CN113440648B - 一种bbg/pcl复合多孔骨支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种BBG/PCL复合多孔骨支架及其制备方法,属于生物医学材料技术应用领域。本发明提供的BBG/PCL复合多孔骨支架由以骨三维模型与以体心立方晶格结构为基本单元的阵列做布尔交叉操作所获得的支架模型为基础经过选择性激光烧结包含BBG粉末和PCL粉末的复合多孔骨支架粉末所得,该复合多孔骨支架具有优良的孔结构、力学性能、生物降解性、生物相容性、蛋白质吸附性、矿化能力和体内促进成骨和血管生成的作用等,可以用于作为性能优良的骨替代移植材料。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料技术应用领域,具体涉及一种BBG(硼酸盐生物活性玻璃)/PCL(聚己内酯)复合多孔骨支架及其制备方法,尤其涉及一种利用SLS(选择性激光烧结)制备的BBG/PCL复合多孔骨支架及其在骨缺损(尤其是临界尺寸骨缺损(CSBD))修复中的应用。
背景技术
骨缺损修复是最常见的再生手术之一,全世界每年有超过200万例骨移植。老年化、外伤、肿瘤切除、发育性畸形和感染是造成骨缺损的主要原因。在骨缺损中,临界尺寸骨缺损(critical-sized bone defect,CSBD)是指长度超过长骨直径的1/2,或长度超过长骨长度的1/5~1/4的骨丢失,骨本身固有的修复能力无法实现有效的桥接,因此其治疗多采用自体骨移植、异体骨移植和骨替代移植。其中,自体骨移植的主要缺点是手术时间长,继发性创伤大,感染风险高。同种异体骨移植后,宿主的免疫反应影响移植物的血管化和细胞化过程,通常有30~60%的病例会出现并发症。骨组织工程(bone tissue engineering,BTE)利用三维多孔骨传导支架促进骨再生,可以为CSBD提供大量需要的供体,是一种很有前景的骨替代移植方法。
对于骨组织工程而言,支架除了具有良好的生物相容性和足够的机械强度外,还应具有多孔互联结构,便于细胞黏附、增殖和组织生长,几何尺寸可控,良好的可降解性,便于定制等特点。支架的这些性能在很大程度上取决于其基质材料和制备方法,不同基质材料、不同方法制备的支架具有不同的结构特点,会直接影响细胞黏附、增殖和分化等生物学特性。
在临床上,由于CSBD往往存在不规则、复杂的三维几何骨缺损,需要患者特有的定制支架来完美贴合解剖剖面,但采用溶剂铸造、颗粒浸出、气体发泡、静电纺丝等传统方法很难实现。基于3D打印技术的BTE可以根据医学成像数据制作具有定制几何形状和精确孔洞结构的支架,虽然在很大程度上克服了的这些困难,但通常需要支撑结构,并且仍不适合于复杂孔隙结构(例如三周期最小曲面、体心立方、负泊松比等特殊结构)的制造。目前也已有众多高分子材料被用来制造骨组织工程支架,例如PCL,其具有良好的热弹性、生物相容性、和在大多数有机溶剂中的溶解性,并且具有机械强度高和低熔点(60℃)特性,然而由于PCL和许多其他聚合物的高度疏水性和缺乏细胞黏附位点,以及生物活性和生物降解性较低等缺陷,限制了其在骨组织工程支架中的广泛应用。
选择性激光烧结(SLS)技术是利用CO2激光束对聚合物或复合粉末进行选择性烧结的快速成型技术,由于其不需要任何支撑结构,且更加适合于复杂孔隙结构的制造,已经成为构建组织工程支架(例如骨组织工程支架)的较为理想的技术。在基质材料的选择上,也逐渐由单一的PCL基质材料替换为由聚合物或生物活性材料(例如羟基磷灰石(HA)、生物玻璃(BG)、β磷酸三钙(β-TCP)等)与PCL组成的复合材料,并已经开发出了具有良好的生物相容性和生物力学性能的骨组织工程支架。例如专利文献CN104441668A(以下称文献1)和郭凌云等人(郭凌云等,选择性激光烧结技术构建HA/PCL骨组织工程支架的研究,口腔材料器械杂志,2015年第24卷第2期,以下称文献2)均公开一种采用SLS技术,将聚己内酯(PCL)与羟基磷灰石(HA)作为原料,得到具有相互连通的三维孔隙结构的HA/PCL骨组织工程支架,该骨组织工程支架具有良好的生物相容性。专利文献CN110327496A(以下称文献3)公开一种通过SLS技术得到的由PCL基体及分散于PCL基体中的Sr-GO复合颗粒组成的Sr-GO/PCL复合支架,该文献公开的方法利用GO作为Sr纳米颗粒的成核基质和载体,协同促进GO和Sr纳米颗粒在PCL基体中的分散,赋予复合支架优异的生物活性、亲水性及力学性能。
然而,虽然上述文献1、文献2和文献3公开的骨组织工程支架具有良好的生物相容性和力学性能(文献1和文献2中将HA与PCL复合反而会降低复合骨支架的力学性能),但其孔隙结构都较为简单,不利于生物体内复杂环境条件下细胞的黏附、繁殖、分化和组织生长。另一方面,以上三者仅公开了其骨组织工程支架的孔隙率、亲水性、力学性能和生物相容性等体外基础指标数据,并未公开其骨组织工程支架的降解率,蛋白吸附能力,以及在生物体的成骨作用和血管生成作用等关键指标数据,因此这些骨组织工程支架在临床中的应用性还不能明确。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题,本发明一个方面提供一种BBG/PCL复合多孔骨支架,其包括以骨三维模型与以体心立方晶格结构为基本单元的阵列做布尔交叉操作所获得的支架模型为基础经过选择性激光烧结复合多孔骨支架粉末获得的基本支架,该基本支架包括位于两端的端面和位于圆周的周面;
在所述基本支架的周面上散布有完全互联的孔隙,在所述基本支架内散布有连通该基本支架两端的端面的通孔,且所述孔隙和通孔相互连通;
所述体心立方晶格结构包括沿该体心立方晶格内体对角线排布的四根圆柱体,其中每根圆柱体的直径D与长度L之间的比例关系为D:L=1:2~1:50,优选为D:L=1:5~1:10,进一步优选为D:L=1:7~1:9;
所述复合多孔骨支架粉末包含5wt%~20wt%的BBG粉末和80wt%~95wt%的PCL粉末。
上述体心立方晶格结构的四根圆柱体的每一根的直径D为0.20mm~1.00mm,长度L为2mm~10mm。
上述骨三维模型选自天然骨扫描三维模型或通过三维造型软件设计的骨三维模型。
在上述基本支架上散布的孔隙和通孔的孔隙率为50%~90%,优选为57%~70%;所述孔隙和通孔的孔径为0.40mm~0.90mm,优选为0.40mm~0.70mm。
上述复合多孔骨支架粉末包含10wt%~20wt%的BBG粉末和80wt%~90wt%的PCL粉末,所述BBG粉末的粒径分布为12μm~90μm,所述PCL粉末的粒径分布为28μm~200μm。
上述BBG粉末由传统熔融淬火法制备而成,其按照质量百分比包括、或基本上由以下组分组成、或由以下组分组成:B2O3:45~60%、MgO:2~8%、CaO:15~25%、Na2O:3~10%、K2O:10~15%和SrO:1~8%;或
所述BBG粉末按照质量百分比的原料包括、或基本上由以下组分组成、或由以下组分组成:B2O3:45~60%、MgO:2~8%、CaO:15~25%、Na2O:3~10%、K2O:10~15%、SrO:1~8%和ZnO:0.5~2%。
本发明另一方面提供一种BBG/PCL复合多孔骨支架的制备方法,其包括以下步骤:
1)将骨三维模型与以体心立方晶格结构为基本单元的阵列做布尔交叉操作所获得的模型作为支架模型,导出为STL格式,并将该支架模型的STL格式数据信息输送到选择性激光烧结机器中;
