CN113481326B

CN113481326B - 一种等温核酸扩增反应试剂、等温核酸扩增方法及其应用

Info

Publication number: CN113481326B
Application number: CN202110780940.7A
Authority: CN
Inventors: 雷洋; 白佳委; 黄认训; 汪大明
Original assignee: Anbio (xiamen) Products Inc
Current assignee: Anbio (xiamen) Products Inc
Priority date: 2021-07-09
Filing date: 2021-07-09
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2041-07-09
Also published as: CN113481326A

Abstract

本发明公开了一种等温核酸扩增反应试剂、等温核酸扩增方法及其应用，本发明提供的等温核酸扩增反应试剂选择莎梵婷、TX‑100、吐温20等温和的表面活性剂，与DMSO、蔗糖、海藻糖、热启动Bst聚合酶和耐高温热启动逆转录酶配合，反应特异性高，能够裂解病原体，释放其基因组核酸，且提供一个高度耐抑制缓冲体系，可实现对血液样本，呼吸道样本等进行直接扩增，实现免提取扩增。

Description

一种等温核酸扩增反应试剂、等温核酸扩增方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种等温核酸扩增反应试剂、等温核酸扩增方法及其应用。

背景技术

在分子检测领域，用于靶标检测的方法包括PCR-直接测序法、PCR-焦磷酸测序法、荧光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-电泳分析、原位杂交(ISH)，等温扩增等多种方法。

PCR-Sanger测序法的操作过程主要包括PCR扩增和PCR产物纯化、测序反应、测序和结果分析四个主要步骤；PCR-Sanger的主要不足是：灵敏度不高，对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；操作复杂，成本相对较高，速度慢、通量低；PCR-焦磷酸测序法检测灵敏度较高，通过特殊的试剂和仪器主要进行短片段的分析；不能对长片段进行分析。实时荧光PCR法灵敏度高，分型准确，但该方法通量不高，探针成本较高，需在特殊的实验室区域进行PCR-电泳分析该方法是指对待分析的目的基因片段进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析，根据PCR产物的大小对基因多态性位点进行基因分型；PCR-电泳分析需要反复打开反应管进行操作，易造成环境污染。原位杂交(ISH)是在细胞核原位对基因的异常进行检测，成本高，通量低，时间较长。

体外核酸扩增被广泛用在研究、医学、食品科学等领域，其中最为广泛被研究和使用的是聚合酶链式反应(PCR)。然而PCR反应依赖于提高和降低反应混合物的温度循环，需要配备专用的热循环仪器才能进行，并且扩增时间长，一般需要几个小时，难以在基层尤其是一些偏远地区或条件较差的实验室推广使用。

针对常规PCR反应的不足，以核酸等温扩增技术为基础的检测技术得到了迅猛的发展。多种机制的等温技术完成了从实验室到实际应用的过渡，正逐步在分子生物学、医学、法学等领域得到广泛运用。特别是在临床和现场快速诊断技术方面，核酸等温扩增技术显示了其突出的优越性。更为重要的是，核酸等温扩增技术由于不需要温度变化的时间且摆脱了对精良仪器设备的依赖，使得我们对病原体的检测诊断得以快速并高通量的实现。

但是体外扩增技术在实际应用当中容易遇到抑制现象。采样方法、样本类型、提取试剂等影响得到的DNA或RNA模板的质量，导致不同程度的扩增抑制，有待进一步改善。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐抑制性好、反应特异性高的新型等温核酸扩增反应试剂、等温核酸扩增方法及其应用。

