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CN113376374A - 病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法 - Google Patents

病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法 Download PDF

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CN113376374A
CN113376374A CN202110332860.5A CN202110332860A CN113376374A CN 113376374 A CN113376374 A CN 113376374A CN 202110332860 A CN202110332860 A CN 202110332860A CN 113376374 A CN113376374 A CN 113376374A
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CN
China
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protein
viral
antibody
preparation
affinity
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CN202110332860.5A
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黄跃进
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Nanjing Jenomed Biotech Co ltd
Original Assignee
Nanjing Jenomed Biotech Co ltd
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Publication date
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Abstract

本发明提供了一种病毒蛋白抗原检测试剂盒及试纸条的制备和使用方法，适用于最近爆发的新冠病毒感染和其他病毒感染的早期现场筛查。所述制备和使用方法包括使检测样本中的病毒抗原肽或蛋白的若干位点与第一亲和蛋白或抗体与金属纳米材料形成的第一标记复合物结合后，再进一步使形成的结合复合物中的病毒抗原肽或蛋白的其他若干位点与第二亲和蛋白或抗体与金属纳米材料形成的第二标记复合物再结合。所述制备和使用方法在10‑20分钟内用肉眼根据EP管或试纸条颜色变化，即可作出是否新冠病毒感染的初步现场筛查判断。

Description

病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法。
背景技术
目前迫切需要安全有效能拮抗新冠病毒感染的快速检测方法和药物。
然而，核酸检测对设备场地和操作人员具有极高的技术要求，并且单一样本完成检测也需要数个小时。这也意味着核酸检测无法在采集现场对样本进行分析处理，且需要对样本进行运输，而核酸样本对保存条件要求苛刻，在保存运输的过程中核酸容易降解，影响检测灵敏度。人体感染新冠病毒后需要在两周左右才能产生抗体，这意味着病毒抗体检测有漏检窗口期，早期或无症状感染者会出现抗体检测阴性。可见，在快速检测早期新冠病毒感染者方面，核酸检测和抗体检测均无法起到全面的筛查作用。
新型冠状病毒基因编码多个结构蛋白，例如S蛋白，N蛋白和E蛋白等，这些蛋白包括多个抗原表位，利用抗原与亲和蛋白或抗体特异性结合的原理，可通过亲和蛋白或抗体检测病毒抗原的存在，从而直接证明样本中含有新冠病毒。另外，抗原检测对实验室的要求低，且能在较短时间内得到检测结果，适用于新冠病毒和其他病毒感染的现场快速筛查。
因此有必要提供新型的病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法，以避免现有技术中存在的上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法，以快速得到准确的检测结果，适用于基层医院的大规模筛查以及现场快速检测。
为实现上述目的，本发明提供的所述病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法，包括以下步骤：提供第一亲和蛋白或抗体以及第二亲和蛋白或抗体，所述第一亲和蛋白或抗体以及所述第二亲和蛋白或抗体与病毒抗原肽或蛋白均具有高亲和力，并带有电荷；使所述第一亲和蛋白或抗体以及所述第二亲和蛋白或抗体分别吸附金属纳米材料，以使所述金属纳米材料聚集并形成至少两个标记复合物，不同的所述金属纳米材料与所吸附的亲和蛋白或抗体具有相反的电荷；提供检测样本，使所述检测样本中的病毒抗原肽或蛋白的若干位点与所述第一亲和蛋白或抗体与所述金属纳米材料形成的第一标记复合物结合，以形成结合复合物，所述检测样本包括受试样本和参比样本中的至少一种；使所述结合复合物中的病毒抗原肽或蛋白的其他若干位点与所述第二亲和蛋白或抗体与所述金属纳米材料形成的第二标记复合物再结合，然后直接或者通过催化过氧化物酶底物的方式产生明显的颜色反应。
