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CN113440616A - Ras或raf突变型癌症的联合疗法 - Google Patents

Ras或raf突变型癌症的联合疗法 Download PDF

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CN113440616A
CN113440616A CN202110321666.7A CN202110321666A CN113440616A CN 113440616 A CN113440616 A CN 113440616A CN 202110321666 A CN202110321666 A CN 202110321666A CN 113440616 A CN113440616 A CN 113440616A
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CN
China
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compound
combination therapy
cancer
kras
mutation
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Application number
CN202110321666.7A
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English (en)
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田红旗
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KECHOW PHARMA Inc
Original Assignee
KECHOW PHARMA Inc
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Abstract

本发明涉及一种联合疗法，所述联合疗法包括对患有癌症的哺乳动物给药治疗有效量的第一组分和第二组分，所述第一组分为MEK抑制剂，所述第二组分为化疗剂、KRAS抑制剂、SHP2抑制剂、RAF抑制剂，或者所述化疗剂和/或KRAS抑制剂和/或RAF抑制剂的组合。

Description

RAS或RAF突变型癌症的联合疗法
技术领域
本发明涉及对患有癌症的哺乳动物进行联合疗法的方法，所述方法包括对患有癌症的哺乳动物给药治疗有效量的第一组分和第二组分，所述第一组分为MEK抑制剂，所述第二组分为化疗剂、KRAS抑制剂、RAF抑制剂，或者所述化疗剂和/或KRAS抑制剂和/或 RAF抑制剂的组合，所述癌症是RAS或RAF突变型癌症。
背景技术
RAS家族蛋白是一类小分子GTP酶，也是第一个在人类肿瘤中被鉴定出来的致癌基因，可广泛参与细胞的生长、分化及肿瘤的发生和发展。RAS蛋白发生的突变引发了许多最具侵袭性的肿瘤，寻找这些突变蛋白的疗法已成为一个急需解决的问题。
目前已知的RAS家族共有三个基因：KRAS，NRAS和HRAS。RAS酶的突变与肿瘤发生密切相关，在不同类型的肿瘤中，RAS突变类型也不同。在人类肿瘤中，KRAS 突变是最为常见的，约占85％，NRAS和HRAS分别占12％和3％。在胰腺癌、结直肠癌和肺癌中，KRAS突变占绝对多数。NRAS突变多见于黑色素瘤和急性骨髓性白血病， HRAS突变多见于膀胱癌和头颈癌。
非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占全部肺癌的80％，肺癌外科治疗主要适合于早中期，然而约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。另一方面，化疗治疗非小细胞肺癌的肿瘤缓解率为40％～50％。然而，化疗一般不能治愈非小细胞肺癌，只能延长患者生存期，同时带来诸如恶性呕吐，严重脱发，口腔黏膜充血，免疫力下降等副作用。值得注意的是，靶向药物作为一种针对性强且副作用小的抗癌药物，与传统化疗剂的联合治疗可以降低化疗剂的用量减轻副作用，并且带来更好的疗效。
KRAS突变肺癌约占NSCLC的25％。因此，在NSCLC患者中，急需针对KRAS突变的治疗手段。KRAS基因被激活最常见的方式是点突变，95％的KRAS突变主要发生在 2号外显子的第12号密码子(>80％)和13号密码子上，常见的突变形式有KRAS-G12C突变(39％)，KRAS-G12V(18-21％)和KRAS-G12D(17-18％)突变。其他位置上的突变主要发生在61号密码子(～0.1％)。
目前针对KRAS突变的癌症治疗途径主要分两种，第一种是直接抑制KRAS蛋白来抑制肿瘤生长，目前有AMG510和MRTX849等进入了临床实验，但是该类药物仅针对G12C 突变类型有效，对其他突变无效。第二种是抑制KRAS的下游通路RAF-MEK-ERK来抑制肿瘤，比如MEK的抑制剂AZD6244和GSK1120212等。
AZD6244在三期临床效果不好，其原因也可能是其只针对某一突变位点有效，其他突变无效。
目前，缺乏对常见的多种KRAS突变的非小细胞肺癌有效治疗的方法。
AMG-510是衍生自丙烯酰胺的KRAS抑制剂，其由Amgen开发，目前正在对具有KRASG12C突变的实体瘤进行临床测试。AMG-510的结构如下：
Figure RE-GDA0003205807320000021
但是，临床结果表明给药AMG-510的NSCLC患者中出现了耐药性，因此需要能够与AMG-510组合进而增强治疗效果的联用药物。
因此，期望一种对RAS基因突变型的癌症治疗有效的疗法；更具体地，期望能够对常见的多种KRAS突变的非小细胞肺癌有效治疗并且耐药性好的药物联合疗法。
RAF是RAS鸟嘌呤-核甘酸结合/GTP酶蛋白的关键下游靶标，并且介导由RAF-MEK-ERK组成的MAP激酶级联的活化。RAF基因编码高度保守的丝氨酸-苏氨酸-特异性蛋白激酶，其在与RAS直接结合后被募集到质膜，这是RAF活化中的最初事件。作为下游激酶之一的RAF通路的抑制剂，传统BRAFV600抑制剂已经被批准与MEK抑制剂曲美替尼联合治疗BRAF突变的NSCLC和黑色素瘤。除此之外，目前对其他BRAF突变适应症的联合治疗方案还没有出现，因此需要继续尝试MEK抑制剂和BRAFV600抑制剂联用对其他适应症的治疗。
