CN113481268B - 一种利用微反应器连续制备脂肪链-glp-1受体激动剂类多肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用微反应器连续制备脂肪链‑GLP‑1受体激动剂类多肽的方法，属于生物工程和制药工程领域，涉及药用蛋白多肽的脂肪链修饰。所述的连续制备方法包括微反应器内连续合成脂肪链‑GLP‑1受体激动剂类多肽和下游修饰产物的分离工艺。本发明建立了一条适用于脂肪链‑GLP‑1受体激动剂类多肽的高效、节能且易于放大的连续制备方法。

Description

一种利用微反应器连续制备脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽 的方法

技术领域

本发明属于生物工程和制药工程领域，涉及药用蛋白多肽的脂肪链修饰，具体涉及脂肪链修饰GLP-1受体激动剂类多肽的连续制备方法。

背景技术

蛋白质/多肽类药物正成为现代生物医药产业的主导产品，包括重组蛋白、多肽、酶和抗体等，具有生物活性高、特异性强等优点，广泛用于心脑血管、癌症以及糖尿病等重大疾病的防治。然而，药用蛋白多肽在临床上仍存在体内半衰期短、免疫原性强等缺陷，导致临床治疗需要反复给药或大剂量用药，易产生药物耐受性及免疫排斥等不良反应，同时给患者增加了经济负担，因此开发长效型蛋白多肽药物将是未来发展的主要方向。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂类药物不仅具有与胰岛素类似的降糖功能，还具有其它多种功效作用，包括食欲控制、减肥和心血管获益等，具有很大的市场潜力。天然的GLP-1在体内可迅速被二肽基肽酶IV(DPP-IV)水解而失去生物活性，半衰期仅1-2min，不具备成药性，因此开发GLP-1受体激动剂类药物的长效剂型将是未来降糖药物发展的重要方向。洛塞那肽是在艾塞那肽化学结构基础上进行修饰改造而成的，将艾塞那肽的第2位Gly、14位Met和28位Asn分别突变为D-Ala、Nle和Gln，提高了基于多肽骨架的酶介稳定性和化学稳定性，同时将肽C端的Ser换成了Cys。

脂肪链修饰蛋白多肽逐渐成为新的缓释药物，即通过化学反应的手段将脂肪酸、醇、醛或胺的侧链偶联到药用蛋白多肽上。连接了脂肪链的药物进入体内后会与人血清白蛋白结合或自组装为聚合体，进而提高体内循环半衰期。此外，修饰后的蛋白多肽类药物还具有生物安全性好、活性保持率高、无免疫原性和脂溶性提高等优点。脂肪链修饰药用蛋白多肽的研究主要涉及新型药物开发、药物的安全有效性评价以及过程工程的相关研究。目前对于过程工程的研究相对薄弱，而这一问题却是制约其产业化应用的瓶颈。脂肪链修饰蛋白多肽类药物的过程主要存在如下问题：第一，亲水性多肽和疏水性脂肪链修饰剂之间的传质效率较低，直接导致修饰反应效率较低；第二，脂肪链修饰药物的制备工艺以传统的间歇操作为主，生产效率较低，批次间不稳定性较大，是工艺扩大的阻碍之一；第三，所用的分离纯化手段基本以色谱手段为主，效率较低、成本较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于脂肪链修饰GLP-1受体激动剂类多肽的高效、节能且易于放大的连续制备方法。

本发明所述的连续制备方法包括微反应器内连续合成脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽和下游修饰产物的分离工艺。针对GLP-1受体激动剂类多肽的巯基或氨基采用特异性修饰剂，如脂肪链马来酰亚胺、脂肪链琥珀酰亚胺或脂肪醛，通过微反应器系统，实现连续合成脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽，之后向粗品溶液中加入缓冲液，以沉淀法实现修饰产物脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽的分离。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案通过如下方案实施：

一种利用微反应器连续制备脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽的方法，其主要包括如下步骤：

