CN113388012A - Uu-DnaJ蛋白的应用以及抗Uu感染的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了Uu‑DnaJ蛋白的应用以及抗Uu感染的疫苗。本发明提供了Uu‑DnaJ蛋白和其T/B细胞优势表位氨基酸片段在制备Uu免疫原或抗Uu感染的疫苗中的新应用，相关实验结果显示，Uu‑DnaJ蛋白能被感染Uu的小鼠血清识别，免疫后能够产生特异性抗体反应，抗体效价高达1:640000；同时Uu‑DnaJ免疫小鼠后刺激脾淋巴细胞增殖增加，产生诱导从IgG1过渡到保护性IgG2a亚型抗体反应和Th1型细胞免疫反应，由此减少小鼠子宫颈Uu定植量、炎症反应和病变，充分表现出免疫保护作用，种种结果证明Uu‑DnaJ蛋白具备开发抗Uu感染的疫苗的潜力。

Description

Uu-DnaJ蛋白的应用以及抗Uu感染的疫苗

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及Uu-DnaJ蛋白的应用以及抗Uu感染的疫苗。

背景技术

解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)是Shepard于1954年首次从非淋菌性尿道炎患者尿道中分离出的致病菌，因其所形成的菌落微小亦被称为“T株”支原体。Uu与人类泌尿生殖道感染密切相关，也是迄今为止发现的最小的能在无生命培养基中生长的具有自我复制能力的原核型微生物。尽管它是从革兰氏阳性祖先进化而来，但无细胞壁，属于柔膜体纲的支原体目。在含尿素的液体支原体培养基中生长时，Uu可分解尿素产氨改变环境pH值进而使指示剂变色。研究表明，Uu是一种在成人泌尿生殖道中定植的低毒力共生菌并可通过性接触传播，常存在于性活跃女性的下泌尿生殖道中，在世界范围内其发病率在40％至80％之间。Uu首先通过黏附在呼吸道或泌尿生殖道上皮细胞表面并定居，并产生许多毒性物质，如脲酶、IgA蛋白酶和磷脂酶等，这无疑会增加一些生殖道疾病的风险，如阴道病、尿道炎、宫颈炎、盆腔炎等。

虽然作为人类无症状携带的常见支原体，Uu对人类的致病作用仍然存在一定的争议，但随着人们对Uu生物群及血清型认识的不断深入，有研究者推测Uu的致病性可能与其不同生物群及血清型存在相关性。脲原体由两种生物类型和14种血清型组成，生物1群(或Parvo)为微小脲原体(U.parvum，UP)，包括基因1型(血清1型)、基因3型(血清3及14型)及基因6型(血清6型)；而生物2群(或T960)为解脲脲原体(U.urealyticum，Uu，本发明以下Uu均表示为此解脲脲原体)，包括基因4型(血清4、7、10、11、12及13型)和基因8型(血清2、5、8和9型)，多为血清型混合感染为主。Uu主要依据表面抗原即多带抗原(MμLtiple-bandedantigen，MBA)进行分型，各血清型MBA长度并不一致，故MBA也是Uu不同生物群、血清型感染引起不同疾病的因素之一。有研究报道Uu生物1群是下生殖道的正常携带菌群,而Uu生物2群则与下生殖道的致病性感染有关。虽然大多数Uu感染者并无明显临床症状，但这些感染会增加胎膜早破、自发性早产、流产和死产等不良妊娠结局的风险。女性生殖道短而直易受Uu感染，且感染早期症状不明显易被忽视，最后会导致慢性、持续性及交叉感染。而妇女妊娠期间，其孕妇身体的整体免疫水平会降低，若免疫平衡出现紊乱则易引起Uu上行性感染，并通过胎盘引起宫内感染，导致胎膜早破、自发性早产、流产等不良妊娠结局。妊娠期孕妇若无明显感染症状，临床不主张采取干预措施。有研究指出在免疫功能低下的成人中，Uu被发现是侵袭性感染的罪魁祸首，且Uu可能会进一步导致早产儿和足月儿的肺炎、脓毒症和脑膜炎。其中，胎龄越低，患病风险则越高。新生儿脑膜炎和神经炎可能会引起严重的脑损伤，并对患者健康产生长期的不良影响。Uu定植还与脑脓肿、前列腺炎、类风湿性关节炎、人工关节感染和肺移植后的高氮血症等有关。尽管Uu感染者可以用抗生素治疗，但随着多重耐药菌株的出现和传播，给一、二线抗菌药的治疗带来极大的挑战，且临床上Uu感染者存在无症状、慢性、持续性、反复性感染。针对它们所引起的生殖道感染难以根治的特性及血清型较多，致病物质难以明确等情况，预防相关疾病的发生比单纯用药治疗更加有效和经济。但是，国内外至今尚未有脲原体相关疫苗被批准应用于临床治疗。因此，亟待研发一种安全、高效和经济的广谱疫苗用于预防脲原体感染。

现有技术中，多带抗原(MBA)蛋白虽然是解脲脲原体(Uu)的主要外膜蛋白，但是Uu不同血清型别之间MBA蛋白的抗原性具有非常大差异，并不能针对临床上Uu不同血清型的感染产生广泛的免疫保护作用；同时，现有技术中只预测了解脲支原体3血清型和14血清型MBA蛋白B细胞表位，但是并未评估其是否具有相关的抗Uu感染免疫保护作用，因此MBA蛋白作为解脲脲原体广谱疫苗并不理想。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供Uu-DnaJ蛋白在制备Uu免疫原以及抗Uu感染的疫苗中的应用，在应用过程中其能够产生高效和广谱的免疫保护作用；

本发明的另外一个目的在于提供一种抗Uu感染的疫苗，其以Uu-DnaJ蛋白作为免疫原，提供高效广谱的免疫保护作用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

Uu-DnaJ蛋白在制备Uu免疫原以及抗Uu感染的疫苗中的应用。

在本文中，Uu-DnaJ蛋白可以是非天然的，例如是合成的或者由人工载体表达的(业内常称为重组Uu-DnaJ蛋白)。术语“非天然的”是指目标物质不是自然界天然存在的，这并不排除所述非天然物质与天然存在的物质具有相同的结构和/或组成。本发明通过原核表达得到重组Uu-DnaJ蛋白，其和Uu-DnaJ蛋白具备完全相同的氨基酸序列，如SEQ ID NO:1所示，本发明使用的Uu-DnaJ蛋白编码序列如SEQ ID NO.2所示。

分子伴侣DnaJ是激活DnaK的ATP酶和蛋白折叠活性所必需的辅助伴侣蛋白，它有70个氨基酸组成的保守J结构域，是与DanK的核苷酸结合域相互作用以刺激ATP水解所必需的；此外，它的C末端含有两个锌结合位点和一个与底物结合的重要结构域。尽管DnaK在宿主对细菌感染的免疫反应中的作用已经广泛研究，但其辅因子DnaJ受到的关注相对较少，并且在Uu感染中完全没有报道，DnaJ是否可以提供针对Uu生殖道感染的保护作用尚不清楚，也没有任何研究结论可以预测。