2)将复合多孔骨支架粉末放置于选择性激光烧结机器中,根据步骤1)的支架模型和预先设定的参数进行加工,获得BBG/PCL复合多孔骨支架;
所述体心立方晶格结构包括沿该体心立方晶格内体对角线排布的四根圆柱体,其中每根圆柱体的直径D与长度L之间的比例关系为D:L=1:2~1:50,优选为D:L=1:5~1:10,进一步优选为D:L=1:7~1:9;
所述复合多孔骨支架粉末包含5wt%~20wt%的BBG粉末和80wt%~95wt%的PCL粉末。
上述方法中,所述预先设定的参数包括:预热温度为40℃~50℃,激光功率为2W~15W,扫描速度为500mm/s~3000mm/s,扫描间距为0.1mm~0.2mm,粉层厚度为0.1mm~0.2mm。
上述方法中,所述体心立方晶格结构的四根圆柱体的每一根的直径D为0.20mm~1.00mm,长度L为2mm~10mm。
上述方法中,所述骨三维模型选自天然骨扫描三维模型或通过三维造型软件设计的骨三维模型。
上述方法中,所述复合多孔骨支架粉末包含10wt%~20wt%的BBG粉末和80wt%~90wt%的PCL粉末,所述BBG粉末的粒径分布为12μm~90μm,所述PCL粉末的粒径分布为28μm~200μm。其中所述BBG粉末由传统熔融淬火法制备而成,其按照质量百分比包括、或基本上由以下组分组成、或由以下组分组成:B2O3:45~60%、MgO:2~8%、CaO:15~25%、Na2O:3~10%、K2O:10~15%和SrO:1~8%;或所述BBG粉末进一步包括ZnO:0.5~2%。
本发明又一方面还提供骨支架用粉末组合物,其包含5wt%~20wt%的BBG粉末和80wt%~95wt%的PCL粉末,其中所述BBG粉末的粒径分布为12μm~90μm,所述PCL粉末的粒径分布为28μm~200μm;
所述BBG粉末由传统熔融淬火法制备而成,其按照质量百分比包括、或基本上由以下组分组成、或由以下组分组成:B2O3:45~60%、MgO:2~8%、CaO:15~25%、Na2O:3~10%、K2O:10~15%和SrO:1~8%;或
所述BBG粉末进一步包括ZnO:0.5~2%。
上述BBG粉末在提高PCL对蛋白质的吸附性能中的应用也属于本发明的内容,所述应用为使BBG粉末与PCL粉末均匀混合后,通过选择性激光烧结制成BBG/PCL复合多孔骨支架,其中所述BBG粉末在BBG/PCL复合多孔骨支架中的质量百分含量为5%以上。
基于以上技术方案提供的BBG/PCL复合多孔骨支架以天然骨扫描三维模型(例如微计算机断层扫描)或通过三维造型软件设计的骨三维模型(例如CAD三维模型)与以体心立方(BCC)晶格结构为基本单元的阵列做布尔交叉操作所获得的支架模型为基础经过选择性激光烧结包含BBG粉末和PCL粉末的复合多孔骨支架粉末而获得,在该BBG/PCL复合多孔骨支架的周面和端面均为凹凸不平结构,且在周面上散布有完全互联的孔隙,在内部散布有连通该BBG/PCL复合多孔骨支架两端端面的通孔,且通孔与孔隙也相互连通,因此本发明提供的BBG/PCL复合多孔骨支架是在三维空间方向上均开设有孔,且所有的孔完全互联的多孔三维结构,这种多孔结构相对于上述文献1至文献3公开的骨组织工程支架的简单孔结构,将极大增加骨架的暴露表面积,更加有利于生物体内复杂环境条件下细胞的黏附、繁殖、分化和组织生长。
另一方面,作为BBG/PCL复合多孔骨支架的基本支架是由BBG和PCL的均匀混合粉末经过SLS(选择性激光烧结)制成,其中PCL粉末经过SLS的熔融处理后表面粗糙,增大了表面积,且复杂的多孔结构又进一步提高了PCL基体的暴露表面积,可以提供更多的细胞附着位点和BBG颗粒的粘附位点,方便位于PCL基体表面均匀散布的BBG材料中的B、Na、Ca、Mg、K、Sr等元素的附着、释放以及与骨组织细胞的接触,更加有利于骨组织细胞的繁殖、分化和组织生长。经体内和体外实验验证,相对于利用单独的PCL材料制成的骨支架,向PCL材料中引入适宜量的BBG材料制成的复合多孔骨支架不仅可以提高骨支架的力学性能、生物相容性、生物降解性和蛋白质吸附性,还可以明显提高骨支架的矿化能力和骨再生能力,在生物体内发挥促进成骨和血管生成的作用,并且不会对细胞产生细胞毒性,因此本发明提供的包含BBG和PCL的骨支架用粉末组合物可以作为一种优良的骨组织工程支架的原料,由其制备的BBG/PCL复合多孔骨支架可以成为一种性能优良的骨移植替代材料,这克服了现有技术中普遍认为的由于BBG的降解会导致强碱性环境不利于细胞生长而不适宜用于制备骨组织工程支架的偏见。
附图说明
图1为体心立方晶格的结构示意图;
图2为PCL粉末和BBG粉末的微观形貌、结构、粒径分布、元素(B、Ca、Na、K、Sr、Mg元素)等的分析结果,其中A幅表示BBG粉末的SEM微观形貌,B幅表示BBG粉末XRD光谱谱图,C幅表示BBG粉末中元素EDS分析结果,D幅表示BBG粉末和PCL粉末的粒径分布曲线,E幅表示PCL粉末的SEM微观形貌;
图3为BBG/PCL复合多孔骨支架的SLS制备流程图;
图4为实施例1中制备的各种支架的形态和表征图像,其中a幅表示5种支架0BBG/PCL、5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL和40BBG/PCL的形态,b幅表示5种支架0BBG/PCL、5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL和40BBG/PCL表面的SEM图像,c幅表示20BBG/PCL支架表面的SEM图像,d幅表示c幅中虚线框部位的SEM和EDS-Mapping(C、Na、Ca、Mg、K和Sr元素)的局部放大图;
图5为本发明的一个实施例制备的BBG/PCL复合多孔骨支架的结构示意图,其中A幅表示主视图,B幅表示左视图;
图6为实施例1制备的5种支架0BBG/PCL、5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL和40BBG/PCL表面的SEM图像;
图7为实施例1制备的各种支架的性能表征结果,其中a幅表示各种支架的抗压强度检测结果,b幅表示各种支架的断裂伸长率检测结果,c幅表示各种支架的孔隙率检测结果,d幅表示各种支架的水接触角测量结果,e幅表示40BBG/PCL支架的水接触角测量结果,f幅表示各种支架的蛋白吸附性能检测结果;
图8为实施例1制备的各种支架的降解性、矿化能力、生物相容性和促进成骨分化性能的检测结果,其中a幅表示支架浸没在Tris-HCl中的支架残余质量变化,b幅表示支架浸没在Tris-HCl中的pH变化情况,c幅表示支架在SBF浸泡1、3、7d后的SEM形貌图,d幅表示使用支架培养h-BMSC细胞1天后的FITC染色和DAPI染色图像,e幅表示使用各种支架培养h-BMSC细胞1、3、5天后的存活率,f幅表示使用各种支架培养h-BMSC细胞3和7天后碱性磷酸酶(ALP)的活性;
图9为实施例1制备的各种支架浸没在Tris-HCl中后B、Ca、K元素的释放曲线,其中a幅表示B元素的释放曲线,b幅表示Ca元素的释放曲线,c幅表示K元素的释放曲线;
图10为实施例1制备的各种支架在SBF溶液中浸泡后支架表面的SEM图像,其中a幅表示0BBG/PCL在SBF溶液中浸泡5天后支架表面的SEM图像,b幅表示20BBG/PCL在SBF溶液中浸泡3天后支架表面的SEM图像,c幅表示40BBG/PCL在SBF溶液中浸泡5天后支架表面的SEM图像;
