CN113403355B - 一种生物法生产l-5-甲基四氢叶酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物法生产L‑5‑甲基四氢叶酸(L‑5‑MTHF)的方法，是在大肠杆菌中敲除了分解代谢途径中的甲硫氨酸合成酶基因(metH)，并引入了一条新的产L‑5‑MTHF的代谢途径构建了产L‑5‑MTHF的工程菌BL21‑WL菌株或BL21(ΔmetH)‑C1T菌株，通过对所构建的工程菌产L‑5‑MTHF的发酵条件优化，所述工程菌最大细胞干重产量可达445.94μg·g^‑1，比优化前提高了99.71％，达到出发菌株的10.0倍，换算为每升培养物的产量后可达1249.11μg，远大于目前报道中的以E.coli为宿主菌的L‑5‑MTHF产量(119.84μg·L^‑1)。预示本发明方法及构建的工程菌具有极大的应用价值和市场前景。

Description

一种生物法生产L-5-甲基四氢叶酸的方法

技术领域

本发明涉及一种生产L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)的方法，尤其涉及一种利用构建大肠杆菌工程菌生物法生产L-5-MTHF的方法，属于生物技术领域。

背景技术

L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)，是维生素B9的生物活性形式，可直接被人体吸收参与体内的甲基化过程和DNA合成，对许多疾病都有一定的治疗作用，如巨红细胞贫血症、神经管缺陷和癌症等，在维持人体健康方面具有重要作用。作为叶酸类药物中唯一可以透过血脑屏障的物质，L-5-MTHF可以用来预防阿尔兹海默症，另外，人体中亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变会影响体内L-5-MTHF的合成，也会引发人体的一系列疾病，因此，对于亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变的人群来说，直接服用L-5-MTHF类药物是十分必要的。欧盟委员会于2014年3月19日决定将L-5-MTHF作为一种新型食品添加剂，增加了L-5-MTHF的市场需求量，这迫使需不断的更新技术以获得更大量的L-5-MTHF。

在已有的文献报道中，大部分5-MTHF都是经化学法合成的，以叶酸为原料，先还原为四氢叶酸，后经甲基化和进一步还原生成5-MTHF。但化学合成需要大量的强化学还原剂，具有一定的危险性，且合成的5-MTHF是外消旋混合物，需要通过手性拆分获得具有生物活性的L-5-MTHF。此外，化学法合成5-MTHF产率小，纯度低，污染环境，不利于人体健康。

经检索，有关对Escherichia coli进行代谢改造，在其细胞中构建新的合成L-5-MTHF代谢途径，且阻断L-5-MTHF的分解代谢途径，并进一步通过优化发酵条件的生物法合成L-5-MTHF的方法还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用大肠杆菌工程菌生物法生产L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)的方法。

本发明所述的生物法生产L-5-MTHF的方法，步骤是：

(1)构建产L-5-MTHF的工程菌：

a.以Escherichia.coli BL21(DE3)基因组为模板扩增SEQ ID NO.3所示的二氢叶酸还原酶基因folA以及SEQ ID NO.4所示的亚甲基四氢叶酸还原酶基因metF，将folA基因和metF基因克隆到pACYCDuet-1载体的两个多克隆位点上，构建重组质粒，命名为pACYCDuet-metF-folA；以Clostridium autoethanogenum基因组为模板扩增SEQ ID NO.5所示的甲酸四氢叶酸连接酶、甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因fhs-fchA-folD，将fhs-fchA-folD基因克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点上，构建重组载体，命名为pETDuet-WL；以Methylobacterium extorquens AM1基因组作为模板扩增SEQ IDNO.6所示的甲酸四氢叶酸连接酶基因ftfL以及SEQ ID NO.7所示的甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因fchA-mtdA，将ftfL、fchA和mtdA克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点上，构建重组载体，命名为pETDuet-C1T；

b.将质粒pACYCDuet-metF-folA和pETDuet-WL共同转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，在含氯霉素和氨苄青霉素抗性的LB固体平板上培养，阳性菌落菌株即为产L-5-MTHF的工程菌，命名为BL21-WL；将质粒pACYCDuet-metF-folA和pETDuet-C1T共同转化到敲除甲硫氨酸合成酶基因(metH)的E.coli BL21(ΔmetH)感受态细胞中，在含氯霉素和氨苄青霉素抗性的LB固体平板上培养，阳性菌落菌株即为产L-5-MTHF的工程菌，命名为BL21(ΔmetH)-C1T；

(2)产L-5-MTHF的工程菌发酵：

将产L-5-MTHF的工程菌BL21-WL菌株或BL21(ΔmetH)-C1T菌株以体积比1～5％的接种量接种到含有氨苄青霉素和氯霉素的发酵培养基中，在37±1℃和180～220rpm转速条件下培养2～4小时至OD_600nm为0.6～1.0，获得菌液；向制得的菌液中加入终浓度为0.4～0.8mM的IPTG，在20～37℃、100～120rpm转速下诱导8～16小时，然后将培养液离心收集菌体，即获得含L-5-MTHF的工程菌细胞；

其中，上述发酵培养基的配方及组分终浓度是：胰蛋白胨10～15g·L^-1，酵母粉20～30g·L^-1，甘油2～5ml·L^-1，叶酸0.01～0.4g·L^-1，甲酸钠0.1～4.0g·L^-1，KH₂PO₄ 2～4g·L^-1，K₂HPO₄ 12～14g·L^-1；氨苄青霉素终浓度为50μg·ml^-1，氯霉素的终浓度为25μg·ml^-1；

(3)破碎工程菌细胞，释放出L-5-MTHF：

将离心后获得的工程菌细胞在厌氧箱中用含0.1％的抗坏血酸和含0.1％巯基乙醇的50mM pH 7.2的经煮沸后脱气厌氧处理的Tris-HCl溶液重悬，密封在厌氧小瓶中，100℃水浴煮沸10min破碎细胞，即得含L-5-MTHF的细胞破碎液，立即将其冰浴，并于15,000rpm，4℃离心15min后收集上清，再加入新鲜小鼠血清至100μl·ml^-1，37℃反应3h，煮沸5min终止反应，离心取上清，用0.22μm的醋酸纤维素滤膜过滤，滤液装入液相小瓶；

(4)使用201×7强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂纯化L-5-MTHF，并使用高效液相色谱(HPLC)对L-5-MTHF产量进行测定：

其中L-5-MTHF的纯化方法是：用1M的NaOH和1M的HCl处理强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂2次，超纯水洗至中性，再用1M的NaOH浸泡树脂24h，将其转变为OH型，用超纯水洗至中性，用50mM pH 7.2的Tris-HCl缓冲液平衡柱子至流出液与缓冲液pH值相同，将步骤(3)液相小瓶中的滤液样品在避光条件下上样，用0.1M pH 7.2的NaCl洗脱，紫外检测器在290nm下检测并收集洗脱液；

其中HPLC对L-5-MTHF测定的方法是：荧光检测器Ex＝290nm,Em＝356nm，以体积比为93:7的33mM pH 3.0磷酸钾和乙腈为流动相，上样量20μl，走样时间30min，柱温箱温度为30℃，保留时间为19.3±0.1min。

上述33mM磷酸钾(pH 3.0)的配制：先配制33mM K₂HPO₄，随后用33mM的H₃PO₄调节pH至3.0。

标准品的配制：准确称取20mg 5-MTHF标准品粉末于流动相中，用1M NaOH溶液调节pH值至完全溶解，定容至100ml，可得浓度为2mg·ml^-1的5-MTHF溶液，将该溶液进行梯度稀释，取0.5、1.0、2.0、4.0、5.0μg·ml^-1的5-MTHF标准品溶液做标准曲线，标准曲线方程为y＝316802x-9684.3(R²＝0.9999)，根据峰面积计算每株工程菌的L-5-MTHF的产量。