本发明通过免疫信息学分析Uu-DnaJ蛋白在Uu不同血清型的保守性，利用分子生物学技术构建Uu重组蛋白DnaJ，大腿肌肉注射BALB/C雌性小鼠，评估Uu重组蛋白DnaJ的免疫应答类型和抗Uu感染的免疫保护机制。结果显示，Uu-DnaJ蛋白能够与Uu感染小鼠血清结合，并在小鼠体内产生特异性抗体反应，抗体效价为1:640000；Uu-DnaJ免疫小鼠后刺激脾淋巴细胞增殖增加，产生诱导从IgG1过渡到保护性IgG2a亚型抗体反应，诱导Th1型细胞免疫反应，由此减少小鼠子宫颈Uu定植量、炎症反应和病变，充分表现出免疫保护作用。而且，过BLASTp软件对血清型10的Uu-DnaJ的保守性进一步分析后得出，Uu-DnaJ蛋白在Uu所有血清型中较高程度的保守，一致性在99％以上，这说明其能够实现针对Uu广谱性的免疫保护，适用于Uu基因4型(血清4、7、10、11、12及13型)和基因8型(血清2、5、8和9型)，同时也说明了其他血清型的Uu-DnaJ也可以同样作为免疫原和制备相关疫苗。

在上述基础上，本发明运用DNAStartv7.1软件Protern模块中多个算法对Uu-DnaJ的各区域多肽链的抗原指数、表面可及性、亲水性和柔韧性预测后得到了它各自最有可能形成B细胞表位的区域。结合得出Uu-DnaJ蛋白在AA_16-42，AA_55-65，AA_99-123，AA_130-160，AA_211-247，AA_257-260，AA_300-309，AA_319-334和AA_342-362氨基酸残基位置均有可能形成B细胞优势表位。随后，使用AMPHI、Rothbard-Taylor和Sette MHC Motifs算法对Uu-DnaJ蛋白的Th细胞、CTL及其能与鼠MHC分子特异性结合的共同表位亦发现，T细胞优势表位所在区域位置大致相同，即：AA_9-18，AA_49-58，AA_107-120，AA_155-160，AA_270-298，AA_335-342，AA_352-363。因此，本发明同时提出了上述这些氨基酸片段一种或两种以上形成的多肽在制备Uu免疫原或抗Uu感染的疫苗中的应用，以及从上述一个或多个氨基酸片段中选取的部分氨基酸序列形成的多肽在制备Uu免疫原或抗Uu感染的疫苗中的应用。

依据应用，本发明还提供了一种抗Uu感染的疫苗，以Uu-DnaJ蛋白和/或前述其T/B细胞优势表位氨基酸片段一种或两种以上形成的多肽为免疫原，或者以从前述Uu-DnaJ蛋白T/B细胞优势表位氨基酸片段中选取的部分氨基酸序列形成的多肽为免疫原。

作为优选，所述疫苗还包括免疫佐剂。在本发明具体实施方式中，所述免疫佐剂为弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、皂素、CpG寡核苷酸佐剂、铝佐剂或细胞因子佐剂。在本发明具体实施方式中，所述免疫原用注射佐剂融化，融化液体积100μL，免疫原蛋白浓度为50μg/只小鼠。

由以上技术方案可知，本发明提供了Uu-DnaJ蛋白和其T/B细胞优势表位氨基酸片段在制备Uu免疫原或抗Uu感染的疫苗中的新应用，相关实验结果显示，Uu-DnaJ蛋白能被感染Uu的小鼠血清识别，免疫后能够产生特异性抗体反应，抗体效价高达1:640000；同时Uu-DnaJ免疫小鼠后刺激脾淋巴细胞增殖增加，产生诱导从IgG1过渡到保护性IgG2a亚型抗体反应和Th1型细胞免疫反应，由此减少小鼠子宫颈Uu定植量、炎症反应和病变，充分表现出免疫保护作用，种种结果证明Uu-DnaJ蛋白具备开发抗Uu感染的疫苗的潜力。

附图说明

图1所示为DNAStartv7.1软件对Uu-DnaJ的B细胞优势抗原表位预测；

图2所示为DNAStartv7.1软件对Uu-DnaJ的T细胞优势抗原表位预测；

图3所示为重组蛋白DnaJ Immunoblotting鉴定；1：抗His；2:Uu感染小鼠血清；3:正常鼠血清；

图4所示为抗体效价检测结果；

图5所示为各组小鼠抗体水平及其亚型检测；每组柱形从左至右依次表示PBS组、FA组和DnaJ组柱形；P<0.05，*；P<0.01，**；P<0.001，***；

图6所示为各组小鼠脾淋巴细胞增殖反应结果；P<0.001，***；

图7所示为ELISA检测脾淋巴细胞上清细胞因子水平；P<0.05，*；P<0.01，**；P<0.001，***；P<0.00001，****；

图8所示为重组蛋白DnaJ免疫的T细胞特异性反应；P<0.05，*；P<0.01，**；P<0.001，***；P<0.00001，****；

图9所示为重组蛋白DnaJ免疫减少Uu在子宫颈的定植；P<0.05，*；

图10所示为重组蛋白DnaJ免疫减轻子宫颈的炎症反应结果；每组柱形从左至右依次表示PBS组、FA组和DnaJ组柱形；P<0.05，*；P<0.01，**；P<0.001，***；

图11所示为重组蛋白DnaJ免疫小鼠子宫颈H&E病变结果；

图12所示为重组蛋白DnaJ免疫小鼠子宫颈免疫组织化学病变结果；

图13所示为ELISA分析候选优势表位对DnaJ组和control组血清的免疫反应性；

图14所示为DnaJ蛋白的候选优势表位多肽刺激淋巴细胞增殖实验

图15所示为D1和D4免疫小鼠抗体效价检测；每组柱形中从左至右依次表示PBS、FA、KLH、D4、D1和DnaJ柱形；

图16所示为免疫BALB/c小鼠血清Ig抗体及IgG亚类抗体检测；每组柱形中从左至右依次表示PBS、FA、KLH、D4和D1柱形；P<0.05，*；P<0.01，**；