发明内容
本申请披露了对癌症，例如NSCLC治疗有效的联合疗法，包括MEK抑制剂与传统化疗剂，例如多西他赛(Docetaxel，DOX)的联合疗法、与KRAS抑制剂的联合疗法、与 SHP2抑制剂的联合疗法、与泛RAF/BRAF突变抑制剂的联合疗法。
本申请披露了一种联合疗法，所述联合疗法包括对患有癌症的哺乳动物给药治疗有效量的第一组分和第二组分，所述第一组分为MEK抑制剂，所述第二组分为化疗剂、 KRAS抑制剂、泛RAF抑制剂，或者所述化疗剂和/或KRAS抑制剂和/或泛RAF/BRAF 抑制剂的组合。
在一实施方案中，所述MEK抑制剂为式(I)化合物或其药学上的盐，
Figure RE-GDA0003205807320000022
其中，
X＝O、S或C＝O；
Y＝N或CH；
R1、R2、R4和R5各自独立地选自氢、卤素或C1-6烷基；
R3选自氢、卤素、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、卤代C1-6烷氧基、卤代C1-6烷硫基、C1-6烷基和卤代C1-6烷基；
R6为-C(O)NR8R7或-NHSO2R7；
R7和R8各自独立地选自氢、被羟基取代的C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基C1-6烷基和被羟基取代的C3-6环烷基C1-6烷基。
在一实施方案中，所述MEK抑制剂为化合物1、化合物2、化合物3、或化合物4。
Figure RE-GDA0003205807320000031
上述MEK抑制剂披露于中国发明专利授权专利：ZL 201210189086.8、ZL201210189087.2、以及ZL 201210190520.4。
在一实施方案中，所述MEK抑制剂以0.1至1000mg/kg体重的有效量给药至所述哺乳动物；优选地，以0.5至10mg/kg体重的有效量给药至所述哺乳动物。给药频率为一天两次或一周两次，取决于所述哺乳动物的具体情况。优选地，每周给药两次。
在一实施方案中，所述化疗剂选自顺铂、卡铂、紫杉醇、结合白蛋白的紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、长春瑞滨、依托泊苷和培美曲塞。
在一实施方案中，所述KRAS抑制剂为AMG510、MRTX849、BAY-293、ARS- 1620、BI1701963等等。
在一实施方案中，所述SHP2抑制剂为JAB-3068、TNO155、BBP-398(IACS-15509)、JAB-3312、SHP099等等。
在一实施方案中，所述RAF抑制剂为PLX4032、LGX818、GSK2118436、 PLX8394、BI882370、TAK580、LY3009120、Vemurafenib等等，其中LY3009120和 vemurafenib具有下式
Figure RE-GDA0003205807320000032
在一实施方案中，所述化疗剂以0.1-30mg/kg体重，如0.1-10mg/kg体重，
在一优选实施方案中，所述化疗剂为多西他赛。在一优选实施方案中，多西他赛的剂量为5-120mg/kg体重，优先为7.5-110mg/kg体重。在所述哺乳动物为人的情况下，多西他赛的剂量每21天在1小时内经静脉内给药，剂量在60和100mg/m2体表面或(1.6～2.6 mg/kg体重)之间；或每周在1小时内静脉内给药，剂量在20和40mg/m2(0.5～1.0mg/kg 体重)之间，给药直到6个月。
尽管以上列出了MEK抑制剂和化疗剂的给药方案，但是给药剂量和给药频率一般根据受试者的一般体格状况和引起的副作用的严重程度，尤其是引起造血、神经系统和肾系统的等副作用的严重程度进行调整。本申请公开的MEK抑制剂和化疗剂可按多种已知方式施用，诸如口服、局部、经直肠、胃肠外、通过吸入喷雾或经由植入的储库，尽管任何给定情况下最合适的途径将取决于具体的宿主及施用活性成分所针对的病症的性质和严重程度。本申请使用的术语“胃肠外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。
在一实施方案中，所述MEK抑制剂和所述化疗剂同时、顺序或间歇给药。在一实施方案中，所述MEK抑制剂与所述化疗剂同时给药。在一实施方案中，所述化疗剂先于所述MEK抑制剂给药；或者所述化疗剂在给药所述MEK抑制剂之后给药；给药时间的间隔取决于患者和所述药物的半衰期。在一实施方案中，所述MEK抑制剂以口服给药；所述化疗剂以静脉给药。
在一实施方案中，所述哺乳动物是人、大鼠、小鼠等。在一优选的实施方案中，所述哺乳动物是人。
在一实施方案中，所述癌症是RAS突变型癌症，例如KRAS突变型癌症、NRAS突变型癌症、HRAS突变型癌症或BRAF突变癌症。在一实施方案中，所述RAS突变型癌症是胰腺癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、急性骨髓性白血病、膀胱癌或头颈癌等。在一优选实施方案中，所述癌症是肺癌。在优选的实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌。
在一实施方案中，KRAS包括在选自密码子12、13、59和61的一个或多个位置处的突变。在一实施方案中，KRAS突变形式在选自G12、G13、S17、P34、A59和Q61的一个或多个氨基酸位置处具有突变。在一实施方案中，所述KRAS突变形式具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：G12C、G12S、G12R、G12F、G12L、G12N、G12A、 G12D、G12V、G13C、G13S、G13D、G13V、G13P、S17G、P34S、A59E、A59G、 A59T、Q61K、Q61L、Q61R和Q61H。在一实施方案中，所述KRAS突变形式在选自 G12、G13、A59、Q61、K117和A146的一个或多个氨基酸位置处具有突变。在一实施方案中，所述KRAS突变形式具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、A59E、 A59G、A59T、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H、K117N、K117R、K117E、A146P、A146T 和A146V。在一实施方案中，所述BRAF突变为BRAF V600E突变。