上述生物法生产L-5-MTHF的方法中：步骤(2)所述工程菌BL21-WL菌株或BL21(ΔmetH)-C1T菌株的发酵条件优选是在37℃和220rpm转速条件下培养2～3小时至OD_600nm为0.6～0.8，并向菌液中加入终浓度为0.6～0.8mM的IPTG，在20～25℃、100～110rpm转速下诱导12～16小时。

上述生物法生产L-5-MTHF的方法中：步骤(2)所述发酵培养基的配方及组分终浓度优选是：胰蛋白胨12g·L^-1，酵母粉24g·L^-1，甘油4ml·L^-1，叶酸0.13g·L^-1，甲酸钠1.3g·L^-1，KH₂PO₄ 2.3g·L^-1，K₂HPO₄ 12.5g·L^-1。

本发明公开了一种生物法生产L-5-MTHF的方法，并成功构建了产L-5-MTHF的大肠杆菌工程菌株，其创新点是在大肠杆菌中构建了一条新的产L-5-MTHF途径，该途径含有来源于E.coli BL21(DE3)的二氢叶酸还原酶和亚甲基四氢叶酸还原酶基因及外源一碳代谢途径的甲酸四氢叶酸连接酶、甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因，并且对E.coli BL21(DE3)中L-5-MTHF分解代谢途径的甲硫氨酸合成酶基因进行了敲除；所述重组大肠杆菌是将二氢叶酸还原酶和亚甲基四氢叶酸还原酶基因连接入pACYCDuet-1载体，将外源一碳代谢途径的相关基因连接入pETDuet-1载体，并将制得的重组质粒共转入E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21(ΔmetH)中获得。本发明方法对于L-5-MTHF的绿色生产具有重要价值。它的应用在于用生物法合成L-5-MTHF专一性强，纯度高，不需要繁琐的化学合成步骤，绿色环保，节省了大量的时间，节约了成本。

实验证实：本发明在E.coli BL21(DE3)产L-5-MTHF的代谢途径的基础上引入了一条新的产L-5-MTHF的途径(见图1)，使L-5-MTHF的产量显著提高。通过qRT-PCR检测到在加入IPTG诱导后，工程菌的外源基因转录水平均得到了较大幅度的提升(见图2)；通过HPLC成功检测到了目的产物L-5-MTHF，其保留时间在19.3±0.1min(见图3)，并通过LC-MS验证了L-5-MTHF的正确性(见图4)；通过对所构建的工程菌产L-5-MTHF的发酵条件进行初步优化后，发现工程菌最大细胞干重产量可达445.94μg·g^-1(见图6、图7)，比优化前提高了99.71％，达到出发菌株的10.0倍，换算为每升培养物的产量后可达1249.11μg，远大于目前报道中的以E.coli为宿主菌的L-5-MTHF产量(119.84μg·L^-1)，对Bacillus subtilis进行代谢工程改造后优化发酵条件所获得的L-5-MTHF的最高产量为1.78mg·L^-1，是当前报道中的最高产量，而本发明所构建的工程菌的产量仅在初步优化发酵条件后就已经很接近目前的最高产量，具有极大的应用价值和市场前景。

附图说明

图1：大肠杆菌合成L-5-MTHF新途径的构建

其中，方框中的物质为需要补加的外源物质，实线箭头为大肠杆菌自身的代谢途径，虚线箭头为引入的外源代谢途径。DHFR：二氢叶酸还原酶；MTHFR：亚甲基四氢叶酸还原酶；MTRR：甲硫氨酸合成酶。

图2：BL21-WL(A)和BL21(ΔmetH)-C1T(B)工程菌中外源基因转录水平变化的qRT-PCR分析结果。

图3：5-MTHF标准品(A)及工程菌中L-5-MTHF(B)色谱图。

图4：BL21-WL工程菌中L-5-MTHF的LC-MS分析。

其中L-5-MTHF放大显示在图A插图中；B为BL21-WL工程菌的L-5-MTHF质谱图。L-5-MTHF m/z理论值为460.1939。

图5：5-MTHF标准曲线。

图6：BL21-WL工程菌发酵条件初步优化。

图7：BL21(ΔmetH)-C1T工程菌发酵条件初步优化。

上述图6和图7中，a为在不同诱导时间下的产量变化情况；b为在最适诱导时间下，在不同诱导温度下的产量变化情况；c为最适诱导时间和温度下，添加不同终浓度的IPTG对产量的影响；d为在不同OD_600nm值下添加IPTG对产量的影响，其余条件均最适。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

本发明中所用菌株、材料及来源说明：

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)细胞购买自Lucigen公司，Clostridiumautoethanogenum购买自德国菌种保藏中心(DSM 10061)，Methylobacterium extorquensAM1由购买自美国模式菌种收集中心(ATCC 14718)。

E.coli BL21(ΔmetH)菌株为E.coli BL21(DE3)敲除metH基因的工程菌株，其制备方法是：

以E.coli BL21(DE3)为出发菌株，根据甲硫氨酸合成酶基因metH(SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列)设计引物。以metH_P1：TGGAATTGGGTAACCCGGCTTGTTGCGC、metH_P2：AAGCAGCTCCAGCCTACACTTGTTCCACTTTGCTGCTCAC为引物，以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，PCR扩增metH基因上同源臂片段；以metH_P3：GGACCATGGCTAATTCCCATGCACCGAATCTGGGGTATGAC、metH_P4：TGCTCTGTACCAGTGCGGTAACGCCG为引物，E.coli BL21(DE3)基因组为模板，PCR扩增metH基因下同源臂片段P2；根据如SEQ ID NO.2所示的带有FRT位点的卡那霉素抗性基因核苷酸序列设计引物，metH_P5：GTGAGCAGCAAAGTGGAACAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTT和metH_P6：GTCATACCCCAGATTCGGTGCATGGGAATTAGCCATGGTCC，pKD4质粒为模板，PCR扩增带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段P3；切胶回收P1、P2、P3片段，Over lapping PCR连接P1、P2和P3片段，制备打靶片段。将打靶片段电转入含有pTKRed质粒的E.coli Bl21(DE3)中，将metH基因通过同源重组替换为带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段，并在42℃下过夜培养，去除掉pTKRed质粒。最后将可以热诱导FLP(flip-out)重组酶的温度敏感质粒pCP20电转入去除了pTKRed质粒的工程菌中，以消除卡那霉素抗性基因片段，并在42℃下过夜培养，去除掉pCP20质粒，最终得到敲除metH基因的菌株，命名为E.coli BL21(ΔmetH)。

质粒小提试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

Top Green qPCR Supermix、Easypure RNA Kit和高保真FastPfuDNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司。5×All-In-One MasterMix和AccuRT Genomic DNA Removal kit购自爱必梦生物科技有限公司。pACYCDuet-1和pETDuet-1载体购自Novagen公司。pTKRed、pKD4和pCP20质粒购买自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Thermo公司。HPLC所用色谱柱为ChromCore120C18柱，购自纳普分析技术有限公司。

下述实施例中，所使用的材料、菌株、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

实施例1：产L-5-MTHF的工程菌的构建

取Clostridiumautoethanogenum和Methylobacterium extorquens AM1细胞，按照细菌基因组DNA提取试剂盒推荐方法，从细胞中分别提取其基因组DNA。

根据已知的E.coli BL21(DE3)基因组中如核苷酸序列SEQ ID NO.3所示的二氢叶酸还原酶基因(folA)序列设计引物folA_F：GGAATTCCATATGATCAGTCTGATTGCGGC和folA_R：CCGCTCGAGTTACCGCCGCTC，以E.coli BL21(DE3)基因组为模板扩增folA基因，PCR循环参数为95℃5min；(95℃30s，56℃30s，72℃15s)；72℃10min，30个循环。