图17所示为间接ELISA法测量小鼠脾淋巴细胞上清中细胞因子水平；P<0.01，**；P<0.001，***。

具体实施方式

本发明公开了Uu-DnaJ蛋白的应用以及抗Uu感染的疫苗，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用和疫苗已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述应用和疫苗进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明通过提取Uu血清型8型标准株DNA，用DNAMAN软件分析限制性核酸内切酶位点。根据原核表达载体pET28a(C端含有一个6×His标签ggatcc，N端含有6×His标签ctcgag)酶切位点图谱，利用PGTool-Win软件设计DnaJ特异性引物并由上海生工公司合成，PCR扩增DNA，将扩增产物以酶切连接的方式导入表达载体pET28a中，以大肠杆菌E.coliBL21(DE3)进行原核表达，IPTG诱导、纯化获得重组的Uu-DnaJ。

Uu-DanJ蛋白的分子式为C₁₈₅₇H₂₉₁₂N₅₀₄O₅₇₅S₉，共由5857个原子所构成，相对分子质量为41.79×10³，等电点为8.04。它由375个氨基酸组成，其中Lys(11.2％)、Gly(8.5％)、Glu(7.7％)和Ile(7.7％)占比较高，而带正负电荷的残基总数之比(Arg+Lys)/(Asp+Glu)为50/54。该蛋白的不稳定指数为37.72，为稳定蛋白(当其<40时定义为稳定蛋白)。预测当该蛋白的半衰期在体外哺乳动物网状细胞中为30h，在大肠埃希菌体内>10h，在酵母菌体内>20h。DanJ蛋白脂肪指数为71.73。该蛋白的平均亲水指数为-0.0594，属于亲水性蛋白。

运用DNAStartv7.1软件Protern模块中多个算法对Uu-DnaJ的各区域多肽链的抗原指数、表面可及性、亲水性和柔韧性预测后得到了它各自最有可能形成B细胞表位的区域(图1)。结合得出蛋白在AA_16-42，AA_55-65，AA_99-123，AA_130-160，AA_211-247，AA_257-260，AA_300-309，AA_319-334和AA_342-362氨基酸残基位置均有可能形成B细胞优势表位。随后，使用AMPHI、Rothbard-Taylor和Sette MHC Motifs算法对Uu-DnaJ蛋白的Th细胞、CTL及其能与鼠MHC分子特异性结合的共同表位亦发现，T细胞优势表位所在区域位置大致相同，即：AA_9-18，AA_49-58，AA_107-120，AA_155-160，AA_270-298，AA_335-342，AA_352-363(图2)。同时通过IEDB软件预测得到6个DnaJ蛋白B细胞结构表位。根据上述预测结果，通过多序列比对筛选出DnaJ蛋白有7个候选T/B细胞共有优势抗原表位(表1)；

表1

上述D1-D7七个多肽序列(依次如SEQ ID NO:3-9所示)同时包含从下列两组氨基酸片段中选取的部分氨基酸序列：

(1)AA_16-42，AA_55-65，AA_99-123，AA_130-160，AA_211-247，AA_257-260，AA_300-309，AA_319-334，AA_342-362(B细胞优势表位)；

(2)AA_9-18，AA_49-58，AA_107-120，AA_155-160，AA_270-298，AA_335-342，AA_352-363(T细胞优势表位)。

D1、D3、D4、D6和D7可刺激DnaJ免疫小鼠的淋巴细胞增殖，其中D1和D4两个多肽序列为DnaJ蛋白T/B细胞共有优势表位，能够与DnaJ免疫血清抗体结合，以及诱导机体特异性体液免疫和细胞免疫。

因此，本发明还提出了从Uu-DnaJ蛋白下列一个或多个氨基酸片段中选取的部分氨基酸序列形成的多肽在制备Uu免疫原或抗Uu感染的疫苗中的应用：

AA_16-42，AA_55-65，AA_99-123，AA_130-160，AA_211-247，AA_257-260，AA_300-309，AA_319-334，AA_342-362，AA_9-18，AA_49-58，AA_107-120，AA_155-160，AA_270-298，AA_335-342，AA_352-363。

作为优选，所述形成的多肽同时包含从下列两组氨基酸片段中选取的部分氨基酸序列：

(1)AA_16-42，AA_55-65，AA_99-123，AA_130-160，AA_211-247，AA_257-260，AA_300-309，AA_319-334，AA_342-362；

(2)AA_9-18，AA_49-58，AA_107-120，AA_155-160，AA_270-298，AA_335-342，AA_352-363。

在本发明具体实施方式中，所述形成的多肽的序列如SEQ ID NO:3-9任意一项所示。

利用来自Uu血清型10的DnaJ蛋白序列，通过BLASTp软件对DnaJ的保守性进一步分析后得出，DnaJ蛋白在Uu所有血清型中较高程度的保守(各血清型的DnaJ氨基酸序列完全一致性≥99％)，根据本发明的实验结论可认为DnaJ是一个广谱疫苗的靶点蛋白。

表2 DnaJ蛋白序列在Uu常见血清型中保守性分布评估

本发明重组蛋白DnaJ大腿肌肉免疫的免疫原性研究采用如下实验方法：

1、重组蛋白DnaJ免疫原性研究

1.1、重组蛋白DnaJ免疫BALB/c小鼠：

(1)饲养45只雌性BALB/c小鼠，周龄为6-8周；

(2)随机分成3组，每组15只，PBS和FA(佐剂)组分别注射100μL的PBS和佐剂，DnaJ组注射佐剂融化液100μL(蛋白浓度为50μg/只)；

(3)每隔14天对对照组和实验组的BALB/c小鼠免疫1次，共免疫3次；

(4)初次免疫BALB/c小鼠后开始收集其尾静脉第0、1、2、3、4、5、6周血清备用；

1.2、重组蛋白DnaJ抗体效价检测：

(1)1×蛋白包被液将DnaJ重组蛋白稀释至10μg/mL，100μL/孔，加至ELISA检测板中并于4℃孵育过夜；

(2)弃去孔内液体，PBST洗板3次，每次3min，孔内残余液体用吸水纸移除，吸水纸上拍干；

(3)将加入5％脱脂牛奶的PBST 200μL/孔加至ELISA板内，37℃孵育箱封闭2h；

(4)弃去孔内液体，PBST洗板3次，每次3min，孔内残余液体用吸水纸移除；

(5)用加入5％脱脂牛奶的PBST倍比稀释不同时间收集的BALB/c小鼠血清(1:100)，100μL/孔，37℃孵育2h；

(6)弃去孔内液体，PBST洗板5次，每次3min，孔内残余液体用吸水纸移除；

(7)稀释HRP标记的羊抗鼠IgG(1:20000)，100μL/孔，37℃孵育2h；

(8)弃去孔内液体，PBST洗板6次，每次3min，孔内残余液体用吸水纸移除；

(9)加入TMB显色液，室温反应35min(避光)，加入终止液；

(10)将样本置于酶标仪中读取各孔OD值(450nm)，实验组与阴性对照组之比≥2.1则为阳性结果。

1.3、重组蛋白DnaJ抗体水平检测

(1)1×蛋白包被液将DnaJ重组蛋白稀释至10μg/mL，100μL/孔加入到ELISA检测板中，并于4℃孵育过夜；

(2)弃去孔内液体，PBST洗板3次，每次3min，孔内残余液体用吸水纸移除，吸水纸上拍干；

(3)加入5％脱脂牛奶的PBST 200μL/孔，37℃孵育温箱中封闭2h；

(4)弃去孔内液体，PBST洗板3次，每次3min，孔内残余液体用吸水纸移除，吸水纸上拍干；

(5)用PBST(含5％脱脂牛奶)稀释末次免疫收集的BALB/c小鼠血清(1:100)，100μL/孔，37℃孵育2h；

(6)弃去孔内液体，PBST洗板5次，每次3min，孔内残余液体用吸水纸移除；

(7)稀释HRP标记的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG3、IgA、IgM(都为1:10000)100μL/孔，37℃孵育2h；

