CN113425836A - 重组人溶菌酶的新应用和祛痰药物 - Google Patents
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Abstract
本申请属于医药技术领域，尤其涉及重组人溶菌酶的新应用和祛痰药物。本申请第一方面公开了重组人溶菌酶在制备治疗或预防呼吸系统疾病的药物中的应用。本申请第二方面公开了重组人溶菌酶在制备治疗或预防呼吸系统疾病的多痰症状的药物中的应用。本申请第三方面提供了一种祛痰药物，包括重组人溶菌酶和药学上可接受的辅料；所述重组人溶菌酶的氨基酸序列为SEQ.ID.No.1、SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.3。本申请公开的重组人溶菌酶的新应用和祛痰药物，是一种有效治疗或预防呼吸系统疾病，或治疗或预防呼吸系统疾病的多痰症状的药物。
Description
技术领域
本申请属于医药技术领域，尤其涉及重组人溶菌酶的新应用和祛痰药物。
背景技术
呼吸系统疾病可由病毒引起。包括鼻病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、冠状病毒、腺病毒、流感和副流感病毒、呼吸道合胞病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒等。也有由细菌引起。细菌感染可直接感染或继发于病毒感染之后，以溶血性链球菌为最常见，其次为流感嗜血杆菌、肺炎球菌、葡萄球菌，肺炎双球菌、支原体、衣原体等，偶或为革兰阴性细菌。新型冠状病毒感染的肺炎是由新型冠状病毒(nCoV)感染导致的肺部炎症。
咳嗽、痰多是呼吸系统疾病的常见症状，咳嗽由气管、支气管粘膜或胸膜受炎症、异物、物理或化学性刺激引起，咳嗽时先是声门关闭，呼吸肌收缩，肺内压升高，然后声门张开，肺内空气喷射而出。咳嗽伴随聚集液体咳出称为咳痰。男女老少在一年四季里皆有有可能患上此症，发病率极高，且如果不及时根治，咳嗽不停，由急性转为慢性常常给患者带来更大的痛苦，如胸闷、咽痒、喘气等，即使症状未加重也影响休息睡眠。
目前，西医止咳化痰的常用药有氨溴索、沐舒坦、氯化铵、必消痰、羧甲半胱氨酸，其对于抑制短期的痰多症状具有显著疗效，但并不能有效止咳祛痰。且西药多以消炎、并配以抗生素类药物来治疗，但是副作用比较大，尤其是抗生素，抗生素的滥用会造成严重的耐药性，有些慢行支气管炎引起的咳嗽也不宜长期使用抗生素治疗。
因此，寻找一种无毒无副作用，不产生耐药性，可以长期使用的祛痰药物，可治疗肺部感染、呼吸道感染和新型冠状病毒感染疾病的药物是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本申请提供了重组人溶菌酶的新应用和祛痰药物，提供了一种有效治疗或预防呼吸系统疾病，或治疗或预防呼吸系统疾病的多痰症状的药物。
本申请第一方面公开了重组人溶菌酶在制备治疗或预防呼吸系统疾病的药物中的应用。
本申请第二方面公开了重组人溶菌酶在制备治疗或预防呼吸系统疾病的多痰症状的药物中的应用。
其中，经军事医学科学院采用小鼠、猕猴为实验动物模型进行毒性、药代动力学试验研究表明，本申请的重组人溶菌酶无毒、安全，无副作用。重组人溶菌酶没有过敏反应，无毒副作用，重复使用也不会产生耐药性。重组人溶菌酶是人源性蛋白质药物，优于原有的抗生素。本申请的重组人溶菌酶填补治疗或预防呼吸系统疾病的多痰症状的药品领域空白。
另一是实施例中，所述呼吸系统疾病包括病毒、细菌、耐药菌引起的肺炎、气管炎、慢性支气管炎、支气管哮喘、支气管扩张或慢性阻塞性肺病。
另一是实施例中，所述病毒选自鼻病毒、冠状病毒、腺病毒、流感和副流感病毒、呼吸道合胞病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒和风疹病毒中的一种或多种。
另一是实施例中，所述冠状病毒包括SARS、SARS-CoV-2和COVID-19中的一种或多种。
另一是实施例中，所述细菌选自溶血性链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、支原体、衣原体和葡萄球菌中的一种或多种。
另一是实施例中，所述药物为雾化溶液药物。
另一是实施例中，所述重组人溶菌酶的使用量为10000U～100000U/mL/d。
另一是实施例中，所述重组人溶菌酶的氨基酸序列为SEQ.ID.No.1、SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.3。
本申请第三方面提供了一种祛痰药物，包括重组人溶菌酶和药学上可接受的辅料；所述重组人溶菌酶的氨基酸序列为SEQ.ID.No.1、SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.3。
另一是实施例中，所述祛痰药物的剂型选自气雾剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、煎膏剂、悬浮剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂或贴剂。
需要说明的是，本申请的重组人溶菌酶，为含有130个氨基酸，分子量约为14700Da，其氨基酸序列为SEQ.ID.No.1：
KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV；
本申请重组人溶菌酶也可以为多四个氨基酸的重组人溶菌酶，多四个氨基酸的重组人溶菌酶有134氨基酸，分子量约为15,100Da，其氨基酸序列为SEQ.ID.No.2：
EAEAKVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV；
本申请重组人溶菌酶也可以为多六个氨基酸的重组人溶菌酶，多六个氨基酸的重组人溶菌酶有136氨基酸，其氨基酸序列为SEQ.ID.No.3：
EAEAEAKVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV。
其中，上述多四个氨基酸的重组人溶菌酶与多六个氨基酸的重组人溶菌酶的效果与重组人溶菌酶的效果相当，多四个氨基酸的重组人溶菌酶与多六个氨基酸的重组人溶菌酶的纯度和活性比重组人溶菌酶更高。
本申请发现重组人溶菌酶是一种可和多种酸性成分反应的基本蛋白，它和酸性粘液糖蛋白反应；重组人溶菌酶可影响凝胶结构，因而影响流变学和气管、支气管粘液的运输特性，重组人溶菌酶有衰解酸性黏多糖作用，净化呼吸通道，减少肺炎综合征的发生几率。因此，本申请公开了重组人溶菌酶在制备治疗或预防呼吸系统疾病的药物中的应用，尤其是重组人溶菌酶在制备治疗或预防呼吸系统疾病的多痰症状的药物中的应用。试验表明，本申请的重组人溶菌酶具有祛痰化痰作用，以及治疗和预防病毒或细菌引起的肺部感染的作用，还具有抑制新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请实施例提供的酚红含量与光吸收值的线性方程；
图2为本申请实施例提供的小鼠雾化实物图；
图3为本申请实施例2提供的正常组的肺组织的病理图；
图4为本申请实施例2提供的金葡菌MRSA感染小鼠肺炎模型第3天的肺组织的病理图；
图5为本申请实施例2提供的金葡菌MRSA感染小鼠肺炎模型第7天的肺组织的病理图；
图6为本申请实施例2提供的金葡菌MRSA感染小鼠肺炎模型第14天的肺组织的病理图；
图7为本申请实施例2提供的雾化吸入溶菌酶(2mg/mL)组第3天对金葡菌MRSA感染小鼠的肺组织的病理图；
图8为本申请实施例2提供的雾化吸入溶菌酶(2mg/mL)组第7天对金葡菌MRSA感染小鼠的肺组织的病理图；
图9为本申请实施例2提供的雾化吸入溶菌酶(2mg/mL)组第14天对金葡菌MRSA感染小鼠的肺组织的病理图；
图10为本申请实施例2提供的雾化吸入溶菌酶(1mg/mL)组第3天对金葡菌MRSA感染小鼠的肺组织的病理图；
图11为本申请实施例2提供的雾化吸入溶菌酶(1mg/mL)组第7天对金葡菌MRSA感染小鼠的肺组织的病理图；
图12为本申请实施例2提供的雾化吸入溶菌酶(1mg/mL)组第14天对金葡菌MRSA感染小鼠的肺组织的病理图；
图13为本申请实施例2提供的雾化吸入溶菌酶(0.5mg/mL)组第3天对金葡菌MRSA感染小鼠的肺组织的病理图；
图14为本申请实施例2提供的雾化吸入溶菌酶(0.5mg/mL)组第7天对金葡菌MRSA感染小鼠的肺组织的病理图；
图15为本申请实施例2提供的雾化吸入溶菌酶(0.5mg/mL)组第14天对金葡菌MRSA感染小鼠的肺组织的病理图；
图16为本申请实施例3提供的正常对照组的病理切片结果；
图17为本申请实施例3提供的模型组的病理切片结果；
图18为本申请实施例3提供的重组人溶菌酶高剂量组的病理切片结果；
图19为本申请实施例3提供的重组人溶菌酶中剂量组的病理切片结果；
图20为本申请实施例3提供的重组人溶菌酶低剂量组的病理切片结果；
图21为本申请实施例3提供的不同组的雾化治疗10天后小鼠肺部外观图。
具体实施方式
本申请提供了重组人溶菌酶的新应用和祛痰药物，提供了一种有效治疗或预防呼吸系统疾病，或治疗或预防呼吸系统疾病的多痰症状的药物。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
其中，以下实施例所用试剂或原料均为市售或自制。
以下实施例1所用的重组人溶菌酶(30000U/mL)由广州奇龙生物医药研究有限公司提供。咳喘宁(药店购买)。0.5％酚红溶液(试剂公司购买配制)、5％NaHCO3(试剂公司购买配制)。小鼠和大鼠(广州市微生物研究所购买)。
以下实施例2所用的药物、试剂、菌株、实验动物和仪器：
受试药：基因重组人溶菌酶(Human Lysozyme，HLZ)：活性单位30000U/mg，批号020110，由长春奇龙生物技术研究所，实验前用PBS配成所需浓度。对照药：克拉霉素：效价948U/mg，中国药品生物制品检定所标准品。实验菌株为2002年于临床分离的耐药金黄色葡萄球菌MRSABAA-42，为四川大学华西医学中心赠送。实验动物为昆明种小鼠，体重17-20克，由四川抗菌素工业研究所动物室提供，动物合格证号：川实动质管第99-30号(2003年合格)。仪器：雾化机蕊，型号46mm，由宁波市勤州塘溪洪达电器配件厂生产，将其固定在φ12cm不锈钢杯中，该自制设备作为雾化吸入盐酸造模用。治疗用雾化器：德国白瑞公司生产的压缩喷雾器(PAR1.BOY)，该设备用于喷雾人溶菌酶治疗用。BL 3100型，BS 200S-WE1型电子天平，北京赛多利斯天平公司生产。玻璃干燥器：大小φ23×12.5cm。
以下实施例3所用的药物、试剂、菌株、实验动物和仪器：