(i)在传统间歇反应器内确定脂肪链修饰剂修饰GLP-1受体激动剂类多肽的工艺参数；

(ii)设计并构建由泵、微混合器以及微通道组成的微反应器系统，在步骤(i)确定的工艺参数下实现微反应器内连续合成脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽，得到粗品溶液；

(iii)利用脂肪链修饰剂与脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽在缓冲液中溶解性的差异，向步骤(ii)制备的粗品溶液中加入缓冲液，使脂肪链修饰剂沉淀，经固液分离后取上清液，经浓缩得到脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽。

进一步地，基于以上技术方案，所述的脂肪链修饰剂是指羧基、羟基或胺基被活化的中长链脂肪酸、脂肪醇或脂肪胺，脂肪酸、醇或胺的碳原子数为8～36，活化基包括马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基和醛基。

进一步地，基于以上技术方案，所述的GLP-1受体激动剂类多肽包括天然GLP-1、艾塞那肽、利司那肽、利西拉来、阿必鲁肽和洛塞那肽。

进一步地，基于以上技术方案，步骤(ii)中合成脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽的具体步骤为：将脂肪链修饰剂溶于反应溶剂中，配制成均相溶液A；将GLP-1受体激动剂类多肽溶于反应溶剂中，配制成均相溶液B，将均相溶液A和均相溶液B分别同时泵入微反应器的微混合器中，混合均匀后通入微通道中反应。

进一步地，基于以上技术方案，所述反应溶剂为缓冲液和有机溶剂的混合溶液，其中缓冲液包括磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液，有机溶剂包括甲醇、乙醇、乙腈、二甲基亚砜(DMSO)；缓冲液在反应溶剂种的体积百分比为10％～60％。

进一步地，基于以上技术方案，均相溶液A中脂肪链修饰剂的浓度为0.1～5mg/mL；均相溶液B中GLP-1受体激动剂类多肽的浓度为0.5～10mg/mL；脂肪链修饰剂和GLP-1受体激动剂类多肽的反应摩尔比为20∶1～1∶1。

进一步地，基于以上技术方案，均相溶液A泵入微反应器的流量为0.05～1.5mL/h；均相溶液B泵入微反应器的流量为0.05～1.5mL/h。

进一步地，基于以上技术方案，泵包括注射泵、蠕动泵；微混合器为Y型微混合器或T型微混合器，微混合器的内径尺寸范围为0.01～0.2cm；微通道的内径尺寸范围为0.01～0.2cm。

进一步地，基于以上技术方案，所述反应的条件为反应温度为0～50℃，反应停留时间为2～10h。

进一步地，基于以上技术方案，步骤(iii)加入的缓冲液占总体系的体积百分比为70％～95％。

进一步地，基于以上技术方案，步骤(iii)中固液分离可采用离心、膜过滤、压滤或抽滤。

进一步地，基于以上技术方案，步骤(iii)所述的浓缩包括但不限于蒸馏、透析。

本发明另一方面提供由上述方法制备得到的脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽。

本发明的连续制备工艺与现有工艺相比，存在的优势至少在于：

(1)本发明利用微反应器进行脂肪链修饰剂修饰GLP-1受体激动剂类多肽的反应，可以实现脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽的连续制备，提升修饰反应的传质传热效率，提高反应效率；与传统反应器相比，微反应器在传质传热、过程控制以及工艺放大方面均有很大优势，微反应器中微米级的通道使所形成的液滴大小等于或小于通道内的特征尺寸，提高了两相间的比表面积，从而强化了传质传热效率；微反应器所组成的系统，可实现高度集成，对反应条件可以在线控制，使生产工艺的过程高度可控；传统反应器的工艺放大需要经过小试、中试到放大的过程，此过程中各工艺参数也会随之变化，而微反应器所涉及到的放大是并行放大，工艺放大过程只是微反应器数量的增加，其它条件基本不变。除此之外，微反应器更加安全环保，可实现生产过程的连续操作以及生产过程的高度可控；这些优势有效地解决脂肪链修饰剂修饰GLP-1受体激动剂类多肽效率低的问题。