本发明的所述病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法的有益效果在于：使所述检测样本中的病毒抗原肽或蛋白的若干位点与所述第一亲和蛋白或抗体与所述金属纳米材料形成的第一标记复合物结合后，再进一步使所述结合复合物中的病毒抗原肽或蛋白的其他若干位点与所述第二亲和蛋白或抗体与所述金属纳米材料形成的第二标记复合物再结合实现了表达信号的放大，从而有利于快速产生明显的颜色反应，适用于基层医院的大规模筛查以及现场检测。
优选的，所述检测样本中的病毒抗原肽或蛋白来源于呼吸道感染病毒、消化道感染病毒、肝炎病毒、乙脑病毒、神经病毒和性传播病毒中的任意一种或多种。
进一步优选的，所述呼吸道感染病毒包括新冠病毒、SARS病毒、MERS病毒、流感病毒、鼻病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒中的任意一种或多种。
优选的，所述受试样本中的病毒抗原肽或蛋白来源于受试者的咳痰、咽拭子、口腔拭子、血液、粪便和体液中的任意一种或多种。
进一步优选的，所述体液包括血液、尿液、汗液和其他体液中的任意一种或多种。
进一步优选的，其他体液包括精液、阴道分泌物等。
优选的，通过生物系统表达或人工合成的方法获取所述参比样本的病毒抗原肽或蛋白。
进一步优选的，所述生物系统包括动物乳腺生物反应器系统、大肠杆菌系统、昆虫细胞系统、酵母系统和哺乳动物细胞系统中的任意一种或多种。
优选的，所述参比样本的病毒抗原肽或蛋白包含新冠病毒刺突蛋白、所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位和S2亚单位及病毒结构蛋白。
优选的，所述参比样本的病毒抗原肽或蛋白包含所述新冠病毒刺突蛋白、所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位和S2亚单位及所述病毒结构蛋白中任意一种或多种的片段、变体或衍生物。
进一步优选的，所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位包括受体结合域。
进一步优选的，所述病毒结构蛋白包括血凝素、神经氨酸酶、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白中的任意一种或多种。
优选的，通过生物系统表达或人工合成的方法获取所述第一亲和蛋白或抗体和第二亲和蛋白或抗体中的任意一种，所述生物系统包括动物乳腺生物反应器系统、大肠杆菌系统、昆虫细胞系统、酵母系统和哺乳动物细胞系统中的任意一种或多种。
优选的，所述第一亲和蛋白或抗体和所述第二亲和蛋白或抗体中的任意一种包括重组全长或片段人ACE2蛋白、ACE2-Fc融合蛋白、人工合成ACE2多肽、病毒亲和蛋白和抗体中的至少一种，所述人工合成ACE2多肽如SEQ ID 1-3所示。
进一步优选的，所述抗体包括筛选出的拮抗新冠病毒刺突蛋白、所述新冠病毒刺突蛋白S1亚单位和S2亚单位及所述病毒结构蛋白的单克隆或多克隆抗体。
进一步优选的，所述抗体包括筛选出的拮抗所述新冠病毒刺突蛋白、所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位和S2亚单位及所述病毒结构蛋白中任意一种或多种的片段、变体或衍生物的单克隆或多克隆抗体。
进一步优选的，所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位包括受体结合域，所述病毒结构蛋白包括血凝素、神经氨酸酶、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白中的任意一种或多种。
优选的，所述金属纳米材料包括胶体金颗粒、银离子颗粒及纳米模拟酶中的至少一种或多种。
进一步优选的，所述纳米模拟酶包括过氧化物纳米模拟酶或具有催化活性的纳米模拟酶。
优选的，所述过氧化物纳米模拟酶或具有催化活性的其他纳米模拟酶的底物包括过氧化氢，以及TMB、 DAB、OPD和CDI中的任意一种或多种。
优选的，所述检测工具包括试剂盒和试纸条，通过所述第一标记复合物的冻干剂或悬液封装品、所述参比样本与所述第一标记复合物结合形成的参比标记复合物的冻干剂或悬液封装品、所述第二标记复合物的冻干剂或悬液封装品和所述金属纳米材料的冻干剂或悬液封装品进行所述试剂盒组成溶液的包装及所述试纸条的组装。
