CN113444789A - 青光眼相关生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了青光眼相关生物标志物及其应用。本发明发现了NME5、CTNNAL1和LY96在青光眼患者中表达上调，基于此，本发明公开了生物标志物NME5、CTNNAL1和/或LY96在制备诊断青光眼的产品中的应用，以及包含检测NME5、CTNNAL1和/或LY96表达水平的试剂的诊断青光眼的产品。

Description

青光眼相关生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，涉及青光眼相关生物标志物及其应用。

背景技术

青光眼是全世界范围内导致视力损害和不可逆性失明的主要疾病之一，是一类复杂的视神经退行性病变，导致视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cells ，RGCs）进行性变性、视神经退化和视野缺损，具有高致盲率的特点，严重威胁人类的视觉健康（ResnikoffS, Pascolini D, Etya'ale D, et al. Global data on visual impairment in theyear 2002[J].Bulletin of the World Health Organization, 2004;82（11）:844-851）。据Tham等人推算，2013年全球青光眼患病人数（40-80岁）约为6430万，占世界总人口的3.5%，其中570万人有视觉障碍，有310万人是盲人，预计将在2020年增至7600万，2040年增至1.118亿（Tham Y C, Li X, Wong T Y, et al. Global prevalence of glaucoma andprojections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis[J] .Ophthalmology, 2014;121（11）:2081-2090）。青光眼至今没有统一的分类标准，临床上根据病因、房角、眼压描记等情况将青光眼分为三大类，包括原发性青光眼、继发性青光眼和先天性青光眼。原发性青光眼根据前房角解剖形态又分为原发性开角型青光眼（Primary Open Angle Glaucoma，POAG）和原发性闭角型青光眼（Primary Angle-Closure Glaucoma PACG）。

多数学者认为POAG是一种多因素性疾病，是由遗传因素和环境因素共同作用而成的复杂疾病，其中遗传因素起着主要作用，而通过对POAG进行遗传学研究有助于寻找其致病基因并进一步探索其致病机制。随着医疗的不断发展，影像学和视功能特殊检查技术为POAG的早期诊断提供了敏感的参考指标，但往往是有POAG病变的人群才能被其早期诊断，对于没有出现POAG病变或者可能会发展为POAG的人群来说则作用不大， POAG的遗传学研究是必不可少且极为重要的。研究筛选与POAG发病相关的致病基因或易感基因，对于POAG的早期预防、早期诊断、早期治疗都有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明基于遗传因素在青光眼的发生发展中的作用，研究与青光眼发生发展相关的生物标志物，从而为青光眼的诊断和治疗提供新的手段。

本发明提供了检测生物标志物的试剂在制备诊断青光眼的产品中的应用，生物标志物包括NME5、CTNNAL1和/或LY96。

进一步，与正常人相比，当NME5、CTNNAL1或LY96在受试者样本中的表达水平上调时，则受试者患有青光眼或存在患青光眼的风险。其中样本包括但不限于组织或流体，如组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其组分或经过处理的材料。

进一步，所述试剂包括：

特异性识别NME5、CTNNAL1或LY96基因的寡核苷酸探针；

特异性扩增NME5、CTNNAL1或LY96基因的引物；或

特异性结合NME5、CTNNAL1或LY96编码的蛋白的结合剂。

本发明提供了一种诊断青光眼的产品，所述产品包括检测生物标志物NME5、CTNNAL1和/或LY96水平的试剂。

进一步，所述试剂为检测所述生物标志物转录的mRNA的量的试剂。

进一步，所述试剂为检测所述生物标志物编码的多肽的量的试剂。

进一步，述试剂为抗体、抗体片段或者亲和性蛋白。

进一步，产品为体外诊断产品的形式。

进一步，所述产品为诊断试剂盒。

进一步，所述产品还包括总RNA抽提试剂、逆转录试剂和/或二代测序试剂。

本发明提供了一种诊断/预测青光眼的装置，其特征在于，所述装置包括：

处理器；

输入模块，用于输入生物样品中生物标志物的水平，所述生物标志物选自NME5、CTNNAL1和/或LY96；

包含指令的计算机可读介质，所述指令在由所述处理器执行时在生物标志物的输入水平上执行算法；以及

输出模块，指示受试者是否患有青光眼或者存在患青光眼的风险。

本发明提供了NME5、CTNNAL1或LY96在制备治疗青光眼的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括NME5、CTNNAL1和/或LY96的抑制剂。

