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CN113403313B - 一种特异识别人PLK1位点的sgRNA、质粒、纳米复合物和应用 - Google Patents

一种特异识别人PLK1位点的sgRNA、质粒、纳米复合物和应用 Download PDF

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CN113403313B CN202110699974.3A CN202110699974A CN113403313B CN 113403313 B CN113403313 B CN 113403313B CN 202110699974 A CN202110699974 A CN 202110699974A CN 113403313 B CN113403313 B CN 113403313B
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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体是涉及到一种特异识别人PLK1位点的sgRNA、质粒、纳米复合物和应用，所述sgRNA的序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，采用本发明的sgRNA序列，基因编辑效率较高，持续时间长，包含上述sgRNA的质粒可以顺利的进入细胞核中发挥作用；脂质体iLP181具有合适的pKa值，较好的内涵体逃逸效果，较好的靶向性；得到的纳米复合物在体内外同时具有较好的安全性，有效的实现荷载核酸的逃逸与释放，且在长时间下依然具有较高的基因编辑效率，可以有效的抑制肿瘤细胞的增值。

Description

一种特异识别人PLK1位点的sgRNA、质粒、纳米复合物和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体是涉及到一种特异识别人PLK1位点的sgRNA、质粒、纳米复合物和应用。
背景技术
Polo样激酶(polo-like kinase1，PLK1)，是一种广泛存在于真核生物中的丝/苏氨酸蛋白激酶，因此在细胞周期中起重要作用而受到广泛关注。研究发现，PLK1在人类大多数肿瘤中高表达，并与肿瘤细胞的增殖及患者的预后密切相关。临床前期结果表明干扰PLK1的表达能够显著抑制包括非小细胞肺癌、淋巴瘤、结直肠癌在内的多种肿瘤的生长，且对正常细胞无显著影响。因此PLK1被认为是一个有良好应用前景的恶行肿瘤新靶点。因此利用基因编辑技术针对肿瘤内的PLK1靶点，揭示PLK1基因调控肿瘤增殖机制，将为人类PLK1位点相关的癌症治疗及药物的研发提供新思路，具有重要意义。
目前较为成熟的基因编辑技术包括：ZFN、TALEN与CRISPR/Cas基因编辑技术。虽然ZFN与TALEN基因打靶技术是目前研究较为成熟的两种定点突变技术，但是这两种技术构建程序较为复杂，每一个位点需要构建一对响应的核酸酶。而CRISPR/Cas基因编辑技术对特异识别的位点靠小的crRNA的引导来完成。每个特异识别的crRNA只有几十个碱基，整个载体较小。相对于ZFN和TALEN载体更加容易构建。
CRISPR/Cas是古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。目前CRISPR/Cas基因编辑技术的发展进入了一个充满希望的时代，为目前无法治愈的疾病提供了新的治疗方法。应用于治疗癌症、水疱性皮肤病、亨廷顿氏病、镰状细胞病(SCD)、HIV-1感染，并建立携带改良基因组的特异性动物模型等。在一定程度上，CRISPR/Cas的出现反映了人类基因编辑技术的重大进展，为进一步了解基因功能、潜在的各种疾病的生物学或病理机制以及最终开发新的治疗方案提供了一个有效而强大的平台。
常用的CRISPR/Cas递送载体有病毒载体和非病毒载体。虽然腺病毒AAV和慢病毒广泛应用于临床研究，但70％人群体内已含有中和AAV的抗体，且具有潜在基因整合性和引发免疫反应的担忧。在非病毒递送载体中，脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticles,LNPs)是应用最广泛的mRNA载体，目前已上市的mRNA疫苗mRNA-1273、BNT162b2，以及尚处于临床试验阶段的新冠病毒mRNA疫苗CVnCoV、ARCT-021和ARCoV都使用的是LNPs递送载体。LNPs主要由可离子化脂质、磷脂、胆固醇和PEG脂质组成，其中可离子化脂质是LNP响应细胞微环境、从内涵体逃逸的关键脂质分子。研究表明，解离常数pKa在6.2-6.5范围的可离子化脂质在正常生理环境(pH7.4)条件下不带电荷，而在溶酶体等微酸环境下带正电荷，通过质子海绵效应、胶体渗透压效应，有效促进荷载核酸的逃逸与释放。与阳离子脂质相比，可离子化脂质显然更有优势，因为后者容易在生理环境下与生物大分子结合带来安全性问题。Alnylam公司上市的siRNA药物Patisiran所使用的LNPs的关键组分是Dlin-MC3-DMA，其pKa＝6.44，Dlin-MC3-DMA的酸响应能力、有效性与安全性已得到验证。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异识别人PLK1位点的sgRNA、质粒、纳米复合物和应用。
