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CN113456834A - 一种基于胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的产品、应用及使用方法 - Google Patents

一种基于胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的产品、应用及使用方法 Download PDF

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CN113456834A
CN113456834A CN202110831492.9A CN202110831492A CN113456834A CN 113456834 A CN113456834 A CN 113456834A CN 202110831492 A CN202110831492 A CN 202110831492A CN 113456834 A CN113456834 A CN 113456834A
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CN
China
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mycobacterium
tuberculosis
protein
recombinant
fusion protein
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Application number
CN202110831492.9A
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孙超伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengdu Keen Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Chengdu Keen Biotechnology Co ltd
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Publication date
Application filed by Chengdu Keen Biotechnology Co ltd filed Critical Chengdu Keen Biotechnology Co ltd
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0006—Skin tests, e.g. intradermal testing, test strips, delayed hypersensitivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明公开了一种基于胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的产品及其应用，属于生物蛋白技术领域。通过胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白（EEC）联合使用，可快速（24h内）鉴别结核病和NTM病，当胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白（EEC）的迟发性超敏反应均呈全阳性时，为结核病；当胞内分支杆菌纯蛋白衍生物的迟发性超敏反应为呈阳性，重组结核杆菌融合蛋白（EEC）的迟发性超敏反应为呈阴性时，为NTM病。而提出一种基于胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的产品及其应用，进而快速鉴别结核病和NTM病，为患者的准确治疗方案提供可靠的依据。

Description

一种基于胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋 白的产品、应用及使用方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白产品及其应用，尤其涉及一种基于胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的产品、应用及使用方法，属于生物蛋白技术领域。
背景技术
结核病是一种严重危害人类和动物健康的慢性传染病，于2019年，全球结核病死亡人数140万。据WTO发布的2020全球结核病年度报告：2019年全球结核病发病人数估计1000万左右(890-1100万)；其中，印度264万，占26％；印尼84.6万，占8.5％；中国83.3万，占8.4％。中国结核病人数世界排名第三，为结核病高负担国家。
对于非结核分枝杆菌病(NTM病)，我国的流行病学数据表明，NTM病感染呈上升趋势；我国历次的结核病流行病学调查资料表明，在所有分枝杆菌病人分离株中，1990年NTM分离率为4.9％，2000年NTM分离率为11.1％，到2010年增加到22.9％。NTM感染是我国面临的重大公共卫生问题，NTM在中国的菌种分布有很大的地域差异性，总体分布特点是，沿海高于内地，南方高于北方，气候温和地区高于寒冷地区。
