CN113466384A - 一种全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法 - Google Patents
一种全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法，通过全血样本离心分离获得血细胞，将血细胞制备为溶血液，并通过重组羧肽酶B水解作用，血红蛋白在β链N末端第二个氨基酸残基(His)处断开，得到糖基化HbA1c二肽和非糖基化HbA0二肽，这些二肽以HPLC‑MS/MS进行分离定量，以HbA1c二肽标准品及HbA0二肽标准品混合物作为校准品，进行分离定量，得到标准曲线，根据HbA1c二肽和HbA0二肽的峰面积计算出其含量。该检测方法所需样本量少、灵敏度高、特异性强、重现性好、分析时间短，可为临床诊断提供可靠依据。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法。
背景技术
糖化血红蛋白(Hemoglobin A1c；HbA1c)是人体血液中葡萄糖与血红蛋白β链N末端缬氨酸残基以共价键结合的稳定的化合物，全称为：血红蛋白β链(血液)-N-(1-脱氧果糖-1-基)血红蛋白β链。HbA1C由葡萄糖的游离醛基与HbA的β链N末端缬氨酸的氨基经非酶促结合反应，先形成不稳定的Schiff碱(醛亚胺)，然后经过Amadori(葡糖胺)重排，最后形成稳定的酮胺化合物，其含量主要取决于血糖浓度及血糖与血红蛋白的接触时间，可以反映测定前120d的平均血糖水平。目前，临床定量测定及应用的是HbA1C结果[1]。
国际临床化学与医学实验室联盟(International Federation of ClinicalChemistry and Laboratory Medicine，IFCC)：测定HbA1C国际公认的参考方法为IFCC推荐的高效液相色谱串联电喷雾电离一级质谱或高效液相色谱串联毛细管电泳，两种方法结果一致。测定方法主要分为三步：首先制备溶血液；然后采用蛋白内切酶Glu-C将溶血液酶解消化，得到糖基化和非糖基化的β链N末端六肽(HbA1c六肽，HbA0六肽)；最后采用高效液相色谱串联电喷雾电离一级质谱或高效液相色谱串联毛细管电泳对HbA1c六肽和HbA0六肽进行定量分析。以标准物质IRMM/IFCC-466HbA1c和IRMM/IFCC-467HbA0的混合物作为校准品，同步进行酶解，分析，得到标准曲线，根据HbA1c六肽，HbA0六肽的峰面积比计算得出HbA1c的含量[1]。经过Glu-C内切酶的水解作用，血红蛋白在β链N末端第6个氨酸残基(Glu)处断开，得到糖基化HbA1C六肽和非糖基化HbA0六肽，即：C4H9O4-CO-CH2-NH-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-COOH和NH2-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-COOH[2]。该参考方法具有准确度高，重复性好等优点，但前处理操作复杂，耗时长且测定成本高昂。
参考文献：
[1]中华人民共和国卫生行业标准WS/T 461—2015
[2]王冬环等，柱前衍生高效液相色谱测定糖基化血红蛋白，中国实验诊断学，2015年12月底19卷底12期
发明内容
为解决现有质谱法测定全血糖化血红蛋白操作复杂、耗时长、成本高昂的技术问题，本发明所提供一种全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法，该方法包括：将待测全血样本制备成溶血液，用重组羧肽酶B将溶血液酶解，然后用HPLC-MS/MS进行分离定量分析，并以HbA0二肽标准品和HbA1c二肽标准品的混合物作为校准品，用HPLC-MS/MS进行分离定量分析，绘制标准曲线，用待测全血样本中的HbA1c二肽和HbA0二肽的峰面积值，通过标准曲线计算得出待测全血样本中的HbA1c和HbA0二肽的浓度，再用以下计算公式计算得到待测全血样本中的HbA1c的含量，单位为质量百分数，计算公式为：待测全血样本中的HbA1c含量＝HbA1c二肽浓度/(HbA1c二肽浓度+HbA0二肽浓度)×100％，公式中，HbA1c二肽浓度表示待测全血样本中HbA1c二肽的浓度，HbA0二肽浓度表示待测全血样本中HbA0二肽的浓度。
进一步，所述待测全血样本制备成溶血液过程包括：用移液枪移取100μL全血样本于1.5mL塑料离心管中，于5600r/min 8℃离心10min后弃血浆，取出弃血浆后的血细胞10μL于新的1.5mL塑料离心管中，加入10μL纯水后1500r/min匀30s，再加入200μL储备缓冲溶液后于1500r/min旋混匀1min即制成溶血液。
