CN113433064A - 一种透明质酸检测试剂盒及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测透明质酸的试剂盒及其方法。本发明通过将HABP包被于胶乳微球上，并利用封闭剂对试剂盒进行封闭后，在一定波长下，用来检测血清中透明质酸的含量。实验结果表明，本发明所述的胶乳免疫比浊法制备的透明质酸检测试剂盒相对其他方法学的透明质酸检测试剂盒在准确度、精密度、线性、稳定性、灵敏度方面均较好，且该方法较其他方法安全性好，检测速速快，且易自动化，试用在产业上有效地推广应用。

Description

一种透明质酸检测试剂盒及其方法

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂生化试剂技术领域，具体涉及一种透明质酸检测试剂盒及其方法。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid HA)是一种大分子的多糖，其主要合成场所是间质细胞，并通过淋巴循环进入人体血液中，后在肝脏中代谢，通过肾小球滤过后排出。一般正常人血清含HA的量小于100ng/ml。由于透明质酸是经过肝内皮细胞摄取降解，所以患有肝病的患者尤其是肝硬化的患者，由于肝内皮细胞受损，导致其对透明质酸的摄取和降解功能的下降，使得肝病患者血清中的透明质酸含量增加，所有通过检测血清中透明质酸的含量的变化可以做为早期诊断肝纤维化的指标。另外，患有类风湿性关节炎和硬皮病时，会增加血清中透明质酸的来源，而使其含量增加；或者肝肾疾病会影响人体内透明质酸的排出，而使其在血清中的含量增加。所以，通过检测血清中透明质酸含量的变化，可以反映肝脏病变及肝硬化程度。

目前血清中透明质酸的含量的检测方法主要有放射性免疫检测法、酶联免疫检测法 (ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)。放射性免疫检测法主要是在未知HA量的标本中加入一定量透明质酸结合蛋白(HABP)；再加入碘标记透明质酸，使其与标本反应所剩的HABP 结合；再用第一抗体即羊或者兔抗HABP血清、第二抗体即驴抗羊或羊抗兔血清，将HABP沉淀下去，测定其放射性，HABP所结合的碘标记的HA与标本中HA含量呈负相关，用HA标准品同步对比操作作出放射性浓度标准曲线，把测得的待测标本放射性相对值在标准曲线上查出对应浓度值。但该方法对设备和人员要求高，不利于应用推广。ELISA检测HA主要是以HABP (透明质酸结合蛋白)为抗体、双夹心法为基础，与放免法比较，灵敏度相近，但检测血清 HA值却明显低于放免法。化学发光免疫分析法检测血清中的透明质酸，主要基于竞争和夹心两种技术，竞争法的原理是将样本中的HA通过与固相载体上的包被HA与稀释液中的HABP结合实现检测，样本HA浓度越高，发光值越低；夹心法检测通过形成固相包被HABP-HA-HABP”夹心复合物”实现检测，发光值与样本HA浓度成正比。但该方法与酶免和放免检测的正常人血清中HA的含量差异很大，分析可能原因是HA本身是一类分子量大小不均匀的多糖分子，其分子量的范围从105-107，双抗体夹心法需要有20个以上的糖基与蛋白结合才能够检测出来，而放免和酶免不需要HA有20个以上的糖基，所以其检测的范围较双抗体夹心法广泛。而酶免和放免检测透明质酸均有其不足之处。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测血清样本中透明质酸含量的操作简便、成本低、可自动化、准确度高的方法，使其能够在临床上得到广泛应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种透明质酸检测试剂盒，该试剂盒包含试剂R1、R2和校准品；其中试剂R1中包含缓冲液、氯化钠、防腐剂以及稳定剂。所述试剂R2包含活化缓冲液、包被缓冲液、封闭液、贮存缓冲液，以及胶乳微球和HABP，以及偶联剂。

本发明的检测原理如下：将透明质酸结合蛋白(HABP)通过偶联剂包被至胶乳微球上，样本中的HA与微球上的HABP特异性结合后，通过在一定波长下测定吸光度的变化，此种变化与样本中的HA含量成比例，从而定量测定出血清样本中HA的含量。

本发明所述试剂R1组分浓度为：缓冲液0.1-100mmol/L、氯化钠1-20g/L、防腐剂0.1-10g/L、稳定剂0.1-10g/L；所述试剂R2组分浓度为：活化缓冲液0.1-100mmol/L、包被缓冲液0.1-100mmol/L、封闭液0.1-100mmol/L、贮存缓冲液0.1-100mmol/L、胶乳微球 1-100ml/L、HABP 2-200ml/L、偶联剂1 0.1-5g/L，偶联剂2 0.05-2.5g/L。

本发明所述试剂R1组分优选的浓度为：缓冲液25mmol/L、氯化钠9g/L、防腐剂5g/L、稳定剂5g/L；所述试剂R2组分优选的浓度为：活化缓冲液50mmol/L、包被缓冲液50mmol/L、封闭液25mmol/L、贮存缓冲液50mmol/L、胶乳微球30ml/L、HABP 50ml/L、偶联剂1 1g/L，偶联剂2 0.5g/L。