动物：健康KM种小鼠50只，雄性，体重26克左右，由四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供，质量符合壹级标准，许可证号：005。试药：人溶菌酶(HLZ)系白色粉末，批号：020110，效价30000U/mg，由长春奇龙生物技术研究所提供，临用前用生理盐水配成所需浓度备用。试剂：AR级盐酸，市售。用蒸馏水配制成1N浓度备用。仪器：雾化机蕊，型号46mm，由宁波市勤州塘溪洪达电器配件厂生产，将其固定在φ12cm不锈钢杯中，该自制设备作为雾化吸入盐酸造模用。治疗用雾化器：德国白瑞公司生产的压缩喷雾器(PAR1.BOY)，该设备用于喷雾人溶菌酶治疗用。BL 3100型，BS 200S-WE1型电子天平，北京赛多利斯天平公司生产。玻璃干燥器：大小φ23×12.5cm。
实施例1
本申请实施例提供了重组人溶菌酶化痰作用试验(酚红法)，具体方法包括：
酚红自小鼠腹腔注射并经腹腔吸收后，可部分地由支气管粘液腺分泌入气道，有祛痰作用的药物在使支气管分泌液增加的同时，其由呼吸道粘膜排出的酚红也随之增加。因而可从药物对气管内酚红排泌量的影响来观察其祛痰作用。酚红在碱性溶液中呈红色，将从呼吸道中洗出的液体，用比色法(分光光度计)测出酚红的排泌量。通过试验，从而得出重组人溶菌酶药物的祛痰作用。
任取两管溶液，以未知酚红的0管作对照，用721分光光度计在波长420～570nm范围内，测光密度值。最后得酚红最大吸收峰的波长在560nm处。
酚红含量测定：在100mL容量瓶内精确配制浓度为1mg/mL的酚红母液，再利用酚红母液配每mL含酚红0.01、0.1、0.3、0.5、0.6、0.7、1、2μg的溶液，分装于8个10mL容量瓶内。将上述配制的酚红溶液，分别在560nm波长处测光密度值，结果各管酚红含量与光密度之间的直线相关有显著意义(相关系数r＝0.9987)，结果如图1所示，图1为本申请实施例提供的酚红含量与光吸收值的线性方程。
重组人溶菌酶雾化试验时药液的浓度为10000U/mL，20000U/mL，30000U/mL，每日一次，即0.5mg/次/日。按体表面积推算至小鼠剂量为1.3×10-3m\只(20g体重计)，由于人通气量9000mL/分相当于小鼠通气量24mL/分的375倍，人用单次剂量0.5mg/70kg相当于小鼠剂量1.3×10-3mg/20g的384倍，上二者较为接近。所以设定用临床人用浓度0.5mg/mL对小鼠进行雾化治疗，另考虑到临床人用吸入雾化重组人溶菌酶气体利用率较高，而小鼠在雾化缸内只能靠自身呼吸吸入含药气体，故只有延长吸入时间才能确保吸入药量，设定为一小时。设定三个剂量梯度，(10000U)0.3mg/mL，(20000U)0.6mg/mL，(30000U)0.9mg/mL三个浓度作为低、中、高剂量组使用的重组人溶菌酶药液浓度。
请参阅图2，图2为本申请实施例提供的小鼠雾化实物图，将小鼠置于玻璃干燥器后，用PAR1.BOY压缩喷雾器雾化不同浓度的重组人溶菌酶对小鼠进行雾化。
取体重18～22g的小鼠60只，雌雄小鼠各半，随机分成5组，分别为生理盐水组、咳喘宁片组(1.60g/kg)、重组人溶菌酶低剂量组(10000U，0.3mg/mL)、重组人溶菌酶中剂量组(20000U，0.6mg/mL)、重组人溶菌酶高剂量组(30000U，0.9mg/mL)，连续用三天，每天雾化1次，第三天给药后0.5小时进行试验。咳喘宁片分别灌胃给予(1.60g/kg)相应供试药品，第一天上、下午各1次给药，第二天给药后0.5小时进行试验。试验动物腹腔注射酚红溶液0.5mL/只，30分钟后，脱颈椎处死，仰位固定。颈部拉直，解剖分离出气管，在气管下穿一丝线，以备固定气管插管用。气管插管(用头部磨平的9号针头)从甲状软骨处插入气管内约0.3cm，用备好的丝线结扎、固定，用1mL注射器吸取NaHCO3溶液0.5mL推注入气管内，反复连续推抽3次，灌洗呼吸道。最后用注射器将灌洗液抽出注入试管中，按上述方法操作3次，冲洗9次，共吸取碳酸钠溶液1.5mL，合并洗出液约1.2～1.5mL，离心后取上清液用分光光度计比色，OD值代入方程，得出酚红浓度。见表1。t检验可知，重组人溶菌酶处理组与生理盐水比较P＜0.05。
表1各组小鼠呼吸道酚红浓度的比较(x±s)
| 组别 | n | 剂量 | 呼吸道酚红浓度(μg/<u>mL</u>) |
| 生理盐水 | 12 | 无雾化药物 | 2.669±0.911 |
| 咳喘宁片 | 12 | 1.60g/kg | 3.901±1.467 |
| 重组人溶菌酶低剂量 | 12 | 10000U | 2.932±0.882 |
| 重组人溶菌酶中剂量 | 12 | 20000U | 3.897±1.429 |
| 重组人溶菌酶高剂量 | 12 | 30000U | 3.988±1.374 |
取体重180～220g大鼠40只，雌雄大鼠各半，每组8只，随机分成5组，分别为生理盐水组，咳喘宁片组(1.60g/kg)，试验前禁食不禁水8～12小时后试验，重组人溶菌酶低剂量组(10000U，0.3mg/mL)、重组人溶菌酶中剂量组(20000U，0.6mg/mL)、重组人溶菌酶高剂量组(30000U，0.9mg/mL)，连续用三天，每天雾化1次，第三天给药后0.5小时进行试验。乌拉坦1.0g/kg腹腔注射麻醉后，仰位固定(注意保暖)。剪开颈正中部皮肤，分离出气管。在甲状软骨下缘正中的软骨环之间用尖锐的注射针头扎一小孔，然后插入玻璃毛细管一根，使毛细管刚好接触气管底部表面，借以吸取气管后部之痰液。当毛细管内痰液充满时，立即另换一根。以毛细管吸取痰液长度评价药物的祛痰效果。记录给药前2小时的正常分泌量后，灌胃给药后(在给药1小时后，再按同等剂量重复给药1次)继续观察4小时痰液分泌量。结果见表2。t检验可知：重组人溶菌酶与给药前比较P<0.05；与生理盐水比较P<0.05。
表2各组大鼠毛细管排痰量的比较(x±s)