优选的，所述试纸条的组装包括：将NC膜粘贴在乙烯基衬垫上；对所述NC膜包被T线和C线；对所述NC膜洗涤和干燥；将吸收垫粘贴在乙烯基背衬上，以与所述NC膜重叠；通过切割形成试纸条，所述试纸条的尺寸为25mm×5mm，将所述试纸条放入铝箔袋中，并加入干燥剂，密封常温放置备用。
优选的，所述检测工具使所述颜色反应在不超过20分钟的时间内完成，以应用于现场快速筛查。
附图说明
图1为本发明实施例的应用于病毒蛋白抗原检测的试剂盒进行现场检测的流程示意图；
图2为本发明实施例的应用于病毒蛋白抗原检测的试纸条进行现场检测流程示意图；
附图标记说明：1. 人工合成ACE2多肽；2. 过氧化物纳米模拟酶；31. 待测试样本中的新冠病毒刺突蛋白S1亚单位；32. 参比样本中的新冠病毒刺突蛋白S1亚单位；4. 第二亲和抗体与过氧化物纳米模拟酶形成的标记复合物；5. 磁力架；6. EP管；7. 试纸条C线；8. 试纸条T线；9.试纸条。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”和“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
针对现有技术存在的问题，本发明的实施例提供一种病毒蛋白抗原检测工具的制备方法及使用方法，以快速得到准确的检测结果，适用于基层医院的大规模筛查以及现场快速检测。
本发明一些实施例中，所述检测工具为试剂盒和试纸条中的至少一种。
本发明实施例的所述病毒蛋白抗原检测试剂盒及试纸条的制备和使用方法，包括以下步骤：
提供第一亲和蛋白或抗体以及第二亲和蛋白或抗体，所述第一亲和蛋白或抗体以及所述第二亲和蛋白或抗体与病毒抗原肽或蛋白均具有高亲和力，并带有电荷；
使所述第一亲和蛋白或抗体以及所述第二亲和蛋白或抗体分别吸附金属纳米材料，以使所述金属纳米材料聚集并形成至少两个标记复合物，不同的所述金属纳米材料与所吸附的亲和蛋白或抗体具有相反的电荷；
提供检测样本，使所述检测样本中的病毒抗原肽或蛋白的若干位点与所述第一亲和蛋白或抗体与所述金属纳米材料形成的第一标记复合物结合，以形成结合复合物，所述检测样本包括受试样本和参比样本中的至少一种；
使所述结合复合物中的病毒抗原肽或蛋白的其他若干位点与所述第二亲和蛋白或抗体与所述金属纳米材料形成的第二标记复合物再结合，然后直接或者通过催化过氧化物酶底物的方式产生明显的颜色反应。
本发明实施例的所述病毒蛋白抗原检测试剂盒及试纸条的制备和使用方法通过在10-20分钟内用肉眼根据EP管或试纸条颜色变化，即可作出是否新冠病毒感染的初步现场筛查判断。
本发明一些实施例中，所述检测样本的病毒抗原肽或蛋白来源于呼吸道感染病毒、消化道感染病毒、肝炎病毒、乙脑病毒、神经病毒和性传播病毒中的任意一种或多种。
具体的，所述呼吸道感染病毒包括新冠病毒、SARS病毒、MERS病毒、流感病毒、鼻病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒中的任意一种或多种。
本发明一些实施例中，所述受试样本的病毒抗原肽或蛋白来源于受试者的咳痰、咽拭子、口腔拭子、血液、粪便和体液中的任意一种或多种。
具体的，所述体液包括血液、尿液、汗液和其他体液中的任意一种或多种。
更具体的，其他体液包括精液、阴道分泌物等。
本发明一些实施例中，通过生物系统表达或人工合成的方法获取所述参比样本的病毒抗原肽或蛋白。
具体的，所述生物系统包括动物乳腺生物反应器系统、大肠杆菌系统、昆虫细胞系统、酵母系统和哺乳动物细胞系统中的任意一种或多种。
本发明一些实施例中，所述参比样本的病毒抗原肽或蛋白参比样本包含新冠病毒刺突蛋白、所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位和S2亚单位及病毒结构蛋白，或所述新冠病毒刺突蛋白、所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位和S2亚单位及所述病毒结构蛋白中任意一种或多种的片段、变体或衍生物。
具体的，所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位包括受体结合域。
具体的，所述病毒结构蛋白包括血凝素、神经氨酸酶、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白中的任意一种或多种。
本发明一些实施例中，通过生物系统表达或人工合成的方法获取所述第一亲和蛋白或抗体和第二亲和蛋白或抗体中的至少一种，所述生物系统包括动物乳腺生物反应器系统、大肠杆菌系统、昆虫细胞系统、酵母系统和哺乳动物细胞系统中的任意一种或多种。
本发明一些实施例中，所述第一亲和蛋白或抗体和第二亲和蛋白或抗体中的任意一种包括重组全长或片段人ACE2蛋白、ACE2-Fc融合蛋白、人工合成ACE2多肽、病毒结合蛋白和抗体中的至少一种，所述人工合成ACE2多肽如SEQ ID 1-3所示。