非结核分枝杆菌病(NTM病)与结核病的临床症状很接近，很容易被当作结核病来治疗，但两者的治疗方案是完全不同的，且NTM病抗药性非常强。
其中，NTM病的治疗方案包括：对于治疗结核病的异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)和吡嗪酰胺，NTM病耐药性很高。通常使用喹诺酮类，如：环丙沙星(Ciprofloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)或氟罗沙星(Fleroxacin)；大环内酯类，如：阿奇霉素(Agithromycin AZ)或克拉霉素(clarithromycin，Cear)；头孢菌素类，如：头孢酊(Cefoxintin，Cet)或头孢克肟(Cefixime)；氨基糖苷类，如：阿米卡星(丁氨卡那霉素AuiKacia，AM)、卷曲霉素(Capreomycin，Cap)、庆大霉素(Gentamicin，Gm)、利福布汀(Rifabutin，Rb)、环丝氨酸(Cycloserin，Cy)或乙硫异烟胺(Ethionamide，Ethion)。此外，如：亚胺培南(Imipenen)，四环素(Tetracyclines，Tz)、多西环素(Doxycycline，Dox)、对氨水杨酸钠(PAS)和磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole)亦有一定疗效。
结核病的治疗方案包括：常见的一线抗结核药物主要包括异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)和吡嗪酰胺，常用的抗结核的一线治疗方案为6个月的治疗方案，前2个月是异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺的四种药物联合；后4个月是两种药物联合，主要是指异烟肼和利福平联合。
目前，NTM病的诊断方法有：高效液相色谱法(HPLC)，分子生物学方法(包括吖啶酯标记的DNA探针测定法、PCR或多重PCR法、PCR-限制性片段长度多态性分析法、DNA测序技术、反向杂交DNA扩增技术)等。
基于NTM病和结核病临床症状接近，但两者治疗方案截然不同，而对于常规的NTM病诊断方法，一般耗时较久(30天以上)，可能严重影响患者的治疗，因此，急需一种能简单、快捷的检测试剂。
现有技术CN111905110A中公开了“一种鉴别结核杆菌感染与非结核分枝杆菌感染的方法、系统及应用”，其中，具体公开：提出一种重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成的变态反应原和NTM菌体蛋白同体双臂皮肤试验，向待测生物注射重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成的变态反应原以及NTM菌体蛋白进行皮试反应；根据皮试反应的结果判断所述待测生物的结核杆菌和NTM感染情况。该发明提供的检测结核杆菌感染和非结核分枝杆菌感染的系统既可以联合使用应用于鉴别诊断，也可分别单独用于结核杆菌感染或NTM感染检测。
发明内容
发明人在长期的研究中发现，通过将胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白(EEC)联合使用，可快速(24h内)鉴别结核病和NTM病，当胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的迟发性超敏反应均呈阳性时(致病菌-堪萨斯分支杆菌除外)，为结核病；当胞内分支杆菌纯蛋白衍生物的迟发性超敏反应为呈阳性，重组结核杆菌融合蛋白(EEC)的迟发性超敏反应为呈阴性时，为NTM病。基于此，提出一种基于胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的产品、应用及使用方法，进而快速鉴别结核病和NTM病，为患者的准确治疗方案提供可靠的依据。
为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
首先，本技术方案提供：一种基于胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的产品，所述产品包括胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白。
进一步的，所述胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的使用浓度均为5μg/mL。
进一步的，所述胞内分支杆菌纯蛋白衍生物的制备方法，包括：以胞内分支杆菌(ATCC13950)为菌种，经扩增、灭活后，得到含代谢蛋白的菌液；
将菌液盐析沉降、酸变性沉降、脱盐超滤及除菌过滤，得到蛋白原液；
将蛋白原液检验、稀释及分装，得到胞内分支杆菌纯蛋白衍生物成品。
其中，在所述扩增中，先进行罗氏鸡蛋培养基扩增，再进行半固体培养基扩增。其中，在罗氏鸡蛋培养基扩增中，制备大批量的菌体，实现大规模化生产，为后续批量化成品做准备；而在半固体培养基扩增中，便于收集菌体的代谢蛋白，一方面衔接罗氏鸡蛋培养基扩增中形成的大批量菌体，另一方面适应于后续蛋白原液以及成品的制备；