为实现本发明的目的，本发明提供了一种等温核酸扩增反应试剂，其包括以下组分：

DMSO、蔗糖、海藻糖、TX-100、莎梵婷、吐温20、MgSO₄、热启动Bst DNA聚合酶、dUTPMix、尿嘧啶DNA糖苷酶及耐热型MMLV逆转录酶。

进一步地，所述反应试剂中，各组分的终浓度为：

进一步地，所述反应试剂还包括酸碱指示剂和/或荧光染料和/或荧光探针。

更进一步地，所述酸碱指示剂为酚红，或者所述荧光染料为SYTO9。

进一步地，所述反应试剂还包括引物组合物，所述引物组合物包括6条茎环信标结构引物IF1,IF2,IF3,IR1,IR2,IR3。

进一步地，所述引物组合物的摩尔比为：IF1:IF2:IF3:IR1:IR2:IR3＝1:1:1:1:1:1。

本发明还提供了一种等温核酸扩增方法，其包括如下步骤：

S1、获得待测样本核酸模板；

S2、将步骤S1中的核酸模板与上述的反应试剂混合，在62-68℃反应10-25min以完成等温核酸扩增反应。

更为优选的，步骤S2中，反应温度为65℃。

本发明还提供了上述等温核酸扩增反应试剂在非疾病诊断目的的病原微生物检测中的应用。

进一步地，所述病原微生物为人类免疫缺陷病毒核酸HIV-1或呼吸道合胞病毒。

进一步的，该应用可以是应用于检测试剂盒的制备。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括以下：

1、本发明提供的等温核酸扩增反应试剂，选择莎梵婷、TX-100、吐温20等温和的表面活性剂，与DMSO、蔗糖、海藻糖、热启动Bst聚合酶和耐高温热启动逆转录酶配合，反应特异性高，能够裂解病原体，释放其基因组核酸，且提供一个高度耐抑制缓冲体系，可实现对血液样本，呼吸道样本等进行直接扩增，实现免提取扩增；

2、本发明提供的等温核酸扩增反应试剂使用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶进行反应，DNA聚合酶在扩增反应中产生大量质子，引发pH值的下降，从而可通过添加酸碱指示剂进行颜色变化的可视化观察；或者可通过添加荧光染料进行溶解曲线分析；或者添加荧光探针、进行荧光信号识别以判断等温扩增反应终点和检测结果判定，反应结果判定简单、快捷；适用于多种病原微生物的快速检测；

3、本发明提供的等温核酸扩增反应试剂还可以包含6条茎环信标结构引物(IF1,IF2,IF3,IR1,IR2,IR3)，通过6条引物的相互作用，不断地产生链置换反应，实现模板的放大。从起始模板量从单拷贝放大到10⁶-10¹⁰拷贝及以上；多对引物相互促进链置换作用，可实现多重引物反应，针对模板多个区域设计引物，多靶点检测基因组核酸，对于容易变异的病原体(如HIV,HCV等)可以有效避免漏检；

4、本发明提供的等温核酸扩增反应试剂应用于人类免疫缺陷病毒核酸(HIV-1RNA)系列血清和呼吸道合胞病毒检测时，检测结果符合企业标准品检测要求，符合方法学对病原体检测的基础性能要求。

附图说明

图1：本发明中引物组合物与待测样本核酸模板结合进行等温扩增反应的示意图。

具体实施方式

为更加清楚的表示，下面结合附图和具体实施例对本发明做详细的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。若无特别说明，本发明选用的原料、试剂或设备均为市售所得。

本发明提供了一种新型的等温核酸扩增反应试剂，其基本组成成分和各组分的终浓度如表1所示。

表1用于实施本发明的基础反应体系

注：表1中终浓度单位为％的表示的是质量百分比，mM为mmol/L的简写。

本发明提供的反应试剂由于采用了适合待测样本直接扩增反应的聚合酶和逆转录酶体系，能够裂解病原体，释放其基因组核酸，且提供了一个高度耐抑制缓冲体系，可实现对血液样本，呼吸道样本等进行直接扩增。该基础反应体系中：

逆转录酶体系采用热启动逆转录酶(耐热型MMLV逆转录酶)，聚合酶采用热启动Bst DNA聚合酶，有效降低了反应前的非特异干扰(如引物二聚体等非特异形成的二级结构等)和细胞裂解产生的杂质干扰，更适合免提取扩增体系；

逆转录酶采用耐高温逆转录酶，可以耐受高温，而不失逆转录的活性，有利于RNA病原体的扩增；

含有DMSO、蔗糖，海藻糖的抗抑性缓冲液可以增加扩增反应试剂的稳定性，促进扩增反应的进行，减小裂解后杂质对扩增酶的影响，同时蔗糖可以加速细胞裂解。热启动BstDNA聚合酶与抗抑性缓冲液一起使用时，显示出更强的抑制剂耐受性和反应特异性。