在一实施方案中，NRAS包括在选自密码子12、13、59、61和146的一个或多个位置处的突变。在一些实施方案中，所述NRAS突变形式在选自G12、G13、A59、Q61、 K117和A146的一个或多个氨基酸位置处具有突变。在一些实施方案中，所述NRAS突变形式具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、 G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、G13V、A59D、A59T、Q61K、Q61L、 Q61R、Q61H、K117N、K117R、K117E、A146P、A146T和A146V。
在进一步优选的实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌，其具有KRAS G12突变或Q61突变。更进一步地，所述突变是KRAS G12突变，选自G12C,G12S或G12V；所述突变是KRASQ61K突变。
在一实施方案中，MEK抑制剂和KRAS抑制剂的比例是1:1至10:1，优选为3:1(体外摩尔浓度比)或者1:1至1:20，优选为1:6～1:8(体内质量浓度比)。
在一实施方案中，MEK抑制剂和泛BRAF抑制剂比例是1:1至1:50，优选为1:40(体外摩尔浓度比)或1:1至1:50，优选1:30(体内质量浓度比)。
本发明的发明人，通过本发明的MEK抑制剂(例如化合物1)和化疗剂多西他赛(Docetaxel，DOX)的联合疗法，对四种KRAS突变(Q61K,G12C,G12S和G12V)的NSCLC均有良好的效果，例如叠加或协同效果，尤其是对具有KRAS G12V和Q61K突变的非小细胞肺癌呈现出了协同作用；本发明的MEK抑制剂与KRAS抑制剂例如 AMG510对具有KRAS G12C突变的非小细胞肺癌具有协同作用；本发明的MEK抑制剂与SHP2抑制剂例如SHP099对KRAS G12C突变的非小细胞肺癌具有协同作用；以及本发明的MEK抑制剂与泛RAF抑制剂例如LY3009120对具有KRAS Q61K突变的非小细胞肺癌具有协同作用。以及本发明的MEK抑制剂与RAF抑制剂例如Vemurafenib对具有 RAF突变的黑色素瘤具有协同作用。
附图说明
图1示出了化合物1和多西他赛联合使用在Calu-6肺癌皮下移植模型中肿瘤生长曲线。
图2示出了化合物1和多西他赛联合使用在NCI-H358肺癌皮下移植模型中肿瘤生长曲线。
图3示出了化合物1和多西他赛联合使用在A549肺癌皮下移植模型中肿瘤生长曲线。
图4示出了化合物1和多西他赛联合使用在NCI-H441肺癌皮下移植模型中肿瘤生长曲线。
图5示出了化合物1和LY3009120联合使用对Calu-6肿瘤的抑制、各组实验动物体重变化、各组实验结束时瘤重以及瘤体积/瘤重变化率分析。
图6示出了化合物1和Vemurafenib对肿瘤细胞的体外抗增殖剂量反应曲线。
图7A和7B示出了化合物1和Vemurafenib联合使用对黑色素瘤细胞A375的体内抗增殖药效。
图8示出了化合物1和AMG510联合对NCI-H358肺癌皮下移植模型的体内药效。
图9示出了化合物1和SHP099联合对NCI-H358肺癌皮下移植模型的体内药效。
具体实施方式
本发明进一步由解释本发明的以下实施例进行示例性说明，但是并不受其限制。
1.药效学评价实验
以下实施例考察了化合物1(获自滨江药物，下同)与多西他赛联合给药在不同的肺癌模型中与化合物1单独疗法相比的药效学评价。
1.1实验设计
Figure RE-GDA0003205807320000051
Figure RE-GDA0003205807320000061
1.2实验动物信息
a)Calu-6/A549：BALB/c裸鼠，雌性，肿瘤细胞接种时周龄为6-8周，饲养环境： SPF级。
b)NCI-H358：NOD/SCID鼠，雌性，肿瘤细胞接种时周龄为6-8周，饲养环境为 SPF级。
c)NCI-H441:NU/NU鼠，雌性，肿瘤细胞接种时周龄为6-8周，饲养环境为SPF 级。
1.3实验动物饲养室的环境条件
实验动物均饲养于恒温恒湿的独立通风盒内，饲养室温度20-22℃，湿度59-78％，10-20次/小时换气，昼夜明暗交替时间12h/12h；持续供给钴60放射灭菌鼠全价颗粒饲料，不限量自由摄取，饮用自来水(高压蒸汽灭菌后使用)，饮水瓶不间断供水，自由摄取。饲养鼠盒是聚砜鼠盒，高压灭菌后使用，规格为325mm×210mm×180mm；垫料是高压灭菌玉米芯，每盒最多饲养6只动物，笼卡上标明实验编号、实验开始时间、实验人员、动物来源、组别和动物号等；实验动物打耳标进行标记。
1.4动物造模和分组
第0天(Day 0)于小鼠右侧皮下接种下述细胞(密度为5×106)，将细胞重悬在0.1mL的混悬液(对Calu-6而言，混悬液是PBS；对NCI-H358、A549和NCI-H441而言，均为1:1的PBS：Matrigel)中，建立相应的肺癌皮下移植模型。细胞接种数天后，待肿瘤生长至平均体积为期望的大小(例如对NCI-H358细胞，生长至201mm3左右；对其它细胞系而言，生长至154mm3左右)按照瘤体积随机分成6组，每组8只，并开始给药。
1.5实验观察
肿瘤接种后，常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低情况，眼睛、被毛及其它异常情况。
接种肿瘤后，每周测量三次小鼠的体重及肿瘤的大小。肿瘤大小计算公式：
肿瘤体积(mm3)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径2)。
1.6细胞信息
表1细胞种类和突变情况以及培养条件
细胞系 突变状态 培养基