所述储备缓冲溶液按如下方法配制而得：移液器取1mol/Lβ吗啉乙磺酸溶液，0.5mol/L碳酸氢钠溶液，1mol/L Na2-EDTA溶液，加纯水定容至100mL混匀，使β吗啉乙磺酸终浓度为50mmol/L、NaHCO3终浓度为25mmol/L、Na2-EDTA终浓度1mmol/L，PH值为6.2即为储备缓冲溶液。
进一步，所述用重组羧肽酶B将溶血液酶解过程包括：将盛有溶血液的塑料离心管于12000r/min高速离心10min后，取出5μL上层液于另一支新的1.5mL塑料离心管中，加入15μL浓度为200μg/mL的重组羧肽酶B溶液，加入200μL消化缓冲溶液于37℃水浴2h，再于-20℃冻存10min后取100μL溶液进行HPLC-MS/MS分离定量分析，进样量为1μL。
所述消化缓冲溶液按如下方法配制而得：
精密称量碳酸氢钠1.68g，置于15mL离心管中，加入10mL纯水溶解，振荡混匀，得到2mol/L碳酸氢钠溶液，移液器取2mol/L碳酸氢钠溶液2.5mL加纯水定容至100mL，混匀，测量其PH，用乙酸调节其PH值到8.0即为消化缓冲溶液，4℃保存。
进一步，所述校准品配制包括：取6支离心管，每支离心管均加入15μl浓度为200μg/mL的重组羧肽酶B溶液和230μl消化缓冲溶液混匀，然后各试管分别加入不同浓度的含有HbA0二肽标准品和HbA1c二肽标准品的标曲储备液5μl，使HbA0二肽标准品和HbA1c二肽标准品的终浓度如下的6份标曲工作液即为6份校准品：
校准品1：含0.3125μg/mL的HbA0二肽标准品和0.03125μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液；
校准品2：含0.625μg/mL的HbA0二肽标准品和0.0625μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液；
校准品3：含1.25μg/mL的HbA0二肽标准品和0.125μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液；
校准品4：含2.5μg/mL的HbA0二肽标准品和0.25μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液；
校准品5：含5μg/mL的HbA0二肽标准品和0.5μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液；
校准品6：含10μg/mL的HbA0二肽标准品和1μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液。
所述消化缓冲溶液与上述所述的消化缓冲溶液相同。
进一步，所述不同浓度的含有HbA0二肽标准品和HbA1c二肽标准品的标曲储备液按如下方法制备得到：分别取浓度1000μg/mL的HbA0二肽标准品储备液和浓度1000μg/mL的HbA1c二肽标准品储备液混合并用纯水稀释成含有HbA0二肽标准品和HbA1c二肽标准品的如下不同终浓度的标曲储备液6份，分别为：
含500μg/mL HbA0二肽标准品和50μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液；
含250μg/mL HbA0二肽标准品和25μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液；
含125μg/mL HbA0二肽标准品和12.5μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液；
含62.5μg/mL HbA0二肽标准品和6.25μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液；
含31.25μg/mL HbA0二肽标准品和3.125μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液；
含15.625μg/mL HbA0二肽标准品和1.5625μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液。
进一步，所述HPLC-MS/MS分析中采用以下色谱条件和质谱条件：