图11为实施例1制备的20BBG/PCL在SBF溶液中浸泡1、3、7天后支架表面Ca/P沉积SEM扫描图像;
图12为细胞培养系统的结构示意图;
图13为兔桡骨缺损骨修复流程示意图和骨修复表征结果,其中a幅表示兔桡骨缺损骨修复流程示意图,b幅表示兔桡骨缺损部位的micro-CT重建三维模型图像,c幅和d幅分别表示植入支架后第6周和第12周的新骨体积和骨体积/组织体积,e幅至j幅分别表示植入支架后6周和12周新生组织骨形成相关基因分析的相对定量结果;
图14为植入支架后6周和12周兔桡骨缺损骨修复部位的照片,其中a幅表示植入支架后6周,b幅表示植入支架后12周;
图15为植入支架后12周兔桡骨缺损骨修复部位的H&E和M-T染色组织学图像,其中a幅表示H&E染色图像,b幅表示M-T染色图像;
图16为植入支架后6周兔桡骨缺损骨修复部位的H&E和M-T染色组织学图像,其中a幅表示H&E染色图像,b幅表示M-T染色图像;
图17为植入20BBG/PCL支架后12周兔桡骨缺损骨修复部位的M-T染色组织学图像;
图18为植入支架(0BBG/PCL和20BBG/PCL)以及未植入支架对照组12周后兔桡骨缺损骨修复部位的M-T染色组织学图像;
图19为植入支架(0BBG/PCL和20BBG/PCL)以及未植入支架对照组6周和12周后支架部位的H&E染色图像,其中a幅表示12周后各组修复部位的H&E染色图像,b幅表示a幅中深色框局部放大图像,c幅表示植入支架(0BBG/PCL和20BBG/PCL)6周和12周后支架残余孔面积分析结果,d幅表示a幅中浅色框局部放大图像,e幅表示植入支架(0BBG/PCL和20BBG/PCL)以及未植入支架对照组6周和12周后新生组织血管生成VEGF相关基因分析结果。
具体实施方式
针对现有技术中骨组织工程支架的孔结构简单,不利于生物体内复杂环境条件下细胞的黏附、繁殖、分化和组织生长以及现有的骨组织工程支架缺乏体内应用数据而不能明确其临床应用性的缺陷,本发明利用选择性激光烧结(SLS)技术,以BBG和PCL的均匀混合粉末为原料,并以天然骨扫描三维模型或通过三维造型软件设计的骨三维模型与以体心立方晶格结构为基本单元的阵列做布尔交叉操作所获得的支架模型为基础,提供一种具有复杂多孔结构设计的BBG/PCL复合多孔骨支架,并利用该BBG/PCL复合多孔骨支架进行了体外和体内实验。
如本文所用,术语“硼酸盐生物活性玻璃(BBG)”是全硼基的生物活性玻璃,其不同于传统的含有Si、P等元素的硅酸盐或磷酸盐生物活性玻璃,其中完全不含有不能被生物代谢降解的Si元素,也不含有P元素,而主要含有B、Ca、K、Na、Mg、Sr等元素。BBG材料已被证明具有良好的生物相容性和生物活性,在软组织修复领域已经有不俗的进展。然而由于BBG在体液内降解较快,短时间内周围组织的pH快速上升(>10),过高的pH会对细胞有产生明显的毒害作用,并且BBG在快速降解过程中也会释放出高浓度的B元素,也会导致明显的细胞毒作用,使得BBG材料不能直接作为软组织修复材料或者其他医学工程材料(例如骨组织工程支架材料)。虽然专利文献CN109985272A公开了可以通过磷酸盐缓冲液处理修饰BBG的方法,以及专利文献CN108275883A公开了可以通过向硼磷系生物活性玻璃中引入AlO4结构的方法减缓BBG在生物体内的降解,从而可以减轻对生物体的毒害作用,可以很好地作为软组织修复材料。但是,由于BBG材料本身固有的质地较脆、韧性较差的特性,即使使用磷酸盐修饰BBG或向磷酸盐修饰的BBG中引入AlO4结构也均不能改变BBG材料本身固有的这些特性,使得这些经修饰后的BBG材料也无法直接用于制备需要具备一定结构韧性、必要的孔洞结构设计和力学性能的骨组织工程支架。
然而,发明人惊讶发现,当向PCL中引入适量的BBG后,具有质地较脆和韧性较差固有特性的BBG材料并不会如HA(与BBG一样具有质地脆、机械性能差的特点)一样引入PCL后导致复合材料的力学性能降低,而是在一定程度上保持复合材料的力学性能,甚至可以明显提高复合材料的力学性能和结构韧性,还能够明显提高复合材料的孔隙率和生物相容性(亲水性)。另一方面,当向PCL聚合物中引入BBG后,PCL聚合物的存在也可以减缓BBG的降解,使得不会由于BBG在体液内的快速降解而导致pH值的快速升高,而只是由于BBG在PCL聚合物的控制作用下的缓慢降解导致体液内的弱碱性环境,有利的是,这种弱碱性环境不但不会对相邻的组织和细胞造成细胞毒性,反而会加速PCL的降解速率,从而明显提高由BBG和PCL组成的复合多孔骨支架的生物降解性,两者表现出协同互作的效果。并且由于BBG在PCL的控制作用下的缓慢降解,会直接影响到BBG中各种元素的可控缓慢释放,不会导致体液中高浓度的B、Ca、K、Na、Mg、Sr等元素,而是持续长时间的缓慢释放,更加有利于细胞、组织的吸收和利用。再一方面,发明人还惊讶发现,向PCL中引入适量的BBG,还可以显著提高复合材料(复合多孔骨支架)对蛋白质的吸附能力,这将更加有利于细胞在复合骨支架表面的附着、迁移和生长。因此,可以将BBG材料和PCL材料复合制备骨组织工程支架,其中BBG和PCL发挥协同和互补作用明显保持或提高复合材料的力学性能、结构韧性、生物相容性、矿化能力和蛋白吸附性能等,并且不会产生潜在的细胞毒作用,且明显提高复合材料的生物降解性,并且经体内实验验证,相对于纯PCL支架,本发明提供的BBG/PCL复合多孔骨支架能够明显促进骨再生和血管生成,可以作为一种优良的骨替代移植材料。
如本文所用,术语“体心立方晶格”为包括沿该体心立方晶格内体对角线排布的四根圆柱体的结构,如图1所示,示出了体心立方晶格的结构示意图。在某些实施方式中,体心立方晶格的每根圆柱体的直径D与长度L之间的比例关系优选为D:L=1:2~1:50,优选为D:L=1:5~1:10,进一步优选为D:L=1:7~1:9。在某些实施方式中,体心立方晶格的每根圆柱体的直径D为0.20mm~1.00mm,长度L为2mm~10mm,但体心立方晶格的每根圆柱体的直径D和长度L并不限于此,将根据骨三维模型的实际尺寸作适应性的变化。
如本文所用,术语“孔径”是指孔隙或通孔在截面方向上的最大宽度。
如本文所用,术语“wt%”是指质量百分比含量。
以下结合具体实施例,对本发明进一步阐述。应当理解的是,具体实施例仅用于进一步说明本发明,而不是用于限制本发明的内容。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,具体可参见文献1至文献3中公开的方法。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的,不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上,所用到的生物材料的来源是广泛的,任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
以下描述中以兔子桡骨的CSBD模型为例制备BBG/PCL复合多孔骨支架,但是利用本发明的方法并不限于制备兔子桡骨的CSBD模型的BBG/PCL复合多孔骨支架,其还可以用于制备任意骨三维模型的BBG/PCL复合多孔骨支架,其中的骨三维模型可以是天然骨扫描三维模型或通过三维造型软件设计的骨三维模型。