NCI-H358 KRAS G12C RPMI1640+10％FBS
A549 KRAS G12S RPMI1640+10％FBS
Calu-6 KRAS Q61K MEM+10％FBS
NCI-H441 KRAS G12V RPMI1640+10％FBS
以上细胞均培养在37度，5％CO2，湿度95％的培养箱中。收集指数生长期的细胞，PBS重悬至适合浓度，用于小鼠右侧皮下接种。
1.7测试药品的配制
将化合物1溶解在包含0.5％HPMC和0.2％Tween-80的超纯水溶液中，每周制备新溶液。多西他赛以临床制剂的形式按照所需剂量使用。
1.8判断参数或标准
根据相对肿瘤抑制率(TGIRTV)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。具体判断参数如下：
相对肿瘤抑制率TGIRTV(％)：TGIRTV＝1-TRTV/CRTV(％)。
TRTV/CRTV％为相对肿瘤增值率，即在某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积的百分比值。
TRTV和CRTV分别为治疗组和PBS对照组在某一特定时间点的相对肿瘤体积 (TV)。
计算公式如下：TRTV：治疗组平均RTV；CRTV：对照组平均RTV；RTV＝Vt/V0， V0为分组时该动物的瘤体积，Vt为治疗后该动物的瘤体积。
1.9统计分析
肿瘤体积及动物体重结果以Mean(平均值)±SEM(平均标准误差)表示。不同组间的相对肿瘤体积统计分析选用分组后的相对肿瘤体积数据。用独立样本T检验方法比较两组间相对肿瘤体积有无显著性差异。所有的数据均用SPSS 18.0进行分析。p<0.05为具有显著性差异；p<0.01为具有极显著性差异。
2.实施例
按照以上药效学评价实验，对上述四种细胞系或肺癌皮下移植模型单独给药化合物 1、单独给药多西他赛、联合给药化合物1+多西他赛、联合给药化合物1+KRAS抑制剂AMG510、联合给药化合物1+SHP2抑制剂SHP099、联合给药化合物1+RAF抑制剂例如LY3009120进行药效学评价。
2.1实施例A--化合物1单独给药或者联合给药在Calu-6肺癌皮下移植模型中的抗肿瘤活性
如表2所示接种肿瘤细胞后第45天时(给药后第28天)，对照组肿瘤体积为3529.0mm3,G2组、G3组、G4组、G5组、G6组肿瘤体积分别为1069.7mm3、 1350.2mm3、1360.7mm3、420.8mm3和493.3mm3，相对肿瘤抑制率TGIRTV(％)分别为 73％、66％、65％、89％、87％。利用独立样本T检验方法分析，相对对照组肿瘤体积统计学上有极具显著性差异(p<0.01)，说明各给药组均有显著抗肿瘤活性。并且单独给药组与其相应联合给药组(G2vs G5,G4 vs G5,G3 vs G6,G4 vs G6)相比，其p值均<0.001，表明联合用药有协同作用。(各治疗组和对照组肿瘤体积见图1)
表2细胞接种后第45天(给药28天)Calu-6肺癌皮下移植模型中的药效分析
Figure RE-GDA0003205807320000071
Figure RE-GDA0003205807320000081
注释:a:和对照组对比
2.2实施例B--化合物1单独给药或联合给药在NCI-H358肺癌皮下移植模型中的抗肿瘤作用
接种肿瘤细胞后第33天时(分组后第26天)，对照组肿瘤体积为1876.5mm3,G2组、G3组、G4组、G5组、G6组肿瘤体积分别为167.4mm3、496.4mm3、229.4mm3、64.9 mm3和77.3mm3，相对肿瘤抑制率TGIRTV(％)分别为91％、74％、89％、97％、96％，相对对照组肿瘤体积统计学上有显著性差异(p值均＜0.001)。
各治疗组和对照组肿瘤生长情况见图2，药效分析见表3。
表3在NCI-H358肺癌皮下移植模型中实验分组后第26天的肿瘤体积的药效分析
Figure RE-GDA0003205807320000082
注释:
a,和对照组对比
b,G2 vs G5,p＝0.017；G4 vs G5,p＝0.006；G3 vs G6,p＜0.001；G4 vs G6,p＝0.008.
与单独用药组相比，联合用药显示更好的肿瘤生长抑制。单独给药组与其相应联合给药组(G2 vs G5,G4 vs G5,G3 vs G6,G4 vs G6)相比，均有显著性差异，说明联合用药有协同作用。
2.3实施例C--化合物1单独给药或者联合给药在BALB/c nude小鼠A549肺癌皮下移植模型中的抗肿瘤活性
A549：如表4所示，分组后第30天，对照组肿瘤体积为1364.5mm3,G2组、G4组、 G5组、G6组肿瘤体积分别为541.2mm3、584.6mm3、246.4mm3和284.2mm3，相对肿瘤抑制率TGIRTV(％)分别为60％、61％、85％、81％，相对对照组肿瘤体积统计学上有显著性差异(p<0.05)，与单独用药相比，联合用药显示更好的肿瘤生长抑制。G3组肿瘤体积为 1012.3mm3，相对肿瘤抑制率TGIRTV(％)分别为26％，相对对照组肿瘤体积统计学上没有显著性差异(p>0.05)。单独给药组与其相应联合给药组(G2 vs G5,G4 vs G5,G3 vs G6,G4 vs G6)相比，均有显著性差异(P值均小于0.05)，说明联合用药有协同作用。
表4在A549肺癌皮下移植模型中实验分组后第30天的肿瘤体积的药效分析
Figure RE-GDA0003205807320000091
注释:a：和对照组对比
2.4实施例D--化合物1单独给药或者联合给药在NU/NU小鼠NCI-H441肺癌皮下移植模型中的抗肿瘤作用
如表5，分组后第20天，对照组肿瘤体积为827.3mm3,G2组、G3组、G4组、G5 组、G6组肿瘤体积分别为294.6mm3、336.8mm3、276.1mm3、132.9mm3和103.6 mm3，相对肿瘤抑制率TGIRTV(％)分别为66％、61％、69％、85％、88％，相对对照组肿瘤体积统计学上有显著性差异(p值＜0.001)。