以上实验结果可知，重组人溶菌酶对小鼠祛痰试验效果明显，其效果与使用浓度无明显量效关系。
实施例2
本申请实施例提供了重组人溶菌酶对金黄色葡萄球菌MRSABAA-42肺部感染小鼠的治疗试验，具体方法包括：
根据以下文献构建小鼠肺部感染模型，参考文献：
[1]Ma Zengshuan,Lin Futian.Experimental respiratory tract infectionwith Klebsiella pneumonia in mice:chemotherapywith levofloxacin,ofloxacin andlomefloxacin.[J]中国抗生素杂志，2000；25：36-40；
[2]柴栋，王睿，裴裴等.克拉霉素与加替沙星联用对大鼠铜绿假单胞菌生物被膜肺部感染的治疗作用[J]中国临床药理学与治疗学，2003；8(6)：618-620；
[3]张伟，蔡映云，顾宇彤等.雾化吸入α1-抗胰蛋白酶对绿脓杆菌肺部感染大鼠的作用研究[J].Chinese Critical Care Medicine,2002；14:282-284；
[4]Go to S In vitro and in vivo antibacterial activities of N Y-198,anew pyridone carboxylic acid derivative Chemother,1988,36(s2):36。
菌液制备及模型建立：挑取受试菌菌苔，用生理盐水冲洗后，用麦氏比浊管校正菌液浓度为2#MCF，约2.7×1011CFU/mL的浊度，再分别用生理盐水稀释至10-1，10-2，10-3菌液浓度，分别给小鼠滴鼻感染(先将小鼠用戊巴比妥麻醉，30mg/kg，ip)，每只小鼠0.05mL。观察小鼠体症变化，并于感染后48h活杀部分小鼠，取全肺组织匀浆，用生理盐水10倍稀释，吸取0.1mL至盛有MH琼脂平皿表面，35℃隔夜培养，革兰氏染色，镜检，并做活菌计数。同时观察记录小鼠死亡个数，并抽取部分小鼠肺组织作病理组织观察。
细菌培养阳性，肺中细菌数≥100CFU/mL，病理组织学观察肺组织出现明显充血，水肿，炎性细胞浸润等病理组织学变化。同时小鼠死亡率在50％以上则表明模型成功。
取致小鼠出现肺部病理变化并50％致死的菌量做为最低致死菌量(LD50)用该菌量作为治疗实验感染菌量。
感染小鼠及分组：选取健康昆明种小鼠，体重17～20克，以戊巴比妥麻醉(30mg/kg，ip)，吸取相当于10倍LD50的菌液对小鼠进行滴鼻感染(0.05mL/只鼠)，具体方法同上，共感染300只。取感染成功小鼠，按体重随机分为10组，每组30只。
药物治疗：重组人溶菌酶临床雾化治疗时药液每日一次。按体表面积推算至小鼠剂量为1.3×10-3mg/只(20g体重计)，由于人通气量9000mL/分相当于小鼠通气量24mL/分的375倍，人用单次剂量0.5mg/70kg相当于小鼠剂量1.3×10-3mg/20g的384倍，上二者较为接近。设定用重组人溶菌酶浓度0.5mg/mL对小鼠进行雾化治疗，另考虑到临床人用吸入雾化溶菌酶气体利用率较高，而小鼠在雾化缸内只能靠自身呼吸吸入含药气体，故只有延长吸入时间才能确保吸入药量，设定为0.5小时。在0.5mg/mL浓度基础上再配制0.25mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL共四个浓度剂量组作为治疗时的药液浓度。本实施例所用重组人溶菌酶活性单位为30000U/mg。(如表3所示)。
表3雾化吸入重组人溶菌酶实验分组
| 组别 | 给药剂量 | 每组/动物数(只) |
| 1.正常组 | 等体积生理盐水 | 30 |
| 2.感染对照组 | 等体积生理盐水 | 30 |
| 3.克拉霉素组 | 10mg/<u>mL</u> | 30 |
| 4.克拉霉素组 | 5mg/<u>mL</u> | 30 |
| 5.克拉霉素组 | 2.5mg/<u>mL</u> | 30 |
| 6.克拉霉素组 | 1.25mg/<u>mL</u> | 30 |
| 7.重组人溶菌酶组 | 2mg/<u>mL</u> | 30 |
| 8.重组人溶菌酶组 | 1mg/<u>mL</u> | 30 |
| 9.重组人溶菌酶组 | 0.5mg/<u>mL</u> | 30 |
| 10.重组人溶菌酶组 | 0.25mg/<u>mL</u> | 30 |
将同一组动物同时放入超声雾化器内，用PAR1.BOY压缩喷雾器雾化吸入不同浓度的人溶菌酶液对小鼠进行雾化治疗(如图2所示)，每日两次，连续5天。
检测方法：各组以感染当日计算，连续观察14天，逐日记录动物发病情况和死亡数，并于感染后第14天，各组抽取2～3只小鼠活杀，取全肺匀浆后做细菌学检测，剩余动物活杀后取全肺，称重后固定于10％甲醛溶液中，送病理检查。
细菌培养：接种细菌后24h，每组取部分小鼠活杀，取出全肺称重，加入2mL灭菌PBS液匀浆10倍稀释，吸取0.1mL于空白MH琼脂平板，35℃培养24h，取每个平板上菌落数在30～300CF的培养平板计数，若相邻两个级别浓度组织液接种平板的菌落数均为30～300CFU，则取低浓度的菌落数计数(每份组织液同时做3个平板，计算其平均值)。于给药后5，7，14天同法各组随机抽取2只小鼠做细菌培养。
病理检测：解剖小鼠后，先肉眼观察肺与胸壁，隔胸膜的粘连情况，肺体积及肺病灶大小，肺表面充血，水肿，实变及不张情况。取出全肺组织用10％的甲醛溶液固定，取材。脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，在光镜下观察肺组织的病理变化。结果如图3～图15。