在以下实施例中使用的BBG生物活性玻璃的配方没有特别限定,但优选以下质量百分比含量的成分体系:B2O3:45~60%、MgO:2~8%、CaO:15~25%、Na2O:3~10%、K2O:10~15%和SrO:1~8%(成分体系1);或B2O3:45~60%、MgO:2~8%、CaO:15~25%、Na2O:3~10%、K2O:10~15%、SrO:1~8%和ZnO:0.5~2%(成分体系2)。其中成分体系1为专利文献CN108164135A中公开的初始硼系玻璃成分,已被证明具有良好的生物活性和生物相容性,成分体系2是在成分体系1的基础上又添加了ZnO,能够进一步为BBG生物活性玻璃提供Zn元素,将更有利于促进成骨修复。经验证,以上成分体系1和成分体系2均能够实现本发明的效果。在以下实施例中使用的BBG生物活性玻璃的制备为采用熔融淬火法(melt-quenchmethod)制备得到成块状的玻璃,经研磨,过筛后得到BBG生物活性玻璃。
实施例1:BBG/PCL复合多孔骨支架的制备
实验1.1、复合多孔骨支架粉末的制备
(1)实验中使用的BBG生物活性玻璃的配方为(均为质量百分比):B2O3:52%、MgO:5%、CaO:20%、Na2O:6%、K2O:12%、SrO:4%和ZnO:1%。以此配方为原料,通过传统的熔融淬火法制备得到成块状的玻璃(其中熔制温度为1000~1350℃,保温时间为0.5~4小时),经充分研磨后,过筛得到BBG粉末,并对该BBG粉末的微观形貌、结构、粒径分布、元素(B、Ca、Na、K、Sr、Mg元素)等进行了分析。如图2所示,示出了该BBG粉末的微观形貌(A)、XRD谱图(B)、EDS元素分析结果(C)和粒径分布曲线(D)。可见制备得到的BBG粉末为纯非晶和非晶结构,即XRD谱图中具有2θ=20-40°和2θ=40-50°两个宽漫射散射峰;粒径分布为12μm~90μm,平均粒径约为40μm;EDS元素分析结果也显示制备得到的BBG粉末中含有B、Ca、Na、K、Sr、Mg元素,完全不含有Si、P元素。
(2)实验中使用的PCL粉末购自索尔维公司,并对该PCL粉末的微观形貌和粒径分布等进行了分析。结果如图2中(E)和(D)所示,其中(E)为PCL粉末的微观形貌,(D)为PCL粉末的粒径分布曲线,可见PCL粉末的粒径分布为28μm~200μm,平均粒径约为90μm。
(3)将BBG粉末和PCL粉末按一定比例混合,其中BBG占混合粉末的质量分数分别为0%、5%、10%、20%和40%。经过充分的摇动和搅拌,分别得到具有不同BBG粉末含量的BBG/PCL混合粉,即为复合多孔骨支架粉末,用于以下实验中。
实验1.2、BBG/PCL复合多孔骨支架的制备
实验以兔子桡骨的CSBD模型为例,制备一种接近天然兔桡骨的CSBD模型的BBG/PCL复合多孔骨支架,结合图3所示的流程示意图,具体包括以下步骤。
(1)如图3中A所示,沿着整个兔子桡骨纵轴切除了34mm长的桡骨,并对切除的桡骨进行空间分辨率为9μm的微计算机断层扫描(micro-CT),获得兔桡骨缺损部的扫描三维模型图像。
(2)将步骤(1)扫描获得的三维模型图像导入Mimics 20.0软件重建兔桡骨缺损部的三维模型(可以如天然骨为带有骨髓腔的空心结构(该空心结构的直径可以按照要求进行设计),也可以为不带有骨髓腔的实心结构。本实施例中以实心的三维模型为例,当选择使用带有骨髓腔的空心结构的三维模型时,制备得到的骨支架也可能带有类似于骨髓腔的空心结构),将其命名为CSBD模型,如图3中B所示。
(3)在Mimics 20.0软件中构建以体心立方晶格(BCC)结构(如图3中C所示)为基本单元的阵列,其中每个BCC包括的沿该体心立方晶格内体对角线排布的四根圆柱体的直径D和长度L分别设计为0.5mm和4mm。选用的体心立方晶格内体对角线排布的四根圆柱体的直径D和长度L还可以分别设计为D=0.2mm,L=10mm;或D=0.3mm,L=9mm;或D=0.4mm,L=2mm;或D=0.5mm,L=5mm;或D=0.8mm,L=8mm;或D=1.0mm,L=8mm等。
(4)将步骤(2)重建的CSBD模型与步骤(3)建立的以体心立方晶格结构为基本单元的阵列做布尔交叉操作保留相交部分,如图3中D所示,获得定制的微孔支架模型,将该微孔支架模型导出为STL格式,并将该微孔支架模型的STL格式数据信息输送到商用的选择性激光烧结(SLS)机器中。
(5)如图3中E所示,将实验1制备的5种复合多孔骨支架粉末分别放置于选择性激光烧结机器中,根据步骤(4)的微孔支架模型的STL格式数据信息按照预先设定的参数(预热温度可以为40℃~50℃,激光功率可以为2W~15W,扫描速度可以为500mm/s~3000mm/s,扫描间距可以为0.1mm~0.2mm,粉层厚度可以为0.1mm~0.2mm。在该实施例中设定的参数具体为预热温度为45℃,激光功率为13W,扫描速度为1000mm/s,扫描间距为0.1mm,粉层厚度为0.15mm)进行烧结加工,附着在表面或困在孔隙中的未烧结的复合多孔骨支架粉末可以使用风力机除去,根据5种复合多孔骨支架粉末分别获得5种BBG/PCL复合多孔骨支架(长度均为34mm,宽度均为6.5mm、高度均为6.5mm),如图3中F所示,按照BBG含量的不同分别命名为0BBG/PCL、5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL和40BBG/PCL(统称为兔桡骨模型支架)。为了不同的研究目的,在同一BBG含量下,还制备了另外两种具有与兔桡骨模型支架相同的单元结构但三维几何形状不同的支架(用于孔隙率测定的立方体支架(长宽高分别为10mm)、用于压缩实验的长方体支架(长度为40mm、宽度为20mm、高度为10mm))以及一个用于蛋白吸附实验用的实心圆片(直径为6mm,高度为1mm),如图4中a所示,示出了各种BBG/PCL支架的形态。
如图5所示,以20BBG/PCL兔桡骨模型支架为例,示出了该实验制备的20BBG/PCL的micro-CT重建结构示意图,其中A幅为20BBG/PCL的主视图,B幅为20BBG/PCL的左视图,可见本发明以骨三维模型与以体心立方晶格结构为基本单元的阵列做布尔交叉操作所获得的支架模型为基础经过选择性激光烧结复合多孔骨支架粉末获得的20BBG/PCL包括位于两端的端面2和位于圆周的周面1,支架的周面1和端面2均为凹凸不平结构(可以为细胞提供更多的附着位点),且其上基本上均匀散布有完全互联的若干孔隙3,在内部散布有连通该20BBG/PCL支架两端端面2的若干通孔4(图中示出为4个),且所有通孔4与所有孔隙2也相互连通,这种复杂的孔结构也极大增大支架表面的暴露面积,更有利于细胞的附着。因此本发明提供的BBG/PCL复合多孔骨支架是在三维空间方向上均开设有孔,且所有的孔完全互联,并且表面是凹凸不平的复杂多孔三维结构,这是传统模板法、冷冻干燥法、气体发泡法以及一般的3D打印技术(如FDM和DIW)均难以实现的。
以下实施例2将通过具体实验详细表征本发明提供的BBG/PCL复合多孔骨支架。
实施例2、BBG/PCL复合多孔骨支架的表征
2.1、BBG/PCL复合多孔骨支架的形态学特征
通过对5种支架0BBG/PCL、5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL和40BBG/PCL(基于兔桡骨模型支架)进行SEM扫描成像和EDS-Mapping元素分析以表征5种支架的形态学特征。如图4中b所示,示出了5种支架0BBG/PCL、5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL和40BBG/PCL表面的SEM图像,图6分别示出了5种支架的SEM图像的放大图;如图4中c所示,示出了20BBG/PCL支架的SEM图像;如图4中d所示,示出了图4中c中虚线框部位的SEM和EDS-Mapping(C、Na、Ca、Mg、K和Sr元素)的局部放大图。
