CN113447560B - 一种基于金属离子加成的小分子代谢物碎裂控制方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于金属离子加成的小分子代谢物碎裂控制方法，将小分子代谢物溶液与金属离子溶液混合，通过激光解吸电离实现混合溶液中小分子代谢物的金属离子加成，然后对不同金属离子加成的小分子代谢物进行串级质谱检测，从而得到不同金属离子加成的小分子代谢物碎片种类和数目。通过改变小分子代谢物加合的金属离子(Li+/Ag+/Na+/K+/Rb+/Cs+)种类，可以控制小分子代谢物碎裂的方式和程度，特别对于Li+和Ag+两种金属离子加成来说，小分子代谢物的碎片信息得到了显著提升。本发明还公开了一种金属离子加成的小分子代谢物碎裂控制方法在鉴定小分子代谢物中的应用，实现了在复杂生物体液中对常见小分子代谢物的精准鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及生化检测领域，尤其涉及一种基于金属离子加成的小分子代谢物碎裂控制方法及应用。
背景技术
质谱(MS)直接根据分子的质荷比(m/z)表征分子，其作为最主要的分析手段之一，在疾病诊断，环境监测，分析化学等领域都有着重要的应用。目前激光解吸电离(LDI)和电喷雾电离(ESI)是最常用，也是最为先进的两种电离机制。在实际的检测应用中，相对于电喷雾电离质谱系统(气/液-气转换)，激光解吸电离质谱具有高通量，样本预处理简单等优势，由于其独特的固-气转换方式。激光解吸电离质谱已经成功应用到了生物大分子(蛋白，多肽和核酸等)的检测。特别地，在世界范围内，激光解吸电离质谱在小分子代谢物中的应用仍然吸引着大量课题组研究。然而，对于小分子代谢物激光解吸电离的主要过程，无论是从实验还是理论角度的了解都非常有限。因此，一项全面的研究将极大地推动质谱在小分子代谢物中的发展，类似于其在蛋白质、核酸等大分子的成功应用。
小分子代谢物作为生命活动的最终产物，能够实时反映生命系统的状态。代谢物图谱技术是一种将实际临床样本中所有小分子代谢物同时进行分析的技术，具有精确监测甚至控制复杂生理和病理过程的潜力。MS和串联MS(MS/MS)是分析小分子代谢物的基本工具，面临着以下几个方面的挑战：I)建立阳离子加成发生电荷转移过程中阳离子-代谢物亲和力以及多阳离子加成规律；II)表征加合物碎裂过程中特定基团丢失的反应路径；III)控制小分子代谢物碎裂的方式和程度，以增强质谱在代谢物分析时的鉴定能力。到目前为止，由于现有的工作只涉及上述方面的部分，探索所有核心过程的解决方案可能会增强MS和MS/MS的分析能力。
目前，对于阳离子加成发生电荷转移过程中阳离子-代谢物亲和力，多阳离子加成规律以及小分子代谢物碎裂过程中特定基团丢失的反应路径研究，特别是系统的研究极少。对于这几个方面的探索有助于加深对小分子代谢物形成加合物过程及其二级碎裂过程的理解。在串级质谱中，传统控制小分子代谢物碎裂的方法主要有：I)改变碰撞粒子(氩气/二氧化碳/氮气/电子)；II)改变解离方式，如碰撞诱导解离(CID)，电子捕获解离(ECD)等方式；III)扩展二级质谱到多级质谱等方式来增加小分子代谢物的碎裂信息。但是，其存在着操作复杂，需要大型仪器辅助，难以对小分子代谢物碎裂程度进行精准控制，碎裂信息不足等缺点。特别是在复杂生物体液中(如血清)，其碎裂信息可能会进一步减少，因此对小分子代谢物进行精准鉴定非常困难。因此目前如何简化操作程序及操作装置，控制小分子代谢物碎裂，实现小分子代谢物的有效鉴定是本领域急需解决的技术问题。
发明内容