(8)弃去孔内液体，PBST洗板6次，每次3min，孔内残余液体用吸水纸移除；

(9)加入TMB显色液，室温反应35min(避光)，加入终止液；(10)将样本置于酶标仪中读取各孔OD值(450nm)，实验组与阴性对照组之

比≥2.1则为阳性结果。

1.4、重组蛋白DnaJ免疫小鼠脾淋巴细胞增殖实验

(1)小鼠末次免疫2周后，麻醉处死小鼠无菌分离脾脏，装载在无菌试管中(含有200目尼龙膜)；

(2)于尼龙膜中加5mL不完全RPMI1640培养基研磨脾脏，1000g离心8min；

(3)无菌操作弃上清，用微量移液器吸取3mL红细胞裂解液加至离心管中混匀，1000g离心8min；

(4)无菌操作弃上清，用微量移液器吸取5mL不完全RPMI1640培养基加至离心管中混匀，1000g离心8min；

(5)无菌操作弃上清，用微量移液器吸取5mL Hank’s液(含双抗即青链霉素)加至离心管中混匀，1000g离心8min；

(6)无菌操作弃上清，用微量移液器吸取4mL不完全1640培养基加至离心管中混匀，1000g离心8min；

(7)无菌操作弃上清，用微量移液器吸取4mL完全1640培养基加至离心管中混匀，吸取20μL显微镜下计数；

(8)稀释细胞数至6×106/孔，分别加入24孔板和96孔板中；

(9)加入DnaJ蛋白(10μg/ml)并设置对照，37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养44h后每孔加入CCK-8液20μL，继续培养至48h后收细胞培养上清，酶标仪读取A450值；

1.5、重组蛋白DnaJ免疫小鼠脾淋巴细胞上清的细胞因子检测

按照步骤1.4收集脾淋巴细胞，以6×10⁶/mL细胞密度转移至24孔板中，每孔加入10μg DnaJ蛋白混匀，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养48h后，6000rpm离心15min收集细胞培养上清，冻存于-20℃，用于后续ELISA方法检测IFN-γ，TNF-α，IL-4和IL-10细胞因子水平。

(1)用1×Coating Buffer缓冲液分别稀释细胞因子捕获抗体，100μL/孔加至96孔ELISA检测板中，置于4℃冰箱过夜；

(2)用微量移液器弃去液体，200μL缓冲液洗板4次，3min/次，弃去液体，拍干；

(3)加入1×ELISA/ELISPOT溶液(200μL/孔)，37℃恒温箱孵育1h；

(4)洗板，同步骤(2)；

(5)建立标准曲线:用Diluent 1×ELISA/ELISPOT倍比稀释标准品，100μL/孔；同时，每孔加入100μL上述处理的脾细胞上清液，37℃恒温箱孵育2h；

(6)重复步骤(2)；

(7)每孔加入100μL检测抗体(1×ELISA/ELISPOT Diluent稀释)，37℃恒温箱孵育1h；

(8)重复步骤(2)；

(9)每孔加入100μL HRP标记的Avidin(1×Assary Diluent稀释孔)，37℃恒温箱避光孵育30min；

(10)步骤(2)重复一次；

(11)加入TMB工作液100μL/孔，室温下孵育15min；

(12)加入终止液50μL/孔，5min后读取ELISA板450nm值。

1.6、流式细胞术

(1)准备流式管、细胞培养板、离心管；

(2)制备小鼠脾细胞悬液:具体操作见1.4。转移制备好的脾细胞悬液(1×10⁶/mL)至24孔板中，设置蛋白刺激孔和未刺激孔(DnaJ蛋白刺激)，37℃,5％CO₂细胞培养箱孵育8h；

(3)准备1.5mL离心管，培养5h后，吸取细胞悬液至1.5mL离心管中，3000rpm离心5min收集细胞，弃上清，同时加入500μL完全1640培养基冲洗细胞培养板，一起收集到离心管中，3000rpm离心5min，弃上清；

(4)分别加入1mL灭菌PBS，3000rpm离心5min，弃上清，用1mL灭菌PBS重悬，3000rpm离心5min，弃上清，再加入100μL PBS重悬细胞；

(5)阻断表面染色:分别加入相应的表面标志抗体(CD4、CD8)1μL，室温避光孵育22min；

(6)每管中加入500μL PBS重悬细胞，室温2276rpm离心5min；

(7)固定破膜:弃上清后，加入300μL Fixation/cytofix，4℃避光孵育23min后用1mL 1×BD perm Wash Buffer清洗细胞2次，3000 rpm离心5min；(8)胞内染色:用100μL 1×BD perm Wash Buffer重悬固定破膜后细胞。按照管设置对应加入相应的PE Rat Anti-Mouse IL-4和APC Rat Anti-Mouse

IFN-γ进行胞内染色，室温避光孵育25min；

(9)用500μL PBS洗细胞2次，3000rpm离心5min，弃上清；

(10)上述细胞用灭菌PBS重悬后，置于4℃冰箱保存，流式细胞仪上机检测。

2、重组蛋白DnaJ的免疫保护性研究

2.1、Uu8型标准菌株的培养、定量于浓缩

2.1.1、Uu8型标准菌株的培养

大量培养复苏且纯化好的Uu8型标准菌株菌液，并设立阴性对照(未加Uu菌液)，37℃培养1-2天，酚红指示剂变色范围为6.8-8.4。观察菌液颜色变化，待培养基颜色由浅黄变为红色且菌液透明无浑浊，可进行后续实验。

2.1.2、Uu8型标准菌株的定量

分别吸取上述培养阳性的菌液100μL按以下稀释比例接种于Uu固体培养基上。

试管1 Uu阳性菌液

试管2 Uu阳性菌液:PBS＝1:10

试管3 Uu阳性菌液:PBS＝1:100

分别取稀释好的菌液100μL平铺于Uu固体培养基上，5％CO₂，37℃恒温培养箱培养1-3天且设不加菌液的固体培养基为阴性对照。取出固体培养基于普通倒置显微镜下观察，低倍镜下计数10个视野Uu菌落数，并采用下述公式计算其支原体载量(CFU/mL)，以备后续定量实验。