到给药后20天，G3(化合物1BIW)与对应联合组G6比较，相对肿瘤体积存在显著差异 (P<0.05)，G2(化合物1BID)在实验终点与G5相比也有显著差异，说明联合治疗效果优于化合物1单药治疗。联合治疗组G6(化合物1BIW，DOX QD)与DOX单独给药组G4相比，在实验终点相对肿瘤体积差异显著，说明联合治疗效果也同样优于DOX单药治疗。但是G4(DOX QW)与G5(化合物1BID，DOX QD)没有显著差异(P>0.05)，这说明联合治疗方案中化合物1的给药方式(BID或者BIW)直接影响了治疗效果。
表5在NCI-H441肺癌皮下移植模型中实验分组后第20天的肿瘤体积的药效分析
Figure RE-GDA0003205807320000092
注释:a：和对照组对比
b,G2 vs G5,p＝0.001；G4 vs G5,p＝0.084；G3 vs G6,p<0.001；G4 vs G6,p＝0.042
从以上结果可知，与化合物1单独给药相比，化合物1与Docetaxel(DOX)联合给药在四种肺癌皮下移植模型(或者说四种KRAS突变型非小细胞肺癌)中显示出叠加作用或者协同作用。
2.5实施例E—化合物1和KRASi AMG510联合体外给药在NSCLC H358上的协同作用
将细胞系NSCLC H358按照3k/well密度接种于96-well plate中，5％CO2 37℃条件下培养。第二天分别加入不同浓度的(1-10000nM)的化合物1和AMG510(获自安瑞克)，正常条件下孵育5天。加入MTT(5mg/ml)，用酶标仪检测490nm波长下的每个浓度孔的吸光度，利用公式viability＝100％*(ODexperimental-ODblank)/(OD媒介物-ODblank)转换成细胞活力。利用graphpad6软件拟合量效曲线，分别计算两种抑制剂的IC50值，参见表6。以同样密度接种细胞，将两抑制剂稀释成其IC50不同倍数(参见表7)，加入到同一细胞培养孔中，并设置两组单一抑制剂的对照，孵育5天。
表6：化合物1和AMG510两种抑制剂在H358上的IC50值
抑制剂 IC50 value
化合物1 117.4nM
AMG510 38.2nM
表7：按照表6的IC50配制联合实验的抑制剂浓度
Well No. 化合物1 AMG510
1 0 0
2 0.0625IC50 0.0625IC50
3 0.125IC50 0.125IC50
4 0.25IC50 0.25IC50
5 0.5IC50 0.5IC50
6 IC50 IC50
7 2IC50 2IC50
8 4IC50 4IC50
9 8IC50 8IC50
10 16IC50 16IC50
用MTT法测试计算细胞活力(方法同上)，并用CalcuSyn软件计算两化合物的协同系数(Combination Index，CI)，按照公式说明CI<1为协同作用，CI>1为拮抗作用，CI＝1为叠加作用。实验结果参见表8。
表8：AMG510和化合物1的协同系数
Figure RE-GDA0003205807320000101
Figure RE-GDA0003205807320000111
结果如上表显示，各个浓度下，CI值始终小于1，说明化合物1和AMG510联合使用能够在体外培养的H358细胞系上产生协同效果。
体内实验方法和结果
将H358以5e6/只的密度接种于裸鼠右侧背部。经过10天，开始分组，每组肿瘤体积的平均值281.9mm3。按照下表给药21天，两天测量一次肿瘤大小，按照公式TGIRTV(％)：TGIRTV＝1-TRTV/CRTV(％)计算给药组TGI。
表9体内实验给药方案
Figure RE-GDA0003205807320000112
第22天结束实验，取完整肿瘤称取质量，计算每组瘤重抑制率。实验结果如图8所示。化合物1和AMG510联合使用对H358肿瘤的生长有抑制效果，联合组的肿瘤生长抑制率(TGI)大于化合物1单药和AMG510单药两组(图中表格所示)，同时，联合组肿瘤重量抑制率(IR)也均大于两个单药组。通过t检验可知，联合组(化合物1+AMG510)相比单独用药，瘤重和瘤体积均有显著差异(P<0.05)。
2.6实施例F—化合物1和泛RAF抑制剂LY3009120体外和体内联合给药在NSCLCCalu-6上的协同作用
体外实验方法
将细胞系NSCLC Calu-6按照3k/well密度接种于96-well plate中，正常条件培养。第二天分别加入不同浓度的(1-10000nM)化合物1和LY3009120(获自毕得医药)，在含5％二氧化碳37℃孵箱中孵育72h天。加入MTT(5mg/ml)，用酶标仪检测570nm波长下的每个浓度孔的吸光度，利用公式viability＝100％*(ODexperimental-ODblank)/(OD媒介物-ODblank)转换成细胞活力。利用graphpad6软件拟合量效曲线，分别计算两种抑制剂的IC50值，参见表9。以同样密度接种细胞，将两抑制剂稀释成其IC50不同倍数(参见表10)，加入到同一细胞培养孔中，并设置两组单一抑制剂的对照，正常条件下孵育3天。
表10：化合物1和LY3009120两种抑制剂在Calu-6上的IC50值
抑制剂 IC50 value
化合物1 21.38nM
LY3009120 812.44nM
表11：按照表9的IC50配制联合实验的抑制剂浓度
Well No. 化合物1 LY3009120
1 0 0
2 0.0625IC50 0.0625IC50
3 0.125IC50 0.125IC50
4 0.25IC50 0.25IC50
5 0.5IC50 0.5IC50
6 IC50 IC50
7 2IC50 2IC50
8 4IC50 4IC50
9 8IC50 8IC50
10 16IC50 16IC50
用MTT法测试计算细胞活力(方法同上)，并用CalcuSyn软件计算两化合物的协同系数(Combination Index，CI)，按照公式说明CI<1为协同作用，CI>1为拮抗作用，CI＝1为叠加作用。实验结果参见表11。
表12：LY3009120和化合物1的协同系数
化合物1 LY3009120 Fa(抑制率) CI
(nM) (nM)
1.33623 50.775 0.184994 0.831
2.67245 101.55 0.309832 0.515
5.34491 203.1 0.468952 0.417
10.6898 406.2 0.661708 0.330