(2)本发明利用疏水性脂肪链修饰剂、亲水性蛋白多肽药物和脂肪链修饰产物在缓冲液中溶解性的差异，采用沉淀法的方式进行脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽的分离纯化，代替现有色谱分离技术，降低了药物生产过程中的分离成本，提高了分离工艺的生产效率。

(3)本发明对其它蛋白多肽类药物的脂肪链修饰具有通用性。

附图说明

图1为C₁₄-MAL的¹H-NMR分析结果。

图2为C₁₄-MAL修饰LOX反应混合物的RP-HPLC分析。

图3为微反应器的实物图。其中A是双通道注射泵，B和C为装有反应溶液的注射器，D是微混合器，E是微通道。

图4为不同内径尺寸的微反应器与传统间歇反应器的反应效率对比。

图5为0.02英寸微反应器40h产能变化图。

图6为沉淀法分离C₁₄-LOX的实物图。

图7为上清液(A)与沉淀物(B)的RP-HPLC分析。

具体实施方式

为了更清楚地展现本发明的技术方案及其所获得的突出技术效果，以下将通过实施例详细叙述本发明的具体实施方式，但具体实施方式不应理解为对本发明的限制。如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂均可从化学试剂公司购买，所用化学试剂均为分析纯。本实施例中所述的洛塞那肽(LOX)原料(纯度大于95％)来自江苏豪森药业集团有限公司。

本发明中反应物与修饰产物的分析方法如下：

合成的脂肪链洛塞那肽粗品中的洛塞那肽和脂肪链洛塞那肽的含量，以及脂肪链马来酰亚胺和脂肪链洛塞那肽的纯度都采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测。使用的色谱柱为德国Merck公司的LiChrospher 100RP-18(250mm×4.0mm，5μm)，流动相A是含0.05％(v/v)三氟乙酸的纯水，流动相B是含0.05％(v/v)三氟乙酸的乙腈，紫外检测波长210nm。在40％B的条件下进样，进样量40μL，流速1mL/min。洗脱梯度为：0-60min使用40-100％的B梯度洗脱。所用三氟乙酸和乙腈试剂均为色谱纯。

反应产物的得率计算公式为：

实施例1十四碳脂肪链修饰剂的合成与制备

针对LOX的巯基合成十四碳的脂肪链特异性修饰剂。其合成过程如下：取2.295g(23.45mmol)马来酸酐溶于5mL无水二氯甲烷，加到50mL三颈烧瓶中。将5g(23.45mmol)十四胺溶于10mL无水二氯甲烷，并逐滴加入三颈烧瓶中，40℃回流30分钟(部分固化)。冷却后抽滤并用冷的无水二氯甲烷洗两遍，烘干，得白色固体(N-十四烷基马来酸)4.81g。取4g(12.8mmol)N-十四烷基马来酸和0.72g(8.8mmol)醋酸钠溶于15mL乙酸酐中，加到100mL圆底烧瓶中，100℃加热两个小时，冷却后加入50mL水，在分液漏斗中静置，用乙醚洗两遍(2×30mL)，用2％KOH溶液洗两遍(2×30mL)，再用30mL水洗一遍，取出有机相，旋干后溶于20mL二氯甲烷中，用MgSO₄干燥，过滤，旋干后得到十四烷马来酰亚胺粗产物3.197g，再用YMC制备液相色谱柱(YMC-Pack ODS-A，20mm×250mm，10μm)进行分离纯化，分离条件参考RP-HPLC分析方法。将纯化样品溶于氘代甲醇中，用500MHz核磁共振仪检测纯品各氢原子的化学位移，确定其化学结构，结果如图1所示，表明合成产物是十四碳脂肪链马来酰亚胺(1-十四烷基-1H-吡咯-2，5-二酮，C₁₄-MAL)。