2.1.3、Uu8型标准菌株的浓缩

收集上述大量培养的Uu菌液，10000rpm离心30min，弃上清，留取Uu

沉淀。用微量移液器吸取灭菌PBS洗2-3次，10000rpm离心10min，留沉淀。灭菌PBS重悬沉淀，置-80℃保存，用于后续Uu生殖道感染小鼠实验研究。

2.2、Uu感染BALB/c小鼠

末次免疫两周后PBS、FA和DnaJ组，每只小鼠阴道注射1×10⁷CFU/mL Uu8型菌液50μL，注射完让小鼠保持仰卧1min，正常对照组不注射。感染前7天，每只小鼠每周一次在颈部皮下注射0.5mg雌二醇苯甲酸酯，持续三周，以同步发情周期并增加小鼠对Uu感染的敏感性。为了鉴定小鼠是否感染Uu，在感染后第0、7、14和21天，将无菌拭子插入下生殖道和子宫取阴道分泌物和宫颈分泌物，旋转并停留1分钟。接着，将拭子样本清洗到Uu液体培养基中，将其分为两部分:一个用于Uu体培养和测定Uu浓度，另一个用于PCR检测。并每天监测小鼠感染部位脱毛、分泌物增加、水肿、充血以及积液情况，以及小鼠体重变化并记录。

2.3、感染后小鼠宫颈中Uu载量和细胞因子检测

2.3.1、宫颈分中Uu DNA提取

使用MP公司DNA提取试剂盒提取宫颈分泌物标本中Uu DNA，具体操作如下:

(1)向lysing Matrix E tube中加入978μL的SPB，再加入122μL MT溶液，将拭子再管中充分搅拌，使分泌物脱落；

(2)涡旋振荡混匀1min；

(3)14000g离心5min；

(4)将上清液吸至新的2.0mL离心管中，加入250μL PPS溶液，颠倒混匀10余次；

(5)14000g离心5min，将上清液吸至新的2.0mL离心管中；

(6)加入1mL BMS溶液，颠倒混匀2min，室温静置3min；

(7)弃掉500μL上清液；

(8)取600μL混合液重悬，加入吸附柱，14000g离心2min，重复一遍，弃废液；

(9)加500μL SEWS-M溶液至吸附柱，14000g离心1min，弃废液，重复一遍，室温静置5min；

(10)加入40μL DES溶液溶解，14000g离心2min，重复一遍，弃废液，提取的DNA溶液放置-20℃冻存。

2.3.2、宫颈中细胞因子检测

使用Bio-Legend公司多细胞因子检测试剂盒测定宫颈分泌物标本中，IL-6，TNF-α，IL-1β，IL-10，IL-1α，IL-17a，MCP-1和IFN-γ细胞因子水平，具体操作如下:

(1)稀释样品:每管中加入25μL样品和25μL Assay Buffer

(2)稀释标准品:第一孔中加入25μL标准品和75μL Assay Buffer，然后依次倍比稀释6孔用于标准曲线的制备；

(3)涡旋振荡混匀放置摇床上避光振摇2h；

(4)3000rpm离心5min,弃上清；

(5)200μL Washing Buffer重悬；

(6)3000rpm离心5min,弃上清；

(7)滴加25μL检测抗体，避光振摇1h，加入25μL SA-PE溶液避光振摇30min；(8)3000rpm离心5min，弃上清，加入200μL Washing Buffer重悬，3000rpm离心5min,弃上清；

(9)加入200μL Washing Buffer重悬，转移至流式管上机检测。

2.4、感染小鼠后各组织的Uu基因组DNA提取

使用天根公司的动物组织基因组DNA小量提取试剂盒提取组织中DNA，具体操作如下:

(1)动物组织处理:称取<10mg动物组织打磨为细胞悬液，12000g离心5min，留取沉淀，加GA缓冲液250μL，振荡悬浮；

(2)加蛋白酶K溶液20μL混匀，放置于56℃水浴箱溶解过夜，次日，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(3)加入GB缓冲液200μL，充分颠倒混匀，置于70℃水浴箱10min，溶液应变澄清，瞬时离心，将上清液转入干净的1.5mL离心管中；

(4)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，12000g离心2min；

(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀加入一个吸附柱CB3中，12000g离30s，弃废液；

(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000g离心30s，弃废液；

(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000g离心30s，弃废液；

(8)步骤(7)重复一次；

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000g离心2min，倒掉废液，将吸附柱室温静置5min；

(10)将上述吸附柱CB3置入干净的收集管中，微量移液器吸取100μLTE缓冲液悬空加入吸附中，静置4min，12000g离心2min，收集液体于-20℃保存。

2.5、实时荧光定量PCR(RT-PCR)

上海生工公司合成Uu8型脲酶基因的特异性引物，RT-PCR检测小鼠各组织中的Uu载量。计算BALB/c小鼠各组织中Uu载量需建立以下标准曲线:对Uu线性化质粒DNA进行10倍稀释(10⁷至10¹的线性化)，得到Uu8型脲酶基因的标准曲线；连续倍比稀释BALB/c小鼠DNA浓度(100ng至0.0488ng)，得到内参(β-actin)基因的标准曲线:

2.6、感染生殖道宫颈组织病理学分析

2.6.1、感染生殖道宫颈组织H&E分析

(1)感染21天后，分离小鼠生殖道组织，加入10％甲醛固定液，48h后石蜡切片脱蜡至水:依次将组织切片放入二甲苯I，二甲苯II，100％I，100％II，75％的乙醇中逐级脱水，时间各为7-9min，自来水冲洗。

(2)苏木素染色:将脱水脱蜡后的切片置于苏木素染色2-6min，水洗片刻，然后置于盐酸水溶液分化，氨水水溶液返蓝，水洗；

(3)伊红染色:切片组织依次入85％、95％的梯度乙醇脱水，加入伊红染液中6min。

(4)脱水封片:切片组织依次置入100％I，100％II，100％III，二甲苯I，二甲苯II各7-9min透明，切片烘干或电干，中性树胶封片，粘贴标签。

(5)显微镜镜检，分析结果。

(6)分析结果:胞核呈蓝色，胞质淡红色。

2.6.2、感染生殖道宫颈组织免疫组化分析

(1)感染21天后，分离小鼠生殖道组织，加入10％甲醛固定液，48h后石蜡切片脱蜡至水:依次将组织切片放入二甲苯I，二甲苯II，二甲苯III，100％I，100％II，85％，75％的乙醇中逐级脱水，时间各为7-10min，自来水冲洗。