色谱条件：色谱柱：ZORBAX SB-CN(2.1mm×150mm,5μm)，柱温：35℃，流动相A：0.2％甲酸水溶液，流动相B：乙腈，进样量：1μL，流速：0.35mL/min，流动相比例：95％B,5％A等度洗脱，洗脱时间为4.5min；
质谱条件：离子源模式为ESI源正离子模式，扫描方式：RMR，雾化气流量：3L/min；加热气流量：10L/min；接口温度：350℃；DL温度：150℃；加热块温度：350℃；干燥气流量：10L/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明方法所需样本量极少、灵敏度高、特异性强、重现性好、分析时间短，操作简便，可为临床诊断提供可靠依据。具体体现：
(1)本发明通过重组羧肽酶B的特异性水解作用，将糖化血红蛋白在血红蛋白β链N末端第2个氨基酸残基(His)处断开，得到糖基化HbA1c二肽(C4H9O4-CO-CH2-NH-Val-His-COOH)和非糖基化HbA0二肽(NH2-Val-His-COOH)，以及采用合理的HPLC-MS/MS定量分析参数及标准品、前处理等技术手段，能快速测定出待测全血糖化血红蛋白的质量百分含量，所需样本量极少，10μl血细胞即可满足要求。
(2)本发明通过重组羧肽酶B特异性水解作用，大大提高了水解效率，37℃2h即能完全水解，缩短了前处理时间，检测时间大大缩短，提高了检验效率。与其它质谱法测定糖化血蛋白的方法相比，更具优势，其中主要包括前处理时间短，分析时间短，检测效率高，耗材成本低，更适用于临床检验实验室批量操作。
(3)本发明采用的高效液相色谱柱的分离合理参数，以及质谱特征离子的选择使得实验过程中干扰降低，具有良好的特异性，能够确保检测精度，为临床诊断提供可靠依据。
本发明与IFCC参考方法相比具有如下优点:
1.前处理步骤简单：IFCC方法前处理需温浴4小时洗涤红细胞两次，加V8蛋白酶水解红细胞需温浴18小时，而本发明无需温浴洗涤红细胞，且加重组羧肽酶B水解红细胞只需水解2小时。前处理步骤简单且所需时间大大缩短。
2.上机分析时间短：IFCC方法单个样本分析时间长达23min，而本发明只需4.5min便可分析单个样本。
3.精密度高：IFCC方法采用一级质谱(HPLC-MS)进行分析采用母离子扫描模式，而本发明采用二级质谱(HPLC-MS/MS)进行分析，采用RMR模式进行扫描，提高了实验精密度及灵敏度。
4.检测成本低：本发明所使用的重组羧肽酶B价格相比V8蛋白酶更低(目前市售重组羧肽酶B价格为399元每毫克，而V8蛋白酶为1800元每毫克)。
(4)本发明适用于人全血样本中糖化血红蛋含量测定，已经在正常人以及糖尿病患者中经过验证，能准确反映出人全血样本中糖化血红蛋白所占血红蛋白比例，以辅助相关疾病的诊断。
(5)本发明不受样本溶血以及样本运输时间及运输条件影响，样本可在常温保存7天，-20℃放置三个月以上仍能反映其真实浓度。
附图说明
图1：试剂空白质谱图。
图2：HbA0二肽标准品的标准曲线谱图，图2中横坐标是HbA0二肽标准品的浓度(μg/mL)，纵坐标是HbA0二肽标准品的色谱峰面积。
图3：HbA1c二肽标准品的标准曲线谱图，图2中横坐标是HbA1c二肽标准品的浓度(μg/mL)，纵坐标是HbA1c二肽标准品的色谱峰面积。
图4：待测全血样本中HbA1c二肽色谱图。图4中横坐标是待测全血样本中HbA1c二肽分析时间(min)，纵坐标是待测全血样本中HbA1c二肽仪器响应值(mv)。
图5：待测全血样本中HbA0二肽色谱图。图5中横坐标是待测全血样本中HbA0二肽分析时间(min)，纵坐标是待测全血样本中HbA0二肽仪器响应值(mv)。
图6：待测全血样本中HbA1c二肽质谱图。图6横坐标是待测全血样本中HbA1c二肽质荷比(m/z)，纵坐标是待测全血样本中HbA1c二肽仪器响应值(mv)。
图7：待测全血样本中HbA0二肽质谱图。图7中横坐标是待测全血样本中HbA0二肽质荷比(m/z)，纵坐标是待测全血样本中HbA0二肽仪器响应值(mv)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，各实施例所用试剂及设备均为市售，各实施例中无特殊说明的为本领域的常规方法。
术语：
HbA1c为糖化血红蛋白。
HbA0为非糖化血红蛋白。
HbA1c二肽为糖化血红蛋白在β链N末端第2个氨基酸残基(His)处断开的二肽化合物。
HbA0二肽为血红蛋白在β链N末端第2个氨基酸残基(His)处断开的二肽化合物。
HPLC-MS/MS：是高效液相色谱串联质谱法的简称(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)。