本发明的内容包括一种特异识别人PLK1位点的sgRNA，所述sgRNA的序列为SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3，优选为SEQ ID NO：2。SEQ ID NO：2是在SEQ ID NO：1的基础上在SEQ ID NO：1序列前添加一段酶切识别位点序列而成，SEQ ID NO：3是在SEQ IDNO：2的基础上在SEQ ID NO：2序列前添加一个稳定sgRNA序列的碱基G而成，。所述的sgRNA负责识别的靶片段序列为SEQ ID NO:12。
一种质粒，包括上述sgRNA。
一种纳米复合物，包括脂质体iLP181，和上述质粒；所述脂质体iLP181由关键脂质iLP181、磷脂、胆固醇和PEG-脂质组成；关键脂质iLP181的结构式为：
Figure BDA0003129428490000021
所述磷脂为包括选自下列至少之一：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱(POPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和蛋黄卵磷脂(EPC)。
所述PEG-脂质包括选自下列至少之一：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG(DSPE-PEG)、二肉豆蔻基甘油(DMG-PEG)和二甲基丙烯酸酯(DMA-PEG)。
所述关键脂质、磷脂、胆固醇和PEG-脂质的摩尔比为(25-57):(1-37):(25-67):(0.1-19)。
脂质体iLP181的制备方法为，将关键脂质、磷脂、胆固醇和PEG-脂质溶于乙醇溶剂中，搅拌，加入到柠檬酸钠溶液，得到脂质体iLP181。
一种所述的sgRNA在基因编辑中的应用。
一种所述的sgRNA在制备治疗癌症药物中的应用。
本发明的有益效果是，采用本发明的sgRNA序列，基因编辑效率较高，发挥基因编辑持续时间长，包含上述sgRNA的质粒可以顺利的进入细胞核中发挥作用；脂质体iLP181具有合适的pKa值，较好的内涵体逃逸效果，较好的靶向性；得到的纳米复合物在体内外同时具有较好的安全性，有效的实现荷载核酸的逃逸与释放，且在长时间下依然具有较高的基因编辑效率，可以有效的抑制肿瘤细胞的增值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例中用到的脂质体iLP181中关键脂质的结构。
图2为本发明实施例中用到的关键脂质iLY1809的核磁氢谱。
图3A为本发明实施例中纳米复合物iLP181/psgPLK1的结构示意图；
图3B为纳米复合物iLP181/psgPLK1的粒径与电势。
图4A为纳米复合物iLP181/psgPLK1的细胞活力检测；
图4B为纳米复合物iLP181的pKa值。
图5A为iLP181/psgPLK1在缓冲溶液和人血清(Human serum,HS)中长达两周的粒径检测。
图5B为iLP181/psgPLK1在缓冲溶液和人血清(Human serum,HS)中长达两周的zata电位检测。
图6A为Lipo2000/psgPLK1能否进入细胞核中发挥质粒的功能检测；
图6B为图6A中的GFP信号定量分析。
图7A为本发明实施例中sgRNAs序列的筛选；
图7B为iLP181/psgPLK1介导HepG2-Luc细胞基因编辑的长效评价。
图8A为本发明实施例中iLP181入胞机制的研究；
图8B为图8A中的荧光信号定量分析。
图9A为本发明实施例中纳米复合物iLP181/Cy5-NA内涵体逃逸研究；
图9B为图9A中的Cy5荧光信号定量分析；
图9C为图9A中Cy5标记的核酸与lysotracker染的内涵体/溶酶体的共定位分析。
图10A为本发明实施例中脂质体iLP181递送Cy5标记的核酸分子在尾静脉给药后的不同时间，使用活体成像系统对全身和分离的主要器官进行荧光成像分析。
图10B为对图10A中分离的主要器官在6h、12h和24h的平均荧光强度(MFIs)定量分析。
图11A为本发明实施例中脂质体iLP181递送表达红色荧光蛋白的质粒在小鼠体内主要脏器的分布情况；
图11B为图11A为中分离的主要器官的RFP定量分析；
图12A为iLP181/psgPLK1的体内抗肿瘤作用示意图；
图12B为实验结束时小鼠肿瘤组织中荧光素酶的表达；
图12C为整个实验期间肿瘤体积生长情况；
图12D为实验结束时肿瘤组织中PLK1 mRNA的表达。
图13为本发明实施例中iLP181/psgRNA复合物治疗小鼠肝癌后，主要脏器病理分析结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1特异识别人PLK1位点的sgRNA设计