21.3796 812.4 0.756792 0.393
42.7592 1624.8 0.836352 0.454
85.5185 3249.6 0.889392 0.551
171.037 6499.2 0.913325 0.819
342.074 12998.4 0.952781 0.803
结果显示，各个浓度下，CI值始终小于1，说明化合物1和LY3009120联合使用能够在体外培养的Calu-6细胞系上产生协同效果。
体内实验方法
将Calu-6以5e6/只的数量接种于裸鼠(B/C nude小鼠，购买自维通利华)右侧背部，经过7天，开始分组，每组肿瘤体积的平均值264mm3，按照下表给药21天，一周测量两次肿瘤大小，按照公式TGI＝[1-(treatment-treatment0)/(媒介物-媒介物0)]*100％计算给药组TGI，第22天结束实验，取完整肿瘤称取质量，计算每组瘤重抑制率。
表13：体内实验给药方案
Figure RE-GDA0003205807320000131
如图5所示，化合物1和LY3009120联合使用对Calu-6肿瘤的生长有抑制效果，联合组的肿瘤生长抑制率(TGI)大于化合物1单药和LY3009120单药两组(图中表格所示)，同时，联合组肿瘤重量抑制率(IR)也均大于两个单药组。根据联合用药评价公式 q＝TGIAB/(TGIA+TGIB-TGIA*TGIB)(A＝化合物1,B＝LY3009120,q＝1表示两药作用相加， q>1表示两药作用协同，q<1表示两药作用拮抗),q值为1.07具有协同作用。通过t检验可知，无论肿瘤体积或者肿瘤重量上，联合组(化合物1+LY3009120)相比两组单独用药，均有显著差异(P<0.05)。因此，化合物1与LY3009120联合疗法在Calu-6(KRAS Q61K)NSCLC 的异种移植模型(xenograft)上产生了良好的协同作用。
2.7实施例G—化合物1单独给药或联合给药在肿瘤细胞Colo-205、HT-29和A375中的体外抗肿瘤活性
将下述细胞培养于含有10％的胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的完全培养基中。培养环境为相对湿度95％，CO2浓度5％的无菌培养箱中。
表14细胞信息
细胞株名称 培养基配方 细胞突变位点
Colo-205 RPMI-1640(Hyclone)+10％FBS(BI) BRAF<sup>V600E</sup>
HT-29 McCoy’s 5a(Gibco)+10％FBS(BI) BRAF<sup>V600E</sup>
A375 DMEM(Hyclone)+10％FBS(BI) BRAF<sup>V600E</sup>
将细胞接种于细胞培养瓶中，加入适量完全培养基，置于无菌培养箱培养，当细胞汇合度达到80％以上，进行传代培养。
称取适量化合物1或Vemurafenib于1.5ml离心管中，加入相应体积的二甲基亚砜(DMSO)配成20mM浓度的储备液并分装，避光保存于-20℃冰箱中备用。
单独给药
以下采用MTT/MTS法检测体外培养细胞的增殖。胰酶消化对数生长期的贴壁细胞或者离心收集悬浮细胞，计数，按1000-3000个/孔的细胞接种密度接种90μl细胞悬液于96孔板，24小时后加入培养基稀释的10倍终浓度化合物10μl/孔(浓度设置见表1.)。以加入同样体积的5％DMSO的孔作为对照，DMSO终浓度为0.5％。药物处理3天后， MTT/MTS检测细胞活力。具体方法如下：每孔加入20μl MTT放入培养箱继续培养4小时后，弃上清并加入150ulDMSO溶解结晶甲瓒，利用酶标仪检测490nM吸光度，或者每孔加入10ul MTS，培养箱中孵育4小时后，直接利用酶标仪检测490nM吸光度。 GraphPad Prism 6软件制作量效曲线并计算IC50。重复实验三遍，并且计算IC50的平均值。
表15.化合物1和Vemurafenib体外抗细胞增殖实验的化合物终浓度
Figure RE-GDA0003205807320000141
C表示:化合物浓度
实验采用四氮唑盐(MTT/MTS)方法检测化合物1和Vemurafenib对BRAF突变的肿瘤细胞的体外抗增殖活性作用。结果显示化合物1对2株BRAF突变的结肠癌细胞系具有强烈的抑制增殖作用。其化合物剂量效应曲线见图6，相应的IC50见表14-16。
表16.化合物1和Vemurafenib对Colo-205细胞的IC50值
Drugs 1st(nM) 2nd(nM) 3rd(nM) Mean±SD(nM)
化合物1 4.9 4.8 4.7 4.8±0.1
Vemurafenib 2279.5 1869.5 2196.9 2115.3±216.8
表17.化合物1和Vemurafenib对HT-29细胞的IC50值
Drugs 1st(nM) 2nd(nM) 3rd(nM) Mean±SD(nM)
化合物1 2.8 2.7 3.5 3±0.4
Vemurafenib 2316.6 1645.9 2008.7 1990.4±335.7
表18.化合物1和Vemurafenib对A375细胞的IC50值
A375 1st(nM) 2nd(nM) 3rd(nM) Mean±SD(nM)
化合物1 3.0 2.9 2.7 2.9±0.2
Vemurafenib 716.4 1068.5 563.7 782.9±258.9
联合给药
根据第一部分实验得到的化合物1和Vemurafenib在两个细胞上IC50均值来设置联合用药实验的药物浓度。具体剂量见表17。
表19.化合物1和Vemurafenib联合用药实验的浓度设置
Figure RE-GDA0003205807320000142
Figure RE-GDA0003205807320000151
将细胞接种于细胞培养瓶中，加入适量完全培养基，置于无菌培养箱培养，当细胞汇合度达到80％以上，进行传代培养。