试剂与主要仪器
试剂(见表1)：
表1试剂信息
主要仪器设备：
检测设备：岛津高效液相色谱串联质谱仪8045(LCMS-8045)
检测环境要求：湿度为20～80％；温度为15～28℃
检测试剂如无特殊要求均为色谱纯。
实施例 本发明提供的一种全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法
本实施案例适用于全血中糖化血红蛋白含量测定。试验之前需要进行全血样本、检测设备及检测试剂的准备工作。具体操作如下：
1绘制标准曲线
1.1标曲储备液配制：
1.1.1标准品储备液的配制：
分别精密称取3mg HbA0二肽标准品及3mg HbA1c二肽标准品，分别以3mL纯水溶解，用纯水分别配制成1000μg/mL浓度的HbA0二肽标准品储备液和1000μg/mL浓度的HbA1c二肽标准品储备液(按标准品纯度折算为不含盐及结晶水的纯品浓度)，-80℃保存。
1.1.2标曲储备液的配制：
分别取浓度1000μg/mL的HbA0二肽标准品储备液和浓度1000μg/mL的HbA1c二肽标准品储备液混合并用纯水稀释成含有HbA0二肽标准品和HbA1c二肽标准品的如下不同终浓度的标曲储备液6份，分别记为L6、L5、L4、L3、L2、L1：
L6：含500μg/mL HbA0二肽标准品和50μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液；
L5：含250μg/mL HbA0二肽标准品和25μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液；
L4：含125μg/mL HbA0二肽标准品和12.5μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液；
L3：含62.5μg/mL HbA0二肽标准品和6.25μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液；
L2：含31.25μg/mL HbA0二肽标准品和3.125μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液；
L1：含15.625μg/mL HbA0二肽标准品和1.5625μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液。
1.1.3其它溶液配制：
1.1.3.1消化缓冲溶液(50mmol/L NaHCO3)配制：
精密称量碳酸氢钠1.68g，置于15mL离心管中，加入10mL纯水溶解，振荡混匀，得到2mol/L碳酸氢钠溶液，移液器取2mol/L碳酸氢钠溶液2.5mL加纯水定容至100mL，混匀，测量其PH，用乙酸调节其PH值到8.0即为消化缓冲溶液(50mmol/L NaHCO3)，4℃保存，待用。
1.1.3.2 200μg/mL重组羧肽酶B溶液的配制：精密称量分析纯重组羧肽酶B用纯水溶解和稀释配置成浓度为200μg/mL重组羧肽酶B溶液。
1.1.3.3储备缓冲溶液配制：移液器取5mL 1mol/Lβ吗啉乙磺酸(MES)溶液，5mL0.5mol/L碳酸氢钠溶液，100μL 1mol/L Na2-EDTA溶液，加纯水定容至100mL混匀，其溶液为含终浓度为50mmol/Lβ吗啉乙磺酸(MES)、25mmol/L NaHCO3、1mmol/L Na2-EDTA的混合液，用PH计测量其PH值，应为6.2，此溶液为储备缓冲溶液。
1.2标曲工作液的配制(即校准品)：
分别取步骤1.1.2所述的不同浓度的标曲储备液各5μl分别置于不同的1.5ml离心管中，各离心管中均加入15μl浓度为200μg/mL的重组羧肽酶B溶液和230μl消化缓冲溶液混匀分别配制为含HbA0二肽标准品和HbA1c二肽标准品的终浓度如下的各标曲工作液，所述标曲工作液即为校准品：
校准品1：含0.3125μg/mL的HbA0二肽标准品和0.03125μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液(对应地用上述标记为L1的标曲储备液配制)。
校准品2：含0.625μg/mL的HbA0二肽标准品和0.0625μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液(对应地用上述标记为L2的标曲储备液配制)。