设计4个靶向PLK1基因的sgRNAs(sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4)。sgRNA1的序列为SEQ ID NO:2，sgRNA2的序列为SEQ ID NO:3，sgRNA3的序列为SEQ ID NO:4，sgRNA4的序列为SEQ ID NO:5。
首先，通过梯度退火PCR方式获得聚合sgRNAs，并通过Bbs1酶切位点将其克隆到PX458质粒上，称为Cas9-sgPLK1。然后将构建的Cas9-sgPLKs质粒(psgPLK1-1、psgPLK1-2、psgPLK1-3和psgPLK1-4)转染感受态大肠杆菌DH5α中。具体方法为：将构建好的Cas9-sgPLKs质粒加入感受态大肠杆菌DH5α中并轻轻混匀置于冰上30min，然后42℃热击90s后置于冰上2-3min，接下来加入适量LB培养基培养(不含抗生素)混匀置于37℃摇床，150rpm震荡培养45min使菌体复苏。然后将复苏后的菌液短暂离心浓缩后，取一定体积的量加到LB琼脂培养基(含氨苄抗生素)中，置于37℃培养箱培养12-16h，次日挑取单克隆的菌落到LB液体培养基(含氨苄抗生素)中并置于37℃摇床，180rpm震荡培养16h使菌体扩培。培养后收集大肠杆菌，用Endo Free质粒试剂盒(康维世纪)提取Cas9-sgPLK1s质粒(psgPLK1-1、psgPLK1-2、psgPLK1-3和psgPLK1-4)。
CRISPR-PX458(PX458-E)为空载体质粒，Cas9-sgPLK1(即psgPLK1)为PX458-E改造后特异识别人PLK1位点的质粒，其中功能结构单元包括：U6启动子、SV40核定位信号、sgRNA改造功能框、T2A、Cas9蛋白序列和增强的绿色荧光信号(Green Fluorescence Protein,GFP)；特异识别人PLK1位点的Cas9-sgPLKs(psgPLK1-1、psgPLK1-2、psgPLK1-3和psgPLK1-4)质粒信息测序结果，结果显示没有错配碱基对，验证了重组Cas9-sgPLKs(psgPLK1-1、psgPLK1-2、psgPLK1-3和psgPLK1-4)构建成功。
实施例2脂质体iLP181的合成
首先是iLY1809(关键脂质)的合成：1)加入N-叔丁氧羰基-1,3-丙二胺和1,2-环氧十二烷及乙醇至三口瓶中，在氮气保护下50℃回流反应过夜。TLC检测反应停止后，减压浓缩。粗产物用展开剂二氯甲烷：甲醇(v/v＝30:1)过硅胶柱进行分离纯化，得到透明液体(3-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯；2)加入化合物(3-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丙基)氨基甲酸叔丁酯及二氯甲烷于三口瓶中，搅拌并加入盐酸醇溶液，常温反应过夜，TLC检测后停止反应。萃取产物并调pH值至7-8后收集有机相，减压浓缩，粗产物用展开剂二氯甲烷：甲醇(v/v＝15:1)过硅胶柱进行分离纯化，得到透明液体1,1'-((3-氨基丙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)；3)加入化合物1,1'-((3-氨基丙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)、丁二酸及催化剂1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于含有二氯甲烷的三口瓶中，氮气保护下常温反应过夜，TLC检测后停止反应。将粗产物水洗、盐洗后，将有机相干燥、过滤减压浓缩。粗产物用展开剂二氯甲烷：甲醇(v/v＝30:1)过硅胶柱进行分离纯化。得到透明液体即化合物N1，N4-双(3-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丙基)琥珀酰胺，命名为iLY1809。
核磁氢谱:1H NMR(700MHz，
CDCl3)δ(ppm)0.88(t,12H,J＝13.24Hz,4×-CH3)1.26-1.59(m,76H,38×-CH2-)2.49(m，8H,2×-CH2-O,2×-CH2-)2.67(t,4H,J＝11.78Hz,4×N-CH2-)3.32(m，4H，2×N-CH2-)3.67(s,2H,2×-CH-OH)5.30(s,4H,4×-OH)。
HR-EIMS m/z calcd for C58H118N4O6(M+)967.5843,found 966.9051。
然后，脂质体iLP181由iLY1809(关键脂质)、PEG-脂质、磷脂、胆固醇通过自组装过程制备成脂质体iLP181。首先将胆固醇、磷脂、iLY1809和PEG-脂质分别溶于乙醇溶液中，配成浓度为20mg/mL的溶液(20mg/mL的浓度是上述4个组分各自的浓度)，然后将上述溶液混合并(如表1)吸入到1mL胰岛素注射器中，在磁力转子的转动下加入到3倍体积的pH＝4柠檬酸钠溶液中得到脂质体iLP181。