其中，所述半固体培养基为土豆苏通半固体培养基，以1000mL计，包括：谷氨酸钠8.0g、磷酸氢二钾0.5g、柠檬酸2.0g、硫酸镁0.5g、柠檬酸铁铵0.05g、甘油60mL及注射用水940mL。分装500mL三角瓶，180mL瓶，每瓶放土豆块。
其中，在所述脱盐超滤中，采用截留分子量为3-50KD的超滤设备脱盐，脱除在沉降中引入的硫酸铵和三氯乙酸残留物，提高成品中蛋白纯度。
其中，在所述除菌过滤中，采用孔径为0.2μm的除菌过滤设备，该精度的除菌过滤设备的进一步限定，有效提高成品中蛋白纯度。
其中在所述稀释中，采用pH7.3、0.01mol/L的PBS溶液，PBS溶液包括0.0005％聚山梨酯-80。
其中，所述胞内分支杆菌纯蛋白衍生物成品分装采用西林瓶和预灌封方式。
其次，本技术方案提供：将胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白联合，并在制备结核病和非结核分枝杆菌病鉴别的产品中的应用。
其中，在所述产品应用中，当胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的迟发性超敏反应均呈阳性时，为结核病；当胞内分支杆菌纯蛋白衍生物的迟发性超敏反应为呈阳性，重组结核杆菌融合蛋白的迟发性超敏反应为呈阴性时，为非结核分枝杆菌病。
最后，本技术方案提供：一种基于胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的产品的使用方法，包括：
A.向待测生物注射胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白，进行皮试反应；
B.根据皮试反应的结果，判断所述待测生物为结核病或非结核分枝杆菌病。
其中，所述判断标准为，当胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的迟发性超敏反应均呈阳性时，为结核病；
当胞内分支杆菌纯蛋白衍生物的迟发性超敏反应为呈阳性，重组结核杆菌融合蛋白的迟发性超敏反应为呈阴性时，为非结核分枝杆菌病。
进一步地，所述皮试反应的判断标准为：
在皮下注射24-48小时后，测量注射部位硬结的横径与纵径，以横径与纵径的均值作为注射样品的皮试反应直径，所述皮试反应直径≥5mm，则定义为阳性反应；反之，为阴性反应。
采用本技术方案，带来的有益技术效果为：
本发明将胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白联合，应用于制备结核病和非结核分枝杆菌病鉴别的产品中，具有较高的显著性，且鉴别时间短(24h内，出现结果)；为患者的准确治疗方案、临床研究等，提供可靠的理论基础和参考依据。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
关于非结核分枝杆菌病(NTM病)，我国南部和东部的NTM流行高于其它地区，全国各大胸科医院及高校的部分文献数据如下表1所示。
表1
Figure BDA0003175722330000051
在下述实施例中，涉及的结核分支杆菌减毒株(CMCC93020)、胞内分支杆菌(CMCC95002)、鸟分支杆菌(CMCC95001)、堪萨斯分支杆菌(CMCC 95013)、海分支杆菌(CMCC95014)、猿分支杆菌(CMCC95015)、戈登分支杆菌(CMCC 95018)、苏加分支杆菌(CMCC95019)、瘰疬分支杆菌(CMCC95017)、脓肿分支杆菌(CMCC 95021)、龟分支杆菌(CMCC95020)及偶发分支杆菌(CMCC95022)，均来源于中国医学细菌保藏管理中心。
实施例1
本实施例讨论将胞内分支杆菌纯蛋白衍生物与重组结核杆菌融合蛋白联合，对结核分支杆菌减毒株(CMCC93020)致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应，以对本技术方案作进一步的说明。
S1：豚鼠
体重300-500gSPF级豚鼠，IVC笼具饲养(每笼3只，每周换窝2次，自由取食饮水)。
S2：皮试
结核菌素纯蛋白衍生物皮试阴性豚鼠。
S3：致敏源
取结核分支杆菌减毒株(CMCC93020)致敏源(50mg/mL)，121℃灭菌20min。
S4：致敏
腹股沟注射0.2mL致敏源菌液(50mg/mL)，第一次致敏后3周后第二次致敏，第二次致敏后2周可进行皮肤试验。
S5：迟发性超敏反应
将豚鼠背部祛毛，皮内注射胞内分支杆菌纯蛋白衍生物(5μg/mL)0.1mL、重组结核杆菌融合蛋白(5μg/mL)0.1mL，分别记录24h、48h时各个部位硬结横径与纵径，计算24h与48h的总平均直径，检测结核分支杆菌减毒株(CMCC93020)致敏豚鼠诱导迟发型超敏反应的效果，得知胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白对结核分支杆菌减毒株(CMCC93020)致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应全呈阳性。所得结果如下表2所示：