进一步，所述抑制剂降低NME5、CTNNAL1和/或LY96的表达水平。

本发明的有益效果：

本发明通过检测NME5、CTNNAL1和/或LY96的表达水平，可以实现青光眼的诊断，增加检测的敏感度，提高检测能力和效率，提升指导青光眼的临床治疗的能力。

附图说明

图1显示NME5基因差异表达图；

图2显示CTNNAL1基因差异表达图；

图3显示LY96基因差异表达图；

图4显示NME5基因诊断青光眼的ROC曲线图；

图5显示CTNNAL1基因诊断青光眼的ROC曲线图；

图6显示LY96基因诊断青光眼的ROC曲线图；

图7显示NME5+CTNNAL1基因诊断青光眼的ROC曲线图；

图8显示NME5+LY96基因诊断青光眼的ROC曲线图；

图9显示CTNNAL1+LY96基因诊断青光眼的ROC曲线图；

图10显示NME5+CTNNAL1+LY96联合诊断青光眼的ROC曲线图。

具体实施方式

以下将对本发明进一步详细说明，应理解，所述用语旨在描述目的，而非限制本发明。

术语 “生物标志物” 指患者表型（例如病理学状态或对治疗剂的可能的反应性）的指示物，其可以在该患者的生物样品中检测到。生物标志包括但不限于DNA、RNA、蛋白质、糖类或基于糖脂的分子标志。

在本发明中，所述生物标志物包括NME5、CTNNAL1和/或LY96。生物标志物例如NME5（NME/NM23 family member 5，gene ID：8382）、CTNNAL1（catenin alpha like 1，gene ID：8727）、LY96（lymphocyte antigen 96，gene ID：23643）；包括基因及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的生物标志物，以及源自细胞中加工的任何形式的生物标志物。该术语涵盖生物标志物的天然发生变体（例如剪接变体或等位变体）。gene ID可在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/获得。

术语“扩增引物”或“引物”，是指包含5～100个核苷酸的核酸片段，优选地，包含能起始酶促反应（如，酶促扩增反应）的15～30个核苷酸。

术语“探针”是指寡核苷酸及其类似物，并涉及通过与靶序列的核苷酸碱基的氢键相互作用而识别多核苷酸靶序列的一系列化学物质。探针或靶序列可以是单链或双链RNA或单链或双链DNA或DNA与RNA碱基的组合。探针至少长8个核苷酸，并少于全基因的长度。探针可以长10、20、30、50、75、100、150、200、250、400、500和长至2000个核苷酸，只要小于靶基因全长即可。探针可以包括修饰寡核苷酸，以具有可通过荧光、化学发光等检测的标签。探针还可以被修饰以具有可检测标签和淬灭分子，例如Taqman和Molecular Beacon 探针。

探针还可以是任何寡核苷酸类似物类型与天然DNA或RNA一起或组合的混合物。同时，寡核苷酸及其类似物可以单独使用或与一种或多种另外的寡核苷酸或其类似物组合使用。

术语 “表达的水平” 或 “表达水平” 一般可互换使用，通常指生物样品中多核苷酸或氨基酸产物或蛋白质的量。 “表达” 通常指基因编码的信息转化为在细胞中存在和运转的结构的过程。因此，本文所用的基因的 “表达” 指转录为多核苷酸、翻译为蛋白质、或甚至蛋白质的翻译后修饰。转录的多核苷酸、翻译的蛋白质或翻译后修饰的蛋白质的片段也视为表达的，无论它们是源自通过选择性剪接产生的转录物或降解的转录物，还是源自蛋白质的翻译后加工（例如，通过蛋白水解）。“表达的基因” 包括转录为多核苷酸（如mRNA ）然后翻译为蛋白质的那些，以及转录为RNA但不翻译为蛋白质的那些（例如，转运RNA和核糖体RNA）。