表1各组分在脂质体iLP181中所占比例
Figure BDA0003129428490000051
实施例3脂质体iLP181包裹psgPLK1形成iLP181/psgPLK1纳米复合物的过程
首先计算好psgPLK1最终需要的总量(总量计算：1)细胞水平：以6孔板转染为例，则一个孔需要加入1.6μg的psgPLK1(600ng/μL)；2)动物水平：一般给药剂量为0.5/1mg/kg，即一只重量为20g的小鼠需要给药10/20μg的psgPLK1(600ng/μL))，按所需总量的1.2倍富余量准备。然后将psgPLK1浓度稀释为1000ng/μL。psgPLK1先与缓冲液(50％乙醇水溶液)按体积比1：1混合；然后将psgPLK1水溶液(1000ng/μL)与脂质体iLP181以1:1的体积比混合。随后，将混合物在50℃下孵育20min，然后室温下混合液装在100KDa透析管中在1×PBS里透析2个小时，(1×PBS所用量根据具体脂质体溶液的量而定，一般每5mL脂质体溶液需要1L 1×PBS)，装1×PBS的烧杯置于磁力搅拌器上，透析过程中保持中速磁力搅拌。透析过程中未包被的iLP181以及乙醇都被1×PBS取代，透析完的液体即为最终脂质体纳米复合物。
实验例
通过如下测试实验，说明sgRNA、质粒、纳米复合物的优点。
图3为用脂质体iLP181包裹psgPLK1质粒形成的纳米粒的物理表征分析。图3A为脂质体纳米粒(Lipid Nanoparticles,LNPs)形成的示意图。图3B为iLP181/psgPLK1纳米复合物的理化参数。
图4A为通过MTT法检测纳米复合物在细胞水平的安全性，图4A中iLP181处理后的细胞存活率超过85％，表明脂质体iLP181在体外具有理想的生物相容性。
图4B为通过TNS(2-(对甲苯基)-6-萘磺酸)荧光探针法测定iLP181的pKa值。首先，在PBS中制备iLP181(10mM)溶液，然后制备一系列pH范围为3.00至10.00的iLP181溶液，其中含有1μM TNS、10mM乙酸铵、10mM 4-吗啉乙磺酸(MES)、10mM HEPES和130mM NaCl。在激发波长321nm，发射波长445nm处，用分光光度计测定各溶液的荧光强度。采用sigmoidal最佳拟合分析对荧光数据进行分析。计算pKa值并定义为引起半最大荧光强度的pH值，得到pKa值为6.43，研究表明，解离常数pKa在6.2-6.5范围的可离子化脂质在正常生理环境(pH7.4)条件下不带电荷，而在溶酶体等微酸环境下带正电荷，通过质子海绵效应、胶体渗透压效应，有效促进荷载核酸的逃逸与释放。
图5为iLP181/psgPLK1在缓冲溶液和人血清(Human serum,HS)中稳定性评价。纳米复合物在缓冲溶液和人血清(Human serum,HS)中的(A)粒径和(B)电势，由图可得，iLP181/psgPLK1在PBS缓冲溶液或10％人血清中孵育2周后，大小和zeta电位均稳定均一，说明iLP181/psgPLK1具有良好的稳定性和相对安全性。
图6为评价Lipo2000/psgPLK1能否进入细胞核中发挥质粒的功能，在HEK293A细胞中经Lipo2000转染siPLK1(siPLK1的正义链序列为SEQ ID NO:10，siPLK1的反义链序列为SEQ ID NO:11，实际使用时，在正义链序列和反义链序列的3’端添加末端悬垂，即dTdT，增强其稳定性)、PX458-E或psgPLK1处理后，发现PX458-E或psgPLK1中GFP在24h和48h均高效表达(图6A)。图6B为图6A的定量，结果表明Lipo2000/psgPLK1可以使psgPLK1进入HEK293A细胞核中。
图7为iLP181/psgPLK1介导的基因编辑及细胞入胞机制的研究进展。图7A为特异识别人PLK1位点的Cas9-sgPLKs(psgPLK1-1、psgPLK1-2、psgPLK1-3和psgPLK1-4)质粒针对人PLK1基因编辑性能评价结果，在HEK293A细胞中利用Lipo2000转染Cas9-sgPLKs(psgPLK1-1、psgPLK1-2、psgPLK1-3和psgPLK1-4)评估其的基因编辑效率，psgPLK1-1、psgPLK1-2、psgPLK1-3和psgPLK1-4所用内参引物序列为hGAPDH：(5’端序列为SEQ ID NO:6，3’端序列为SEQ ID NO:7)，所用PLK1基因引物序列为：hPLK1(5’端序列为SEQ ID NO:8，3’端序列为SEQ ID NO:9)，所用的siPLK1的正义链序列为SEQ ID NO:10，siPLK1的反义链序列为SEQ ID NO:11。结果显示，sgPLK1-1序列的活性最好，基因编辑效率达到33％(图7A)。在HepG2-Luc细胞用iLP181包裹psgPLK1质粒，能显著的介导PLK1基因的DNA敲除。图7B为iLP181/psgPLK1介导HepG2-Luc细胞基因编辑的长期评价，由结果可知该体系在细胞水平上可实现长达7天的基因编辑，在转染后第七天，iLP181/psgPLK1组仍可实现32％的基因编辑效率。