表2 胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白对结核分支杆菌减毒株(CMCC93020)致敏动物实验结果
Figure BDA0003175722330000061
其中，胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白对结核分支杆菌减毒株致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应全呈阳性，符合结核病的判断标准；模型和判断结果一致。
实施例2
本实施例讨论将胞内分支杆菌纯蛋白衍生物与重组结核杆菌融合蛋白联合，对非结核分支杆菌Ⅲ群(慢生长、不产色)主要致病菌的胞内分支杆菌(CMCC 95002)和鸟分支杆菌(CMCC95001)致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应，以对本技术方案作进一步的说明。
S1：豚鼠
体重300-500gSPF级豚鼠，IVC笼具饲养(每笼3只，每周换窝2次，自由取食饮水)。
S2：皮试
结核菌素纯蛋白衍生物皮试阴性豚鼠。
S3：致敏源
取胞内分支杆菌(CMCC 95002)和鸟分支杆菌(CMCC95001)致敏源(50mg/mL)，121℃灭菌20min。
S4：致敏
腹股沟注射0.2mL致敏源菌液(50mg/mL)，第一次致敏后3周后第二次致敏，第二次致敏后2周可进行皮肤试验。
S5：迟发性超敏反应
将豚鼠背部祛毛，皮内注射胞内分支杆菌纯蛋白衍生物(5μg/mL)0.1mL、重组结核杆菌融合蛋白(5μg/mL)0.1mL，分别记录24h、48h时各个部位硬结横径与纵径，计算24h与48h的总平均直径，检测胞内分支杆菌(CMCC 95002)和鸟分支杆菌(CMCC95001)致敏豚鼠诱导迟发型超敏反应的效果，得知胞内分支杆菌纯蛋白衍生物对非结核分枝杆菌Ⅲ群(慢生长、不产色)主要致病菌胞内分支杆菌(CMCC 95002)和鸟分支杆菌(CMCC95001)致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应呈阳性；而重组结核杆菌融合蛋白对其迟发性超敏反应呈阴性。所得结果如下表3-4所示：
表3 胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白对胞内分支杆菌(CMCC95002)致敏动物实验结果
Figure BDA0003175722330000071
表4 胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白对鸟分支杆菌(CMCC95001)致敏动物实验结果
Figure BDA0003175722330000081
其中，胞内分支杆菌纯蛋白衍生物对胞内分支杆菌和鸟分支杆菌致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应全呈阳性，重组结核杆菌融合蛋白对胞内分支杆菌和鸟分支杆菌致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应全呈阴性，符合非结核病的判断标准；模型和判断结果一致。
实施例3
本实施例讨论将胞内分支杆菌纯蛋白衍生物与重组结核杆菌融合蛋白联合，对非结核分支杆菌Ⅰ群(慢生长、光产色)主要致病菌的堪萨斯分支杆菌(CMCC 95013)、海分支杆菌(CMCC 95014)和猿分支杆菌(CMCC95015)致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应，以对本技术方案作进一步的说明。
S1：豚鼠
体重300-500gSPF级豚鼠，IVC笼具饲养(每笼3只，每周换窝2次，自由取食饮水)。
S2：皮试
结核菌素纯蛋白衍生物皮试阴性豚鼠。
S3：致敏源
取堪萨斯分支杆菌(CMCC 95013)、海分支杆菌(CMCC 95014)和猿分支杆菌(CMCC95015)致敏源(50mg/mL)，121℃灭菌20min。
S4：致敏
腹股沟注射0.2mL致敏源菌液(50mg/mL)，第一次致敏后3周后第二次致敏，第二次致敏后2周可进行皮肤试验。
S5：迟发性超敏反应
将豚鼠背部祛毛，皮内注射胞内分支杆菌纯蛋白衍生物(5μg/mL)0.1mL、重组结核杆菌融合蛋白(EEC)(5μg/mL)0.1mL，分别记录24h、48h时各个部位硬结横径与纵径，计算24h与48h的总平均直径，检测堪萨斯分支杆菌(CMCC 95013)、海分支杆菌(CMCC 95014)和猿分支杆菌(CMCC95015)致敏豚鼠诱导迟发型超敏反应的效果，得知胞内分支杆菌纯蛋白衍生物对非结核分枝杆菌Ⅰ群(慢生长、光产色)主要致病菌堪萨斯分支杆菌(CMCC95013)、海分支杆菌(CMCC 95014)和猿分支杆菌(CMCC95015)致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应呈阳性；而重组结核杆菌融合蛋白(EEC)对其迟发性超敏反应呈阴性(堪萨斯除外)。所得结果如下表5-7所示：
表5 胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白对堪萨斯分支杆菌(CMCC 95013)致敏动物实验结果