由图4中c所示的20BBG/PCL支架的SEM图像,并结合图5所示的20BBG/PCL的micro-CT重建结构示意图,可知20BBG/PCL支架以相互粘结的PCL粉末作为骨架,在PCL骨架表面均匀散布着BBG粉末,在相互粘结的PCL粉末之间还存在着微小孔结构(包括孔隙和通孔),经检测,孔结构中孔的孔径大小约为600~700μm。还对其他3种含有BBG的骨支架上散布的孔的孔径大小进行检测,其中5BBG/PCL支架表面上散布的孔的孔径大小约为400~500μm,10BBG/PCL支架表面上散布的孔的孔径大小约为500~600μm,40BBG/PCL支架表面上散布的孔的孔径大小约为900~1000μm,可见孔结构中孔的孔径大小会随着BBG的含量增加而提高,这可能是由于不同BBG含量的复合多孔骨支架粉末的物料特性不同,即在选择性激光烧结条件下的流动性质不同,导致由不同BBG含量的复合多孔骨支架粉末所制备得到的骨支架表面上孔的孔径大小不同。然而40BBG/PCL支架表面还存在大量的非设计孔隙,这可能是导致40BBG/PCL支架的机械强度下降的主要原因(以下详述)。一般来说,孔径大于150μm是骨再生支架的合适选择,这将为骨缺损修复过程中支架内细胞和血管的生长提供必要条件,因此本发明制备的BBG/PCL复合多孔骨支架在表面孔结构的孔径(400~700μm)方面是满足要求的。
由图4中d所示的20BBG/PCL支架的EDS-Mapping元素分析结果可知,20BBG/PCL支架表面出现了只存在于BBG中的Na、Ca、Mg、K、Sr等元素,所以这些元素所在区域就是BBG所在区域。同样的,其他所有BBG/PCL支架表面也可见BBG颗粒,并均匀分散在PCL基质中。
2.2、BBG/PCL复合多孔骨支架的机械性能
通过对5种支架0BBG/PCL、5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL和40BBG/PCL(基于长方体支架试样)进行抗压强度和断裂伸长率测试以表征5种支架的机械性能。结果如图7所示,其中a幅示出了5种支架的抗压强度结果,b幅示出了5种支架的断裂伸长率结果。图中n=3,误差条代表平均值±SD,*表示与0BBG/PCL相比差异显著,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
由图7中a幅可见,随着复合支架中BBG含量的增加,支架的抗压强度先增大后减小,与纯PCL试样(0.82±0.012MPa)相比,5BBG/PCL的抗压强度达到最大值1.01±0.015MPa,提高了约18.6%,10BBG/PCL组下降至0.97±0.019MPa,20BBG/PCL的抗压强度(0.86±0.019MPa)与0BBG/PCL支架的抗压强度基本相同,而40BBG/PCL则降至0.44±0.035MPa(这可能与40BBG/PCL支架表面还存在大量的非设计孔隙有关,如图6所示)。显然可见,虽然BBG是如HA一样具有质地较脆和韧性较差固有特性的材料,但是适量(例如占复合体系质量百分比为20%以下)的BBG掺入PCL中后,BBG材料并不会如HA一样导致复合材料的力学性能(例如抗压强度)降低,而是在一定程度上保持复合材料的力学性能,甚至会明显提高复合材料的力学性能。
由图7中b幅可见,随着复合支架中BBG含量的增加,试样的断裂伸长率从23.2±0.929%稳步提高到39.8±2.183%,这意味着复合支架具有更强的延展性。显然可见,虽然BBG是一种具有质地较脆和韧性较差固有特性的材料,但是将其引入PCL中后,反而会显著提高复合材料的延展性,即结构韧性。
2.3、BBG/PCL复合多孔骨支架的孔隙率
对5种支架0BBG/PCL、5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL和40BBG/PCL(基于立方体支架试样)进行孔隙率检测。结果如图7中c幅所示,图中n=3,误差条代表平均值±SD,*表示与0BBG/PCL相比差异显著,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
由图7中c幅所示结果,可见0BBG/PCL、5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL和40BBG/PCL支架的孔隙率分别为56.44±0.64%、57.94±0.59%、63.56±0.81%、68.45±1.01%和74.85±0.98%。显然,复合支架的孔隙率随着支架中BBG质量百分比的增加而增加(其中BBG含量为5%~20%范围内的孔隙率约为57%~70%)。对于骨再生是必要的支架的孔隙率需要为至少50%,因此本发明提供的BBG/PCL复合多孔骨支架满足骨再生的要求,支架中这些相互连通的孔隙使细胞在植入后可以从支架表面迅速迁移到支架内部,并在再生过程中促进血管生成和养分渗透。
2.4、BBG/PCL复合多孔骨支架的亲水性
对5种支架0BBG/PCL、5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL和40BBG/PCL(基于立方体支架试样)进行水接触角检测以表征5种支架的亲水性。结果如图7中d幅所示,图中n=3,误差条代表平均值±SD,*表示与0BBG/PCL相比差异显著,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
由图7中d幅所示,可见纯PCL支架(即0BBG/PCL)表面具有较强的疏水性,与水接触角为97.6±0.76°,这在一定程度上限制了其生物应用。5BBG/PCL支架的水接触角降低至95.2±0.76°。当BBG质量分数增加到10%时,水接触角进一步降低到88.2±0.29°,从疏水性向亲水性转变。20BBG/PCL支架的水接触角变化更明显,降至63.2±0.57°。40BBG/PCL支架表面完全潮湿,由于水滴在表面存在的时间太短(约0.20s),无法测量水接触角(如图7中e幅所示)。很明显,在PCL中适当引入BBG对提高PCL支架的亲水性有积极的作用,由于支架的细胞粘附性与支架表面的亲水性密切相关,支架表面越亲水性,细胞粘附越有利,因此在PCL中适当引入BBG可以显著提高复合支架对细胞的粘附性。
2.5、BBG/PCL复合多孔骨支架的蛋白吸附性
对5种支架0BBG/PCL、5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL和40BBG/PCL(基于实心圆片试样)进行蛋白质(绿色荧光蛋白GFP)吸附实验以表征5种支架的蛋白吸附性能。图7中f幅显示支架与GFP溶液孵育24h后的荧光图像。
如图7中f幅所示,与空白对照组(用PBS代替GFP)相比,添加BBG的支架对蛋白质的吸收明显优于纯PCL支架。具体来说,随着BBG含量的增加,在荧光图像中显示越来越多的区域变亮,且亮度增加。令人难以置信的是,40BBG/PCL组在与其他组相同的拍摄参数下过度曝光,这意味着大量的GFP附着在其表面。而空白对照组各支架间暗态无变化。表明支架对蛋白质的吸附能力随着BBG含量的增加而提高,这可能是由蛋白质的胺基与支架上带负电荷的生物活性玻璃组分之间的静电力不可逆相互作用造成的。