本发明使用具有链置换活性的DNA聚合酶(热启动Bst DNA聚合酶)作为反应试剂的成分以进行等温核酸扩增反应。其原理为DNA聚合酶在本扩增反应中产生大量质子，引发pH值的下降，从而可通过预先在反应试剂中添加酸碱指示剂进行颜色变化的可视化观察；具体的，本发明进行了如下实验，扩增反应前和扩增结束后，对在反应体系的pH值进行测定，发现反应前成碱性，反应后溶液呈酸性。为了明确是否可以用酸碱指示剂观察其颜色变化，在实验中，加入酚红后，进行测试，反应前体系为红色，扩增反应后，体系为黄色。这表明本发明可进一步实现核酸扩增结果的可视化分析。本发明还可以通过添加荧光染料(例如荧光染料SYTO9)进行溶解曲线分析；或者添加荧光探针、进行荧光信号识别以判断等温扩增反应终点和检测结果判定，反应结果判定简单、快捷；适用于多种病原微生物的快速检测。本发明的反应体系中还可以同时包含酚红、荧光染料和荧光探针，三者结果综合判断，进一步提高结果判定的可靠性。本发明提供的反应试剂采用的聚合酶对dUTP底物的识别能力，扩增反应所需的核苷酸底物dTTP可被dUTP完全取代，因此扩增产物均包含dUTP，在配合热敏UDG(UNG)酶的情况下，气溶胶污染物，将会在起始反应阶段被彻底清除。应用该试剂，能大大降低等温扩增反应中由于气溶胶污染造成的假阳性信号。

本发明提供的试剂进行等温核酸扩增反应包括以下步骤：

S1、获得待测样本核酸模板；

S2、将步骤S1中的核酸模板与上述的反应试剂混合，在62℃-68℃温度下反应10-25min以完成等温核酸扩增反应。

常见的等温扩增需要核酸提取或者需要加入免提取的裂解液，而本发明提供的反应试剂中添加多种化学物质，可以让酶发挥更好效能，耐受粗提样本，或原始样本，实现免提取扩增。

具体的，细胞在裂解的过程中，需要表面活性剂的作用来加速细胞膜蛋白和脂类的溶解。但多数表面活性剂作用剧烈，在裂解细胞的同时会影响聚合酶的活性，从而影响核酸扩增的效果。在表面活性剂的选择上，本发明选择了莎梵婷、TX-100、吐温20等温和表面活性剂，通过联合调节莎梵婷、TX-100、吐温20等温和表面活性剂浓度上下调整10％-20％，和pH值6.5-8.5之间调节优化。通过实验，得出了最佳组合，和各组分使用浓度。可在加速细胞裂解、释放核酸的同时又能保证酶的活性。细胞裂解后，会产生包含蛋白片段和脂类的杂质，这些杂质存在于反应体系中时会影响反应效果，所以必须降低这些杂质对反应干扰以保证结果。以上表面活性剂可以增加细胞膜的通透性，裂解细胞，同时吸附非核酸类的杂质。DMSO、蔗糖，海藻糖可以增加扩增试剂的稳定性，促进扩增反应的进行，减小裂解后杂质对扩增的影响，同时蔗糖可以加速细胞裂解。

本发明提供的反应试剂还进一步包含引物组合物，所述引物组合物包含6条茎环信标结构引物(IF1,IF2,IF3,IR1,IR2,IR3)，参照图1所示，该6条引物分别和模板链杂交结合进行延伸，产物链延伸的同时，对下游引物延伸的链进行剥离，促进下游引物延伸的产物形成。茎环引物的结构为3端和5端互补配对，形成茎环。5端为人为添加的碱基，使其和茎环引物3端配对，形成一个茎环引物，遇到模板时，茎环引物和模板链杂交，茎环打开，引物3端开始延伸，而引物5端和模板链不匹配，且不能杂交，以便于被其他引物延伸链剥离，加速链置换反应。多对引物引发链置换反应，加速整个反应速度。

通过6条引物的相互作用，不断地产生链置换反应，实现模板的放大。从起始模板量从单拷贝放大到10⁶-10¹⁰拷贝及以上。多对引物相互促进链置换作用，可实现多重引物反应，针对模板多个区域设计引物，多靶点检测基因组核酸，对于容易变异的病原体(如HIV、HCV等)可以有效避免漏检。

本

本发明提供的等温核酸扩增反应试剂可以用于在非疾病诊断目的的病原微生物检测，并进一步可制成检测相应的检测试剂盒等。

本发明提供的反应试剂应用于非疾病诊断目的的病原微生物检测时，具有快速、灵敏、免核酸提取、简易操作，常温保存、检测结果可以肉眼判读或使用便携式仪器判读。整个检测时间短，仅需要10-25分钟左右，检测灵敏度高。反应体系含UDG(UNG)酶，具有热敏性，能大大降低等温扩增反应中由于气溶胶污染造成的假阳性信号，增加反应检测的准确性。

以下通过具体应用实施例对本发明进行更详细的说明。

实施例1：

本实施例提供了上述的等温核酸扩增反应试剂应用于非疾病诊断目的的人类免疫缺陷病毒核酸(HIV-1RNA)检测上。下载NCBI的HIV病毒基因组序列，通过MEGA等软件比对序列找到保守的区域，我们根据引物与模板碱基互补原则，手动设计引物，采用primer软件计算引物TM值，通过TM值和序列初步筛选出引物，剔除掉有连续一样碱基的引物，避免形成引物二聚体。进而通过实验进行验证和再筛选。