从图3～15图可知，图3为正常组，其肺脏层胸膜无结缔组织增生增厚，未见炎性渗出：各级支气管管腔内及肺泡内未见渗出水肿、出血及炎细胞浸润，肺泡壁未见增厚，支气管黏膜假复层纤毛柱状上皮无增生、萎缩、坏死脱落。图4为金葡菌MRSA感染小鼠肺炎模型第3天照片(HE 10×10)肺泡壁部分增厚，伴有单核、淋巴细胞浸润。图5为金葡菌MRSA感染小鼠肺炎模型第7天肺组织病理照片(HE 10×10)弥散性肺泡壁增厚，伴有单核、淋巴细胞浸润。图6为金葡菌MRSA感染小鼠肺炎模型第14天肺组织病理照片(HE 10×10)局灶性肺泡壁组织增厚，散在分布单核、淋巴细胞浸润,局部出血、水肿。图7为雾化吸入溶菌酶(2mg/mL)组第3天对金葡菌MRSA感染小鼠肺组织病理照片(HE 10×10)局部肺泡壁增厚，伴有少许单核细胞浸润。图8为雾化吸入溶菌酶(2mg/mL)组第7天对金葡菌MRSA感染小鼠肺组织病理照片(HE 10×10)基本正常。图9为雾化吸入溶菌酶(2mg/mL)组第14天对金葡菌MRSA感染小鼠肺组织病理照片(HE 10×10)基本正常。图10为雾化吸入溶菌酶(1mg/mL)组第3天对金葡菌MRSA感染小鼠肺组织病理照片(HE 10×10)细支气管周肺泡壁增厚，见少许单核细胞浸润。图11为雾化吸入溶菌酶(1mg/mL)第7天对金葡菌MRSA感染小鼠肺组织病理照片(HE10×10)伴有少许单核细胞浸润。图12为雾化吸入溶菌酶(1mg/mL)第14天对金葡菌MRSA感染小鼠肺组织病理照片(HE 10×10)基本正常。图13为雾化吸入溶菌酶(0.5mg/mL)第3天对金葡菌MRSA感染小鼠肺组织病理照片(HE 10×10)弥散性肺泡壁轻度增厚伴有少许单核细胞浸润。图14为雾化吸入溶菌酶(0.5mg/mL)第7天对金葡菌MRSA感染小鼠肺组织病理照片(HE 10×10)局限或弥散性肺泡壁增厚，少许单核细胞浸润。图15为雾化吸入溶菌酶(0.5mg/mL)第14天对金葡菌MRSA感染小鼠肺组织病理照片(HE 10×10)细支气管周肺泡壁轻度增厚，伴有少许单核细胞浸润。
病理组织学观察结果表明：基因重组人溶菌酶2、1、0.5mg/mL组及感染对照组肺组织在给药后第3，7天抽杀解剖病理观察结果表明人溶菌酶组小鼠肺部病症程度明显低于感染对照组。于14天观察结束24h后活杀各组动物，解剖取小鼠肺组织进行病理组织学观察表明，人溶菌酶各给药组小鼠肺部基本恢复正常，而感染对照组80％动物死亡，存活的少数小鼠濒临死亡状况，肺部呈现局灶性肺泡壁组织增厚，局部或弥散分布单核、淋巴细胞浸润，局部出血、水肿等病理变化。
死亡率及半数有效剂量ED50的计算自感染日起，连续观察记录14天内死亡动物数及其存活率，平均存活天数，与感染对照组进行比较。按Bliss法，运用NDST软件计算半数有效剂量ED50值及其95％可行限。
数据处理和统计分析：实验中有关计量资料，将原始数据按组分别用SPSS软件进行统计学处理，各组结果以算术平均数±标准差表示。根据《新药西药临床前研究指导原则汇编》中的有关新药药效学研究中统计处理的指导原则，选择Studentt检验进行各给药组均数与模型组均数；相同剂量的受试药组与对照组的差异显著性检验(P<0.05为有显著性差异)。
细菌检测结果见表4。雾化吸入重组人溶菌酶2mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL第1天，第3天和第5天小鼠全肺中细菌数明显低于感染对照组，且具有显著性差异(P<0.05)，至第14天，人溶菌酶给药组细菌基本转阴，≤10CFU/mL。
各组动物肺组织的病理检测结果见表5。病理检测结果表明雾化吸入基因重组人溶菌酶(2mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL)对小鼠肺组织病理变化程度均显著较感染对照组轻，至给药后第7、14天，治疗组小鼠肺组织基本恢复正常。
存活率及ED50值：雾化吸入基因重组人溶菌酶2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL对金葡菌MRSA BAA-42感染小鼠肺炎治疗的存活率依次为76.7％、56.7％、46.7％和40％，平均存活天数分别为12.93±2.05天、11.23±3.36天、10.3±3.77天、9.30±4.08天，其存活率及存活天数均显著高于感染对照组(较感染对照组提高30％～60％，P﹤0.05)。其半数有效剂量ED50为0.53mg/mL(0.20～0.90mg/mL)，如表6和表7。
本申请实施例的表3～表7可知，雾化吸入重组人溶菌酶对金葡菌MRSA BAA-42致小鼠肺部感染具有较好的治疗作用，其半数有效剂量ED50为0.53mg/mL。雾化吸入2mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL，0.25mg/mL，其小鼠14天存活率分别为76.7，56.7，46.7和40％。平均存活天数分别为12.93±2.05天、11.23±3.36天、10.3±3.77天、9.30±4.08天，与感染对照组比较有显著性的差异(P<0.05)。以上实验结果表明，雾化吸入重组人溶菌酶对小鼠细菌性感染肺炎有较好保护治疗作用。
感染对照组的动物大部分死亡(14天存活率为16.7％。5/30)。重组人菌酶雾化吸入2mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL和0.25mg/mL各给药组的存活率分别为76.7％，56.7％，46.7％和40％，与未治疗组比较均有显著性差异(P<0.05)。其半数有效剂量ED50为0.53mg/mL。