(2)抗原修复:微波炉内抗原修复，中火6min至沸，停火6 min保温再转中低火6min。自然冷却后，于PBS缓冲液(pH7.4)中，震动洗涤4次，7min/次。

(3)阻断内源性过氧化物酶:切片放入3％H2O2溶液(H2O2:H2O＝1:9)，避光放置20min，将玻片置于pH为7.4的PBS缓冲液中。于脱色摇床上振荡洗涤3次，7min/次。

(4)血清封闭:在组化圈内滴加3％BSA均匀覆盖切片，室温封闭35min。

(5)加一抗:轻轻移除封闭液，于切片上加一抗(非免疫小鼠抗Uu血清)，4℃放置切片平于湿盒内过夜。

(6)加二抗:于PBS缓冲液(pH7.4)中，震动洗涤4次，7min/次。稍甩干切片后，在圈内滴加HRP标记的羊抗鼠IgG二抗。覆盖切片，室温下放置55min。

(7)DAB显色:置玻片于pH为7.4的PBS缓冲液中，于脱色摇床上震动洗涤5次，7min/次。稍甩干切片后，滴加新鲜配制的DAB显色液于圈内，显微镜下观察，阳性为棕黄色，终止显色。

(8)复染细胞核:苏木素Harris复染5min，水洗，分化，水洗，返蓝，水洗。

(9)脱水封片:75％，85％，100％I，100％II，二甲苯I中逐级脱水透明，时间各为7-10min，将切片从二甲苯拿出稍晾干，中性树胶中封片。

(10)显微镜镜检，结果分析。

(11)分析石蜡切片免疫组化结果:胞核为蓝色，阳性表达为棕黄色粒。

3、统计学处理方法

采用GraphPad Prism 7.0软件对本实验数据进行统计学分析，细胞因子含量及组织中Uu载量以平均值±标准差(±S)表示，组间比较用单因素方差分析，两两比较采用PostHoc检验。*为P<0.05，表示差异具有统计学意义，NS即P>0.05表示差异无统计学意义。

以下就本发明所提供的Uu-DnaJ蛋白的应用以及抗Uu感染的疫苗做进一步说明。

实施例1：纯化重组蛋白DnaJ的Immunoblotting鉴定

分别用鼠抗His单克隆抗体、Uu感染小鼠血清以及正常小鼠血清作为一抗，羊抗鼠IgG(H+L)作为二抗，对重组蛋白DnaJ进行Immunoblotting分析及鉴定，结果显示,感染小鼠血清及抗His抗体作为一抗时出现相应明显的特异性反应条带，并与预期相对分子量大小相符而对照组(正常小鼠血清)则并无特异性条带出现(图3)。

实施例2：重组蛋白DnaJ免疫的特异性抗体效价检测

探究重组蛋白DnaJ是否能够诱导小鼠抗体反应，分别收集各组小鼠免疫后的第0、1、2、3、4、5、6周的尾静脉血，ELISA法检测血清中特异性IgG抗体效价水平。结果显示，在7天时，DnaJ免疫小鼠中IgG抗体水平升高，随着免疫时间的增加呈逐渐升高趋势(图4)，抗体效价为1:640000。结果表明将重组蛋白DnaJ肌肉注射BALB/c小鼠后会产生特异性抗体反应。

实施例3：重组蛋白DnaJ抗体水平及IgG亚型检测

如图5所示，DnaJ组IgG和IgM抗体水平明显高于对照组对照组(PBS组和FA组)。进一步评价由DnaJ诱导的抗体反应的特定类型，检测血清中IgG亚类抗体(IgG1，IgG2a和IgG3)的水平，发现DnaJ组IgG2a的水平高于IgG1，表明DnaJ免疫小鼠后诱导从IgG1过渡到保护性IgG2a亚型抗体反应。

实施例4：重组蛋白DnaJ免疫BALB/c小鼠脾淋巴细胞增殖

BALB/c小鼠末次免疫2周后，无菌分离各组小鼠脾细胞，体外用相应的DnaJ重组蛋白刺激后，CCK-8法检测各组BALB/c小鼠的脾淋巴细胞增殖水平。结果显示DnaJ组小鼠的脾淋巴细胞增殖增加，脾淋巴细胞刺激指数值(SI)与对照组相比有显著差异，见图6。

实施例5：重组蛋白DnaJ刺激BALB/c小鼠的脾淋巴细胞内T细胞表型

1、间接ELISA法检测脾淋巴细胞上清细胞因子水平

研究重组蛋白DnaJ免疫小鼠后诱导的细胞反应类型，蛋白刺激小鼠后收集各组小鼠脾细胞上清培养，间接ELISA法检测细胞因子水平。DnaJ免疫小鼠的脾细胞表现出较高水平的Th1相关细胞因子TNF-α和IFN-γ，与对照组相比具有显著差异，见图7。而Th2相关细胞因子IL-4和IL-10与对照组相比，差异无统计学意义。综上所述，这些结果表明DnaJ的免疫原性是基于其诱导保护性T细胞应答，特别是Th1偏向型细胞免疫应答的能力。

2、流式细胞术分析BALB/c小鼠的脾淋巴细胞内T细胞表型

尽管CD4⁺和CD8⁺T细胞对于预防Uu感染都是必需的，但可以通过检测IFN-γ的水平来识别并监测宿主免疫反应，IFN-γ是与病原体早期免疫反应有关的最重要的Th1相关细胞因子。因此，在Uu攻击之前通过流式细胞术研究了IFN-γ的产生。与对照组相比，DnaJ免疫组的IFN-γ产生均显著增加。免疫组的脾细胞中产生IFN-γ的T细胞(即产生IFN-γ的CD4+和CD8⁺T细胞)水平，DnaJ免疫组与对照组比较CD4⁺T细胞产生IFN-γ均显著增加(图8a)，DnaJ免疫组与对照组比较CD8⁺T细胞产生IFN-γ显著增加(图8c)。相反，在免疫组和对照组之间，IL-4的产生无显著差异(图8b)。此外，结果表明，与对照组相比，DnaJ免疫组IFN-γ含量明显增加，而IL-4水平无统计学意义，进一步证实DnaJ免疫BALB/c小鼠能诱导Th1型细胞免疫反应。

实施例6：重组蛋白DnaJ的免疫保护性

1、重组蛋白DnaJ免疫减少小鼠子宫颈Uu定植量

评估DnaJ免疫小鼠的保护作用，BALB/c小鼠接种Uu8型菌液。在感染初期，每隔三天取阴道分泌物，每隔一周取宫颈分泌物做微生物培养分析以及PCR鉴定，结果显示培养阳性表明Uu感染小鼠成功。此外，Uu感染后一周，所有小鼠均表现出阴道周围毛发脱落，分泌物增加，阴道口发红和食欲不振，但DnaJ免疫组的小鼠症状相对较轻(图9a)，为确证DnaJ免疫小鼠是否可以减弱小鼠Uu定植部位(子宫颈)的Uu定植量，Uu接种小鼠21天后通过定量PCR方法评估定植部位的Uu载量负荷。结果表明，DnaJ免疫组小鼠Uu定植部位的Uu载量水平明显低于对照组(图9b)