具体的，所述抗体包括筛选出的拮抗新冠病毒刺突蛋白、所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位和S2亚单位及所述病毒结构蛋白的单克隆或多克隆抗体，或拮抗所述新冠病毒刺突蛋白、所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位和S2亚单位及所述病毒结构蛋白中任意一种或多种的片段、变体或衍生物的单克隆或多克隆抗体。
更具体的，所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位包括受体结合域，所述病毒结构蛋白包括血凝素、神经氨酸酶、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白中的任意一种或多种。
本发明一些实施例中，所述金属纳米材料包括胶体金颗粒、银离子颗粒及纳米模拟酶中的至少一种或多种。
进一步的，所述胶体金颗粒的悬液的制备方法包括：对双蒸水、HAuCl4水溶液和柠檬酸钠水溶液形成的混合液进行加热反应，所述加热反应在第一温度下进行，直至所述混合液沸腾并呈现红色透明状；然后在第二温度下反应2-20分钟后得到所述标记物悬液。
本发明一些具体的实施例中，所述第一温度为300-500℃，所述第二温度为150-250℃。所述HAuCl4水溶液的质量浓度为5-15%，所述柠檬酸钠水溶液的质量浓度为0.5-2%。所述柠檬酸钠水溶液的体积为所述HAuCl4水溶液体积的10-30倍，所述双蒸水的体积为所述HAuCl4水溶液体积的500-2000倍。
本发明实施例1中，所述双蒸水的体积为100毫升，所述HAuCl4水溶液的质量浓度为10%，体积为0.1毫升，所述柠檬酸钠水溶液的质量浓度为1%，体积为2.5毫升。所述第一温度为400℃，所述加热反应在所述第一温度下使所述混合液由透明变成黑色，再变成紫红色透明。所述第二温度为200℃，在所述第二温度下加热10分钟。
本发明一些实施例中，所述纳米模拟酶包括过氧化物纳米模拟酶或具有催化活性的纳米模拟酶。
进一步的，所述过氧化物纳米模拟酶冻干剂的制备方法包括：对去离子水、三氯化铁、无水乙酸钠和乙二醇形成的混合溶液在160℃-200℃下进行8-16小时的水热反应，得到沉淀产物，对所述沉淀产物进行洗涤和冷冻干燥，得到过氧化物纳米模拟酶冻干剂。
本发明一些实施例中，所述三氯化铁和所述无水乙酸钠的摩尔比为1:3-1:12，所述去离子水体积为0.36-0.9mL。
本发明一些实施例中，所述过氧化物纳米模拟酶或具有催化活性的纳米模拟酶的底物包括过氧化氢，以及TMB、DAB、OPD和CDI中的任意一种或多种。
本发明实施例1中，所述试剂盒的组成溶液通过所述第一标记复合物的冻干剂或悬液封装品、所述参比样本与所述第一标记复合物结合形成的参比标记复合物的冻干剂或悬液封装品、第二标记复合物的冻干剂或悬液封装品进行包装形成。
具体的，所述第一标记复合物的冻干剂或悬液封装品包括重组ACE2蛋白或人工合成ACE2多肽与金属纳米材料形成的标记复合物的冻干剂或悬液；所述参比标记复合物的冻干剂或悬液封装品包括重组新冠病毒刺突蛋白S1亚单位、重组ACE2蛋白或人工合成ACE2多肽以及金属纳米材料形成的标记复合物冻干剂或悬液；所述第二标记复合物的冻干剂或悬液封装品包括第二亲和蛋白或抗体与金属纳米材料形成的标记复合物冻干剂或悬液。控制进行封装的房间为无菌密闭状态，湿度≤30％，温度为18-25℃，将上述冻干剂或悬液分别封装于第一无菌EP管、第二无菌EP管和第三无菌EP管，并于室温或冷藏条件下保存。
在现场检测的场景下，将待测试样品置于所述重组ACE2或ACE2多肽与金属纳米材料形成的标记复合物悬液中，并在密封状态下混匀，室温静置3-5分钟；然后加入所述第二亲和蛋白或抗体与金属纳米材料形成的标记复合物悬液，并在密封状态下混匀，静置3-5分钟后，肉眼观察颜色变化。
本发明实施例2中，所述试剂盒的组成溶液通过第一亲和蛋白或抗体负载纳米模拟酶形成的蛋白或抗体-纳米模拟酶标记复合物冻干剂或悬液封装品，参比样本、第一亲和蛋白或抗体与纳米模拟酶形成的标记复合物冻干剂或悬液封装品，第二亲和蛋白或抗体负载纳米模拟酶形成的蛋白或抗体再与纳米模拟酶结合形成的标记复合物冻干剂或悬液封装品，纳米模拟酶的冻干剂或悬液封装品组成的标记复合物封装品进行包装形成。所述纳米模拟酶包括过氧化物纳米模拟酶或具有催化活性的纳米模拟酶底物。
具体的，所述标记复合物封装品包括重组ACE2蛋白或人工合成ACE2多肽与过氧化物纳米模拟酶形成的标记复合物冻干剂或悬液，重组新冠病毒刺突蛋白S1亚单位、重组ACE2蛋白或人工合成ACE2多肽以及过氧化物纳米模拟酶形成的标记复合物冻干剂或悬液，第二亲和蛋白或抗体与过氧化物纳米模拟酶形成的标记复合物冻干剂或悬液以及过氧化物纳米模拟酶底物的冻干剂或悬液，所述过氧化物纳米模拟酶底物为DAB和H2O2。控制进行封装的房间为无菌密闭状态，湿度≤30％，温度为18-25℃，将上述冻干剂或悬液分别封装于第一无菌EP管、第二无菌EP管、第三无菌EP管和第四无菌EP管，并于室温或冷藏条件下保存。
图1为本发明一些实施例的应用于病毒蛋白抗原检测的试剂盒进行现场检测的流程示意图。