根据已知的E.coli BL21(DE3)基因组中如核苷酸序列SEQ ID NO.4所示的亚甲基四氢叶酸还原酶基因(metF)序列设计引物metF_F：CATGCCATGGGCATGAGCTTTTTTCACG和metF_R：CCCAAGCTTTTATAAACCAGGTCGAACCC，以E.coli BL21(DE3)基因组为模板扩增metF基因序列。PCR循环参数为95℃5min；[95℃30s，56℃30s，72℃27s]；72℃10min，30个循环。

将folA基因和metF基因克隆到pACYCDuet-1载体的两个多克隆位点上，构建重组质粒，命名为pACYCDuet-metF-folA。

根据已知的C.autoethanogenum基因组中如核苷酸序列SEQ ID NO.5所示的甲酸四氢叶酸连接酶、甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因(fhs-fchA-folD)序列设计引物CA1616.1618_F：GGAATTCCATATGACTTATAAATCAGAC和CA1616.1618_R：CCCTCGAGTTATAGGTTATTTTGTAAC，以C.autoethanogenum DSM 10061基因组为模板扩增fhs-fchA-folD序列。PCR循环参数为95℃10min；[95℃30s，48℃30s，72℃48s]；72℃10min，30个循环。

将fhs-fchA-folD基因克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点上，构建重组载体，命名为pETDuet-WL。

将C.autoethanogenum中的甲酸四氢叶酸连接酶、甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因(fhs、fchA和folD)替换为来源于M.extorquens AM1的功能相同的酶的基因ftfL、fchA和mtdA。

根据已知的M.extorquens AM1基因组中如SEQ ID NO.6所示的甲酸四氢叶酸连接酶基因(ftfL)序列设计引物ftfL_F：CGCGGATCCATGCCCTCAGATATCGAGATC和ftfL_R：CCCAAGCTTCTAGAACAGCCCGTCGATC，以M.extorquens AM1基因组作为模板扩增ftf_L基因；根据已知的M.extorquens AM1基因组中如SEQ ID NO.7所示的甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因(fchA-mtdA)序列设计引物mf_F：CGCCATATGTCCAAGAAGCTGCTCTTCCAG和mf_R：CGGGGTACCTCAGTTTACCTTGGACTTCACCGTC,以M.extorquens AM1基因组作为模板扩增mtdA-fchA序列。两段基因的PCR的循环参数均为：95℃10min；[95℃30s，65℃30s，72℃45s]；72℃10min，30个循环。

将甲酸四氢叶酸连接酶、甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因(ftfL、fchA和mtdA)克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点上，构建重组载体，命名为pETDuet-C1T。

以上所有的PCR反应体系如下：

以上所有PCR产物经琼脂糖凝胶电泳初步确认正确后，用DNA纯化回收试剂盒纯化。将纯化的PCR产物与载体分别在37℃酶切30min，酶切体系如下：

以上所有连接反应体系如下：

25℃反应1h，所得连接产物(重组载体)分别在冰上加入到E.coli DH5α感受态细胞中，冰浴30分钟，37℃热击5min，冰浴5min，加入500μl无抗生素的LB液体培养基，37℃震荡培养1h，分别在含氯霉素和氨苄青霉素抗性的LB固体平板上培养12h，挑取单菌落，双酶切验证和测序筛选阳性克隆，分别命名为DH5α-pACYCDuet-metF-folA、DH5α-pETDuet-WL和DH5α-pETDuet-C1T，保存甘油管。

将DH5α-pACYCDuet-metF-folA、DH5α-pETDuet-WL和DH5α-pETDuet-C1T在5ml LB摇管中过夜培养后，分别提取质粒pACYCDuet-metF-folA、pETDuet-WL和pETDuet-C1T，将质粒pACYCDuet-metF-folA和pETDuet-WL共同转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，在含氯霉素和氨苄青霉素抗性的LB固体平板上培养12h，挑取单菌落，PCR验证目的基因片段，挑选阳性菌落，所得工程菌株即为产L-5-MTHF的工程菌，命名为BL21-WL；将质粒pACYCDuet-metF-folA和pETDuet-C1T共同转化到敲除甲硫氨酸合成酶基因(metH)的E.coli BL21(ΔmetH)感受态细胞中，在含氯霉素和氨苄青霉素抗性的LB固体平板上培养12h，挑取单菌落，PCR验证目的基因片段，挑选阳性菌落，所得工程菌株即为产L-5-MTHF的工程菌，命名为BL21(ΔmetH)-C1T。

上述重组质粒共同转入宿主菌的条件为：取相同质量的两种重组质粒共10μl，加入到100μl感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s后立即置于冰上5min，加入500μl无抗生素的LB液体培养基，37℃孵育1h后取50μl菌液涂布在含有1‰氨苄青霉素和氯霉素的固体LB平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落。

新构建的产L-5-MTHF的代谢途径见图1。

实施例2：工程菌株的外源基因转录水平分析

将实施例1中BL21-WL和BL21(ΔmetH)-C1T工程菌在培养基中培养至OD_600nm值为0.8时，取1ml菌液，作为诱导前的样品。然后加入终浓度为0.8mM的IPTG诱导12h，取1ml菌液，并用无菌生理盐水稀释至OD_600nm值为0.8，作为诱导处理后的菌液。收集到的细胞用Easypure RNA Kit提取RNA，再用AccuRT Genomic DNA Removal kit和5×All-In-OneMasterMix反转录生成cDNA(25℃10min；42℃15min；85℃5min)，将cDNA稀释到相同浓度后作为qPCR分析的模板。qPCR以

Top Green qPCR Supermix作为染料，使用LightCycler 480进行反应。

以16s rRNA基因的表达水平作为内参，每个样本做三组平行，并对所有样本的Ct值进行计算，用2^-ΔΔCt法计算基因表达的相对倍数变化，qRT-PCR反应所需引物核苷酸序列如下所示。

qRT-PCR反应体系如下：

qRT-PCR反应程序：

测定结果表明，BL21-WL和BL21(ΔmetH)-C1T工程菌中转入的外源基因在诱导后的转录水平均大幅度提高。见图2。

实施例3：工程菌中L-5-MTHF的产量计算方法及LC-MS分析

(1)实施例1中所得BL21-WL或BL21(ΔmetH)-C1T工程菌细胞的破碎方法是：将离心后获得的工程菌细胞在厌氧箱中用含0.1％的抗坏血酸和含0.1％巯基乙醇的50mMTris-HCl(pH 7.2)重悬至相同体积，用橡胶塞密封在厌氧小瓶中，100℃水浴煮沸10min破碎细胞，即得含L-5-MTHF的细胞破碎液。随即立即冰浴，15,000rpm，4℃离心15min后收集上清，加入新鲜小鼠血清(100μl·ml^-1)，37℃反应3h，煮沸5min终止反应，离心取上清，用0.22μm的醋酸纤维素滤膜过滤，滤液装入液相小瓶。

上述步骤中50mM Tris-HCl(pH 7.2)溶液煮沸后脱气厌氧处理。

(2)L-5-MTHF的纯化方法：用1M的NaOH和1M的HCl处理强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂2次，超纯水洗至中性，再用1M的NaOH浸泡树脂24h，将其转变为OH型，用超纯水洗至中性，用50mM的Tris-HCl(pH 7.2)缓冲液平衡柱子至流出液与缓冲液pH值相同，将步骤(3)中处理好的样品在避光条件下上样，用0.1M的NaCl(pH 7.2)洗脱，紫外检测器在290nm下检测并收集洗脱液。