首先，最终设计筛选得到的用于实施本发明的引物序列见表2，合成表2中的引物得到引物组合物，备用。

表2实施例1中用于实施本发明的引物序列表

接着，配制总的反应体系，进行等温扩增反应。总的反应体系组成如表3所示。

表3实施例1中用于实施本发明的总反应体系

注：表3中终浓度单位为％的表示的是质量百分比，mM为mmol/L的简写，μM为μmol/L，终浓度或终用量一栏中单位为体积μL表示的为终用量。

本实施例采用表2中反应体系，对参考品进行检测。企业参考品采用外购的国家标准品。使用前稀释到工作浓度。

人类免疫缺陷病毒核酸(HIV-1RNA)系列血清(液体)国家标准物质为康彻思坦提供。见表4：

表4实施例1中用于实施本发明的国家标准物质

本发明选取多种待测样本核酸模板(上述参考品)，进行了多项检测实验。具体的，包括：

1、检测限实验：

检测限实验为每种检测限参考品(见表5)重复检测20次，本发明提供的反应试剂对2种检测限参考品(见表5)，在20次重复检测中，均100％检出阳性，证明了本发明提供的反应试剂的敏感性。

表5实施例1中用于实施本发明的检测限实验的参考品

2、阴阳性参考品符合率实验：

检测表6的HIV P1阳性参考品3次，检测结果均为HIV阳性。检测HIV N1阴性参考品3次，检测结果均为HIV阴性。

表6实施例1中用于实施本发明的阴阳性参考品符合率的参考品

3、特异性实验：

检测表7中的特异性参考品各3次，均为阳性。

表7实施例1中用于实施本发明的特异性实验的参考品

4、精密度实验：

检测表8中的精密度参考品：HIV T1，HIV T2，每种精密度参考品重复检测10次，均检测为阳性。检测精密度参考品HIV T3 10次，均检测为阴性。

通过以上检测结果对比，得出结论，本发明的检测结果符合企业标准品检测要求，符合该方法学对HIV检测的基础性能要求。

表8实施例1中用于实施本发明的精密度实验的参考品

5、样本检测：检测200份阳性HIV样本均为阳性，检测1000份正常人样本均为阴性。

实施例2

本实施例提供了上述的等温核酸扩增反应试剂应用于非疾病诊断目的的呼吸道合胞病毒检测上。

下载NCBI的Influenza A virus物种库上的呼吸道合胞病毒基因组序列，通过MEGA等软件比对序列找到保守的区域，我们根据引物与模板碱基互补原则，手动设计引物，采用primer软件计算引物TM值，通过TM值和序列初步筛选出引物，剔除掉有连续一样碱基的引物，避免形成引物二聚体。进而通过实验进行验证和再筛选。

首先，最终设计筛选得到的用于实施本发明的引物序列见表9，合成表9中的引物得到引物组合物，备用。

表9实施例2中用于实施本发明的引物序列表

接着，配制总的反应体系，进行等温扩增反应。总的反应体系组成如表10所示。

表10实施例2中用于实施本发明的总反应体系

注：表10中终浓度单位为％的表示的是质量百分比，mM为mmol/L的简写，μM为μmol/L的简写，终浓度或终用量一栏中单位为体积μL表示的为终用量。

本实施例采用表10中的反应体系，对参考品进行检测。企业参考品采用人工合成的RSV假病毒(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)和收集的呼吸道合胞病毒的阳性咽拭子液。使用前稀释到工作浓度。