以下采用MTS/MTT法检测细胞的增殖。胰酶消化对数生长期的贴壁细胞或者离心收集悬浮细胞，计数，按1000-3000个/孔的细胞接种密度接种80μl细胞悬液于96孔板，经过24小时孵育，先后向每孔加入10μl化合物1(10倍终浓度)和10μl Vemurafenib(10倍终浓度)。以加入同样体积的2.5％DMSO的孔作为对照，DMSO终浓度为0.5％，另设置只有一种化合物的单药对照，每个浓度有三个复孔。药物处理3天后，MTT/MTS检测细胞活力。具体方法如下：每孔加入20μl MTT放入培养箱继续培养4小时后，弃上清并加入 150ul DMSO溶解结晶甲瓒，利用酶标仪检测490nM吸光度，或者每孔加入10ul MTS，培养箱中孵育4小时后，直接利用酶标仪检测490nM吸光度。用药物协同作用评测软件 Calcusyn计算联合指数(combination index,CI)。重复实验2～3遍。
利用MTS/MTT细胞增殖检测法测试双药联合作用下细胞存活，通过对比同时进行的化合物1和Vemurafenib单药测试，利用TING-CHAO CHOU建立的药物协同作用模型来计算CI值，通过CI值(CI>1拮抗作用；CI＝1叠加作用；CI<1协同作用)来判断是否具有协同效应。
在Colo-205上，通过对三次实验结果的综合判断，从1/8倍IC50到4倍IC50之间的浓度范围内，化合物1和Vemurafenib具有协同作用，并且在IC50附近，具有强烈的协同作用。见表18。
表20.colo-205的CI值汇总
Figure RE-GDA0003205807320000152
Fa值代表药物对细胞的抑制率
在HT-29上，通过对三次实验结果的综合判断，从1/16倍IC50到4倍IC50之间的浓度范围内，化合物1和Vemurafenib具有协同作用，并且在1/2倍IC50附近，具有强烈的协同作用。见表19。
表21.HT-29的CI值汇总
Figure RE-GDA0003205807320000161
Fa值代表药物对细胞的抑制率
在A375上，通过对三次实验结果的综合判断，从1/4倍IC50到4倍IC50之间的浓度范围内，化合物1和Vemurafenib具有协同作用，并且在IC50附近，具有强烈的协同作用。见表20。
表22.A375的CI值汇总
Figure RE-GDA0003205807320000162
Fa值代表药物对细胞的抑制率
2.8实施例H—化合物1单独给药或联合给药在肿瘤细胞A375中的体内抗肿瘤药效
将A375以5e6/只的密度接种于裸鼠右侧背部。经过7天，开始分组，每组肿瘤体积的平均值188mm3。按照下表给药9天，一周测量两次肿瘤大小，按照公式TGI＝[1-(treatment- treatment0)/(媒介物-媒介物0)]*100％计算给药组TGI。
表23给药方案
Figure RE-GDA0003205807320000171
第10天结束实验，取完整肿瘤称取质量，计算每组瘤重抑制率。实验结果如图7A和7B所示。化合物1和Vemurafenib联合使用对A375肿瘤的生长有抑制效果，联合组的肿瘤生长抑制率(TGI)大于化合物1单药和Vemurafenib单药两组(图中表格所示)，同时，联合组肿瘤重量抑制率(IR)也均大于两个单药组。根据联合用药评价公式 q＝TGIAB/(TGIA+TGIB-TGIA*TGIB)(A＝化合物1,B＝Vemurafenib,q＝1表示两药作用相加， q>1表示两药作用协同，q<1表示两药作用拮抗)，q值为1.51具有协同作用。通过t检验可知，联合组(化合物1+Vemurafenib)相比Vemurafenib单独用药，瘤重和瘤体积均有显著差异(P<0.05)。
以上结果表明化合物1和Vemurafenib在BRAF V600E突变的肿瘤细胞上(两株结肠癌细胞一株黑色素瘤细胞)的协同作用，结果表明化合物1与Vemurafenib作为单药对细胞的增殖有显著抑制效果，相比单独用药，化合物1和Vemurafenib联合作用下，癌细胞对药物刺激更加敏感，在一定水平的抑制率下，两种化合物有比较强烈的协同作用。
2.9实施例I—化合物1单独给药或联合SHP2抑制剂SHP099的抗肿瘤活性
将下述细胞培养于含有10％的胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的完全培养基中。培养环境为相对湿度95％，CO2浓度5％的无菌培养箱中。
表24细胞信息
细胞株名称 培养基配方 细胞突变位点
H358 RPMI-1640(Gibco)+10％FBS(Yeason) KRAS<sup>G12C</sup>
将细胞接种于细胞培养瓶中，加入适量完全培养基，置于无菌培养箱培养，当细胞汇合度达到80％以上，进行传代培养。
称取适量化合物1或SHP099于1.5ml离心管中，加入相应体积的二甲基亚砜(DMSO)配成20mM浓度的储备液并分装，避光保存于-20℃冰箱中备用。
单独给药
以下采用MTT法检测体外培养细胞的增殖。胰酶消化对数生长期的贴壁细胞或者离心收集悬浮细胞，计数，按3000个/孔的细胞接种密度接种90μl细胞悬液于96孔板，24 小时后加入培养基稀释的10倍终浓度化合物10μl/孔(浓度设置见表1.)。以加入同样体积的5％DMSO的孔作为对照，DMSO终浓度为0.5％。药物处理5天后，MTT检测细胞活力。具体方法如下：每孔加入10μl MTT放入培养箱继续培养4小时后，弃上清并加入150 ul DMSO溶解结晶甲瓒，利用酶标仪检测490nM吸光度。GraphPad Prism 6软件制作量效曲线并计算IC50。重复实验三遍，并且计算IC50的平均值。
表25.化合物1和SHP099体外抗细胞增殖实验的化合物终浓度
Figure RE-GDA0003205807320000181
C表示:化合物浓度
实验采用四氮唑盐(MTT)方法检测化合物1和SHP099对KRAS突变的肿瘤细胞的体外抗增殖活性作用。结果显示化合物1对KRAS突变的肺癌细胞系具有强烈的抑制增殖作用。其化合物剂量效应曲线见图9，相应的IC50见表26。
表26.化合物1和SHP099对H358细胞的IC50值
Drugs IC50(nM)
化合物1 7.24
SHP099 5808.51
联合给药
根据第一部分实验得到的化合物1和SHP099在两个细胞上IC50值来设置联合用药实验的药物浓度。具体剂量见表17。
表27.化合物1和SHP099联合用药实验的浓度设置
Figure RE-GDA0003205807320000182
将细胞接种于细胞培养瓶中，加入适量完全培养基，置于无菌培养箱培养，当细胞汇合度达到80％以上，进行传代培养。