(3)HPLC检测L-5-MTHF产量的方法是：荧光检测器Ex＝290nm,Em＝356nm，以33mM磷酸钾(pH 3.0)和乙腈(93:7，v/v)为流动相，上样量20μl，走样时间30min，柱温箱温度为30℃，保留时间为19.3±0.1min左右。配制5-MTHF标准品：准确称取20mg 5-MTHF标准品粉末于流动相中，用1M NaOH溶液调节pH值至完全溶解，定容至100ml，可得浓度为0.2mg/ml的5-MTHF溶液，将该溶液进行梯度稀释，取0.5、1.0、2.0、4.0、5.0μg/ml的5-MTHF标准品溶液做标准曲线，标准曲线方程为y＝316802x-9684.3(R²＝0.9999)，根据峰面积计算每株工程菌的L-5-MTHF的产量。

(4)LC-MS分析目的产物的正确性：取处理好的菌体细胞破碎液经0.22μm滤膜过滤后装入液相小瓶，液相色谱质谱联用(LC-MS)的检测程序参照HPLC程序，将流动相A相的33mM硫酸钾溶液换为8mM的甲酸溶液，使用ChromCore 120C18柱分析，具体程序如下：紫外检测器检测波长290nm，跑样时间30min，流动相为8mM甲酸—乙腈(90：10)，进样量10μL，流速为0.5ml·min^-1。MS分析由otofControl软件(Bruker Daltonics)在以下条件下进行：ESI-阳性模式扫描，增强二次模式校准，雾化器气体氮气1bar，干燥气体氮气8L·min^-1，探针温度180℃，全扫描质量范围为50至700m/z。数据由DataAnalysis软件(BrukerDaltonics)分析。

结果表明，在BL21-WL或BL21(ΔmetH)-C1T工程菌细胞破碎中检测到了目的产物L-5-MTHF，证明了本发明所需目标产物的正确性。见图3、图4、图5。

实施例4:BL21-WL和BL21(ΔmetH)-C1T工程菌中的关键酶亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶酶活的测定

工程菌粗酶液的制备：按最适诱导条件诱导获得1L的BL21-WL或BL21(ΔmetH)-C1T工程菌液，4℃，6,000rpm离心10min后弃上清，用50mM Tris-HCl(pH 7.4)重悬菌体，离心弃上清，以彻底除去培养基，再次离心收集菌体并重悬到破碎杯中，用超声破碎仪破碎菌体，总共破碎40min(破碎5s，间歇6s，破碎功率为50％)，将细胞破碎液装入超速离心管中4℃，20,000g，离心15min，取上清进行酶活的测定。

蛋白质浓度测定：以牛血清白蛋白为标准品，参照Bradford法进行测定细胞破碎液的蛋白浓度。

粗酶中亚甲基四氢叶酸还原酶比活的测定：在用橡胶塞密封的1cm石英厌氧比色皿中进行反应，厌氧比色皿中充入N₂，以50mM Tris-HCl(含2mM DTT，pH 7.4)作为反应缓冲液，在恒定37℃环境中，利用紫外分光光度计监测反应的进行。

反应体系如下：

以粗酶起始反应，可以发现体系吸光值逐渐上升，最后趋于平缓，通过吸光值上升的速度再根据朗伯比尔定律计算亚甲基四氢叶酸还原酶的比活，计算公式如下：

上述

是每分钟吸光度变化值；

V_总是总反应体系的体积，单位ml；

V_酶是加入粗酶液的体积，单位ml；

N是粗酶液的浓度，单位mg·ml^-1；

L是比色皿的光程，单位cm；

ε是NADH在340nm的摩尔消光系数，为ε＝6.2mM^-1cm^-1。

1个酶活力单位(U)定义为每分钟还原1μmol亚甲基四氢叶酸所需要的酶量。

粗酶中亚甲基四氢叶酸脱氢酶比活的测定：在用橡胶塞密封的1cm石英厌氧比色皿中进行反应，厌氧比色皿中充入N₂，以100mM的MOPS-KOH(含2mM DTT，pH 6.5)作为反应缓冲液，反应体系如下：

加入粗酶起始反应，可以发现体系吸光值逐渐上升，最后趋于平缓，通过吸光值上升的速度再根据上述朗伯比尔定律计算亚甲基四氢叶酸脱氢酶的比活，其中ε为30.5mM^{- 1}cm^-1[NAD(P)Hε＝5.6mM^-1cm^-1,亚甲基四氢叶酸ε＝24.9mM^-1cm^-1]。

1个酶活力单位(U)定义为每分钟还原1μmol亚甲基四氢叶酸和NAD(P)H所需要的酶量。

结果显示：BL21-WL和BL21(ΔmetH)-C1T工程菌中亚甲基四氢叶酸还原酶的比酶活分别为0.114±0.005和0.177±0.083，相比于E.coli BL21(DE3)的0.073±0.003，分别提高了0.36和0.86倍；亚甲基四氢叶酸脱氢酶的比酶活为0.047±0.0007和0.033±0.008，相比于E.coli BL21(DE3)的0.003±0.0003，提高了14.67和10.00倍。

实施例5:工程菌BL21-WL产L-5-MTHF的发酵条件初步优化

(1)实施例1构建的BL21-WL工程菌菌株的初始发酵条件为：将BL21-WL工程菌以体积比1％的接种量接种到含有氨苄青霉素和氯霉素的发酵培养基中，37℃培养至OD_600nm为0.8时加入0.8mM IPTG，25℃诱导12h；

其中，上述发酵培养基的配方及组分终浓度是：Tryptone 12g·L^-1，Yeastextract 24g·L^-1，Glycerol 4ml·L^-1，KH₂PO₄ 2.3g·L^-1，K₂HPO₄ 12.5g·L^-1，叶酸0.13g·L^-1，甲酸钠1.3g·L^-1。

上述抗生素为终浓度为25μg·ml^-1的氯霉素和终浓度为50μg·ml^-1的氨苄青霉素。

(2)对BL21-WL工程菌的诱导时间进行优化，诱导时间分别为4h、8h、12h、16h、20h，确定最适诱导时间为16h。

(3)在BL21-WL最适诱导时间下，对工程菌的诱导温度进行优化，分别在20℃、25℃、30℃、37℃下诱导，确定最适诱导温度为25℃。

(4)在最适诱导时间及温度下加入终浓度为0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM的IPTG进行最适IPTG终浓度筛选，确定L-5-MTHF产量最大时的IPTG终浓度为0.6mM。

(5)在37℃，220rpm下培养菌体长至OD_600nm值分别为0.4、0.6、0.8、1.0时加入最适浓度的IPTG(0.6mM)，其它条件均保持最适，筛选出加入IPTG的最适时间为OD_600nm值为0.8。

结果显示：BL21-WL工程菌在发酵培养基中37℃，220rpm培养至OD_600nm值为0.8时添加0.6mM的IPTG，25℃，110rpm诱导16h，产量可达445.94μg·g^-1DCW，比优化前(223.29μg·g^-1DCW)提高了99.71％，达到出发菌株E.coli BL21(DE3)(44.62μg·g^-1DCW)的10.0倍，见图6。

实施例6:工程菌BL21(ΔmetH)-C1T产L-5-MTHF的发酵条件初步优化

将实施例1构建的BL21(ΔmetH)-C1T工程菌菌株按实施例5中的方法进行发酵条件的初步优化。诱导时间选4h、8h、12h和16h进行优化，确定最适诱导时间为12h；诱导温度选20℃、25℃、30℃和37℃进行优化，确定适诱导温度为25℃；加入IPTG的终浓度选0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM进行优化，确定最适IPTG终浓度为0.6mM；加入IPTG时的OD_600nm值选0.4、0.6、0.8和1.0进行优化，确定最适加入IPTG的OD_600nm值为0.8。

结果显示：BL21(ΔmetH)-C1T工程菌在发酵培养基中37℃，220rpm培养至OD_600nm值为0.8时添加0.6mM的IPTG，25℃，110rpm诱导12h，细胞干重产量可达380.01μg·g^-1，比优化前(157.26μg·g^-1DCW)提高了141.64％，达到出发菌株E.coli BL21(DE3)的8.5倍，见图7。