校准品3：含1.25μg/mL的HbA0二肽标准品和0.125μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液(对应地用上述标记为L3的标曲储备液配制)。
校准品4：含2.5μg/mL的HbA0二肽标准品和0.25μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液(对应地用上述标记为L4的标曲储备液配制)。
校准品5：含5μg/mL的HbA0二肽标准品和0.5μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液(对应地用上述标记为L5的标曲储备液配制)。
校准品6：含10μg/mL的HbA0二肽标准品和1μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液(对应地用上述标记为L6的标曲储备液配制)。
1.3绘制标准曲线：
分别用步骤1.2所述的各校准品分别在岛津高效液相色谱串联质谱仪8045仪器上机用高效液相色谱串联质谱法进行分离定量检测，色谱和质谱检测参数条件如表2和表3所示，分别得到各校准品的HbA0二肽标准品的峰面积值和HbA1c二肽标准品的峰面积值。分别以各校准品中HbA0二肽标准品的浓度、HbA1c二肽标准品的浓度为横坐标，对应地以各校准品中HbA0二肽标准品的峰面积值和HbA1c二肽标准品的峰面积值为纵坐标分别绘制HbA0二肽标准品的标准曲线谱图(图2)、HbA1c二肽标准品的标准曲线谱图(图3)。
表2岛津高效液相色谱串联质谱仪8045的色谱条件和质谱条件
质谱扫描参数：(见表3)
表3 Q3 SIM参数设置表
在各校准品检测的同时，在其相同色谱、质谱条件下进行试剂空白检测，所述试剂是除标曲工作液中所有涉及的HbA0二肽标准品和HbA1c二肽标准品用量用纯水替代外，其余试剂成分及其用量、浓度与标曲工作液相同。其试剂空白质谱图如图1所示。
2待测全血样本中糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测
2.1待测全血样本处理：
2.1.1全血样本的采集：全血样本采集前，要消除病人的紧张心理，采血时要规范操作，并及时混匀。送检全血样本选用EDTA-Na2紫帽采血真空管抽取患者2mL血液。样本容器选择：无菌的一次性真空采血管(碧迪医疗器械(上海)有限公司)。
2.1.2待测全血样本制备成溶血液
用移液枪移取100μL全血样本于1.5mL塑料离心管中，于5600r/min 8℃离心10min后弃血浆，从该塑料离心管中取出血细胞10μL于新的1.5mL塑料离心管中，加入10μL纯水后1500r/min匀30s，加入200μL储备缓冲溶液后于1500r/min旋混匀1min即制成溶血液。
2.1.3酶解及上机检测
将盛有溶血液的塑料离心管于12000r/min高速离心10min后，取出5μL上层液于另一支新的1.5mL塑料离心管中，加入15μL 200μg/mL的重组羧肽酶B溶液，加入200μL消化缓冲溶液于37℃水浴2h，再于-20℃冻存10min后取100μL溶液进行HPLC-MS/MS分离定量分析，进样量1μL，色谱和质谱参数条件如表2和表3所示。
2.2计算浓度，本发明并通过重组羧肽酶B水解作用，待测全血样本溶血液中血红蛋白在β链N末端第2个氨基酸残基(His)处断开，得到糖基化HbA1c二肽(C4H9O4–CO-CH2-NH-Val-His-COOH)和非糖基化HbA0二肽(NH2-Val-His-COOH)，这些二肽采用HPLC-MS/MS进行分离定量，以HbA1c二肽标准品和HbA0二肽标准品混合物作为校准品，并用HPLC-MS/MS对校准品进行分离定量分析，绘制标准曲线，用待测全血样本中HbA1c二肽色谱峰面积值和HbA0二肽的色谱峰面积(图4、图5)通过标准曲线计算出待测全血样本中HbA1c二肽和HbA0二肽的浓度，浓度单位为ug/ml，再以如下计算公式计算得到待测全血样本中HbA1c含量，报告结果单位为质量百分数。具体如图4、图5可知，待测全血样本中HbA1c二肽色谱峰面积值为1488657(仪器显示)，待测全血样本中HbA0二肽的色谱峰面积值为62527081(仪器显示)，通过标准曲线图2、图3，对应输入前述色谱峰面积值，计算(仪器自动计算)出待测全血样本中HbA1c二肽的浓度为0.150μg/mL和HbA0二肽的浓度为2.893μg/mL，再以如下计算公式计算得到待测全血样本中HbA1c含量为4.93％(质量百分数)。