由于细胞的附着、迁移和生长受到从周围环境中吸收到支架表面的蛋白质的影响,而在生物体内与支架相互作用的蛋白多为亲水性细胞外蛋白(例如GFP),因此,复合支架中BBG含量的增加不仅提高了支架的亲水性,还能使更多的蛋白质被吸附在支架表面,更加有利于细胞的粘附、迁移和生长。
2.6、BBG/PCL复合多孔骨支架的生物降解性
为了表征5种支架0BBG/PCL、5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL和40BBG/PCL的生物降解性,将这5种支架(立方体支架试样)在pH 7.4的Tris-HCl溶液中浸泡28天,监测支架重量和浸泡溶液中B、Ca、K离子浓度的变化以及监测溶液在浸泡24h内的pH的变化。结果如图8中a幅、b幅和图9所示。
由图8中a幅所示,可见浸泡28d后,0BBG/PCL、5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL和40BBG/PCL支架的残留质量分数分别为98.55±0.84%、97.52±0.21%、95.63±0.20%、88.89±0.51%和58.22±0.19%。并且随着浸泡时间的延长,所有支架的失重都有所增加,降解速率有所减缓。在相同条件下,高BBG浓度的支架降解速率较高,尤其是40BBG/PCL支架降解速度明显快于其他支架,前3天支架质量就下降27.82%,可能的原因是40BBG/PCL支架降解速度过快造成支架在短时间内坍塌。如图9所示,可见随着支架质量的损失,更多的离子从支架中释放出来,其中B(图9中a幅)、Ca(图9中b幅)、K(图9中c幅)离子的释放趋势与减重趋势非常一致,尤其是40BBG/PCL支架表现出高浓度的B、Ca、K离子的释放。而这些元素在浸泡28天后仍能检测到,说明BBG/PCL支架具有优良的药物控制释放能力。
由图8中b幅所示,可见随着时间的推移,浸泡溶液的pH值逐渐升高,并且支架中BBG含量越高,浸泡溶液的pH值越高,尤其是浸泡40BBG/PCL的溶液的pH值在第4小时便达到8,随着时间的延长甚至能高达10,表现出较强的碱性,会对邻近的细胞组织具有明显的细胞毒性;而BBG含量不高于20%的复合支架的浸泡溶液在24小时内pH值一直呈弱碱性,表明BBG的降解速度较慢,B、Ca、K离子的释放速度也较慢(如图9所示),使得溶液pH值上升较慢。
以上结果表明浸泡溶液的pH值与支架降解质量损失之间存在明显的正相关关系,40BBG/PCL的碱性过强可能导致支架在短时间内出现坍塌(如图8中a幅所示),使得PCL不能控制BBG的降解,导致BBG降解速率过快,并释放出高浓度的B、Ca、K等离子,最终导致溶液pH值的快速升高。而在BBG含量不高于20%的复合支架中,复合支架不会出现坍塌现象,且可以明显延缓BBG的降解速率以及B、Ca、K等离子的释放速率,使得浸泡复合支架的溶液长时间内保持弱碱性的环境,并且证明这种弱碱性环境不会对相邻组织和细胞造成毒性作用(以下详述),且表现出对复合支架的降解是有利的,如图8中a幅所示,相对于纯PCL支架,BBG含量不高于20%的复合支架的残留质量分数明显降低,但又不像40BBG/PCL支架降解过快,可以实现支架降解率与骨组织修复率之间的匹配关系,不会造成对细胞组织有毒害作用的强碱性环境,并且通过调节复合支架中BBG的含量,还可以实现复合支架的可控降解和BBG中B、Ca、K等离子的可控释放。
2.7、BBG/PCL复合多孔骨支架的矿化能力
为了表征5种支架0BBG/PCL、5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL和40BBG/PCL的矿化能力,将这5种支架(立方体支架试样)在模拟体液(SBF溶液)中浸泡7天,监测5种支架表面形成磷灰石的能力。结果如图8中c幅、图10和图11所示,其中图8中c幅为5种支架在SBF溶液中浸泡1、3、7天(1D、3D、7D)后支架的SEM形貌图(放大:×4000);图10为不同支架在SBF溶液中浸泡后的支架表面SEM图像,其中a幅表示0BBG/PCL在SBF溶液中浸泡5天并在空气中干燥后的支架表面SEM图像,b幅表示20BBG/PCL在SBF溶液中浸泡3天并在空气中干燥后的支架表面SEM图像,c幅表示40BBG/PCL在SBF溶液中浸泡5天并在空气中干燥后的支架表面SEM图像;图11为20BBG/PCL在SBF溶液中浸泡1、3、7天后的Ca/P沉积的SEM图像(基于EDS元素分析)。
由图8中c幅和图10所示的SEM图像,可见所有支架表面都形成了矿化,并且随着浸泡时间和BBG含量的增加,支架上的矿物颗粒变大变厚。由图11所示的分析结果可知,在支架表面形成的矿物表面同时含有P和Ca元素,但磷矿沉淀的成分随着浸泡时间的变化而变化。对于20BBG/PCL支架,在SBF浸泡1、3和7天后形成的矿物质钙磷比分别为1.33、1.61和1.88。由于亲水表面有利于羟基磷灰石的形成,在PCL中添加BBG后有利于复合支架的亲水性的提高,进而更加有利于支架表面羟基磷灰石的形成,并且随着BBG含量的提高,复合支架的这种矿化能力表现越突出。
2.8、BBG/PCL复合多孔骨支架的体外生物相容性、细胞增殖和人骨髓干细胞(hBMSC)的成骨分化
为了表征5种支架0BBG/PCL、5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL和40BBG/PCL的体外生物相容性、细胞增殖能力和hBMSC的成骨分化能力,将这5种支架(长方体支架试样)置于图12所示的共培养系统中。在该共培养系统中,利用购买自密理博的插入式培养皿,其筛网将细胞与支架隔开,支架放置在筛网上方,细胞种在培养皿底部,以评估不同BBG含量的支架对hBMSC生长和分化的影响。结果如图8中d、e和f幅所示,其中图8中d幅表示使用不同支架培养hBMSC细胞(细胞骨架用FITC(phalloidin)染色,细胞核用DAPI染色)1天后的共聚焦显微镜图像;图8中e幅表示用不同支架培养hBMSC细胞1、3、5天后的细胞存活率(利用CCK-8试剂盒分析,以450nm处的吸光度值来表示,吸光度值越高,细胞存活率越高(定性表征));图8中f幅表示用不同支架培养hBMSC细胞3和7天后的hBMSC碱性磷酸酶(ALP)活性。图8中e和f幅中,n=3,误差条代表平均值±SD,*表示与0BBG/PCL相比差异显著,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
由图8中d幅所示结果可见,使用所有支架培养hBMSC细胞都可见hBMSC细胞在培养皿底部附着和延伸,大部分种子细胞伸长(扁平),形成丝状伪足。在5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL三种复合支架中,随着BBG含量的增加,相同视野范围内的hBMSC数量也相应增加,均显著多于0BBG/PCL,细胞伪足数也增多,更加有利于细胞间的相互作用和交流,表现出优良的生物相容性。而40BBG/PCL组细胞数量相对于另外三组复合支架明显下降,这可能是由于40BBG/PCL支架中过多的BBG导致了强碱性微环境,不利于细胞的生长。