本文用术语 “诊断”来指分子或病理学状态、疾病或病症的鉴定或分类。例如，“诊断” 可以指，通过所累及的组织/器官（例如，青光眼），或通过分子特征（例如，表征为特定基因或该基因所编码的蛋白质之一或其组合的表达），鉴定患青光眼的风险。

“辅助诊断”来指辅助就症状或病症的具体类型的存在或性质作出临床决定的方法。例如，辅助诊断青光眼方法可以包括测量某些基因在来自个体的生物样品中的表达。

术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，且包括单克隆抗体（ 例如，全长或完整的单克隆抗体）、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体（ 例如，双特异性抗体，只要它们显示希望的生物学活性），且也可以包括某些抗体片段（ 如本文更详细地描述）。抗体可以是人、人源化和/或亲和力成熟的抗体。

“抗体片段” 仅包含完整抗体的部分，其中该部分优选保留与该部分存在于完整抗体中时通常相关的功能的至少一种，优选多数或全部。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合部位，从而保持结合抗原的能力。在另一实施方案中，抗体片段（ 例如包含Fc区的抗体片段）保留通常与该Fc区存在于完整抗体中时相关的生物学功能的至少一种，如FcRn结合、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是单价抗体，其具有基本上类似于完整抗体的体内半衰期。例如，这种抗体片段可以包含与能够赋予该片段体内稳定性的Fc序列连接的抗原结合臂。

本文所用的术语 “单克隆抗体” 指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可以少量存在的可能的天然存在的突变外，包含该群体的单种抗体是相同的。单克隆抗体高度特异，针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。

本文的单克隆抗体特别包括 “嵌合” 抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或隶属于特定抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，一条或多条链的其余部分与衍生自另一物种或隶属于另一抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，以及这类抗体的片段，只要它们显示希望的生物学活性。

术语 “双抗体” 指具有两个抗原结合部位的小的抗体片段，该片段包含在同一条多肽链中与可变轻链结构域（VL）连接的可变重链结构域（VH）（ VH-VL）。通过使用太短而不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一条链上的互补结构域配对，并产生两个抗原结合部位。

“亲和力成熟的” 抗体是在其一个或多个高变区中具有一个或多个改变的抗体，与不具有那些改变的亲本抗体相比，该改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。在某些实施方案中，亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。

本文所述的基因表达水平的检测可以采用本领域已知的测定方法，包括但不限于检测所述生物标志物的RNA转录物的量或所述生物标志物编码的多肽的量的方法。

生物标志物的RNA转录物可通过本领域已知的方法转化为与其互补的cDNA，通过测定互补cDNA的量可以获得RNA转录物的量。生物标志物的RNA转录物或与其互补的cDNA的量，可以针对样本中总RNA或总cDNA的量或者针对一组看家基因的RNA转录物或与其互补的cDNA的量来标准化。

在本文中，RNA转录物可以通过例如杂交、扩增、测序的方法来检测和量化，包括但不限于将RNA转录物与探针或者引物杂交的方法，通过基于聚合酶链式反应（PCR）的各种定量PCR技术或测序技术检测RNA转录物或其对应cDNA产物的量的方法。所述定量PCR技术包括但不限于荧光定量PCR、实时PCR或半定量PCR技术。所述测序技术包括但不限于Sanger测序、二代测序、三代测序和单细胞测序等。优选地，所述测序技术为二代测序，更优选地为靶向RNA-seq技术。

在本文中，多肽的量可以通过例如蛋白组学或试剂来检测。优选地，所述试剂为抗体、抗体片段或者亲和性蛋白。在本文提供的方法中可以使用任何合适的蛋白质定量方法。在某些实施方案中，使用基于抗体的方法。可使用的示例性方法包括但不限于免疫印迹法(蛋白质印迹(western blot))、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫组织化学、流式细胞术、流式细胞术微珠阵列和质谱法。ELISA的一些类型是常用的，包括直接ELISA、间接ELISA和夹心ELISA。