优选的试剂R1中，所述的缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl，MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种；试剂R2中，所述的活化缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl，MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种，所述的包被缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl，MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种，所述的封闭液液为磷酸缓冲液、Tris-HCl，MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种，并在其中加入牛血清白蛋白，所述的贮存缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl，MES缓冲液、HEPES 缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种。

优选的所述试剂R1和试剂R2中的缓冲液的PH值为5.0-9.0。

为了提高该发明试剂盒的稳定性，优选的试剂R1和R2中的稳定剂为PEG系列。试剂R1和R2中的防腐剂为叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列，优选Proclin 300。试剂R2中的偶联剂为，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)。试剂R2中的胶乳微球的粒径为0.08-0.5μm。

本发明还提供了一种上述透明质酸检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

(1)依次加入试剂R1，待测样本，混匀，37℃下温育4-10分钟，后加入试剂R2，混匀，37℃温育4-10分钟后，600nm波长下测定吸光度；

(2)根据定标的标准曲线计算待测样品中透明质酸的浓度。

优选的，标准曲线采用HA校准品定标，HA校准品的浓度为0～1000ng/ml。

本发明所述试剂盒通过将天然蛋白HABP包被于胶乳微球上，使其能够特异性结合血清样本中的HA。本发明测定血清中HA含量。试验结果表明，本发明所述的透明质酸检测试剂盒测定结果与放射性免疫分析法的测定结果一致，较酶免和化学发光的试剂测定结果准确，且稳定性好，在冷藏状态下至少能稳定存放13个月，线性范围宽，灵敏度高，检测速度快，且易于自动化操作。

附图说明

图1所示是本发明透明质酸测定试剂盒A线性图。

图2所示是本发明透明质酸测定试剂盒B线性图。

图3所示是本发明透明质酸测定试剂盒C线性图。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种透明质酸检测试剂盒及方法。通过实施例进一步阐述本发明的技术手段、优点及功效，以下实施例旨在说明本发明，但并不限定本发明的范围，相关领域的技术人员在没有背离本发明的主旨和范围内，可对实施例进行更换和修改，但这些修改和更换均在本发明保护范围内。

实施例1

血清中透明质酸检测试剂盒的制备过程：

试剂R1的组成成分及浓度：

MES(pH6.0) 25mmol/L

氯化钠 9g/L

PEG6000 5g/L

Proclin300 5g/L

试剂R2的组成成分及浓度：

活化缓冲液的组成成分及浓度：

MES(pH6.0) 50mmol/L

Proclin 300 5g/L；

包被缓冲液的组成成分及浓度：

HEPES(pH7.5) 50mmol/L

Proclin300 5g/L

封闭缓冲液的组成成分及浓度：

甘氨酸(pH7.0) 25mmol/L

BSA 5g/L

Proclin300 5g/L

贮存缓冲液的组成成分及浓度：

Tris-HCl(pH7.0) 50mmol/L

Proclin300 5g/L

胶乳微球 30ml/L

HABP 50ml/L

NHS 1g/L

EDC 0.5g/L

试剂R1的制备过程：

依次加入制备量的MES、氯化钠、PEG6000、Proclin300四种化合物与制备量的80％的纯化水中，且每种物质在完全溶解完后，再加入另一种物质，用1N或者6N的NaOH调节 pH至6.0，纯化水定容至制备量。

试剂R2的制备过程：

(1)取制备量的胶乳微球加入至制备量的活化缓冲液中，混匀后，依次加入制备量的 NHS和EDC，置于37℃恒温振荡器中反应30分钟后，取出；

(2)取制备量的HABP原料加入至制备量的包被缓冲液中，混匀；

(3)将(2)中的溶液加入至(1)中，混匀后，置于37℃恒温振荡器中反应2小时后，取出；

(4)取制备量的封闭液加入至(3)中，混匀后，置于37℃恒温振荡器中反应30分钟后，取出；

(5)取制备量的贮存缓冲液加入至(4)中，混匀后，即得试剂R2。

血清中透明质酸检测试剂盒在全自动生化分析仪上的应用：

分析方法：速率法

反应方向：上升反应

校准方式：spline

测定主波长：600nm

测定副波长：800nm

测定温度：37℃

加样量比例：样本：R1:R2＝2:180:60(μL)

操作步骤：将2μL检测样本加入到180μL试剂R1中，37℃孵育3-5分钟后读取吸光度A1，后加入试剂R2 60μL，混匀，37℃温育5分钟后读取吸光度A2，计算ΔA＝A2-A1。

定标：采用多点定标法，用东芝-40全自动生化分析仪进行检测，校准品浓度为：C10ng/mL、C2 50ng/mL、C3 100ng/mL、C4 200ng/mL、C5 400ng/mL、C6 1200ng/mL。