十四碳脂肪链马来酰亚胺(C₁₄-MAL)的反应方程如式(1)所示：

实施例2传统间歇反应器中C₁₄-MAL修饰LOX

使用纯化后的C₁₄-MAL在传统间歇反应器(试管中)筛选不同的反应溶剂体系从而实现与LOX反应，如水-甲醇/乙醇体系。以水-甲醇(1∶9，v/v)为例，构建1mL反应体系，使用PBS水溶液-甲醇(1∶9，v/v)混合溶液为反应溶剂，pH为6.07，C₁₄-MAL/LOX摩尔比为5∶1，在20℃下反应2h。具体过程为：在2mL试管中加入10mg/mL的LOX的PBS水溶液(pH＝6.07)0.1mL，加入1mg/mL的C₁₄-MAL甲醇溶液0.35mL，再加入0.55mL的甲醇溶剂，在转速为200rpm、温度为20℃的摇床中反应4h后加入1M的DTT溶液50μL，用以结束反应。反应结束后使用液相色谱检测，结果如图2所示。由此可知，可检测到修饰产物十四碳脂肪链洛塞那肽(C₁₄-LOX)，说明在PBS水溶液-甲醇(1∶9，v/v)混合溶液中实现了C₁₄-MAL修饰LOX的反应。

C₁₄-MAL修饰LOX的反应方程如式(2)所示：

实施例3微反应器的构建与应用微反应器制备C₁₄-LOX

图3是构建的微反应器，其中A是双通道注射泵，B和C为分别装有C₁₄-MAL和LOX的反应溶液的注射器，D是内径为1/16英寸(0.158cm)的微混合器，E是内径0.04英寸(0.1cm)的微通道，其中注射器到微混合器的容积为0.22mL，微通道的容积是1.5mL。在微反应器中连续合成C₁₄-LOX，使用PBS水溶液-甲醇(1∶9，v/v)混合溶液为反应溶剂，pH为6.07，C₁₄-MAL/LOX摩尔比为5∶1，在20℃下反应4h。

反应过程如下：配制2mg/mL的LOX溶液(PBS水溶液-甲醇，1∶9)和0.70mg/mL C₁₄-MAL溶液(PBS水溶液-甲醇，1∶9)，各取2mL至注射器中，将注射器固定在注射泵中。注射泵首先以0.22mL/min的流速运行1min，使反应流体流至微混合器处，之后以0.19mL/h的流速运行，保证反应4h。在通道出口处设置有50μL DTT溶液(1M)的2mL试管，收集反应混合物1mL用来检测。

实施例4不同内径尺寸微反应器与传统间歇反应器的反应效率对比

使用0.04英寸(0.1cm)和0.02英寸(0.5mm)两种尺寸内径的微通道进行反应，其它反应条件不变，分别反应0.5、1、2、4、6、8、10、12h(通过控制流速控制反应时间)。以传统间歇反应器中的反应作为对比，考察在不同内径尺寸微反应器中反应效率的差异。具体实验方法参照实例2和实例3。结果如图4所示，在传统间歇反应器中反应10h时，反应产物得率为94.5％；在0.04英寸的微反应器中反应8h，反应产物得率高达96.0％；在0.02英寸的微反应器中反应4h，反应产物得率达到95.7％。可以看出，在相同条件下，微反应器内径尺寸越小，修饰反应时间越短，并且能够保持较高的反应效率。

实施例5微反应器中连续合成C₁₄-LOX

由实例4可知在0.02英寸的微反应器中反应4h基本可完成反应，反应产物得率为95.7％，因此选择在0.02英寸微反应器中连续合成C₁₄-LOX。参考实例3中实验条件，配制2mg/mL的LOX溶液(PBS水溶液-甲醇，1∶9)和0.70mg/mL C₁₄-MAL溶液(PBS水溶液-甲醇，1∶9)，各取8mL至注射器中，将注射器固定在注射泵中。注射泵首先以0.22mL/min的流速运行1min，使反应流体流至微混合器处，之后以0.19mL/h的流速运行40小时，如图5所示，列出了40小时内生产强度情况。