由图8中e幅所示结果可见,随着培养时间的延长,代表细胞数量的O.D.值(450nm处)明显增加,说明所有支架均能促进hBMSC细胞增殖。在5BBG/PCL、10BBG/PCL、20BBG/PCL三种复合支架中,随着BBG含量的增加,表现出对hBMSC细胞的增殖能力增强,在所有条件下,20BBG/PCL组的细胞增殖率均高于其他组(P<0.01),这与图8中d幅所示结果一致。而40BBG/PCL支架的细胞增殖活性是唯一低于0BBG/PCL支架的,提示有潜在的细胞毒性,这可能是由于40BBG/PCL支架中过多的BBG导致了强碱性微环境,不利于细胞生长。
由图8中f幅所示结果可见,各组hBMSC的碱性磷酸酶活性均随着培养时间的延长而增加,表明所有支架均可以促进hBMSC细胞的分化和成骨细胞表型的表达。除40BBG/PCL支架外,ALP活性与支架内BBG含量呈正相关,并且20BBG/PCL组的ALP活性显著高于其他各组(P<0.01),表现出明显上调hBMSC细胞的成骨分化。
实施例3:BBG/PCL复合多孔骨支架的体内作用
该实施例以实施例1制备的20BBG/PCL支架(兔桡骨模型支架)为例,并以0BBG/PCL(兔桡骨模型支架)支架作为阴性对照,验证本发明提供的BBG/PCL复合多孔骨支架的体内作用(包括成骨作用、体内降解和血管生成作用)。
3.1、BBG/PCL复合多孔骨支架的体内成骨作用
具体操作如图13中a幅所示,在兔前肢桡骨处进行手术产生1.8cm的缺损,然后将与缺损大小和形状相匹配的20BBG/PCL支架植入缺损部位,以0BBG/PCL支架为阴性对照组,以未处理兔桡骨CSBD(兔前肢桡骨处具有1.8cm的缺损)为空白对照组,随后监测各组兔桡骨缺损骨的修复状态,并对术后新骨体积进行定量分析和对新生组织骨形成相关基因分析。在整个术后期间,所有动物均未见炎症或感染迹象,说明所有支架在体内具有良好的生物相容性和安全性。结果如图13中b至j幅和图14,其中图13中b幅表示在植入0BBG/PCL、20BBG/PCL支架和未植入组的第6周和第12周的兔前肢桡骨缺损部位的micro-CT图像;图13中c幅和d幅分别表示各组术后6周和12周的NBV(新骨体积,mm3)和BV/TV(骨体积/组织体积,%);图13中e至j幅分别表示术后6周和12周新生组织骨形成相关基因OPN(骨桥蛋白表达基因)、OCN(骨钙蛋白表达基因)、BMP-2(骨形态发生蛋白表达基因)、ALP、RUNX2和COL-1(1型胶原蛋白表达基因)的相对表达情况(RT-PCR方法,通过定量GAPDH值对表达进行归一化处理)。图14表示在植入0BBG/PCL、20BBG/PCL支架和未植入组的第6周(a幅)和第12周(b幅)的兔前肢桡骨缺损部位照片。
由图14的结果所示,可见随着时间的增加,各组兔前肢桡骨缺损部位均出现不同程度的修复。对各组兔前肢桡骨缺损部位进行micro-CT重建三维模型,如图13中b幅所示的三个不同方向的图像,可见在没有支架引导的情况下(即空白对照组),在手术间隙两端只出现不规则和棘状的新骨,并且缺陷太大,无法自我修复,形成连续半径。而阴性对照组和20BBG/PCL支架组由于植入有支架,其力学性能足以维持其在骨修复过程中的形状,并为缺损区骨组织的稳定生长占据必要的空间,但是其中0BBG/PCL支架相对于空白对照组虽有了明显改善,可以提供一定的成骨引导作用,但新骨生长缓慢,手术后12周仍具有较大的缺陷部位。而对于20BBG/PCL支架,相对于阴性对照组,明显促进新骨的生长,并且新形成的骨与相邻的原生骨融合良好,无骨发育不良现象出现,手术后12周基本上修复缺损部位。
如图13中c幅和d幅所示,可见随着植入时间的延长,各组NBV和BV/TV均增加。植入6周后,20BBG/PCL支架组NBV和BV/TV(46.14mm3,27.12%)显著高于0BBG/PCL支架组(28.62mm3,16.88%)和空白对照组(27.88mm3,16.44%)。植入12周后,20BBG/PCL支架组的BV和BV/TV(78.83mm3,45.36%)也显著高于0BBG/PCL支架组(50.96mm3,29.32%)和未治疗组(40.14mm3,23.10%),因此本发明提供的向PCL中引入BBG的复合支架相对于纯PCL支架具有更加优异的体内骨缺损修复效果。
如图13中e至j幅所示结果,可见与空白对照组和0BBG/PCL对照组相比,20BBG/PCL支架组所有成骨相关基因表达水平均显著升高,这与体外实验中BBG/PCL复合支架能够促进hBMSC成骨分化和成骨细胞表型表达的结果一致。
该实验中还对植入0BBG/PCL、20BBG/PCL支架6周和12周后的骨缺损部位进行H&E染色和M-T染色观察,结果如图15、图16、图17和图18所示,其中图15表示植入0BBG/PCL、20BBG/PCL支架12周后骨缺损部为的H&E染色组织学图像(a幅)和M-T(马森三色,b幅)染色组织学图像;图16表示植入0BBG/PCL、20BBG/PCL支架6周后骨缺损部为的H&E染色组织学图像(a幅)和M-T(b幅)染色组织学图像;图17表示植入20BBG/PCL支架12周后骨缺损部的M-T染色组织学图像;图18表示植入0BBG/PCL、20BBG/PCL支架和未植入组的12周后的骨缺损部的M-T染色组织学图像。在图15和图16中,MB表示成熟骨;NB表示新骨;BV表示血管;SM表示支架材料。
由图15和图16所示的结果,可见两组(0BBG/PCL和20BBG/PCL)的新骨面积随着时间的推移逐渐增加。高倍镜显示,无论是纯PCL支架还是20BBG/PCL支架,缺损区域均有新的骨组织出现,修复区域均有大量类似骨小梁结构的骨组织出现。由图18所示的结果,明显可见,与0BBG/PCL支架组相比,20BBG/PCL支架上有更多成熟的新骨组织区域,孔洞区域更少,且20BBG/PCL支架上胶原分泌增多。此外,由图17所示的结果,可见在20BBG/PCL支架和缺陷末端之间观察到一个连续的骨髓腔,更加有利于细胞的繁殖、迁移和组织生长。因此,相对于未添加BBG的纯PCL支架,20BBG/PCL支架具有优良的骨形成能力和高的骨再生效率。
3.2、BBG/PCL复合多孔骨支架的体内降解和血管生成作用
该实验对植入0BBG/PCL、20BBG/PCL支架6周和12周后的骨缺损部位进行H&E染色,并对两组支架在术后6周、12周残余孔的直径进行定量分析,以及对植入0BBG/PCL、20BBG/PCL支架6周和12周后的支架上的血管进行H&E染色,并对新生组织血管生成VEGF相关基因分析(qRT-PCR定量分析)。结果如图19所示,其中a幅表示术后12周,各组缺损部位H&E染色图像反映的支架剩余孔的大小;b幅表示0BBG/PCL和20BBG/PCL支架残留孔区域(图19中a幅的实线框)的H&E染色图像;c幅表示术后6周、12周两组支架(0BBG/PCL和20BBG/PCL)残余孔面积定量分析结果;d幅表示术后12周骨缺损部位0BBG/PCL和20BBG/PCL支架上具有代表性的血管H&E染色图像(图19中a幅的虚线框);e幅表示术后6周和12周两组支架上新生组织血管生成VEGF相关基因分析结果。在图19中d幅,箭头表示支架上的血管。