实施例2

透明质酸测定试剂盒性能评估

一、分析灵敏度

以实施例1配制的本发明三批试剂盒A、B、C同时定标，其结果见表1。

表1本发明三批透明质酸测定试剂盒A、B、C定标结果

由表1可以看出，本发明试剂盒A、B、C在透明质酸含量为50ng/L时，吸光度变化率分别是0.0258、0.0255、0.0269，均大于0.005。

二、准确度测定

以实施例1配制的本发明三批试剂盒A、B、C通过回收实验测定准确度。

在临床血清样本中加入一定体积的标准溶液，通过测值计算其回收率。测定结果及回收率见表2。

表2本发明三批透明质酸测定试剂盒准确度测定结果

由表2可以看出，本发明试剂盒A、B、C的回收率从104.67％至99.80％，均小于105％-95％，说明该试剂盒的准确度较高。

三、加速稳定性检测

以实施例1配制的本发明一批试剂盒A通过水浴37℃加速后，定标，并测定10例新鲜血清样本。测定结果见表3、表4。

表3透明质酸测定试剂盒加速后定标结果

表4透明质酸测定试剂盒加速后测定10例新鲜血清样本结果

单位：ng/L

通过表4可以看出，本发明试剂盒A在37℃加速3天、5天、7天、10天后，测定 10例新鲜血清样本平均值的偏差小于5％，性能稳定。可以看出本发明试剂盒A在37℃加速稳定性较好。

四、批间差实验

以实施例1配制的本发明三批试剂盒A、B、C，测定同一质控标本，每个水平重复测定三次，其结果见表5。

表5本发明三批透明质酸测定试剂盒A、B、C批间差实验结果

由表5可以看出，本发明试剂盒A、B、C测定低值质控的批间差为0.36％，测定高值质控的批间差为0.15％。由此可见，该试剂盒的批间差小于5％，批间差很小。

五、线性检测

以实施例1配制的三批本发明试剂盒A、B、C通过测定由透明质酸浓品配制成的一系类浓度梯度的标准溶液，进行线性测定。其线性结果见表6、表7、表8、图1、图2、图3。

表6透明质酸测定试剂盒A线性结果

表7透明质酸测定试剂盒B线性结果

表8透明质酸测定试剂C线性结果

由表6、表7、表8、图1、图2、图3可知，本发明透明质酸测定试剂盒A、B、C 线性相关系数R2均为0.9999，[15.63，250]ng/L范围内，绝对偏差小于±5ng/L；在(250， 1000]ng/L范围内，相对偏差小于±2％。本发明透明质酸测定试剂盒的线性很好。

Claims (12)

1.一种透明质酸检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包含试剂R1和R2和校准品，其中试剂R1中包含缓冲液、氯化钠、防腐剂以及稳定剂；试剂R2包含活化缓冲液、包被缓冲液、封闭液、贮存缓冲液，以及胶乳微球和HABP，以及偶联剂。

2.根据权利要求1所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1组分浓度为：缓冲液 0.1-100 mmol/L、氯化钠1-20g/L、防腐剂0.1-10g/L、稳定剂0.1-10 g/L；所述试剂R2组分浓度为：活化缓冲液 0.1-100 mmol/L、包被缓冲液 0.1-100 mmol/L、封闭液 0.1-100 mmol/L、贮存缓冲液 0.1-100 mmol/L、胶乳微球1-100ml/L、HABP 2-200ml/L、偶联剂10.1-5g/L，偶联剂2 0.05-2.5g/L。

3.根据权利要求2所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1组分浓度为：缓冲液 25mmol/L、氯化钠9g/L、防腐剂5g/L、稳定剂5 g/L；所述试剂R2组分浓度为：活化缓冲液50 mmol/L、包被缓冲液 50mmol/L、封闭液 25 mmol/L、贮存缓冲液 50 mmol/L、胶乳微球30ml/L、HABP 50ml/L、偶联剂1 1g/L，偶联剂2 0.5g/L。

4.根据权利要求1-3所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，试剂R1中，所述的缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl，MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种；试剂R2中，所述的活化缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl，MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种，所述的包被缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl，MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种，所述的封闭液液为磷酸缓冲液、Tris-HCl，MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种，并在其中加入牛血清白蛋白，所述的贮存缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl，MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种。

5.根据权利要求4所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2中的缓冲液的PH值为5.0-9.0。

6.根据权利要求1-3所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，试剂R1中的稳定剂为PEG系列。

7.根据权利要求1-3所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，试剂R1中的防腐剂为叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列。

8.根据权利要求1-3所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，试剂R2中的偶联剂为N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）。

9.根据权利要求1-3所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，试剂R2中的胶乳微球的粒径为0.08-0.5μm。

10.根据权利要求1-9所述，透明质酸检测试剂盒的检测方法包括如下步骤：

（1）依次加入试剂R1，待测样本，混匀，37℃下温育4-10分钟，后加入试剂R2，混匀，37℃温育4-10分钟后，600nm波长下测定吸光度；

（2）根据定标的标准曲线计算待测样品中透明质酸的浓度。

11.根据权利要求10所述，其特征在于，所述的标准曲线采用透明质酸校准品定标。

12.根据权利要求11所述，其特征在于，透明质酸校准品的浓度为0-1000ng/mL。

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