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明通过改变小分子代谢物加成金属离子的种类(Li+/Ag+/Na+/K+/Rb+/Cs+)，从而实现对小分子代谢物碎裂方式和程度的控制。其中，特别对于Li+和Ag+两种金属离子加成，小分子代谢物的碎片信息得到了显著提升，有效解决了小分子代谢物碎裂信息少，控制碎裂困难等缺陷。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于金属离子加成的小分子代谢物碎裂控制方法，该方法主要包括以下步骤：
步骤1：准备仪器：将基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋共振质谱设置成阳离子模式；
步骤2：分别配制至少一种小分子代谢物溶液和至少一种金属离子溶液；所述至少一种金属离子溶液中的至少一种选自由锂离子溶液，银离子溶液，钠离子溶液，钾离子溶液，铷离子溶液和铯离子溶液组成的组；
步骤3：将每一种小分子代谢物溶液分别与每一种金属离子溶液进行混合，得到各种混合溶液样本；
步骤4：在质谱靶板上进行样品制备，对每种混合溶液样本进行点样，室温下干燥；
步骤5：将氧化铁无机纳米材料作为基质，在干燥后的带有混合溶液样本的质谱靶板上进行基质点样，将基质与每种混合溶液样本混合，室温下干燥；
步骤6：通过激光解吸电离实现每种混合溶液样本中的小分子代谢物的金属离子加成，然后对不同金属离子加成的小分子代谢物进行串级质谱检测，得到串级质谱图；
步骤7：对串级质谱图进行分析，得到不同金属离子加成的小分子代谢物的碎片和个数。
进一步地，步骤2中的所述至少一种小分子代谢物中的至少一种选自由谷氨酰胺，天冬酰胺，异亮氨酸，赖氨酸，脯氨酸，苏氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，缬氨酸，丙氨酸，精氨酸，葡萄糖，柠檬酸，鸟嘌呤，维生素B6，纤维二糖，阿魏酸，叶酸，肌酸，吡啶甲酸，半乳糖，乳糖和尿嘧啶核苷组成的组。
进一步地，在步骤3中所述混合溶液样本中，所述小分子代谢物的浓度为1mg/mL。
进一步地，在步骤3中所述混合溶液样本中，所述金属离子的浓度为0.2mg/mL。
进一步地，步骤5中基质的浓度为1mg/mL。
进一步地，步骤4中每种混合溶液样本的点样量为1uL，步骤5中每个基质的点样量为1uL。
本发明还提供了一种金属离子加成的小分子代谢物碎裂控制方法在鉴定小分子代谢物中的应用，所述应用包括以下步骤：
步骤一：准备仪器：将基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋共振质谱设置成阳离子模式；
步骤二：配制至少一种金属离子溶液；所述至少一种金属离子溶液中的至少一种选自由锂离子溶液，银离子溶液，钠离子溶液，钾离子溶液，铷离子溶液和铯离子溶液组成的组；
步骤三：提供待检测的包含小分子代谢物的样本，将所述样本稀释到合适浓度；
步骤四：将稀释后的样本与所述至少一种金属离子溶液分别进行混合，得到各种混合溶液样本；
步骤五：将每种混合溶液样本在质谱靶板上进行点样，室温下干燥；
步骤六：将氧化铁无机纳米材料作为基质，在干燥后的带有混合溶液样本的质谱靶板上进行基质点样，将基质与每种混合溶液样本混合，室温下干燥；
步骤七：通过激光解吸电离实现每种混合溶液样本中的小分子代谢物的金属离子加成，然后对不同金属离子加成的小分子代谢物进行串级质谱检测，得到串级质谱图；
步骤八：对串级质谱图进行分析，与标准品的金属离子加成的小分子代谢物的质谱图进行比较，从而确定样本中的小分子代谢物。
进一步地，所述步骤一、步骤二和步骤三不分先后顺序。
进一步地，在步骤四中所述混合溶液样本中，所述金属离子的浓度为0.2mg/mL。
进一步地，步骤六中基质的浓度为1mg/mL。
进一步地，步骤五中每种混合溶液样本的点样量为1uL，步骤六中每个基质的点样量为1uL。
进一步地，所述待检测的包含小分子代谢物的样本包括但不限于血清，尿液，脑脊液，房水，唾液，泪液等常见体液。
本发明技术效果