计算公式：待测全血样本中HbA1c含量(％)＝HbA1c二肽浓度/(HbA1c二肽浓度+HbA0二肽浓度)×100％，公式中HbA1c二肽浓度表示待测全血样本中HbA1c二肽的浓度(单位为μg/mL，根据标准曲线计算得到)；HbA0二肽浓度表示待测全血样本中HbA0二肽的浓度(单位为μg/mL，根据标准曲线计算得到)。
3方法学验证
3.1日内日间精密度
3.1.1实验目的
考察实验方法的稳定性
3.1.2实验方法
取3份不同人全血样本标注为样本1、样本2、样本3，按步骤2.1待测全血样本处理，每份样本每次平行处理5份，同一天测三批计算日内精密度；此3份样本每份样本每次平行处理5份,连续测定三天计算日间精密度，色谱和质谱参数条件如表2和表3所示。
3.1.3实验结果(表4)
表4方法精密度测定结果
3.1.4实验结论
实验结果日内日间精密度相对标准偏差RSD<6.5％，符合生物样本测定RSD<15％要求。
3.2加标回收率
3.2.1实验目的
通过对加标样品的回收率考察实验结果的准确性。
3.2.2实验方法
3.2.2.1溶血液制备:取正常人全血样本200μl经5600r/min 8℃离心10min去血浆后取50μl血细胞，加50μl纯水混匀，加入1mL储备缓冲液，混匀，12000r/min8℃速离心10min后，得到溶血液。
3.2.2.2加标:取三支1.5ml离心管，分别加入步骤1.1.2中所述的L1标曲储备液8μl，L3标曲储备液8μl，L4标曲储备液8μl,然后三支离心管均加入上述步骤3.2.2.1所述的溶血液192μl，于1500r/min混匀1min得3个加标液，其理论加标液浓度为低浓度(0.625μg/mLHbA0、0.0625μg/mL HbA1c)、中浓度(2.5μg/mL HbA0、0.25μg/mL HbA1c)和高浓度(5μg/mLHbA0、0.5μg/mL HbA1c)，加标平行样本各5份，分别取出5μL加标液于1.5mL塑料离心管中，均加入15μL 200μg/mL重组羧肽酶B和200μL消化缓冲液，1500r/min混匀1min后于37℃水浴2h，取出于-20℃冻存10min后，每份均取100μL进HPLC-MS/MS分析，进样量1μL，色谱和质谱参数条件如表2和表3所示。
3.2.3实验结果(表5)
表5回收率实验结果
表5中空白样本是3.2.2.1所术正常人全血样本。
3.2.4实验结论
由实验结果可知三个加标浓度的回收率均为95～115％之间，且相对标准偏差RSD<6.0％，满足方法学验证回收率为85～120％之间,RSD<15.0％的要求。
3.3标准曲线
3.3.1实验目的
验证本方法的线性范围
3.3.2实验方法
按照步骤1所述方法绘制标准曲线，进样分析，一共分析4批。
3.3.3实验结果(表6)
表6标准曲线验证结果
3.3.4实验结论
标曲线性范围：由1.2、1.3及3.3.3看出，HbA0二肽标准品在0.3125μg/mL到10μg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.999；HbA1c二肽标准品在0.03125μg/mL到1μg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.999；满足方法学R2﹥0.990要求。
3.4定量下限
3.4.1实验目的
考察样品在定量下限附近时的检测准确度
3.4.2实验方法
按照步骤2.1.1-2.1.3所述方法取正常人全血样本平行处理五份，并计算五份样本的平均浓度值及对应的S/N(信噪比)值，再根据已知的S/N值对全血样本进行稀释，并平行处理五份，使稀释后的样本所对应的S/N值等于10左右，此时所对应的浓度值为定量限。
3.4.3实验结果(表7)
表7定量限验证结果
3.4.4实验结论
定量限(LOQ)：HbA0二肽0.12μg/mL，HbA1c二肽0.024μg/mL；线性范围：HbA0二肽在0.3125μg/mL到10μg/mL范围内，HbA1c二肽在0.03125μg/mL到1μg/mL，线性良好，满足以10倍信噪比(10S/N)作为定量限(LOQ)的要求。
综合上述验证实验，本发明方法的前处理时间短(整个前处理时间为2.5～3.0小时),上机检测分析时间短(每个样本检测所需时间4.5min),精密度高(日内精密度RSD最大值6.41％，日间精密度RSD最大值4.48％)，稳定性好(回收率均为95～115％之间，相对标准偏差RSD<6.0％)，灵敏度高(定量限0.12μg/mL)，特异性强(HbA0二肽母离子288.6m/z，子离子110.1m/z，HbA1c二肽母离子408.3m/z，子离子263.1m/z)、从而满足了临床糖化血红蛋白测定的需要。
Claims (6)