序列表

<110>山东大学

<120>一种生物法生产L-5-甲基四氢叶酸的方法

<141> 2021-06-11

<160>7

<210> 1

<211>3684

<212> DNA

<213> Escherichia coli BL21(DE3)

<221> 甲硫氨酸合成酶基因（metH）的核苷酸序列

<222>（1）…（3684）

<400> 1

gtgagcagca aagtggaaca actgcgtgcg cagttaaatg aacgtattct ggtgctggac 60

ggcggtatgg gcaccatgat ccagagttat cgactgaacg aagccgattt tcgtggtgaa 120

cgctttgccg actggccatg cgacctcaaa ggcaacaacg acctgctggt actcagtaaa 180

ccggaagtga tcgccgctat ccacaacgcc tactttgaag cgggcgcgga tatcatcgaa 240

accaacacct tcaactccac gaccattgcg atggcggatt accagatgga atccctgtcg 300

gcggaaatca actttgcggc ggcgaaactg gcgcgagctt gtgctgacga gtggaccgcg 360

cgcacgccag agaaaccgcg ctacgttgcc ggtgttctcg gcccgaccaa ccgcacggcg 420

tctatttctc cggacgtcaa cgatccggca tttcgtaata tcacttttga cgggctggtg 480

gcggcttatc gagagtccac caaagcgctg gtggaaggtg gcgcggatct gatcctgatt 540

gaaaccgttt tcgacaccct taacgccaaa gcggcggtat ttgcggtgaa aacggagttt 600

gaagcgctgg gcgttgagct gccgattatg atctccggca ccatcaccga cgcctccggg 660

cgcacgctct ccgggcagac caccgaagca ttttacaact cattgcgcca cgccgaagct 720

ctgacctttg gcctgaactg tgcgctgggg cccgatgaac tgcgccagta cgtgcaggag 780

ctgtcacgga ttgcggaatg ctacgtcacc gcgcacccga acgccgggct acccaacgcc 840

tttggtgagt acgatctcga cgccgacacg atggcaaaac agatacgtga atgggcgcaa 900

gcgggttttc tcaatatcgt cggcggctgc tgtggcacca cgccacaaca tattgcagcg 960

atgagtcgtg cagtagaagg attagcgccg cgcaaactgc cggaaattcc cgtagcctgc 1020

cgtttgtccg gcctggagcc gctgaacatt ggcgaagata gcctgtttgt gaacgtgggt 1080

gaacgcacca acgtcaccgg ttccgctaag ttcaagcgcc tgatcaaaga agagaaatac 1140

agcgaggcgc tggatgtcgc gcgtcaacag gtggaaaacg gcgcgcagat tatcgatatc 1200

aacatggatg aagggatgct cgatgccgaa gcggcgatgg tgcgttttct caatctgatt 1260

gccggtgaac cggatatcgc tcgcgtgccg attatgatcg actcctcaaa atgggacgtc 1320

attgaaaaag gtctgaagtg tatccagggc aaaggcattg ttaactctat ctcgatgaaa 1380

gagggcgtcg atgcctttat ccatcacgcg aaattgttgc gtcgctacgg tgcggcagtg 1440

gtggtaatgg cctttgacga acagggacag gccgatactc gcgcacggaa aatcgagatt 1500

tgccgtcggg cgtacaaaat cctcaccgaa gaggttggct tcccgccaga agatatcatc 1560

ttcgacccaa acatcttcgc ggtcgcaact ggcattgaag agcacaacaa ctacgcgcag 1620

gactttatcg gcgcgtgtga agacatcaaa cgcgaactgc cgcacgcgct gatttccggc 1680

ggcgtatcta acgtttcttt ctcgttccgt ggcaacgatc cggtgcgcga agccattcac 1740

gcagtgttcc tctactacgc tattcgcaat ggcatggata tggggatcgt caacgccggg 1800

caactggcga tttacgacga cctacccgct gaactgcgcg acgcggtgga agatgtgatt 1860

cttaatcgtc gcgacgatgg caccgagcgt ttactggagc ttgccgagaa atatcgcggc 1920

agcaaaaccg acgacaccgc caacgcccag caggcggagt ggcgctcgtg ggaagtgaat 1980

aaacgtctgg aatactcgct ggtcaaaggc attaccgagt ttatcgagca ggataccgaa 2040

gaagcccgcc agcaggctac gcgcccgatt gaagtgattg aaggcccgtt gatggacggc 2100

atgaatgtgg tcggcgacct gtttggcgaa gggaaaatgt tcctgccaca ggtggtcaaa 2160

tcggcgcgcg tcatgaaaca ggcggtggcc tacctcgaac cgtttattga agccagcaaa 2220

gagcagggca aaaccaacgg caagatggtg atcgccaccg tgaagggcga cgtccacgac 2280

atcggtaaaa atatcgttgg tgtggtgctg caatgtaaca actacgaaat tgtcgatctc 2340

ggcgttatgg tgcctgcgga aaaaattctc cgtaccgcta aagaagtgaa tgctgatctg 2400

attggccttt cggggcttat cacgccgtcg ctggacgaga tggttaacgt ggcgaaagag 2460

atggagcgtc agggcttcac tattccgtta ctgattggcg gcgcgacgac ctcaaaagcg 2520

cacacggcgg tgaaaatcga gcagaactac agcggcccga cggtgtatgt gcagaatgcc 2580

tcgcgtaccg ttggtgtggt ggcggcgctg ctttccgata cccagcgtga tgattttgtc 2640

gctcgtaccc gcaaggagta cgaaaccgta cgtattcagc acgggcgcaa gaaaccgcgc 2700

acaccaccgg tcacgctgga agcggcgcgc gataacgatt tcgcttttga ctggcaggct 2760

tacacgccgc cggtggcgca ccgtctcggc gtgcaggaag tcgaagccag catcgaaacg 2820

ctgcgtaatt acatcgactg gacaccgttc tttatgacct ggtcgctggc cgggaagtat 2880

ccgcgcattc tggaagatga agtggtgggc gttgaggcgc agcggctgtt taaagacgcc 2940

aacgacatgc tggataaatt aagcgccgag aaaacgctga atccgcgtgg cgtggtgggc 3000

ctgttcccgg caaaccgtgt gggcgatgac attgaaatct accgtgacga aacgcgtacc 3060

catgtgatca acgtcagcca ccatctgcgt caacagaccg aaaaaacagg cttcgctaac 3120

tactgtctcg ctgacttcgt tgcgccgaag ctttctggta aagcagatta catcggcgca 3180

tttgccgtga ctggcgggct ggaagaggac gcactggctg atgcctttga agcgcagcac 3240

gatgattaca acaaaatcat ggtgaaagcg cttgccgacc gtttagccga agcctttgcg 3300

gagtatctcc atgagcgtgt gcgtaaagtc tactggggct atgcgccgaa cgagaacctc 3360

agcaacgaag agctgatccg cgaaaactac cagggcatcc gtccggcacc gggctatccg 3420

gcctgcccgg aacatacgga aaaagccacc atctgggagc tgctggaagt ggaaaaacac 3480

actggcatga aactcacaga atctttcgcc atgtggcccg gtgcatcggt ttcgggttgg 3540

tacttcagcc acccggacag caagtactac gctgtagcac aaattcagcg cgatcaggtt 3600

gaagattatg cccgccgtaa aggtatgagc gttaccgaag ttgagcgctg gctggcaccg 3660

aatctggggt atgacgcgga ctga 3684

<210> 2

<211>3267

<212> DNA

<213> pKD4

<221> 带有FRT位点的卡那霉素抗性基因的核苷酸序列

<222>（1）…（3267）

<400> 2

gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa gatcccctca 60

cgctgccgca agcactcagg gcgcaagggc tgctaaagga agcggaacac gtagaaagcc 120

agtccgcaga aacggtgctg accccggatg aatgtcagct actgggctat ctggacaagg 180

gaaaacgcaa gcgcaaagag aaagcaggta gcttgcagtg ggcttacatg gcgatagcta 240

gactgggcgg ttttatggac agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc gccctctggt 300

aaggttggga agccctgcaa agtaaactgg atggctttct tgccgccaag gatctgatgg 360

cgcaggggat caagatctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa 420

gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg 480

gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc 540

ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca 600

gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc 660

actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca 720

tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat 780

acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca 840

cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg 900

ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc 960

gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct 1020

ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct 1080

acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac 1140

ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc 1200

tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag 1260

atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg 1320

ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccccagct 1380

tcaaaagcgc tctgaagttc ctatactttc tagagaatag gaacttc 3267

<210> 3

<211>480

<212> DNA

<213> Escherichia coli BL21(DE3)