应用

本发明涉及用于测定样品中生物标志物的试剂在制备青光眼的诊断产品中的应用，所述生物标志物包括NME5、CTNNAL1和/或LY96。

优选地，所述诊断产品包括检测样品中NME5、CTNNAL1和/或LY96表达水平的试剂。

作为可选择的实施方案，所述试剂包括：

特异性识别NME5、CTNNAL1或LY96基因的寡核苷酸探针；

特异性扩增NME5、CTNNAL1或LY96基因的引物；或

特异性结合NME5、CTNNAL1或LY96编码的蛋白的结合剂。

作为可选择的实施方案，蛋白的结合剂包括但不限于是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。

作为一种优选地实施方案，蛋白的结合剂为抗体。

作为可选择的实施方案，所述样本包含来自受试者的血浆、血清或血液抽取物、刷洗物、活组织检查物或外科手术切除的组织或液体样品。

（诊断）产品

本发明涉及一种诊断青光眼的产品，所述产品包括检测生物标志物NME5、CTNNAL1和/或LY96的试剂。

在一实施方案中，所述试剂为检测所述生物标志物表达水平的试剂。

在一实施方案中，所述诊断产品为体外诊断产品的形式。

在一具体的实施方案中，所述诊断产品为诊断试剂盒。

在一实施方案中，所述试剂为检测所述生物标志物转录的RNA，特别是mRNA的量的试剂。在又一实施方案中，所述试剂为检测与所述mRNA互补的cDNA的量的试剂。

在一优选的实施方案中，所述诊断产品还包括总RNA抽提试剂、逆转录试剂和/或二代测序试剂。

所述总RNA抽提试剂可以为本领域常规的总RNA抽提试剂。

所述逆转录试剂可以为本领域常规的逆转录试剂，并且优选地包括dNTP溶液和/或RNA逆转录酶。

所述二代测序试剂可以为本领域常规使用的试剂，只要能够满足对所得序列进行二代测序的要求即可。二代测序试剂可以为市售产品，其实例包括但不限于Illumina公司MIseq® Reagent Kit v3（150cycle）（MS-102-3001）、TruSeq® Targeted RNA IndexKitA-96Indices（384Samples）（RT-402-1001）。二代测序为本领域常规的二代测序，例如为靶向RNA-seq技术。因此，二代测序试剂还可以包括可供构建靶向RNA-seq的文库Illumina定制的试剂，例如Targeted RNA Custom Panel Kit（96Samples）（RT-102-1001）。

在优选的实施方案中，所述试剂为探针或引物。

在可选的实施方案中，所述试剂为检测所述生物标志物编码的多肽的量的试剂。

在具体的实施方案中，所述试剂为抗体、抗体片段或者亲和性蛋白。

“试剂盒” 是包含至用于特异性检测本发明的生物标志基因或蛋白质的探针的制成品（例如，包装或容器）。在某些实施方案中，该制成品作为用于进行本发明的方法的单位推销、分销或销售。

这类试剂盒可以包含区室化来紧密限制地容纳一个或多个容器手段（如小瓶、管等）的载体手段，每个容器手段包含将要在方法中使用的分开的组成部分之一。例如，容器手段之一可以包含进行可检测标或可以进行可检测标记的探针。这种探针可以是对包含基因表达特征的一个或多个基因的多核苷酸特异的多核苷酸。在试剂盒利用核酸杂交来检测靶核酸时，试剂盒还可以具有包含用于扩增靶核酸序列的一种或多种核酸的容器和/或包含报道手段的容器，如生物素结合蛋白，如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，结合于报道分子，如酶、荧光或放射性同位素标记。

试剂盒通常将包含上述容器和一个或多个其他容器，该其他容器包含商业和用户角度希望的物质，包括缓冲液、稀释液、滤器、针头、注射器和含有使用说明的包装说明书。容器上可以存在标签来指示该组合物用于具体的治疗或非治疗性应用，且还可以指示体内或体外使用的方向，如上文所述的那些。试剂盒中的其他可选成分包括一种或多种缓冲液（ 例如封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等）、其他试剂（如通过酶标记发生化学改变的底物）、表位修复溶液、对照样品（阳性和/或阴性对照）、对照切片等。