于感染细菌后第3天，第7天和第14天取部分小鼠肺组织研磨液进行细菌学检测结果表明：重组人溶菌酶2mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL给药组小鼠肺组织的细菌数随着给药天数的递增而明显降低，与给药前及感染对照组比较均呈现显著性差异(P<0.05)。
表4雾化吸入重组人溶菌酶对小鼠肺部感染金葡菌MRSA BAA-42的细菌检测结果
与感染对照组比：*P<0.05,**P<0.01
与克拉霉素组(0.75mg/mL)相比：△P<0.05,△△P<0.01
表5人溶菌酶各给药组小鼠肺组织病理检测结果
表6雾化吸入人溶菌酶对小鼠金葡菌MRSABAA-42所致细菌性肺炎的小鼠死亡分布
注：与感染对照组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；
与克拉霉素组比较，△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001；上表的“-”为无数据。
表7雾化吸入人溶菌酶对小鼠肺部感染金葡菌MRSABAA-42的治疗作用
上表的“-”为无给药。
实施例3
本申请实施例提供了重组人溶菌酶对支气管肺炎小鼠的雾化治疗试验，具体方法包括：
将50只小鼠随机均分五组，每组10只，任意挑选其中四组进行吸入雾化盐酸造模。将小鼠置于存有自制雾化器的玻璃干燥器内，每批10只，雾化器内存有1N HCl液，利用电子超频震荡原理将盐酸雾化，小鼠在雾化盐酸空气中吸入酸性气体，造成吸入性支气管肺损伤模型。吸入时间为一小时。其机理为：酸性物质吸入肺时，引起白细胞的粘附，ICAM-1表达的升高，酸性物质导致肺的内皮细胞和上皮细胞对蛋白的通透性增加，从而引起肺水肿，另外酸性物质吸入肺，引起一些炎细胞因子的释放。这些细胞因子和中性粒细胞肺组织中的聚集和相互激活可导致细胞粘附、组织受损。将造模后的40只小鼠重新合并后再随机分成四组，分别设立三个给药组和一个模型组。
重组人溶菌酶每日一次。按体表面积推算至小鼠剂量为1.3×10-3mg/只(20g体重计)，由于人通气量9000mL/分相当于小鼠通气量24mL/分的375倍，人用单次剂量0.5mg/70kg相当于小鼠剂量1.3×10-3mg/20g的384倍，上二者较为接近。重组人溶菌酶的使用浓度为0.5mg/mL对小鼠进行雾化治疗，另考虑到临床人用吸入雾化溶菌酶气体利用率较高，而小鼠在雾化缸内只能靠自身呼吸吸入含药气体，故只有延长吸入时间才能确保吸入药量，设定为一小时。在0.5mg/mL为重组人溶菌酶低剂量浓度基础上再配制1.0mg/mL、2.0mg/mL二浓度作为重组人溶菌酶中剂量组、重组人溶菌酶高剂量组治疗时的药液浓度。
请参阅图2，小鼠置于玻璃干燥器后，用PAR1.BOY压缩喷雾器雾化不同浓度的人溶菌酶液对小鼠进行雾化治疗，每日一次，连续5-10天。雾化治疗第5天和10天时，每组处理一半动物(5只)，解剖取肺组织称重，并根据体重计算肺脏器系数，肉眼观察肺外观病变情况，取肺组织进行病理切片观察。
(1)雾化治疗5天后，解剖发现模型组小鼠肺呈暗红色，有个别肺叶颜色更深暗，比正常对照组的肺色泽相比存在明显反差，正常对照组肺呈鲜明淡粉红色。各用药组肺外观色泽有较明显的改观。各组肺脏器系数见表1。
表8雾化治疗5天后各组小鼠肺脏器系数
由表1可见，雾化治疗5天后，模型组体重仍明显低于正常对照组，用药组使体重恢复。模型组肺脏器系数明显增大，重组人溶菌酶用药组除高剂量组外，中、低二剂量组与模型组比较显著性下降。
如图图16～图20，图16为正常对照组的病理切片结果，图17为模型组的病理切片结果，图18为重组人溶菌酶高剂量组的病理切片结果，图19为重组人溶菌酶中剂量组的病理切片结果，图20为重组人溶菌酶低剂量组的病理切片结果，图16～图20显示，正常对照组：细支气管、小支气管、终末性细支气管以及呼吸性支气管，肺泡管均未见异常。模型组：细、小支气管腔内充满大量变性炎细胞，相应支气管壁见多量单核细胞、淋巴细胞浸润，部分细支气管、小支气管内见少许粉红色粘液伴少许单核细胞，少许假复层上皮、单层柱状上皮脱失；终末性细支气管、呼吸性细支气管仍可见单层柱状或立方上皮脱失，肺组织大片弥散分布性肺泡壁明显增厚，致肺泡压闭，其间多量单核细胞及部分中性白细胞浸润。4/5只产生病变。重组人溶菌酶高剂量组：偶见小叶间支气管见假复层上层内少许单核、淋巴细胞浸润，部分细支气管内见少许炎细胞及分泌物，有2/5只呈现病变，为细支气管周单核细胞为主浸润，另一只为多处小灶分布肺泡壁增厚伴单核细胞浸润，其余3/5只正常。重组人溶菌酶中剂量组：少数细小支气管周偶见少许淋巴、单核细胞浸润，多数细小支气管粘膜上层，管壁完好，偶见少许粘膜上皮脱失，5/5只基本正常；重组人溶菌酶低剂量组：一肺组织两处细小支气管粘膜上皮脱失，另一肺组织一处细支气管管腔内少许红血球，余未见异常。其于肺组织细小支气管未见异常，4/5只基本正常，有一只为肺泡壁型及细支气管周少许单核细胞浸润。模型组为肺组织大片弥散分布性肺泡壁明显增厚，致肺泡压闭，期间多量单核细胞及部分中性白细胞浸润。可见，正常对照组为基本正常。高剂量组为细支气管因单核细胞为主浸润。中剂量组为基本正常。低剂量组为肺泡壁型及细支气管因少许单核细胞浸润。