<221> 二氢叶酸还原酶基因（folA）的核苷酸序列

<222>（1）…（480）

<400> 3

atgatcagtc tgattgcggc gttagcggta gatcgcgtta tcggcatgga aaacgccatg 60

ccgtggaacc tgcctgccga tctcgcctgg tttaaacgca acaccttaaa taaacccgtg 120

attatgggcc gccatacctg ggaatcaatc ggtcgtccgt tgccaggacg caaaaatatt 180

atcctcagca gtcaaccggg tacggacgat cgcgtaacgt gggtgaagtc ggtggatgaa 240

gccatcgcgg cgtgtggtga cgtaccagaa atcatggtga ttggcggcgg tcgcgtttat 300

gaacagttct tgccaaaagc gcaaaaactg tatctgacgc atatcgacgc agaagtggaa 360

ggcgacaccc atttcccgga ttacgagccg gatgactggg aatcggtatt cagcgaattc 420

cacgatgctg atgcgcagaa ctctcacagc tattgctttg agattctgga gcggcggtaa 480

<210> 4

<211>891

<212> DNA

<213> Escherichia coli BL21(DE3)

<221> 亚甲基四氢叶酸还原酶基因（metF）的核苷酸序列

<222>（1）…（891）

<400> 4

atgagctttt ttcacgccag ccagcgggat gccctgaatc agagcctggc agaagtccag 60

gggcagatta acgtttcgtt cgagtttttc ccgccgcgta ccagtgaaat ggagcagacc 120

ctgtggaact ccatcgatcg ccttagcagc ctgaaaccga agtttgtatc ggtgacctat 180

ggcgcgaact ccggcgagcg cgaccgtacg cacagcatta ttaaaggcat taaagatcgc 240

actggtctgg aagcggcacc gcatcttact tgcattgatg cgacgcccga cgagctgcgc 300

accattgcac gcgactactg gaataacggt attcgtcata tcgtggcgct gcgtggcgat 360

ctgccgccgg gaagtggtaa gccagaaatg tatgcttctg acctggtgac gctgttaaaa 420

gaagtggcag atttcgatat ctccgtggcg gcgtatccgg aagttcaccc ggaagcaaaa 480

agcgctcagg cggatttgct taatctgaaa cgcaaagtgg atgccggagc caaccgcgcg 540

attactcagt tcttcttcga tgtcgaaagc tacctgcgtt ttcgtgaccg ctgtgtatcg 600

gcgggcattg atgtggaaat tattccggga attttgccgg tatctaactt taaacaggcg 660

aagaaatttg ccgatatgac caacgtgcgt attccggcgt ggatggcgca aatgttcgac 720

ggtctggatg atgatgccga aacccgcaaa ctggttggcg cgaatattgc catggatatg 780

gtgaagattt taagccgtga aggagtgaaa gatttccact tctatacgct taaccgtgct 840

gaaatgagtt acgcgatttg ccatacgctg ggggttcgac ctggtttata a 891

<210> 5

<211>3288

<212> DNA

<213> Clostridium autoethanogenum

<221> 亚甲基四氢叶酸脱氢酶、甲酰四氢叶酸环水解酶、甲酸四氢叶酸连接酶基因（fhs-fchA-folD）的核苷酸序列

<222>（1）…（3288）

<400> 5

atgacttata aatcagacat cgaaatagct caagaatgca caatgaagga cattaaggaa 60

attgcaaaga aattaaatat ttccgaagat gatattgaat tgtatggtaa atacaaagca 120

aaggtaaatt acaacttgtt aaagactaca cctggtaaga atggaaaact tatattatgt 180

acagctataa acccaacacc tgctggagaa ggaaaaacta ctacagcaat aggtgtagca 240

gatgcattaa atagaatggg aaaatctgtt gttgttgcac ttagagaacc atctatggga 300

cctgtatttg gtataaaagg tggagctgcc ggcggtggat atgctcaagt agtacctatg 360

gaagacataa acctacactt tacaggtgat atacatgcac tcactgctgc taacaattta 420

cttgcagcaa tgatagataa tcatatatat caaggcaata aacttaacat agacccaaga 480

aggattgctt ggagaagatg cgtagacatg aacgacagac agctcaggtt tgtagttgat 540

ggattaggtg gaaaagccaa tggtacacct agagaagatg gatttgatat aacagttgct 600

tcagaaataa tggctatatt ctgtttatca agtgacataa ttgatttaaa gaacagaatt 660

gctaaaatag ttgtaggata tactagagat ggcaagcctg taacagctca tgatttaaaa 720

gctgaaggag ctatggcagc acttcttaaa gatgcattaa aaccaaatct agttcaaact 780

cttgaaggaa caccagcatt tgtacacggc ggaccatttg caaatatagc tcatggttgt 840

aactcaataa tggctactag aatggctctt cactttggtg attatgtagt tacggaggca 900

ggtttcggtg ctgacctagg tgctgaaaaa ttcttagata tcaagtgcag aatggcagga 960

ttaaaaccag atgcagtaat aatagttgct acagttagag cattgaaata caacggcgga 1020

gttccaaagg ctgacttaaa taatgaaaac ttagaagctc ttgaaaaagg acttccaaat 1080

ttattaaaac atgtagagaa tataaccaag gtatacaaat taccagcagt agttgcatta 1140

aatgcattcc ctacagatac gcaggcagaa ttaaaattag tagaagataa atgtaaagaa 1200

ttaggcgtaa atgtaagatt atcagaagtt tgggctaaag gcggcgaagg tggaatagaa 1260

gttgccaaag aagtgcttag acttataaaa gaagagaaaa atgacttcca gtttgcttat 1320

gatgaaaaat taccaatcag agataaaata agagcagtag ctcaaaagat atatggtgct 1380

gatgatgtta ctttcacaaa tcaggcagac aaagaaattg atgagcttga aaaattagga 1440

tttggtaaaa caccagtatg tatagcaaag actcaatact ccttaactga tgaccagact 1500

aaacttggaa gaccaacagg atttaatatt acagtaagac aggttacaat ttctgctgga 1560

gcaggttttg tagttgcagt aactggttca ataatgaaga tgccaggcct tggaaaagtt 1620

ccatctgctg aaaaaataga tgtagatgaa aatggagtaa taagcggatt attctaaaaa 1680

catttaggag gaaacaatat gaaattagca gataaaagtt gcacagattt tatagaagtt 1740

cttgcatcta aagctgcaac tcctggtgga ggcggaggat cagctattac aggtgctata 1800

ggaatggcac ttggaggcat ggtatgtaac cttacaatag gaaagaaaaa gtatgcacag 1860

tatgacgaaa aggtaaaagg catacttaaa agatctgatg agcttcaagc agagctttta 1920

aagatgatgg atgcagatgc agagtgtttt ctacctcttt caaaggctta tggaatgcca 1980

aaagacactg aagagcagaa aaaaataaaa gaagaaactc tagaaaagtg tctaaaacaa 2040