1、本发明通过改变小分子代谢物加合的金属离子的种类(Li+/Ag+/Na+/K+/Rb+/Cs+)，可以控制其碎裂的方式和程度，特别地，对于Li+和Ag+两种金属离子的加成来说，小分子代谢物的碎片信息得到了显著提升，有效解决了小分子代谢物碎裂信息少，控制碎裂困难等缺陷；
2、本发明实现了在复杂生物体液中对常见小分子代谢物的精准鉴定，解决了传统串级质谱技术中存在的在复杂生物体液中无法对小分子代谢物进行有效鉴定的问题；
3、相比于传统的技术来说，本技术实现简单，有望在不同的实验室和工业生产中实现大规模应用。
附图说明
图1为在模拟血清中，不同金属离子加成代谢物鉴定半乳糖结果；
图2为在标准血清中，不同金属离子加成代谢物鉴定葡萄糖结果。
具体实施方式
以下介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1
一种基于金属离子加成的小分子代谢物碎裂控制方法，包括以下步骤：
步骤1：将基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋共振质谱设置成阳离子模式；
步骤2：分别配制各种小分子代谢物(谷氨酰胺，天冬酰胺，异亮氨酸，赖氨酸，脯氨酸，苏氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，缬氨酸，丙氨酸，精氨酸，葡萄糖，柠檬酸，鸟嘌呤，维生素B6，纤维二糖，阿魏酸，叶酸，半乳糖，乳糖和尿嘧啶核苷)溶液，和各种金属盐(氯化锂，硝酸银，氯化钠，氯化钾，氯化铷，碘化铯)溶液；
步骤3：将步骤2中每一种小分子代谢物溶液分别与每一种金属盐溶液进行混合，得到各种混合溶液样本；在各种混合溶液样本中，小分子代谢物的最终浓度为1mg/mL，金属盐的浓度为0.2mg/mL；
步骤4：对每种混合溶液样本在质谱靶板上进行点样，每个样本点样1μL，室温下干燥；
步骤5：将氧化铁无机纳米材料作为基质，浓度为1mg/mL，在干燥后的带有混合溶液样本的质谱靶板上进行基质点样，将基质与每种混合溶液样本混合，每个基质点样1μL，室温下干燥；
步骤6：通过激光解吸电离实现每种混合溶液样本中的小分子代谢物的金属离子加成，然后对不同金属离子加成的小分子代谢物进行串级质谱检测，得到串级质谱图；
步骤7：对串级质谱图进行分析，得到不同金属离子加成的小分子代谢物的碎片和个数。
表1.不同代谢物小分子在不同金属离子加成条件下产生的碎片个数
表2.代谢物小分子在不同阳离子加成下产生的碎片
通过表1和表2可知，小分子代谢物加合的金属离子(Li+/Ag+/Na+/K+/Rb+/Cs+)的种类不同，其碎裂的方式和程度明显不同。尤其是对于Li+和Ag+两种金属离子的加成来说，相比于其他几种金属离子，小分子代谢物的碎片信息得到了显著提升，可以有效解决小分子代谢物碎裂信息少，控制碎裂困难等问题。
实施例2
本实施例提供了一种模拟复杂生物体液的简单混合体系，在混合体系中实现对小分子代谢物的精准鉴定，包括以下步骤：
步骤1：将基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋共振质谱设置成阳离子模式；
步骤2：配制简单混合体系，将谷氨酸、肌酸、半乳糖、纤维二糖和吡啶甲酸五种小分子代谢物进行混合，每种小分子代谢物的浓度为1mg/mL；加入氯化钠(0.2mg/mL)，氯化钾(0.2mg/mL)和牛血清白蛋白(5mg/mL)，以模拟复杂生物体液中高盐、高蛋白的环境；
步骤3：配制各种金属盐(氯化锂，硝酸银，氯化钠，氯化钾，氯化铷，碘化铯)溶液；
步骤4：将步骤2中简单混合体系与每一种金属盐溶液分别进行等比例混合，得到各种混合溶液样本；在各种混合溶液样本中，金属盐的浓度为0.2mg/mL；
步骤5：对每种混合溶液样本在质谱靶板上进行点样，每个样本点样1μL，室温下干燥；
步骤6：将氧化铁无机纳米材料作为基质，浓度为1mg/mL，在干燥后的带有混合溶液样本的质谱靶板上进行基质点样，将基质与每种混合溶液样本混合，每个基质点样1μL，室温下干燥；