2、重组蛋白DnaJ免疫减轻小鼠子宫颈的炎症反应

用多细胞因子流式分析试剂盒评估Uu阴道感染BALB/c小鼠后，DnaJ免疫组和对照组的子宫颈组织匀浆上清液中IL-6，TNF-α，IL-1β，IL-10，IL-1α，IL-17a，MCP-1和IFN-γ的水平。如图10a所示，DnaJ免疫组小鼠和对照组之间，IL-17a，IL-6，IL-10和IL-1α水平无明显差异，而DnaJ免疫组小鼠子宫颈的IFN-γ(P<0.05)，TNF-α(P<0.01)，MCP-1(P<0.05)和IL-1β(P<0.001)的水平显著低于对照组。图10b是对应的热图分析。

3、重组蛋白DnaJ免疫可显著减轻小鼠宫颈病变

Uu感染引起PBS(图11a，e，i)和FA(图11b，f，j)组小鼠的宫颈组织严重的病理损伤，H&E结果显示PBS和FA组小鼠子宫颈组织出现水肿、出血及分泌物增加严重。Uu感染后PBS和FA组小鼠中表现出炎症反应(大量炎症细胞浸润并且腺体腔内有炎性积液渗出)(图11)。而DnaJ组(图11c，g，k)小鼠的宫颈组织中腺体扩张，腺体分泌物增加，水肿、出血和炎性细胞浸润等病理特征减少，且与正常对照组小鼠相比(图11d，h，l)，可以清楚地识别出腺体和宫颈组织的结构，并保持其完整性。

S-P免疫组织化学评估Uu感染小鼠21天后的小鼠宫颈组织切片，结果显示，DnaJ蛋白免疫组小鼠的病理损伤较轻，且DnaJ免疫组小鼠的Uu载量(图12c，g)(棕色；红色箭头)显著低于PBS和FA组(图12a，b，e，f)。结果还显示且与正常对照组小鼠相比(图12d，h)Uu主要存在于子宫颈腺体，间质细胞和细胞质中。

实施例7：DnaJ蛋白候选优势表位多肽的免疫作用

将表1中预测的7个候选DnaJ蛋白优势抗原表位合成相应肽段并纯化。经过HPLC分析，各多肽的纯度均达到90％以上。质谱分析鉴定，各多肽的相对分子量的测定值与理论值相符，表明合成的多肽符合要求，可用于后续的实验。

1、DnaJ蛋白免疫优势表位的鉴定

将上述合成的7条DnaJ候选优势表位多肽(D1-D7)，经ELISA方法分别检测其对DnaJ免疫血清和control组血清的免疫反应性，结果表明D1和D4多肽可与相应免疫血清抗体结合，是B细胞优势表位(图13)。并且候选优势表位多肽中的D1、D3、D4、D6和D7可刺激相应淋巴细胞增殖(CCK-8法)，为T细胞优势表位(图14)。综合得出，D1和D4为DnaJ蛋白T/B细胞共有优势表位，而D3、D4、D6和D7为DnaJ蛋白T细胞优势表位而非B细胞优势表位。

2、DnaJ蛋白免疫优势表位多肽可诱导机体特异性体液免疫

上述合成的D1和D4两条裸肽与KLH耦联以增加其在机体内的稳定性，并与弗式佐剂混合乳化后通过肌肉注射BALB/c小鼠，分别收集各组小鼠免疫后的第0、14、28和42天的血清作为一抗，利用相应多肽(无KLH耦联的裸肽)或DnaJ蛋白作为包被抗原，间接ELISA法检测特异性IgG抗体效价水平。结果显示，在14天时D1和D4免疫小鼠中IgG抗体水平升高，此后，随着免疫时间的增加呈逐渐升高趋势，且均在第42天达到峰值(图15)。

进一步检测了免疫血清中IgA、IgM、IgG及其亚型抗体水平，结果如图16所示，D1和D4免疫小鼠中的IgG和IgM抗体水平要显著高于PBS组，FA组和KLH组。D1和D4免疫小鼠中血清IgG抗体亚型水平(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)同样也要显著高于阴性对照组，并且还发现IgG2a的水平高于IgG1。

3、DnaJ蛋白免疫优势表位多肽可诱导机体特异性细胞免疫

无菌制备各免疫组小鼠脾淋巴细胞，分别用完整DnaJ蛋白、D1、D4、PBS、FA、KLH刺激48h后收集脾细胞上清，并采用间接ELISA法测量细胞因子水平。如图17所示，经D1和D4免疫小鼠的脾细胞表现出较高水平TNF-α和IFN-γ(Th1细胞相关细胞因子)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南华大学

<120> Uu-DnaJ蛋白的应用以及抗Uu感染的疫苗

<130> MP21012603

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 375

<212> PRT

<213> Ureaplasma urealyticum serovar 10 str. ATCC 33699

<400> 1

Met Ala Lys Arg Asp Tyr Tyr Glu Val Leu Gly Val Ser Lys Ser Ala

1 5 10 15

Ser Pro Glu Glu Ile Lys Thr Ala Phe Arg Lys Leu Ala Lys Glu His

20 25 30

His Pro Asp Arg Asn Lys Ser Ala Asp Asp Thr Val Phe Lys Glu Ile

35 40 45

Asn Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Pro Lys Lys Arg Ala Gln Tyr