雾化治疗10天后，取出各组的肺部，观察其外观情况，结果如图21所示。图21的A为模型组小鼠肺的外观图，B为正常对照组小鼠肺的外观图，C为重组人溶菌酶高剂量组小鼠肺的外观图，D为重组人溶菌酶中剂量组小鼠肺的外观图，E为重组人溶菌酶低剂量组小鼠肺的外观图。从图21解剖发现模型组小鼠肺似呈暗红色，与正常对照组相比较明显存在色泽反差，并且该组动物于第9天有死亡(一只)，解剖肺脏见有重度病变，肺叶系暗黑色。C、D和E各用药组小鼠肺外观有较大程度改观，各组肺脏器系数见表9。
表9雾化治疗10天后各组小鼠肺脏器系数
由表9可见，雾化治疗10天，模型组体重显著性(P<0.05)低于正常对照组，各用药组体重与正常对照组接近，模型组肺脏器系数显著性(P<0.01)高于正常对照组，用药组有下降趋势，但只有重组人溶菌酶低剂量组表现显著性(p<0.01)。
综合以上实验结果分析，重组人溶菌酶治疗小鼠吸入盐酸性支气管肺损伤模型有效，其治疗效果与使用浓度无明显量效关系。
实施例4
本申请委托中国科学院武汉病毒研究所对重组人溶菌酶对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的抑制试验，具体方法包括：
1、使用Vero E6细胞培养病毒，得到一定滴度的SARS-CoV-2，调整病毒滴度为106pFU/mL。
2、测试中使用Caco-2细胞评估重组人溶菌酶的抗SARS-CoV-2的效果，首先用cck8染色测试了重组人溶菌酶在浓度为10000U、20000U、30000U的细胞毒性，重组人溶菌酶10000U对Caco-2细胞活性影响小于5％，因此测试中使用了重组人溶菌酶的两个浓度：5000U和10000U。
3、SARS-CoV-2抑制试验前48h，接种105个Caco-2细胞于24孔板的每个孔中。
4、用含2％FBS的DMEM配制重组人溶菌酶终浓度为5000U和10000U的重组人溶菌酶溶液，并以终浓度为10μM的瑞德西韦作为药物阳性对照，加病毒前将测试组的细胞培养液换成重组人溶菌酶溶液或瑞德西韦溶液，不加重组人溶菌酶或药物的对照组的细胞培养液换成新鲜的含2％FBS的DMEM。
5、取10μL滴度为104PFU/mL的SARS-CoV-2病毒液，加入到上述24孔板的Caco-2细胞中，做好相应的不加重组人溶菌酶的病毒组和细胞组对照。
6、将24孔板置于37℃、5％的CO2培养箱中培养。
7、于72h取200μL培养液上清进行核酸拷贝数的检测。
8、用济凡生物科技(常州)有限公司(型号：FHT101-32)的自动化磁珠核酸提取仪对样本进行提取，采用针对新冠S基因的核酸检测试剂盒对核酸拷贝数进行检测。核酸检测在Bio-Rad CFX96仪器上完成。结果如表10和表11所示。
表10重组人溶菌酶在不同浓度对细胞的活性率测试(CCK8染色后测试450nm的吸收值)
通常认为在药物作用下细胞的活性率大于95％，则在该药物浓度下无细胞毒性。表10可知，重组人溶菌酶对在10,000U的浓度下无细胞毒性。
抑制率计算：根据公式，病毒抑制率＝()1-药物作用组RNA拷贝数/病毒对照组的RNA拷贝数×100％，可以计算出重组人溶菌酶的两个浓度作用下的病毒抑制率。
表11重组人溶菌酶对SARS-CoV-2的抑制率检测结果(三次重复结果)
| 重组人溶菌酶浓度 | 72h病毒拷贝数(Log值) | 抑制率 |
| 5000U | 7.90±0.31 | 86.2％ |
| 10000U | 6.39±0.10 | 99.6％ |
| 瑞德西韦10<u>μM</u> | 5.79±0.05 | 99.89％ |
| 病毒对照组 | 8.76±0.06 | 无 |
用Caco-2细胞培养在不同浓度重组人溶菌酶作用下的病毒，培养72h检测病毒核酸，得到5000U和10000U的重组人溶菌酶对病毒的抑制率分别为86.2％和99.6％，表明重组人溶菌酶在一定浓度下有抗新冠病毒作用。
以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
序列表
<110> 广州奇龙生物科技有限公司
<120> 重组人溶菌酶的新应用和祛痰药物
<130> MP21006002
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly
1 5 10 15
Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala
20 25 30
Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly
35 40 45
Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp
50 55 60
Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser
65 70 75 80
Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala
85 90 95
Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp
100 105 110
Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys
115 120 125
Gly Val
130
<210> 2
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Ala Glu Ala Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu
1 5 10 15
Lys Arg Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp
20 25 30
Met Cys Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn
35 40 45
Tyr Asn Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn
50 55 60
Ser Arg Tyr Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala
65 70 75 80
Cys His Leu Ser Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala
85 90 95
Val Ala Cys Ala Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala
100 105 110
Trp Val Ala Trp Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr
115 120 125
Val Gln Gly Cys Gly Val
130
<210> 3
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Ala Glu Ala Glu Ala Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg
1 5 10 15
Thr Leu Lys Arg Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala
20 25 30
Asn Trp Met Cys Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala
35 40 45
Thr Asn Tyr Asn Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln
50 55 60
Ile Asn Ser Arg Tyr Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val
65 70 75 80
Asn Ala Cys His Leu Ser Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala
85 90 95
Asp Ala Val Ala Cys Ala Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile
100 105 110
Arg Ala Trp Val Ala Trp Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg
115 120 125
Gln Tyr Val Gln Gly Cys Gly Val
130 135
Claims (10)
1.重组人溶菌酶在制备治疗或预防呼吸系统疾病的药物中的应用。
2.重组人溶菌酶在制备治疗或预防呼吸系统疾病的多痰症状的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述呼吸系统疾病包括病毒、细菌、耐药菌引起的肺炎、肺脓肿、咽喉炎、气管炎、慢性支气管炎、支气管哮喘、支气管扩张或慢性阻塞性肺病。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒选自鼻病毒、冠状病毒、腺病毒、流感和副流感病毒、呼吸道合胞病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒和风疹病毒中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒包括SARS、SARS-CoV-2和COVID-19中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述细菌选自溶血性链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、支原体、衣原体和葡萄球菌中的一种或多种。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为雾化溶液药物。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组人溶菌酶的使用量为10000～100000U/mL/d。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组人溶菌酶的氨基酸序列为SEQ.ID.No.1、SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.3。
10.一种祛痰药物，其特征在于，包括重组人溶菌酶和药学上可接受的辅料；所述重组人溶菌酶的氨基酸序列为SEQ.ID.No.1、SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.3。
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