以下采用MTS/MTT法检测细胞的增殖。胰酶消化对数生长期的贴壁细胞或者离心收集悬浮细胞，计数，按1000-3000个/孔的细胞接种密度接种80μl细胞悬液于96孔板，经过24小时孵育，先后向每孔加入10μl化合物1(10倍终浓度)和10μl SHP099(10倍终浓度)。以加入同样体积的2.5％DMSO的孔作为对照，DMSO终浓度为0.5％，另设置只有一种化合物的单药对照，每个浓度有三个复孔。药物处理3天后，MTT/MTS检测细胞活力。具体方法如下：每孔加入10μl MTT放入培养箱继续培养4小时后，弃上清并加入150 ul DMSO溶解结晶甲瓒，利用酶标仪检测490nM吸光度，或者每孔加入10ul MTS，培养箱中孵育4小时后，直接利用酶标仪检测490nM吸光度。用药物协同作用评测软件Calcusyn 计算联合指数(combinationindex,CI)。重复实验2～3遍。
利用MTS/MTT细胞增殖检测法测试双药联合作用下细胞存活，通过对比同时进行的化合物1和SHP099单药测试，利用TING-CHAO CHOU建立的药物协同作用模型来计算 CI值，通过CI值(CI>1拮抗作用；CI＝1叠加作用；CI<1协同作用)来判断是否具有协同效应。
在H358上，从1/8倍IC50到4倍IC50之间的浓度范围内，化合物1和SHP099具有协同作用，并且在IC50附近，具有强烈的协同作用。见表18。
表28.化合物1和SHP099联合使用在H358上的CI值汇总
Figure RE-GDA0003205807320000191
Fa值代表药物对细胞的抑制率
2.10实施例J—化合物1单独给药或联合给药在肿瘤细胞H358中的体内抗肿瘤药效
将H358以5e6/只的密度接种于裸鼠右侧背部。经过10天，开始分组，每组肿瘤体积的平均值281.9mm3。按照下表给药21天，两天测量一次肿瘤大小，按照公式TGIRTV(％)：TGIRTV＝1-TRTV/CRTV(％)计算给药组TGI。
表29给药方案
Figure RE-GDA0003205807320000192
第22天结束实验，取完整肿瘤称取质量，计算每组瘤重抑制率。实验结果如图9所示。化合物1和SHP099联合使用对H358肿瘤的生长有抑制效果，联合组的肿瘤生长抑制率(TGI)大于化合物1单药和SHP099单药两组(图中表格所示)，同时，联合组肿瘤重量抑制率(IR)也均大于两个单药组。通过t检验可知，联合组(化合物1+SHP099)相比单独用药，瘤重和瘤体积均有显著差异(P<0.05)。
上述实施例和一些实施方案的描述应理解为说明性，而并非是对本发明进行限制，本发明由权利要求限定。容易理解的是，可利用上述特征的多种变化和组合而不脱离权利要求中所述的本发明。所有这样的变化旨在包括于本发明的范围内。援引的全部参考文献通过引用以其整体并入本申请。

Claims (16)

1.一种联合疗法，所述联合疗法包括对患有癌症的哺乳动物给药治疗有效量的第一组分和第二组分，所述第一组分为MEK抑制剂，所述第二组分为化疗剂、KRAS抑制剂、SHP2抑制剂、RAF抑制剂，或者所述化疗剂和/或KRAS抑制剂和/或RAF抑制剂的组合。
2.权利要求1的联合疗法，其中所述MEK抑制剂为式(I)化合物或其药学上的盐，
Figure RE-FDA0003205807310000011
其中，
X＝O、S或C＝O；
Y＝N或CH；
R1、R2、R4和R5各自独立地选自氢、卤素或C1-6烷基；
R3选自氢、卤素、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、卤代C1-6烷氧基、卤代C1-6烷硫基、C1-6烷基和卤代C1-6烷基；
R6为-C(O)NR8R7或-NHSO2R7；
R7和R8各自独立地选自氢、被羟基取代的C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环烷基C1-6烷基和被羟基取代的C3-6环烷基C1-6烷基。
3.权利要求1的联合疗法，其中所述MEK抑制剂为化合物1、化合物2、化合物3、或化合物4。
Figure RE-FDA0003205807310000012
4.权利要求1的联合疗法，其中所述MEK抑制剂以0.1至1000mg/kg体重的有效量给药至所述哺乳动物，一天给药两次或一周给药两次。
5.权利要求1的联合疗法，其中所述化疗剂选自顺铂、卡铂、紫杉醇、结合白蛋白的紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、长春瑞滨、依托泊苷和培美曲塞。
6.权利要求5的联合疗法，其中所述化疗剂为多西他赛。
7.权利要求1的联合疗法，其中所述癌症是RAS基因突变的癌症。
8.权利要求7的联合疗法，其中所述癌症是胰腺癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、急性骨髓性白血病、膀胱癌或头颈癌。
9.权利要求8的联合疗法，其中所述癌症具有选自KRAS突变或NRAS突变或BRAF突变。
10.权利要求9的联合疗法，其中KRAS突变形式在选自G12、G13、S17、P34、A59和Q61的一个或多个氨基酸位置处具有突变。
11.权利要求9的联合疗法，其中所述KRAS突变形式在选自G12、G13、A59、Q61、K117和A146的一个或多个氨基酸位置处具有突变。
12.权利要求9的联合疗法，其中所述BRAF突变为BRAF V600E突变。
13.权利要求7的联合疗法，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
14.权利要求1的联合疗法，其中所述KRAS抑制剂为AMG-510、MRTX849或BI1701963。
15.权利要求1的联合疗法，其中所述RAF抑制剂为LY3009120、PLX4032、LGX818、GSK2118436、BI 882370、TAK580或Vemurafenib。
16.权利要求1的联合疗法，其中所述SHP2抑制剂为JAB-3068、TNO155、BBP-398(IACS-15509)、JAB-3312或SHP099。
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