图8A为iLP181被HepG2-Luc细胞摄取是否依赖ApoE检测，图8B为通过flowjo7.6.1软件对图8A的定量分析，Opti-MEM和DMEM分别代表iLP181/Cy5-NA的转染过程分别在无血清培养基(Opti-MEM)和完全培养基(DMEM)中进行；DMEM+ApoE代表iLP181/Cy5-NA/ApoE混合物转染的细胞，转染过程在DMEM中进行；iLP181/Cy5-NA代表iLP181与Cy5标记的核酸结合，方法如上所述。由结果可知通过iLP181/Cy5-NA/ApoE组转染，Cy5荧光信号较强，说明iLP181/Cy5-NA进入细胞较多，iLP181/Cy5-NA被HepG2-Luc细胞摄取是依赖ApoE的。
图9为iLP181的内涵体/溶酶体逃逸效果和共定位分析。图9A为通过激光共聚焦显微镜观察不同转染时间点iLP181/Cy5-NA在HepG2-Luc细胞中的亚细胞定位和内涵体逃逸分析，比例尺：20μm。图9B为iLP181/Cy5-NA进入HepG2-Luc细胞后在不同时间点的平均荧光强度(MFIs)，结果证明，随着转染时间的延长，iLP181/Cy5-NA的MFI逐渐增加，说明在HepG2-Luc细胞中积累了越来越多的核酸。图9C为Cy5标记的核酸与lysotracker染的内涵体/溶酶体的共定位分析。由图可得，转染1-3小时后，iLP181/Cy5-NA进入细胞，并被溶酶体/内涵体内化；大约在转染3-5h后，iLP181/Cy5-NA从内涵体/溶酶体中逃逸出来，说明了iLP181具有较好的内涵体逃逸效果。
图10为iLP181/Cy5-NA在小鼠的体内分布情况。实验分为3组：PBS组、Naked Cy5-NA和iLP181/Cy5-NA。在给药后的不同时间，使用活体成像系统对全身和离体的主要器官进行荧光成像(图10A)。定量分析离体器官6h、12h和24h的平均荧光强度(MFIs)(图10B)。其中，G1为PBS组(阴性对照)，G2为Naked Cy5-NA，G3为iLP181/Cy5-NA。Cy5-NA代表Cy5标记的核酸，其与iLP181结合的方法与上文提到的方法相同。首先将3种制剂经尾静脉注射入小鼠的体内。在给药1、6、12和24h后，使用活体成像系统检查小鼠或分离的主要器官中的Cy5荧光分布情况，结果显示，Cy5荧光信号主要富集在小鼠肝脏和肿瘤部位，在24h，Cy5荧光信号只富集在小鼠肝脏和肿瘤部位，其他部位的荧光信号均被代谢了(图10A和图10B)。
图11为iLP181/Plasmid在小鼠的体内分布情况。实验分为3组：PBS组、NakedPlasmid和iLP181/Plasmid。在给药后的不同时间，使用活体成像系统对(A)离体的主要器官进行荧光成像和(B)定量分析肿瘤部位的平均荧光强度(MFIs)。(A)分别于给药后2d、3d和5d对离体器官进行RFP成像。iLP181/Plasmid代表iLP181与表达红色荧光蛋白的报告质粒(Red Fluorescent Protein,RFP)结合，其与iLP181结合的方法与上文提到的方法相同。首先将3种制剂经尾静脉注射入小鼠的体内。在给药2d、3d和5d后，分别使用活体成像系统观察小鼠分离的主要器官中的RFP表达情况，结果显示，在尾静脉给药后的24h小鼠肿瘤部位开始表达RFP，同时该信号只在肿瘤部位表达，并且持续到第5d RFP荧光信号依然存在(图11B)。
图12为iLP181/psgPLK1制剂的体内抗肿瘤情况，实验分为4组：PBS组、iLP181/PX458-E、iLP181/siPLK1和iLP181/psgPLK1，将4种制剂经瘤内注射入小鼠，并记录小鼠肿瘤体积。其中图12A为抑瘤实验方案；图12B为实验结束时动物肿瘤的生物发光成像；图12C为整个实验过程肿瘤体积的生长曲线；图12D为实验结束时肿瘤组织中PLK1 mRNA的表达；G1为PBS，G2为iLP181/PX458-E，G3为iLP181/siPLK1，G4为iLP181/psgPLK1。结果显示，iLP181/psgPLK1制剂通过瘤内局部给药这种治疗方式，显著减少了肿瘤细胞的数量(荧光信号减弱)(图12B)，显著的控制了HepG2-Luc肿瘤的增殖(图12C)，并且还敲低了PLK1基因的表达(图12D)。
图13为iLP181/psgPLK1制剂的体内抗肿瘤安全系数评价，实验分为4组：PBS、iLP181/siPLK1、iLP181/PX458-E和iLP181/psgPLK1，将4种制剂经瘤内注射入小鼠的体内，实验终点将主要脏器进行石蜡包埋、切片，并进行H&E染色分析。结果显示iLP181/psgPLK1对主要脏器没有带来伤害，是一种安全的给药方式。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本申请中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本申请中一个或多个实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本申请中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