由图19中a幅、b幅所示结果,并结合图8中a幅所示结果,由于向PCL中加入BBG材料可以提高复合支架的降解性能,因此随着支架的持续降解,新的骨组织可以从支架边缘向中心生长,更多的支架降解后,会留下更多的空间形成新的骨组织填充缺损部位,导致支架孔尺寸变小,进而实现组织填充和支架降解之间的动态平衡。而由于纯的PCL支架的降解速率较低,会导致支架的降解和新的骨组织生长的不匹配,这在一定程度上会阻断CSBD的修复过程,因此导致支架孔尺寸较大。由图19中c幅所示的统计结果,也可见虽然两组支架(0BBG/PCL和20BBG/PCL)的残余孔面积都随着时间的推移而减小,但是相同条件下,例如植入6周后,20BBG/PCL支架的残余孔面积(0.084mm2)明显小于0BBG/PCL支架的残余孔面积(0.783mm2,几乎是20BBG/PCL支架组的9倍);植入12周后,20BBG/PCL支架的残余孔面积下降到0.025mm2,仍明显小于0BBG/PCL支架的残余孔面积0.424mm2,这与体外实验结果一致,即向PCL中添加BBG可以明显提高复合支架的降解速率,实现再生组织填充和支架降解之间的动态平衡。
由图19中d幅所示结果,可见在术后12周,0BBG/PCL和20BBG/PCL支架上均显示丰富的血管生成,但相对于0BBG/PCL,20BBG/PCL支架具有更加丰富的血管生成,这些血管可以为附着在支架上的细胞提供足够的血液循环和营养物质,进而促进细胞的增殖和分化,最终确保新骨形成。由图19中e幅所示的新组织中血管生成基因的qRT-PCR定量分析结果,可知在同一组中,血管生成基因随时间的增加而增加,并且在支架植入6周和12周后,20BBG/PCL支架组显著高于0BBG/PCL和空白对照组,表明向PCL中添加BBG将更加有利于生物体内血管生成,表现出更佳的成骨修复作用。
综上实施例结果,将适宜量(例如5wt%~20wt%,更优选为10wt%~20wt%)的BBG引入PCL中后并通过SLS方法制备成BBG/PCL复合多孔骨支架,相对于纯PCL支架可以获得相当或更加优异的结构性能,主要表现在:(1)孔结构更加复杂并明显提高孔隙率,进而更加有利于细胞的粘附、迁移、繁殖和组织生长;(2)具有质地较脆和机械性能较差固有特性的BBG材料引入PCL材料中后,不但没有恶化复合支架的力学性能(抗压强度和结构韧性),反而使复合支架的力学性能与纯PCL支架保持相当或者明显优于纯PCL支架的力学性能;(3)具有更加优异的亲水性能、生物相容性和矿化能力,将更加有利于细胞的粘附;(4)具有优异的蛋白质吸附性能,更加有利于细胞的粘附、迁移和生长;(5)具有提高的复合支架的生物降解性、减缓的BBG降解速率和BBG中各种元素的可控释放,将BBG材料引入PCL聚合物中后,PCL聚合物的存在可以起到控制BBG降解的作用,进而可以延缓BBG的降解以及BBG中各种元素(例如B、Ca、K等)的释放,只会引起邻近体液的弱碱性环境,这种弱碱性环境不会对邻近的细胞和组织产生毒性作用,并且还可以促进复合支架的降解,进而实现支架降解率与骨组织修复率之间的匹配关系;(6)更加有利于细胞增殖和hBMSC的成骨分化;(7)具有更加优异的生物体内成骨作用、提高的体内生物降解性能和促进血管生成的作用。因此本发明提供的包含BBG粉末和PCL粉末的骨支架用粉末组合物可以作为优良的制备骨组织工程支架的原料,且由其通过SLS制备的BBG/PCL复合多孔骨支架可以作为优良的骨替代移植材料。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种BBG/PCL复合多孔骨支架,其包括以骨三维模型与以体心立方晶格结构为基本单元的阵列做布尔交叉操作所获得的支架模型为基础经过选择性激光烧结复合多孔骨支架粉末获得的基本支架,该基本支架包括位于两端的端面和位于圆周的周面;
在所述基本支架的周面上散布有完全互联的孔隙,在所述基本支架内散布有连通该基本支架两端的端面的通孔,且所述孔隙和通孔相互连通;
所述体心立方晶格结构包括沿该体心立方晶格内体对角线排布的四根圆柱体,其中每根圆柱体的直径D与长度L之间的比例关系为D:L=1:2~1:50;
所述复合多孔骨支架粉末包含5 wt%~20 wt%的BBG粉末和80 wt%~95 wt%的PCL粉末。
2.根据权利要求1所述的BBG/PCL复合多孔骨支架,其中每根圆柱体的直径D与长度L之间的比例关系为D:L=1:5~1:10。
3.根据权利要求2所述的BBG/PCL复合多孔骨支架,其中每根圆柱体的直径D与长度L之间的比例关系为D:L=1:7~1:9。
4.根据权利要求1所述的复合多孔骨支架,所述体心立方晶格结构的四根圆柱体的每一根的直径D为0.20 mm~1.00 mm,长度L为2 mm~10 mm。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的复合多孔骨支架,所述骨三维模型选自天然骨扫描三维模型或通过三维造型软件设计的骨三维模型。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的复合多孔骨支架,其中在所述基本支架上散布的孔隙和通孔的孔隙率为50%~90%;所述孔隙和通孔的孔径为0.40 mm~0.90 mm。
7.根据权利要求6所述的复合多孔骨支架,其中所述基本支架上散布的孔隙和通孔的孔隙率为57%~70%;所述孔隙和通孔的孔径为0.40 mm~0.70 mm。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的复合多孔骨支架,所述复合多孔骨支架粉末包含10 wt%~20 wt%的BBG粉末和80 wt%~90 wt%的PCL粉末,所述BBG粉末的粒径分布为12 μm~90 μm,所述PCL粉末的粒径分布为28 μm~200 μm。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的复合多孔骨支架,所述BBG粉末由传统熔融淬火法制备而成,其按照质量百分比包括:B2O3:45~60%、MgO:2~8%、CaO:15~25%、Na2O:3~10%、K2O:10~15%和SrO:1~8%;或
所述BBG粉末按照质量百分比进一步包括ZnO:0.5~2%。
10.一种BBG/PCL复合多孔骨支架的制备方法,其包括以下步骤:
1)将骨三维模型与以体心立方晶格结构为基本单元的阵列做布尔交叉操作所获得的模型作为支架模型,导出为STL格式,并将该支架模型的STL格式数据信息输送到选择性激光烧结机器中;
2)将复合多孔骨支架粉末放置于选择性激光烧结机器中,根据步骤1)的支架模型和预先设定的参数进行加工,获得BBG/PCL复合多孔骨支架;
所述体心立方晶格结构包括沿该体心立方晶格内体对角线排布的四根圆柱体,其中每根圆柱体的直径D与长度L之间的比例关系为D:L=1:2~1:50;
所述复合多孔骨支架粉末包含5 wt%~20 wt%的BBG粉末和80 wt%~95 wt%的PCL粉末。
11.根据权利要求10所述的制备方法,其中每根圆柱体的直径D与长度L之间的比例关系为D:L=1:5~1:10。
12.根据权利要求11所述的制备方法,其中每根圆柱体的直径D与长度L之间的比例关系为D:L=1:7~1:9。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的制备方法,其中所述预先设定的参数包括:预热温度为40℃~50℃,激光功率为2W~15W,扫描速度为500 mm/s~3000 mm/s,扫描间距为0.1 mm~0.2 mm,粉层厚度为0.1 mm~0.2 mm。
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