gcatgcagtg ttccagtaag cattgttaag caagcttatg aagcaataaa actccatgag 2100

gcacttgtag ataactgttc caaacttgca ataagtgatg ttggtgtagg agttcagtgt 2160

ctaagagctg ctattattgg agcacagctt aatgtcataa tcaacataaa ttctattaaa 2220

gatcaggaat atgttaaaaa ggtaaaagcg gagacggaac ctttagttga agaaggcatt 2280

aagattgcag ataaggtata tgaaaaagta gttagtgcac tttccaaata aaattattat 2340

tctccagaag aaattttaat ttcttctgga ggcacttgta aattagttta gtatggtaca 2400

gatagctaat tttaatatga aggagatata agtatgggtc aaataattaa aggtaaacca 2460

gtggcagatg ctataagtga aactttaact aaagaagtta atgatttaaa ggtaaagggt 2520

attactccaa agcttacatt agtaagagtt ggagcaaacg gaagtgacct tgcttatgaa 2580

aaaggagctc taaaaaagtg cgaaaaaatt ggaatagagg cagtcgttaa agagctacca 2640

gcagatatat cacaggacaa gtttattgaa gaattgaaaa aaataaatgc ggacaagact 2700

gtaaatgcaa taatggtatt cagaccattt cctaagcaat tagatgaaag tgttataaag 2760

tatataatcg cccctgagaa agatgtagat tgctttagtc ctgtaaatgt tgctaaattg 2820

atggaaaaag atatgacagg ttttgcacct tgtacaccat ctgcggttat agaaatcctt 2880

aagcattata aagttcctat gaagggaaaa aatgcagtta tagtaggaag atctatggta 2940

gttggaaaac cagcgtgcat gctgctctta aatgaaaatg ctacagttac cgtatgccat 3000

tcaaaaacta ctgatatgcc aaaggtttgt tcccaggcag acatactggt agtaggcata 3060

ggaaaagcta aaatgataga ttcaaaatat gtaaaagatg gtgccgtagt tatagatgta 3120

ggcataaatg tagatgaaag tggaaagtta tgtggagatg tagatacaga agactgtgaa 3180

gcaaaagctt caatgataac gccagttcct aaaggagtag gctcagttac gtcatctata 3240

cttgcacagc atattgtaaa agcatgtaag ttacaaaata acctataa 3288

<210> 6

<211>2186

<212> DNA

<213> Methylobacterium extorquens AM1

<221> 甲酸四氢叶酸连接酶基因（ftfL）的核苷酸序列

<222>（1）…（2186）

<400> 6

tcgacgtggc tcaagcgctg acccaggccg gttacaccgc caccgcgatg accggttgaa 60

accattcggc ctcgcgcgcc ggccggcggc ggatcacctg tcccaaacca cctgtcccat 120

gagaaaactt aacggtcggg ttaaaaaaaa tccgagacgc ttttcgtcgt cgtttcgctc 180

acactgccac gatcggttta tcgtggccgt tccgttcgct accacggaag catagggacg 240

gaccgggcga cggctcggca cgccgcgagc ccgcgtgaac aagaaacgac ggtgagagaa 300

atgccctcag atatcgagat cgcccgcgcg gcgaccctga agccgatcgc ccaggtcgcc 360

gaaaagctcg gcatcccgga cgaggcgctt cacaactacg gcaagcacat cgccaagatc 420

gaccacgact tcatcgcctc gctcgagggt aagcccgagg gcaagctggt gctcgtcacc 480

gcgatctcgc cgacgcccgc gggcgagggc aagaccacca cgaccgtggg tctcggcgac 540

gcactcaacc ggatcggcaa gcgggcggtg atgtgcctgc gcgagccctc gctcggcccc 600

tgcttcggca tgaagggcgg cgcggccggt ggcggcaagg cccaggtcgt gccgatggag 660

cagatcaacc tgcacttcac cggggacttc cacgccatca cctcggcgca ctcgctcgcc 720

gccgcgctga tcgacaacca catctactgg gccaacgagc tcaacatcga cgtgcgccgc 780

atccactggc gccgcgtggt cgacatgaac gaccgggcgc tgcgcgcgat caaccagtcg 840

ctcggcggcg tcgccaacgg ctttccgcgt gaggacgggt tcgacatcac cgtcgcctcc 900

gaggtgatgg cggtgttctg cctcgccaag aatctggccg acctcgagga gcggctcggc 960

cgcatcgtca tcgccgagac ccgcgaccgc aagccggtga cgctggccga cgtgaaggcg 1020

accggcgcga tgaccgttct cctcaaggat gcgctgcagc cgaacctcgt gcagacgctg 1080

gagggcaacc cggccctgat ccatggcggc ccgttcgcca acatcgccca cggctgcaac 1140

tcggtgatcg ccacccgtac cggcctgcgg ctggccgact acaccgtcac cgaggccggc 1200

ttcggcgcgg atctcggcgc ggagaagttc atcgacatca agtgccgcca gaccggcctc 1260

aagccctcgg cggtggtgat cgtcgccacg atccgcgccc tcaagatgca tggcggcgtc 1320

aacaagaagg atctccaggc tgagaacctc gacgcgctgg agaagggttt cgccaacctc 1380

gagcgccacg tgaacaacgt gcggagcttc ggcctgccgg tggtggtggg cgtgaaccac 1440

ttcttccagg acaccgacgc cgagcatgcc cggttgaagg agctctgccg cgaccgtctt 1500

caggtcgagg cgatcacctg caagcactgg gcggagggcg gcgcgggcgc cgaggctctg 1560

gcgcaggccg tggtgaagct cgccgagggc gagcagaagc cgctgacctt cgcctacgaa 1620

actgagacga agatcaccga caagatcaag gcgatcgcga ccaagctcta cggtgcggcc 1680

gatatccaga tcgagtcgaa ggccgccacc aagctcgccg gcttcgagaa ggatggctac 1740

ggcggattgc ccgtctgcat ggccaagacg cagtactcgt tctcgaccga cccgaccctg 1800

atgggcgcgc cctcgggcca cctcgtctcg gtgcgcgacg tgcgcctctc ggcgggcgcc 1860

ggcttcgtcg tggtgatctg cggtgagatc atgaccatgc cgggcctgcc caaggtgccg 1920

gcggcggaca ccatccgcct cgacgccaac ggtcagatcg acgggctgtt ctagccgctg 1980

ctctcagccc tccccctacc caagtcgggc ttgcccgact tgggcggatc gttgcggatc 2040

tcgggcaagc ccgaggtccg tcgggggagg gccctttgcc ctctgcgcta cgccgccagc 2100

ccgcgcttct tcagcagcgg ctcgatgctc ggcagccgcc cccggaacgc cgtataggcc 2160

tcgcgcgcat cgcgcaggtt gcccgc 2186

<210> 7

<211>1587

<212> DNA

<213> Methylobacterium extorquens AM1

<221> 甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因（fchA-mtdA）的核苷酸序列

<222>（1）…（1587）

<400> 7