<110> 北京理工大学
<120> 一种特异识别人PLK1位点的sgRNA、质粒、纳米复合物和应用
<160>12
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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tacctacggc aaattgtgct 20
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<212>DNA
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caccgctccc cgtcatattc gactt 25
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<212>DNA
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<212>RNA
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<212>RNA
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uaaggagggu gaucuucuuc a 21
<210>12
<211>2160
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ggaggctctg ctcggatcga ggtctgcagc gcagcttcgg gagcatgagt gctgcagtga 60
ctgcagggaa gctggcacgg gcaccggccg accctgggaa agccggggtc cccggagttg 120
cagctcccgg agctccggcg gcggctccac cggcgaaaga gatcccggag gtcctagtgg 180
acccacgcag ccggcggcgc tatgtgcggg gccgcttttt gggcaagggc ggctttgcca 240
agtgcttcga gatctcggac gcggacacca aggaggtgtt cgcgggcaag attgtgccta 300
agtctctgct gctcaagccg caccagaggg agaagatgtc catggaaata tccattcacc 360
gcagcctcgc ccaccagcac gtcgtaggat tccacggctt tttcgaggac aacgacttcg 420
tgttcgtggt gttggagctc tgccgccgga ggtctctcct ggagctgcac aagaggagga 480
aagccctgac tgagcctgag gcccgatact acctacggca aattgtgctt ggctgccagt 540
acctgcaccg aaaccgagtt attcatcgag acctcaagct gggcaacctt ttcctgaatg 600
aagatctgga ggtgaaaata ggggattttg gactggcaac caaagtcgaa tatgacgggg 660
agaggaagaa gaccctgtgt gggactccta attacatagc tcccgaggtg ctgagcaaga 720
aagggcacag tttcgaggtg gatgtgtggt ccattgggtg tatcatgtat accttgttag 780
tgggcaaacc accttttgag acttcttgcc taaaagagac ctacctccgg atcaagaaga 840
atgaatacag tattcccaag cacatcaacc ccgtggccgc ctccctcatc cagaagatgc 900
ttcagacaga tcccactgcc cgcccaacca ttaacgagct gcttaatgac gagttcttta 960
cttctggcta tatccctgcc cgtctcccca tcacctgcct gaccattcca ccaaggtttt 1020
cgattgctcc cagcagcctg gaccccagca accggaagcc cctcacagtc ctcaataaag 1080
gcttggagaa ccccctgcct gagcgtcccc gggaaaaaga agaaccagtg gttcgagaga 1140
caggtgaggt ggtcgactgc cacctcagtg acatgctgca gcagctgcac agtgtcaatg 1200
