[1-实验组OD值-T细胞对照OD值/靶细胞对照OD值]×100％实验。
5.根据权利要求1所述的BsAb体外负载T细胞，其特征在于：所述细胞因子的分泌取对数生长期癌细胞系以105个细胞/孔铺12孔板，第二天加入T细胞或BsAb负载的T细胞，以效靶比5:1的浓度共同培养4小时，收集上清液，用ELISA Kit Human IFN-γ、ELISA KitHuman TNF-α检测细胞IFN-γ、TNF-α分泌水平。
6.根据权利要求1所述的BsAb体外负载T细胞，其特征在于：所述原癌基因和抑癌基因的表达是通过肿瘤细胞以每孔2×106个细胞种入6孔板内，第二天分别加入2×107效T细胞、BsAb负载的T细胞效靶比浓度5：1，未处理的肿瘤细胞做空白对照，共同培养24小时，弃上清液，PBS漂洗细胞两次，加入TRIZOL1ml，收集细胞裂解液，用总RNA试剂盒提取总RNA，再逆转录为cDNA；以cDNA为模板，qPCR检测相关基因的mRNA表达。
7.根据权利要求1所述的BsAb体外负载T细胞，其特征在于：所述BsAb负载的T细胞对体内肿瘤细胞的杀伤取6周龄裸鼠30只，雌雄各半，每只裸鼠右腋下皮下注射1×107各种阳性肿瘤细胞系，随机分成3组：生理盐水对照组，T细胞组和BsAb负载的T细胞组；以BsAb负载的T细胞和T细胞作为效应细胞，尾静脉注射1×107细胞/次，注射总体积为200ul，每周2次；对照组以相同体积的生理盐水代替；每次治疗前用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积长度a mm，宽度为b mm，肿瘤体积计算公式＝1/2ab2；并统计每天死亡数，绘制移植瘤模型鼠的生存率曲线。
8.根据权利要求1所述的BsAb体外负载T细胞，其特征在于：所述TaqMan芯片筛查肿瘤组织中免疫相关基因和肿瘤标志物的变化通过移植瘤模型鼠在治疗一个月后，颈椎脱臼处死并收集肿瘤组织；研磨肿瘤组织提取RNA，并反转录为cDNA，以所得到的cDNA为模板，送专业的生物公司进行TaqMan芯片法检测免疫相关基因和肿瘤标志物的表达变化。
9.根据权利要求1所述的BsAb体外负载T细胞，其特征在于：所述免疫组化检测肿瘤组织中CD3+T细胞含量将移植瘤模型鼠在治疗一个月后，颈椎脱臼处死并收集肿瘤组织；将肿瘤组织切片成厚度为4μm组织片后进行免疫组化染色；福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织依次浸泡于不同浓度梯度的酒精和二甲苯，置于PH10的柠檬酸盐缓冲液中并加热25分钟以行抗原修复，3％过氧化氢溶液在室温下反应5分钟，1：50稀释的单克隆CD3抗体在室温下反应60分钟，二抗在室温下反应30分钟，与DAB溶液在室温下反应5分钟，与苏木精溶液染色5分钟，盖玻片后将切片置于奥林帕斯显微镜下进行观察评价。
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