1.一种全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法，其特征在于，将待测全血样本制备成溶血液，用重组羧肽酶B将溶血液酶解，然后用HPLC-MS/MS进行分离定量分析，并以HbA0二肽标准品和HbA1c二肽标准品的混合物作为校准品，用HPLC-MS/MS进行分离定量分析，绘制标准曲线，用待测全血样本中的HbA1c二肽和HbA0二肽的峰面积值，通过标准曲线计算得出待测全血样本中的HbA1c和HbA0二肽的浓度，再用以下计算公式计算得到待测全血样本中的HbA1c的含量，单位为质量百分数，计算公式为：待测全血样本中的HbA1c含量＝HbA1c二肽浓度/(HbA1c二肽浓度+HbA0二肽浓度)×100％，公式中，HbA1c二肽浓度表示待测全血样本中HbA1c二肽的浓度，HbA0二肽浓度表示待测全血样本中HbA0二肽的浓度。
2.根据权利要求1所述的全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法，其特征在于，所述待测全血样本制备成溶血液过程包括：用移液枪移取100μL全血样本于1.5mL塑料离心管中，于5600r/min 8℃离心10min后弃血浆，取出弃血浆后的血细胞10μL于新的1.5mL塑料离心管中，加入10μL纯水后1500r/min匀30s，再加入200μL储备缓冲溶液后于1500r/min旋混匀1min即制成溶血液；
所述储备缓冲溶液按如下方法配制而得：移液器取1mol/Lβ吗啉乙磺酸溶液，0.5mol/L碳酸氢钠溶液，1mol/L Na2-EDTA溶液，加纯水定容至100mL混匀，使β吗啉乙磺酸终浓度为50mmol/L、NaHCO3终浓度为25mmol/L、Na2-EDTA终浓度1mmol/L，pH值为6.2即为储备缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法，其特征在于，所述用重组羧肽酶B将溶血液酶解过程包括：将盛有溶血液的塑料离心管于12000r/min高速离心10min后，取出5μL上层液于另一支新的1.5mL塑料离心管中，加入15μL浓度为200μg/mL的重组羧肽酶B溶液，加入200μL消化缓冲溶液于37℃水浴2h，再于-20℃冻存10min后取100μL溶液进行HPLC-MS/MS分离定量分析，进样量为1μL；
所述消化缓冲溶液按如下方法配制而得：
精密称量碳酸氢钠1.68g，置于15mL离心管中，加入10mL纯水溶解，振荡混匀，得到2mol/L碳酸氢钠溶液，移液器取2mol/L碳酸氢钠溶液2.5mL加纯水定容至100mL，混匀，测量其pH，用乙酸调节其pH值到8.0即为消化缓冲溶液，4℃保存。
4.根据权利要求1所述的全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法，其特征在于，所述校准品配制包括：取6支离心管，每支离心管均加入15μl浓度为200μg/mL的重组羧肽酶B溶液和230μl消化缓冲溶液混匀，然后各试管分别加入不同浓度的含有HbA0二肽标准品和HbA1c二肽标准品的标曲储备液5μl，使HbA0二肽标准品和HbA1c二肽标准品的终浓度如下的6份标曲工作液即为6份校准品：
校准品1：含0.3125μg/mL的HbA0二肽标准品和0.03125μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液；
校准品2：含0.625μg/mL的HbA0二肽标准品和0.0625μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液；
校准品3：含1.25μg/mL的HbA0二肽标准品和0.125μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液；
校准品4：含2.5μg/mL的HbA0二肽标准品和0.25μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液；
校准品5：含5μg/mL的HbA0二肽标准品和0.5μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液；
校准品6：含10μg/mL的HbA0二肽标准品和1μg/mL的HbA1c二肽标准品的标曲工作液。
所述消化缓冲溶液与权利要求3中所述的消化缓冲溶液相同。