本发明选取多种待测样本核酸模板(上述参考品RSV假病毒和咽拭子液)，进行了多项检测实验。具体的，包括：

1、检测限实验：

检测下表(表11)2种检测限参考品：检测限实验为每种检测限参考品重复检测20次。

利用本实施例提供的反应试剂对2种检测限参考品进行检测，在20次重复检测中，均100％检出阳性，证明了本发明反应试剂的敏感性。

表11实施例2中用于实施本发明的检测限实验的参考品

参考品编号	浓度	详细信息
			RSV L1	200copies/mL	RSV假病毒
RSV L2	500copies/mL	RSV假病毒

2、阴阳性参考品符合率实验：

检测表12的HIV P1阳性参考品3次，检测结果均为HIV阳性。检测HIV N1阴性参考品3次，检测结果均为HIV阴性。

表12实施例2中用于实施本发明的阴阳性参考品符合率的参考品

3、特异性实验：

检测表13中的特异性参考品各3次，检测结果均为阳性。

表13实施例2中用于实施本发明的特异性实验的参考品

4、精密度实验：

检测表14的精密度参考品：RSV T1，RSV T2，每种精密度参考品重复检测10次，检测结果均为阳性。检测精密度参考品RSV T3 10次，检测结果均为阴性。

通过以上检测结果对比，可知，本实施例提供的反应试剂检测结果符合企业标准品检测要求，符合该方法学对呼吸道合胞病毒检测的基础性能要求。

表14实施例2中用于实施本发明的精密度实验的参考品

参考品编号	浓度	基因型
			RSV T1	2000copies/mL	RSV假病毒
RSV T2	5000copies/mL	RSV假病毒
			RSV T3	/	正常人咽拭子液(RSV阴性)

5、样本检测实验：检测120份阳性呼吸道合胞病毒样本均为阳性，检测800份正常人咽拭子液样本均为阴性。

以上实施例仅用以解释说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管上述实施例对本发明进行了具体的说明，相关技术人员应当理解，依然可对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改和等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围之中。

序列表

<110> 厦门健康工程与创新研究院

<120> 一种等温核酸扩增反应试剂、等温核酸扩增方法及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cttactgagg aagagcaaaa caaaagtaag 30

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccttggtaag gatagagata aaagacacca agg 33

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagagggata taatacagta gcaaccctct a 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtagtaggct gaaagccttc tcttctacta c 31

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatacccgat aatgctgaaa acatgggtat c 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caccccatgg tgtttaaatc ttgtggggtg 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttggtcacta agtgattcaa caatgaccaa 30

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatcaaaatt atctgaatta cttggatttg atc 33

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gctagttaaa ttataataaa tatcaactag c 31

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gaccatttat agtctcaagt gacaatggtc 30

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

catcatgtat ataaatctgt gtgttatgat g 31

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtatagtttc atcaagtttt ctcactatac 30

Claims

1.一种等温核酸扩增反应试剂，其特征在于：包括以下组分：

DMSO、蔗糖、海藻糖、TX-100、莎梵婷、吐温20、MgSO₄、热启动Bst DNA 聚合酶、dUTP Mix、尿嘧啶DNA糖苷酶及耐热型MMLV逆转录酶；

所述反应试剂还包含引物组合物，所述引物组合物包含6条茎环信标结构引物IF1，IF2，IF3，IR1，IR2，IR3，所述6条引物分别和模板链杂交结合进行延伸，产物链延伸的同时，对下游引物延伸的链进行剥离，促进下游引物延伸的产物形成；所述茎环信标结构引物的结构为3端和5端互补配对，形成茎环，其中5端为人为添加的碱基，使其与引物3端配对，形成一个茎环信标结构引物；遇到模板时，所述茎环信标结构引物和模板链杂交，茎环打开，引物3端开始延伸，而引物5端和模板链不匹配，且不能杂交，以便于被其他引物延伸链剥离，加速链置换反应。

2.如权利要求1所述的等温核酸扩增反应试剂，其特征在于：所述反应试剂中，各组分的终浓度为：

DMSO 2~5% w/w

蔗糖 0.5~1% w/w

海藻糖 1-3% w/w

TX-100 0.5~0.9% w/w

莎梵婷 0.1~0.5% w/w

吐温20 0.1~0.2% w/w

MgSO₄ 5mM~12 mM

dUTP Mix 1.6-6mM。

3.如权利要求1所述的等温核酸扩增反应试剂，其特征在于：所述反应试剂还包括酸碱指示剂和/或荧光染料和/或荧光探针。

4.如权利要求3所述的等温核酸扩增反应试剂，其特征在于：所述酸碱指示剂为酚红，所述荧光染料为SYTO9。

5.如权利要求1所述的等温核酸扩增反应试剂，其特征在于：所述引物组合物的摩尔比为：IF1:IF2:IF3:IR1:IR2:IR3=1:1:1:1:1:1。

6.一种非疾病诊断目的的等温核酸扩增方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、获得待测样本核酸模板；

S2、将步骤S1中的核酸模板与权利要求1-5任一项所述的反应试剂混合，在62℃-68℃温度下反应10-25min以完成等温核酸扩增反应。

7.一种如权利要求1-5任一项所述的等温核酸扩增反应试剂在非疾病诊断目的的病原微生物检测中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述病原微生物为人类免疫缺陷病毒核酸HIV-1或呼吸道合胞病毒。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：应用于检测试剂盒的制备。