由图5可知，在运行4小时后，微反应器内C₁₄-LOX的平均产能为0.42mg/h，积分可知微反应器40小时可生产16.36mg C₁₄-LOX。对比实例2中传统间歇反应器，其10小时完成一批反应，平均产能为0.16mg/h，40小时可生产6.51mgC₁₄-LOX。在40小时内0.02英寸微反应器稳定运行后的产能是传统间歇反应器的2.6倍，显著提高了C₁₄-LOX的生产效率。

实施例6沉淀法分离反应产物

收集实例5中微反应器连续合成的C₁₄-LOX粗品溶液，通过增加水相的比例实现C₁₄-LOX与C₁₄-MAL及其水解产物的分离。用2mL试管在微反应器出口处收集反应产物，并增加试管中水相比例分别为30％、50％、70％和90％(v/v)，结果如图6所示。当水相比例超过70％时，溶液出现沉淀。经12000rpm离心10min，减压蒸馏浓缩后，进行液相色谱分析，结果如图7所示。沉淀部分为C₁₄-MAL及其水解产物，上清部分是C₁₄-LOX，收率为94.0％，纯度为93.1％，实现了反应产物C₁₄-LOX的有效分离。

Claims (7)

1.一种利用微反应器连续制备脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽的方法，其特征在于，主要包括如下步骤：

（i）在传统间歇反应器内确定脂肪链修饰剂修饰GLP-1受体激动剂类多肽的工艺参数；所述的脂肪链修饰剂是指羧基、羟基或胺基被活化的中长链脂肪酸、脂肪醇或脂肪胺，所述脂肪酸、脂肪醇或脂肪胺的碳原子数为8~36，活化基包括马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基和醛基；所述的GLP-1受体激动剂类多肽包括天然GLP-1、艾塞那肽、利司那肽、利西拉来、阿必鲁肽和洛塞那肽；

（ii）设计并构建由泵、微混合器以及微通道组成的微反应器系统，在步骤（i）确定的工艺参数下实现微反应器内连续合成脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽，得到粗品溶液；步骤（ii）中合成脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽的具体步骤为：将脂肪链修饰剂溶于反应溶剂中，配制成均相溶液A；将GLP-1受体激动剂类多肽溶于反应溶剂中，配制成均相溶液B，将均相溶液A和均相溶液B分别同时泵入微反应器的微混合器中，混合均匀后通入微通道中；

（iii）利用脂肪链修饰剂与脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽在缓冲液中溶解性的差异，向步骤（ii）制备的粗品溶液中加入缓冲液，使脂肪链修饰剂沉淀，经固液分离后取上清液，经浓缩得到脂肪链-GLP-1受体激动剂类多肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应溶剂为缓冲液和有机溶剂的混合溶液，其中缓冲液包括磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和甘氨酸-盐酸缓冲液，有机溶剂包括甲醇、乙醇、乙腈以及二甲基亚砜；缓冲液在反应溶剂中的体积百分比为10%~60%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，均相溶液A中脂肪链修饰剂的浓度为0.1~5mg/mL；均相溶液B中GLP-1受体激动剂类多肽的浓度为0.5~10 mg/mL；脂肪链修饰剂和GLP-1受体激动剂类多肽的反应摩尔比为20:1~1:1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，均相溶液A泵入微反应器的流量为0.05~1.5 mL/h；均相溶液B泵入微反应器的流量为0.05~1.5 mL/h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述泵包括注射泵、蠕动泵；微混合器为Y型微混合器或T型微混合器，微混合器的内径尺寸范围为0.01~0.2 cm；微通道的内径尺寸范围为0.01~0.2cm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连续合成的条件为反应温度0~50℃，反应停留时间2~10h。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤（iii）中加入的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和甘氨酸-盐酸缓冲液，最终缓冲液占总体系的体积百分比为70%~95%；固液分离包括离心、膜过滤、压滤或抽滤；所述的浓缩包括减压蒸馏、透析。

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