atgtccaaga agctgctctt ccagttcgac accgatgcca cgccgagcgt cttcgacgtc 60

gtcgtcggct acgacggcgg tgccgaccac atcaccggct acggcaacgt cacgcccgac 120

aacgtcggcg cctatgtcga cggcacgatc tacacccgcg gcggcaagga gaagcagtcg 180

acggcgatct tcgtcggcgg cggcgacatg gcggccggcg agcgggtgtt cgaggcggtg 240

aagaagcgct tcttcggccc gttccgcgtg tcctgcatgc tggattcgaa cggctccaac 300

acgaccgccg cggcgggtgt ggcgctcgtc gtcaaggcgg cgggcggctc ggtcaagggc 360

aagaaggccg tcgtgctcgc gggcaccggc ccggtcggca tgcgctcggc ggcgctgctc 420

gccggcgagg gcgccgaggt cgtgctgtgc gggcgcaagc tcgacaaggc gcaggccgcg 480

gccgattccg tgaacaagcg cttcaaggtg aacgtcaccg cggccgaaac cgcggacgac 540

gcttcgcgcg ccgaggccgt gaagggcgcc catttcgtct tcaccgccgg tgcgatcggc 600

cttgaactgc tgccgcaggc agcctggcag aacgagagtt cgatcgagat cgtggccgac 660

tacaacgccc agccgccgct cggcatcggc gggatcgatg cgaccgacaa aggcaaggaa 720

tacggcggaa agcgcgcctt cggtgcgctc ggcatcggcg gcttgaagct caagctgcac 780

cgcgcctgca tcgccaagct gttcgagtcg agcgaaggcg tcttcgacgc cgaggagatc 840

tacaagctgg ccaaggaaat ggcctgacgg ctcacggccc aaagggtcac agctcaatgg 900

gcggcgccgg ccttcggcgc cgccccagcg aatcaacaag aactgacagg ggagggaccc 960

atggccggca acgagacgat cgaaacattc ctcgatggcc tggcgagctc ggccccgacc 1020

cccggcggcg gcggtgccgc cgcgatctcc ggcgccatgg gcgcggcgct ggtctcgatg 1080

gtgtgtaacc tcaccatcgg caagaagaag tatgtcgagg tcgaggccga cctgaagcag 1140

gtgctggaga agtcggaagg cctgcgccgc acgctcaccg gcatgatcgc cgacgacgtc 1200

gaggctttcg acgcggtgat gggcgcctac gggctgccga aaaacaccga cgaggagaag 1260

gctgcccgcg ccgccaagat tcaggaggcg ctcaagaccg cgaccgacgt gccgctcgcc 1320

tgctgccgcg tctgccgcga ggtgatcgat ctggccgaga tcgtcgccga gaagggcaat 1380

ctcaacgtca tctcggatgc cggcgtcgcc gtgctctcgg cctatgccgg tctgcgctcg 1440

gcggccctca acgtctacgt caacgccaag ggcctcgacg accgcgcctt cgccgaggag 1500

cggctgaagg agctggaagg cctgctggcc gaggcgggcg cgctcaacga gcggatctac 1560

gagacggtga agtccaaggt aaactga 1587

Claims (3)

1.一种生物法生产L-5-甲基四氢叶酸的方法，步骤是：

（1）构建产L-5-甲基四氢叶酸（L-5-MTHF）的工程菌：

a. 以大肠杆菌E. coli BL21(DE3)基因组为模板扩增SEQ ID NO.3所示的二氢叶酸还原酶基因folA以及SEQ ID NO.4所示的亚甲基四氢叶酸还原酶基因metF，将folA基因和metF基因克隆到pACYCDuet-1载体的两个多克隆位点上，构建重组质粒，命名为pACYCDuet-metF-folA；以自产乙醇梭菌（C. autoethanogenum）基因组为模板扩增SEQ ID NO.5所示的甲酸四氢叶酸连接酶、甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因fhs-fchA-folD，将fhs-fchA-folD基因克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点上，构建重组载体，命名为pETDuet-WL；以扭脱甲基杆菌（M. extorquens）AM1基因组作为模板扩增SEQ ID NO.6所示的甲酸四氢叶酸连接酶基因ftfL以及SEQ ID NO.7所示的甲酰四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因fchA-mtdA，将ftfL、fchA和mtdA克隆到pETDuet-1载体的多克隆位点上，构建重组载体，命名为pETDuet-C1T；

b. 将质粒pACYCDuet-metF-folA和pETDuet-WL共同转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中，在含氯霉素和氨苄青霉素抗性的LB固体平板上培养，阳性菌落菌株即为产L-5-MTHF的工程菌，命名为BL21-WL；将质粒pACYCDuet-metF-folA和pETDuet-C1T共同转化到敲除甲硫氨酸合成酶基因（metH）的E. coli BL21(ΔmetH)感受态细胞中，在含氯霉素和氨苄青霉素抗性的LB固体平板上培养，阳性菌落菌株即为产L-5-MTHF的工程菌，命名为BL21(ΔmetH)-C1T；

（2）产L-5-MTHF的工程菌发酵：

将产L-5-MTHF的工程菌BL21-WL菌株或BL21(ΔmetH)-C1T菌株以体积比1~5%的接种量接种到含有氨苄青霉素和氯霉素的发酵培养基中，在37±1℃和180~220 rpm转速条件下培养2~4小时至OD600nm为0.6~1.0，获得菌液；向制得的菌液中加入终浓度为0.4~0.8 mM 的IPTG，在20~37℃、100~120 rpm转速下诱导8~16小时，然后将培养液离心收集菌体，即获得含L-5-MTHF的工程菌细胞；

其中，上述发酵培养基的配方及组分终浓度是：胰蛋白胨 10~15 g∙L-1，酵母粉 20~30g∙L-1，甘油 2~5 ml∙L-1，叶酸 0.01~0.4 g∙L-1，甲酸钠 0.1~4.0 g∙L-1，KH2PO4 2~4 g∙L-1，K2HPO4 12~14 g∙L-1；氨苄青霉素终浓度为50 µg∙ml-1，氯霉素的终浓度为25 μg∙ml-1；

（3）破碎工程菌细胞，释放出L-5-MTHF：

将离心后获得的工程菌细胞在厌氧箱中用含0.1%的抗坏血酸和含0.1%巯基乙醇的50mM pH 7.2 的经煮沸后脱气厌氧处理的Tris-HCl溶液重悬，密封在厌氧小瓶中，100℃水浴煮沸10 min破碎细胞，即得含L-5-MTHF的细胞破碎液，立即将其冰浴，并于15,000 rpm，4℃离心15 min后收集上清，再加入新鲜小鼠血清至100 µl∙ml-1，37℃反应3 h，煮沸5 min终止反应，离心取上清，用0.22 µm的醋酸纤维素滤膜过滤，滤液装入液相小瓶；

（4）使用201×7强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂纯化L-5-MTHF，并使用高效液相色谱（HPLC）对L-5-MTHF产量进行测定：

其中L-5-MTHF的纯化方法是：用1 M的NaOH和1 M的HCl处理强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂2次，超纯水洗至中性，再用1 M的NaOH浸泡树脂24 h，将其转变为OH型，用超纯水洗至中性，用50 mM pH 7.2的Tris-HCl缓冲液平衡柱子至流出液与缓冲液pH值相同，将步骤（3）液相小瓶中的滤液样品在避光条件下上样，用0.1 M pH 7.2的NaCl洗脱，紫外检测器在290 nm下检测并收集洗脱液；

其中HPLC对L-5-MTHF测定的方法是：荧光检测器Ex=290 nm, Em=356 nm，以体积比为93:7的33 mM pH 3.0磷酸钾和乙腈为流动相，上样量20 µl，走样时间30 min，柱温箱温度为30℃，保留时间为19.3±0.1min。

2.根据权利要求1所述生物法生产L-5-MTHF的方法，其特征在于：步骤（2）所述工程菌BL21-WL菌株或BL21(ΔmetH)-C1T菌株的发酵条件是在37℃和200 rpm转速条件下培养2~3小时至OD600nm为0.6~0.8，并向菌液中加入终浓度为0.6~0.8 mM 的IPTG，在20~25℃、100~110 rpm转速下诱导12~16小时。

3.根据权利要求1所述生物法生产L-5-MTHF的方法，其特征在于：步骤（2）所述发酵培养基的配方及组分终浓度是：胰蛋白胨 12 g∙L-1，酵母粉 24 g∙L-1，甘油 4 ml∙L-1，叶酸0.13 g∙L-1，甲酸钠 1.3 g∙L-1，KH2PO4 2.3g∙L-1，K2HPO4 12.5 g∙L-1。

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