装置

本发明提供了一种诊断/预测青光眼的装置，所述装置包括：

处理器；

输入模块，用于输入生物样品中生物标志物的水平，所述生物标志物选自NME5、CTNNAL1和/或LY96；

包含指令的计算机可读介质，所述指令在由所述处理器执行时在生物标志物的输入水平上执行算法；以及

输出模块，指示受试者是否患有青光眼或者存在患青光眼的风险。

如本文应用的装置应至少包括上述模块。装置的模块可操作地彼此连接。如何以操作方式链接将取决于装置中包含的模块的类型。

所述处理器可以执行一系列的机器可读指令，该机器可读指令可以以程序或软件来体现。指令可以被存储于存储器位置，诸如存储器中。指令可以被导向处理器，该指令可以随后编程或以其他方式配置处理器以实现本公开内容。由处理器进行的操作的实例可以包括读取、解码、执行和写回。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例 与青光眼诊断相关的基因标志物

1、数据和预处理

从GEO数据库下载青光眼及其对照的数据集GSE27276的基因表达数据，并利用注释文件对其注释，多个探针对应同一个基因的取平均值作为其表达量，然后获得基因表达矩阵文件。

2、差异表达分析

使用R软件中的“limma”包进行差异表达分析，差异基因的筛选标准为Pvalue<0.05。

分析结果显示，NME5、CTNNAL1、LY96呈现显著上调，其表达情况如图1-3所示，其中，*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。

3、诊断效能分析

使用R包“pROC”ROC曲线，分析差异表达基因作为检测变量的AUC值、敏感性和特异性，判断其诊断效能。在判断每个基因的诊断效能时，直接使用基因的表达量进行分析。首先调用pROC包，然后读入目的基因构建的表达量矩阵，运行绘制ROC曲线的命令，其中命令采用for循环，同时涉及添加AUC，thres（阈值）、smooth（拟合曲线）的命令。在判断基因联合的诊断效能时，首先是使用glmnet对基因进行logistics回归，利用建立的Logistic回归模型，使用predict（）函数观察某个预测变量在各个水平对结果概率的影响，计算预测概率，绘制预测结果的ROC曲线。

结果如表1和图4-10所示，从表中可以看出NME5、CTNNAL1、LY96及其组合应用于青光眼的诊断具有较高的准确性，尤其是三者的组合，具有较高的准确性、敏感性以及特异性。

表1 差异表达基因诊断效能分析

以上结合附图详细描述了本申请的优选实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。

Claims (10)

1.检测生物标志物的试剂在制备诊断青光眼的产品中的应用，其特征在于，生物标志物选自NME5、CTNNAL1和/或LY96。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，与正常人相比，当NME5、CTNNAL1或LY96在受试者样本中的表达水平上调时，则受试者患有青光眼。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：

特异性识别NME5、CTNNAL1或LY96基因的寡核苷酸探针；

特异性扩增NME5、CTNNAL1或LY96基因的引物；或

特异性结合NME5、CTNNAL1或LY96编码的蛋白的结合剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为检测所述生物标志物转录的RNA的量的试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂为检测所述生物标志物转录的mRNA的量的试剂。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为检测所述生物标志物编码的多肽的量的试剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂为抗体、抗体片段或者亲和性蛋白。

8.根据权利要1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为体外诊断产品的形式。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品为诊断试剂盒。

10.一种诊断/预测青光眼的装置，其特征在于，所述装置包括：

处理器；

输入模块，用于输入生物样品中生物标志物的水平，所述生物标志物选自NME5、CTNNAL1和/或LY96；

包含指令的计算机可读介质，所述指令在由所述处理器执行时在生物标志物的输入水平上执行算法；以及

输出模块，指示受试者是否患有青光眼或者存在患青光眼的风险。

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