在现场检测的场景下，如图1所示，利用过氧化物纳米模拟酶2固有的磁性和催化性特点，将待测试样品（图中未标示）加入到放置有人工合成ACE2多肽1与所述过氧化物纳米模拟酶2形成的标记复合物悬液（图中未标示）的EP管6中，并在密封状态下混匀，室温静置3-5分钟，使待测试样本中的新冠病毒刺突蛋白S1亚单位31和所述人工合成ACE2多肽1与所述过氧化物纳米模拟酶2形成的标记复合物悬液（图中未标示）结合；将所述EP管6置于磁力架5上，吸出悬液，加入所述第二亲和抗体与过氧化物纳米模拟酶形成的标记复合物4的悬液，并在密封状态下混匀，室温静置3-5分钟；将所述EP管6置于所述磁力架5上，吸出悬液，加入DAB 和H2O2形成的悬液，并在密封状态下混匀，室温静置3-5分钟，肉眼观察颜色变化。
同时，作为对照，将参比样本（图中未标示）和所述人工合成ACE2多肽1与所述过氧化物纳米模拟酶2形成的标记复合物悬液（图中未标示）在密封状态下混匀于所述EP管6，室温静置3-5分钟，使参比样本中的新冠病毒刺突蛋白S1亚单位32和所述人工合成ACE2多肽1与所述过氧化物纳米模拟酶2形成的标记复合物悬液（图中未标示）结合；将所述EP管6置于所述磁力架5上，吸出悬液，加入所述人工合成ACE2多肽1与所述过氧化物纳米模拟酶2形成的标记复合物悬液（图中未标示），并在密封状态下混匀，室温静置3-5分钟；将所述EP管6置于所述磁力架5上，吸出悬液，加入DAB 和H2O2形成的悬液，并在密封状态下混匀，室温静置3-5分钟，肉眼观察颜色变化。
本发明一些实施例中，试纸条的组装包括：将NC膜粘贴在乙烯基衬垫上；对所述NC膜包被T线和C线；对所述NC膜洗涤和干燥；将吸收垫粘贴在乙烯基背衬上，以与所述NC膜重叠；切割形成所述试剂条，所述试剂条的尺寸为25mm × 5mm，将所述试剂条放入铝箔袋中，并加入干燥剂，密封常温放置备用。
本发明实施例3中，所述试剂条组装包括：
S1：吸取30-40微升所述第二亲和蛋白或抗体与过氧化物纳米模拟酶形成的标记复合物悬液并于所述NC膜表面特定位置划线形成所述T线；
S2：等比例混合重组新冠病毒刺突蛋白S1亚单位、重组ACE2蛋白或人工合成ACE2多肽以及过氧化物纳米模拟酶形成标记复合物悬液以及第二亲和蛋白或抗体与过氧化物纳米模拟酶形成的标记复合物悬液，得到混合液；
S3：吸取30-40微升所述混合液并于所述NC膜表面特定位置划线形成所述C线，以完成标记过程；
S4：将完成所述标记过程的载体膜在37℃干燥，然后用1%的BSA孵育30分钟后，再用硼酸缓冲液洗涤至少三次，在37℃干燥；
S5：将吸收垫粘贴于所述衬底并与所述划线NC膜重叠，得到待裁切试剂条S6：用切割机切割成25mm x 5mm左右的试纸条，放入铝箔袋中，加入干燥剂，密封常温放置备用。
图2为本发明一些实施例的应用于病毒蛋白抗原检测的试纸条进行现场检测流程示意图。
在现场检测的场景下，如图2所示，首先将待测试样品（图中未标示）置于所述人工合成ACE2多肽1与所述过氧化物纳米模拟酶2形成的标记复合物悬液（图中未标示）中，形成测试悬液（图中未标示），并在密封状态下混匀，室温静置3-5分钟，使所述待测试样本中的新冠病毒刺突蛋白S1亚单位31和所述人工合成ACE2多肽1与所述过氧化物纳米模拟酶2形成的标记复合物悬液（图中未标示）结合；然后将试剂条9垂直插入所述测试悬液（图中未标示）中，室温静置；3-5分钟后快速取出所述试纸条9，并垂直插入DAB 和H2O2形成的悬液，室温静置；3-5分钟后快速取出所述试纸条9，用无菌去离子水停止反应，肉眼观察试纸条T线8和试剂条C线7的颜色变化。
同时，作为对照，将参比样本（图中未标示）和所述人工合成ACE2多肽1与所述过氧化物纳米模拟酶2形成的标记复合物悬液（图中未标示）在密封状态下混匀于所述EP管6，室温静置3-5分钟，使参比样本中的新冠病毒刺突蛋白S1亚单位32和所述人工合成ACE2多肽1与所述过氧化物纳米模拟酶2形成的标记复合物悬液（图中未标示）结合；然后将所述试剂条9垂直插入所述测试悬液（图中未标示）中，室温静置；3-5分钟后快速取出所述试纸条9，并垂直插入DAB 和H2O2形成的悬液，室温静置；3-5分钟后快速取出所述试纸条9，用无菌去离子水停止反应，肉眼观察试纸条T线8和试剂条C线7的颜色变化。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。
序列表
<110> 上海桀蒙生物技术有限公司
<120> 病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法
<130> HRCN20L31013
<140> HRCN20L31013
<141> 2020-04-03
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 601
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 1