cctccaagcc ctcggagcgt gggctggtca ggcaagagga ggctgaggat cctgcctgca 1260
tccccatctt ctgggtcagc aagtgggtgg actattcgga caagtacggc cttgggtatc 1320
agctctgtga taacagcgtg ggggtgctct tcaatgactc aacacgcctc atcctctaca 1380
atgatggtga cagcctgcag tacatagagc gtgacggcac tgagtcctac ctcaccgtga 1440
gttcccatcc caactccttg atgaagaaga tcaccctcct taaatatttc cgcaattaca 1500
tgagcgagca cttgctgaag gcaggtgcca acatcacgcc gcgcgaaggt gatgagctcg 1560
cccggctgcc ctacctacgg acctggttcc gcacccgcag cgccatcatc ctgcacctca 1620
gcaacggcag cgtgcagatc aacttcttcc aggatcacac caagctcatc ttgtgcccac 1680
tgatggcagc cgtgacctac atcgacgaga agcgggactt ccgcacatac cgcctgagtc 1740
tcctggagga gtacggctgc tgcaaggagc tggccagccg gctccgctac gcccgcacta 1800
tggtggacaa gctgctgagc tcacgctcgg ccagcaaccg tctcaaggcc tcctaatagc 1860
tgccctcccc tccggactgg tgccctcctc actcccacct gcatctgggg cccatactgg 1920
ttggctcccg cggtgccatg tctgcagtgt gccccccagc cccggtggct gggcagagct 1980
gcatcatcct tgcaggtggg ggttgctgta taagttattt ttgtacatgt tcgggtgtgg 2040
gttctacagc cttgtccccc tccccctcaa ccccaccata tgaattgtac agaatatttc 2100
tattgaattc ggaactgtcc tttccttggc tttatgcaca ttaaacagat gtgaatattc 2160

Claims (4)

1.一种纳米复合物，其特征是，包括脂质体iLP181，和质粒，所述质粒包括特异识别人PLK1位点的sgRNA，所述sgRNA的序列为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3；
所述脂质体iLP181由关键脂质iLY1809、磷脂、胆固醇和PEG-脂质组成；关键脂质iLY1809的结构式为：
Figure 347668DEST_PATH_IMAGE001
；
所述关键脂质iLY1809、磷脂、胆固醇和PEG-脂质的摩尔比为(25-57):(1-37):( 25-67):(0.1-19)；
脂质体iLP181的制备方法为，将关键脂质iLY1809、磷脂、胆固醇和PEG-脂质溶于乙醇溶剂中，搅拌，加入到柠檬酸钠溶液，得到脂质体iLP181。
2.如权利要求1所述的纳米复合物，其特征是，所述磷脂包括二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、蛋黄卵磷脂中的一个或多个。
3.如权利要求1所述的纳米复合物，其特征是，所述PEG-脂质包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-PEG、二肉豆蔻基甘油、二甲基丙烯酸酯中的一个或多个。
4.一种如权利要求1所述的纳米复合物在制备治疗癌症药物中的应用。
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EP4585272A2 (en) * 2016-03-30 2025-07-16 Intellia Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations for crispr/cas components
GB2600859B (en) * 2019-08-14 2024-04-03 Acuitas Therapeutics Inc Improved lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
CN111388677B (zh) * 2020-03-24 2021-08-06 河南大学 药物载体、基于crispr基因编辑技术的脑靶向纳米药物及其制备方法和应用
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