步骤7：通过激光解吸电离实现每种混合溶液样本中的小分子代谢物的金属离子加成，然后对不同金属离子加成的小分子代谢物进行串级质谱检测，得到串级质谱图；
步骤8：对串级质谱图进行分析，与标准品的金属离子加成的小分子代谢物的质谱图进行比较，从而确定样本中的小分子代谢物。
在简单混合体系(模拟血清)中，通过控制金属离子加成可以实现对小分子代谢物的精准鉴定。如图1a-f所示，模拟血清中测得的金属离子加成的半乳糖的质谱图(图1a-f质谱图的下半部分)与标准品的金属离子加成的半乳糖的质谱图(图1a-f质谱图的上半部分)完全对应，由此可以推断模拟血清中存在半乳糖小分子代谢物。
此外，在模拟血清中，Li+/Ag+加成母离子(187.08，286.97)产生的碎片数目较多(＞10)，并且与半乳糖标准品对应碎片能较好对应，可以实现模拟血清中对半乳糖的精准鉴定。而Na+/K+/Rb+/Cs+加成母离子(203.05，219.03，264.97，312.97)产生的碎片数目较少(＜2)，对实现模拟血清中对半乳糖的精准鉴定相对困难一些。
实施例3
本实施例提供了在血清中实现对小分子代谢物的精准鉴定的应用，包括以下步骤：
步骤1：将基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋共振质谱设置成阳离子模式；
步骤2：提供标准血清，将标准血清稀释10倍；
步骤3：配制各种金属盐(氯化锂，氯化钠，氯化钾，氯化铷)溶液；
步骤4：将步骤2中的稀释血清与每一种金属盐溶液分别进行等比例混合，得到各种混合溶液样本；在各种混合溶液样本中，金属盐的浓度为0.2mg/mL；
步骤5：对每种混合溶液样本在质谱靶板上进行点样，每个样本点样1μL，室温下干燥；
步骤6：将氧化铁无机纳米材料作为基质，浓度为1mg/mL，在干燥后的带有混合溶液样本的质谱靶板上进行基质点样，将基质与每种混合溶液样本混合，每个基质点样1μL，室温下干燥；
步骤7：通过激光解吸电离实现每种混合溶液样本中的小分子代谢物的金属离子加成，然后对不同金属离子加成的小分子代谢物进行串级质谱检测，得到串级质谱图；
步骤8：对串级质谱图进行分析，与标准品的金属离子加成的小分子代谢物的质谱图进行比较，从而确定样本中的小分子代谢物。
在实际复杂体系(标准血清)中，通过控制金属离子加成可以实现对小分子代谢物的精准鉴定。如图2a-d所示，标准血清中测得的金属离子加成的葡萄糖的质谱图(图2a-d质谱图的下半部分)与标准品的金属离子加成的葡萄糖的质谱图(图2a-d质谱图的上半部分)完全对应，由此可以推断标准血清中存在葡萄糖小分子代谢物。
此外，在标准血清中，Li+加成母离子(187.08)产生的碎片数目较多(＞10)，并且与葡萄糖标准品对应碎片能较好对应，可以实现实际体系中对葡萄糖的精准鉴定。而Na+/K+/Rb+加成母离子(203.05，219.03，264.97)产生的碎片数目较少(＜2)，对实现模拟血清中对葡萄糖的精准鉴定相对困难一些。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于金属离子加成的小分子代谢物碎裂控制方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：准备仪器：将基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋共振质谱设置成阳离子模式；
步骤2：分别配制至少一种小分子代谢物溶液和至少一种金属离子溶液；所述至少一种金属离子溶液中的至少一种选自由锂离子溶液，银离子溶液，钠离子溶液，钾离子溶液，铷离子溶液和铯离子溶液组成的组；
步骤3：将每一种小分子代谢物溶液分别与每一种金属离子溶液进行混合，得到各种混合溶液样本；