5.根据权利要求4所述的全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法，其特征在于，所述不同浓度的含有HbA0二肽标准品和HbA1c二肽标准品的标曲储备液按如下方法制备得到：分别取浓度1000μg/mL的HbA0二肽标准品储备液和浓度1000μg/mL的HbA1c二肽标准品储备液混合并用纯水稀释成含有HbA0二肽标准品和HbA1c二肽标准品的如下不同终浓度的标曲储备液6份，分别为：
含500μg/mL HbA0二肽标准品和50μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液；
含250μg/mL HbA0二肽标准品和25μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液；
含125μg/mL HbA0二肽标准品和12.5μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液；
含62.5μg/mL HbA0二肽标准品和6.25μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液；
含31.25μg/mL HbA0二肽标准品和3.125μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液；
含15.625μg/mL HbA0二肽标准品和1.5625μg/mL HbA1c二肽标准品的标曲储备液。
6.根据权利要求1所述的全血糖化血红蛋白含量液相色谱串联质谱定量检测方法，其特征在于，所述HPLC-MS/MS分析中采用以下色谱条件和质谱条件：
色谱条件：色谱柱：ZORBAX SB-CN(2.1mm×150mm,5μm)，柱温：35℃，流动相A：0.2％甲酸水溶液，流动相B：乙腈，进样量：1μL，流速：0.35mL/min，流动相比例：95％B,5％A等度洗脱，洗脱时间为4.5min；
质谱条件：离子源模式为ESI源正离子模式，扫描方式：RMR，雾化气流量：3L/min；加热气流量：10L/min；接口温度：350℃；DL温度：150℃；加热块温度：350℃；干燥气流量：10L/min。
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Citations (3)
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| CN1852987A (zh) * | 2003-09-18 | 2006-10-25 | 龟甲万株式会社 | 制备α－糖化二肽的方法和测定α－糖化二肽的量的方法 |
| US20070037243A1 (en) * | 2003-09-18 | 2007-02-15 | Kikkoman Corporation | Process for producing alpha-glycosylated dipeptide and method of assaying alpha-glycosylated dipeptide |
| CN103278574A (zh) * | 2013-04-26 | 2013-09-04 | 首都医科大学附属北京朝阳医院 | 利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测糖化血红蛋白的方法 |
-
2021
- 2021-08-12 CN CN202110921727.3A patent/CN113466384B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN1852987A (zh) * | 2003-09-18 | 2006-10-25 | 龟甲万株式会社 | 制备α－糖化二肽的方法和测定α－糖化二肽的量的方法 |
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| Title |
|---|
| KAISER P 等: "Modified HPLC-electrospray ionization/mass spectrometry method for HbA1c based on IFCC reference measurement procedure", 《CLINICAL CHEMISTRY》 * |
| 王冬环 等: "柱前衍生高效液相色谱测定糖化血红蛋白", 《中国实验诊断学》 * |
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