Figure BDA0003175722330000091
表6 胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白对海内分支杆菌(CMCC95014)致敏动物实验结果
Figure BDA0003175722330000092
表7 胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白对猿分支杆菌(CMCC95015)致敏动物实验结果
Figure BDA0003175722330000093
胞内分支杆菌纯蛋白衍生物对堪萨斯分支杆菌、海分支杆菌和猿分支杆菌致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应全呈阳性；重组结核杆菌融合蛋白对堪萨斯分支杆菌致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应全呈阳性(不符合非结核病的判断标准，模型和判断结果不一致。因堪萨斯分支杆菌含有与结核分枝杆菌同样的抗原ESAT-6和CFP-10，因此重组结核杆菌融化蛋白(EEC)迟发性超敏反应呈阳性)；重组结核杆菌融合蛋白对海分支杆菌和猿分支杆菌致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应全呈阴性，符合非结核病的判断标准；模型和判断结果一致。
实施例4
本实施例讨论将胞内分支杆菌纯蛋白衍生物与重组结核杆菌融合蛋白联合，对非结核分支杆菌Ⅱ群(慢生长、暗产色)主要致病菌的戈登分支杆菌(CMCC 95018)、苏加分支杆菌(CMCC 95019)和瘰疬分支杆菌(CMCC95017)致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应，以对本技术方案作进一步的说明。
S1：豚鼠
体重300-500gSPF级豚鼠，IVC笼具饲养(每笼3只，每周换窝2次，自由取食饮水)。
S2：皮试
结核菌素纯蛋白衍生物皮试阴性豚鼠。
S3：致敏源
取戈登分支杆菌(CMCC 95018)、苏加分支杆菌(CMCC 95019)和瘰疬分支杆菌(CMCC95017)致敏源(50mg/mL)，121℃灭菌20min。
S4：致敏
腹股沟注射0.2mL致敏源菌液(50mg/mL)，第一次致敏后3周后第二次致敏，第二次致敏后2周可进行皮肤试验。
S5：迟发性超敏反应
将豚鼠背部祛毛，皮内注射胞内分支杆菌纯蛋白衍生物(5μg/mL)0.1mL、重组结核杆菌融合蛋白(EEC)(5μg/mL)0.1mL，分别记录24h、48h时各个部位硬结横径与纵径，计算24h与48h的总平均直径，检测戈登分支杆菌(CMCC 95018)、苏加分支杆菌(CMCC 95019)和瘰疬分支杆菌(CMCC95017)致敏豚鼠诱导迟发型超敏反应的效果，得知胞内分支杆菌纯蛋白衍生物对非结核分枝杆菌Ⅱ群(慢生长、暗产色)主要致病菌戈登分支杆菌(CMCC95018)、苏加分支杆菌(CMCC 95019)和瘰疬分支杆菌(CMCC95017)致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应呈阳性；而重组结核杆菌融合蛋白(EEC)对其迟发性超敏反应呈阴性。所得结果如下表8-10所示：
表8 胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白对戈登分支杆菌(CMCC95018)致敏动物实验结果
Figure BDA0003175722330000111
表9 胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白对苏加分支杆菌(CMCC95019)致敏动物实验结果
Figure BDA0003175722330000112
表10 胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白对瘰疬分支杆菌(CMCC 95017)致敏动物实验结果
Figure BDA0003175722330000113
胞内分支杆菌纯蛋白衍生物对戈登分支杆菌、苏加分支杆菌和瘰疬分支杆菌致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应全呈阳性；重组结核杆菌融合蛋白对戈登分支杆菌、苏加分支杆菌和瘰疬分支杆菌致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应全呈阴性，符合非结核病的判断标准；模型和判断结果一致。
实施例5
本实施例讨论将胞内分支杆菌纯蛋白衍生物与重组结核杆菌融合蛋白联合，对非结核分支杆菌Ⅳ群(快生长)主要致病菌的脓肿分支杆菌(CMCC 95021)、龟分支杆菌(CMCC95020)和偶发分支杆菌(CMCC95022)致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应，以对本技术方案作进一步的说明。
S1：豚鼠
体重300-500gSPF级豚鼠，IVC笼具饲养(每笼3只，每周换窝2次，自由取食饮水)。
S2：皮试
结核菌素纯蛋白衍生物皮试阴性豚鼠。
S3：致敏源