50 55 60

Asp Gln Phe Gly His Asp Gly Pro Gln Gly Phe Ala Gly Ala Gly Gly

65 70 75 80

Phe Ser Gly Phe Ser Asp Gly Phe Gly Gly Val Asp Phe Asp Ile Asn

85 90 95

Asp Ile Phe Gly Ser Phe Phe Lys Asn Gly Ala Ser Ser Arg Ser Ser

100 105 110

Ser Ser Gln Tyr Glu Thr Tyr Asp Ile His Leu Arg Leu His Leu Glu

115 120 125

Phe Ile Glu Ala Ile Lys Gly Val Ser Lys Asn Ile Ser Tyr Asp Arg

130 135 140

Lys Ile Thr Cys Asn Lys Cys Gln Gly Thr Gly Ala Lys Asp Pro Lys

145 150 155 160

Asp Val Lys Thr Cys Thr Lys Cys His Gly Arg Gly Thr Thr Ile Glu

165 170 175

Asn Val His Ser Leu Phe Gly Thr Ile Gln Gln Glu Val Glu Cys His

180 185 190

Glu Cys Glu Gly Thr Gly Lys Val Ala Asn Ser Lys Cys Glu Gln Cys

195 200 205

Tyr Gly Lys Lys Val Ile Asn Glu Arg Val Asn Leu Thr Val Glu Ile

210 215 220

Pro Ala Gly Thr Gln Asp Asn Glu Lys Leu Val Val Ser Lys Lys Gly

225 230 235 240

Asn Ile Ile Asn Asn Gln Glu Phe Asp Leu Tyr Leu His Ile Ser Val

245 250 255

Lys Pro Ser Lys Tyr Phe Ala Phe Asp Gly Leu Asp Ile Tyr Ser Glu

260 265 270

Thr Tyr Val Asp Pro Ile Lys Ala Ile Val Gly Gly Val Ile Glu Val

275 280 285

Val Thr Thr Ser Gly Ile Lys Thr Ile Glu Ile Pro Pro Asn Thr Pro

290 295 300

Glu Gly Lys Lys Phe Arg Ile Ser Gly Ala Gly Ile Val Asn Lys Lys

305 310 315 320

Pro Asn Ile Phe Ser Lys Lys Asn Gly Asp Phe Tyr Thr Thr Ile Arg

325 330 335

Tyr Ala Lys Pro Leu Glu Leu Thr Lys Glu Glu Ile Ala Tyr Leu Lys

340 345 350

Asn Ile Ser Ala Arg Thr Asn Gln Ser Val Glu Tyr Tyr Lys Asn Lys

355 360 365

Leu Leu Lys Glu Val Asn Lys

370 375

<210> 2

<211> 1128

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcaaaac gtgattacta tgaagtttta ggtgttagta aatcagcaag ccctgaagaa 60

attaaaactg cgtttcgtaa attagcaaaa gagcaccatc cagatcgaaa caaatctgct 120

gatgatactg tttttaaaga aattaatgaa gcttatgagg tgttatcaga tcctaaaaaa 180

cgtgctcaat acgaccaatt tggtcatgat ggaccgcaag ggtttgctgg agctggtggc 240

ttttctgggt ttagtgatgg atttggcggt gttgattttg acatcaacga catttttgga 300

agttttttta aaaatggtgc tagctcacgt agttcatcaa gccaatatga aacgtatgac 360

attcatttac gtttacattt agaatttata gaagctatta agggtgtttc taaaaatatt 420

agttatgatc gtaaaatcac atgtaacaag tgtcaaggaa caggagcaaa agatcctaaa 480

gatgttaaaa cttgtacaaa atgtcatggt cgtggaacta caattgaaaa cgttcattca 540

ttatttggaa caattcaaca agaagttgaa tgtcatgaat gtgagggaac tggaaaagtt 600

gctaatagca aatgcgaaca atgttatggc aaaaaagtta ttaatgaacg cgttaattta 660

acagttgaaa ttcctgctgg tacacaagat aatgaaaaat tagtagtaag taaaaaaggt 720

aatatcataa ataaccaaga atttgatctt tatttacata ttagcgttaa accatcaaaa 780

tattttgcat tcgatggttt agatatttac tcagaaactt atgttgatcc tattaaagca 840

attgttggtg gtgtaattga agtagtaaca acaagtggaa ttaaaactat tgaaattcca 900

ccaaatactc cagaaggtaa aaaatttaga attagtggcg ctggaattgt taataaaaaa 960

ccaaatattt ttagcaaaaa aaatggagat ttttacacaa caattcgtta tgcaaaacca 1020

cttgaattaa ctaaagaaga aattgcttat ttaaaaaata ttagtgctcg taccaaccaa 1080

agtgttgagt attataaaaa taaattatta aaagaggtta ataaataa 1128

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Thr Ile Glu Ile Pro Pro Asn Thr Pro Glu Gly Lys Lys Phe Arg Ile

1 5 10 15

Ser Gly Ala Gly Ile Val Asn Lys Lys

20 25

<210> 4

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Ser Pro Glu Glu Ile Lys Thr Ala Phe Arg Lys Leu Ala Lys Glu

1 5 10 15

His His Pro Asp Arg Asn Lys

20

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Leu Thr Lys Glu Glu Ile Ala Tyr Leu Lys Asn Ile Ser Ala Arg

1 5 10 15

Thr Asn Gln Ser

20

<210> 6

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asn Ile Ser Tyr Asp Arg Lys Ile Thr Cys Asn Lys Cys Gln Gly Thr

1 5 10 15

Gly Ala Lys Asp Pro Lys Asp Val Lys Thr

20 25

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Phe Gly Ser Phe Phe Lys Asn Gly Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser

1 5 10 15

Gln Tyr

<210> 8

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asn Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Pro Lys Lys Arg Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Asp Gln Phe

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ile Tyr Ser Glu Thr Tyr Val Asp Pro Ile Lys Ala Ile Val Gly Gly

1 5 10 15

Val Ile Glu Val

20

Claims (8)

1.Uu-DnaJ蛋白或其下列氨基酸片段一个或两个以上形成的多肽在制备Uu免疫原或抗Uu感染的疫苗中的应用：

AA_16-42，AA_55-65，AA_99-123，AA_130-160，AA_211-247，AA_257-260，AA_300-309，AA_319-334，AA_342-362，AA_9-18，AA_49-58，AA_107-120，AA_155-160，AA_270-298，AA_335-342，AA_352-363。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述Uu-DnaJ蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或与其一致性在99％以上的氨基酸序列。

3.从Uu-DnaJ蛋白下列一个或多个氨基酸片段中选取的部分氨基酸序列形成的多肽在制备Uu免疫原或抗Uu感染的疫苗中的应用：

AA_16-42，AA_55-65，AA_99-123，AA_130-160，AA_211-247，AA_257-260，AA_300-309，AA_319-334，AA_342-362，AA_9-18，AA_49-58，AA_107-120，AA_155-160，AA_270-298，AA_335-342，AA_352-363。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述形成的多肽同时包含从下列两组氨基酸片段中选取的部分氨基酸序列：

(1)AA_16-42，AA_55-65，AA_99-123，AA_130-160，AA_211-247，AA_257-260，AA_300-309，AA_319-334，AA_342-362；

(2)AA_9-18，AA_49-58，AA_107-120，AA_155-160，AA_270-298，AA_335-342，AA_352-363。

5.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，所述形成的多肽的序列如SEQ ID NO:3-9任意一项所示。

6.一种抗Uu感染的疫苗，其特征在于，以权利要求1中的Uu-DnaJ蛋白和/或其氨基酸片段一种或两种以上形成的多肽为免疫原，或者以权利要求3-5任意一项权利要求中所述形成的多肽为免疫原。

7.根据权利要求6所述疫苗，其特征在于，还包括免疫佐剂。

8.根据权利要求7所述疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂为弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、皂素、CpG寡核苷酸佐剂、铝佐剂或细胞因子佐剂。

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