步骤4：在质谱靶板上进行样品制备，对每种混合溶液样本进行点样，室温下干燥；
步骤5：将氧化铁无机纳米材料作为基质，在干燥后的带有混合溶液样本的质谱靶板上进行基质点样，将基质与每种混合溶液样本混合，室温下干燥；
步骤6：通过激光解吸电离实现每种混合溶液样本中的小分子代谢物的金属离子加成，然后对不同金属离子加成的小分子代谢物进行串级质谱检测，得到串级质谱图；
步骤7：对串级质谱图进行分析，得到不同金属离子加成的小分子代谢物的碎片和个数。
2.如权利要求1所述的基于金属离子加成的小分子代谢物碎裂控制方法，其特征在于，步骤2中的所述至少一种小分子代谢物中的至少一种选自由谷氨酰胺，天冬酰胺，异亮氨酸，赖氨酸，脯氨酸，苏氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，缬氨酸，丙氨酸，精氨酸，葡萄糖，柠檬酸，鸟嘌呤，维生素B6，纤维二糖，阿魏酸，叶酸，肌酸，吡啶甲酸，半乳糖，乳糖和尿嘧啶核苷组成的组。
3.如权利要求1所述的基于金属离子加成的小分子代谢物碎裂控制方法，其特征在于，在步骤3中所述混合溶液样本中，所述小分子代谢物的浓度为1mg/mL。
4.如权利要求1所述的基于金属离子加成的小分子代谢物碎裂控制方法，其特征在于，在步骤3中所述混合溶液样本中，所述金属离子的浓度为0.2mg/mL。
5.如权利要求1所述的基于金属离子加成的小分子代谢物碎裂控制方法，其特征在于，步骤4中每种混合溶液样本的点样量为1uL，步骤5中每个基质的点样量为1uL。
6.一种如权利要求1所述的基于金属离子加成的小分子代谢物碎裂控制方法在鉴定小分子代谢物中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
步骤一：准备仪器：将基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋共振质谱设置成阳离子模式；
步骤二：配制至少一种金属离子溶液；所述至少一种金属离子溶液中的至少一种选自由锂离子溶液，银离子溶液，钠离子溶液，钾离子溶液，铷离子溶液和铯离子溶液组成的组；
步骤三：提供待检测的包含小分子代谢物的样本，将所述样本稀释到合适浓度；
步骤四：将稀释后的样本与所述至少一种金属离子溶液分别进行混合，得到各种混合溶液样本；
步骤五：将每种混合溶液样本在质谱靶板上进行点样，室温下干燥；
步骤六：将氧化铁无机纳米材料作为基质，在干燥后的带有混合溶液样本的质谱靶板上进行基质点样，将基质与每种混合溶液样本混合，室温下干燥；
步骤七：通过激光解吸电离实现每种混合溶液样本中的小分子代谢物的金属离子加成，然后对不同金属离子加成的小分子代谢物进行串级质谱检测，得到串级质谱图；
步骤八：对串级质谱图进行分析，与标准品的金属离子加成的小分子代谢物的质谱图进行比较，从而确定样本中的小分子代谢物。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤一、步骤二和步骤三不分先后顺序。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤四中所述混合溶液样本中，所述金属离子的浓度为0.2mg/mL。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤五中每种混合溶液样本的点样量为1uL，步骤六中每个基质的点样量为1uL。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述待检测的包含小分子代谢物的样本包括血清，尿液，脑脊液，房水，唾液和泪液。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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