取脓肿分支杆菌(CMCC 95021)、龟分支杆菌(CMCC 95020)和偶发分支杆菌(CMCC95022)致敏源(50mg/mL)，121℃灭菌20min。
S4：致敏
腹股沟注射0.2mL致敏源菌液(50mg/mL)，第一次致敏后3周后第二次致敏，第二次致敏后2周可进行皮肤试验。
S5：迟发性超敏反应
将豚鼠背部祛毛，皮内注射胞内分支杆菌纯蛋白衍生物(5μg/mL)0.1mL、重组结核杆菌融合蛋白(EEC)(5μg/mL)0.1mL，分别记录24h、48h时各个部位硬结横径与纵径，计算24h与48h的总平均直径，检测脓肿分支杆菌(CMCC 95021)、龟分支杆菌(CMCC 95020)和偶发分支杆菌(CMCC95022)致敏豚鼠诱导迟发型超敏反应的效果，得知胞内分支杆菌纯蛋白衍生物对非结核分枝杆菌Ⅳ群(快生长)主要致病菌脓肿分支杆菌(CMCC 95021)、龟分支杆菌(CMCC 95020)和偶发分支杆菌(CMCC95022)致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应呈阳性；而重组结核杆菌融合蛋白(EEC)对其迟发性超敏反应呈阴性。所得结果如下表11-13所示：
表11 胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白对脓肿分支杆菌(CMCC 95021)致敏动物实验结果
Figure BDA0003175722330000121
表12 胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白对龟分支杆菌(CMCC95020)致敏动物实验结果
Figure BDA0003175722330000131
表13 胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白对偶发分支杆菌(CMCC 95022)致敏动物实验结果
Figure BDA0003175722330000132
胞内分支杆菌纯蛋白衍生物对脓肿分支杆菌、龟分支杆菌和偶发分支杆菌致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应全呈阳性；重组结核杆菌融合蛋白对脓肿分支杆菌、龟分支杆菌和偶发分支杆菌致敏的豚鼠诱导迟发性超敏反应全呈阴性，符合非结核病的判断标准；模型和判断结果一致。

Claims (7)

1.将胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白联合，在制备结核病和非结核分枝杆菌病鉴别的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白联合在制备结核病和非结核分枝杆菌病鉴别的产品中的应用，其特征在于，所述鉴别的标准为，当胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的迟发性超敏反应均呈阳性时，为结核病；当胞内分支杆菌纯蛋白衍生物的迟发性超敏反应为呈阳性，重组结核杆菌融合蛋白的迟发性超敏反应为呈阴性时，为非结核分枝杆菌病。
3.一种基于胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的产品，其特征在于，所述产品包括胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的基于胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的产品，其特征在于，所述胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的使用浓度均为5μg/mL。
5.根据权利要求3所述的基于胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的产品，其特征在于，所述胞内分支杆菌纯蛋白衍生物的制备方法，包括：以胞内分支杆菌ATCC13950为菌种，经扩增、灭活后，得到含代谢蛋白的菌液；
将菌液盐析沉降、酸变性沉降、脱盐超滤及除菌过滤，得到蛋白原液；
将蛋白原液检验、稀释及分装，得到胞内分支杆菌纯蛋白衍生物成品。
6.一种根据权利要求3-5中任意一项所述的基于胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的产品的使用方法，其特征在于，包括：
A．向待测生物注射胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白，进行皮试反应；
B．根据皮试反应的结果，判断所述待测生物为结核病或非结核分枝杆菌病。
7.根据权利要求6所述的基于胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的产品的使用方法，其特征在于，所述判断标准为，当胞内分支杆菌纯蛋白衍生物和重组结核杆菌融合蛋白的迟发性超敏反应均呈阳性时，为结核病；
当胞内分支杆菌纯蛋白衍生物的迟发性超敏反应为呈阳性，重组结核杆菌融合蛋白的迟发性超敏反应为呈阴性时，为非结核分枝杆菌病。
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