Met Lys Val Leu Ile Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Gln
1 5 10 15
Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn Tyr
35 40 45
Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala Gly
50 55 60
Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln Met
65 70 75 80
Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu Gln
85 90 95
Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser Lys
100 105 110
Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr Gly
115 120 125
Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu Pro
130 135 140
Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg Leu
145 150 155 160
Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg Pro
165 170 175
Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala Asn
180 185 190
His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asn
195 200 205
Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp Val
210 215 220
Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His Ala
225 230 235 240
Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser Pro
245 250 255
Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg Phe
260 265 270
Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro Asn
275 280 285
Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln Arg
290 295 300
Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro Asn
305 310 315 320
Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly Asn
325 330 335
Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys Gly
340 345 350
Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu
355 360 365
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
370 375 380
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
385 390 395 400
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
405 410 415
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
420 425 430
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
435 440 445
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
450 455 460
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
465 470 475 480
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
485 490 495
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
500 505 510
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
515 520 525
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
530 535 540
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
545 550 555 560
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
565 570 575
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
580 585 590
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
595 600
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 2
Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His Glu Ala
1 5 10 15
Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser
20
<210> 3
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 3
His Arg Lys Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn
1 5 10 15
His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser His Arg Lys
20 25

Claims (12)

1.一种病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供第一亲和蛋白或抗体以及第二亲和蛋白或抗体，所述第一亲和蛋白或抗体以及所述第二亲和蛋白或抗体与病毒抗原肽或蛋白均具有高亲和力，并带有电荷；
使所述第一亲和蛋白或抗体以及所述第二亲和蛋白或抗体分别吸附金属纳米材料，以使所述金属纳米材料聚集并形成至少两个标记复合物，不同的所述金属纳米材料与所吸附的亲和蛋白或抗体具有相反的电荷；
提供检测样本，使所述检测样本中的病毒抗原肽或蛋白的若干位点与所述第一亲和蛋白或抗体与所述金属纳米材料形成的第一标记复合物结合，以形成结合复合物，所述检测样本包括受试样本和参比样本中的至少一种；
使所述结合复合物中的病毒抗原肽或蛋白的其他若干位点与所述第二亲和蛋白或抗体与所述金属纳米材料形成的第二标记复合物再结合，然后直接或者通过催化过氧化物酶底物的方式产生明显的颜色反应。
2.根据权利要求1所述病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法，其特征在于，所述检测样本中的病毒抗原肽或蛋白来源于呼吸道感染病毒、消化道感染病毒、肝炎病毒、乙脑病毒、神经病毒和性传播病毒中的任意一种或多种，所述呼吸道感染病毒包括新冠病毒、SARS病毒、MERS病毒、流感病毒、鼻病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒中的任意一种或多种。
3.根据权利要求1所述病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法，其特征在于，所述受试样本中的病毒抗原肽或蛋白来源于受试者的咳痰、咽拭子、口腔拭子、血液、粪便和体液中的任意一种或多种，所述体液包括血液、尿液、汗液、精液和阴道分泌物中的任意一种或多种。
4.根据权利要求1所述病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法，其特征在于，通过生物系统表达或人工合成的方法获取所述参比样本的病毒抗原肽或蛋白，所述生物系统包括动物乳腺生物反应器系统、大肠杆菌系统、昆虫细胞系统、酵母系统和哺乳动物细胞系统中的任意一种或多种。
5.根据权利要求4所述病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法，其特征在于，所述参比样本的病毒抗原肽或蛋白包含新冠病毒刺突蛋白、所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位和S2亚单位、病毒结构蛋白，或所述新冠病毒刺突蛋白、所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位和S2亚单位以及所述病毒结构蛋白中任意一种或多种的片段、变体或衍生物，所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位包括受体结合域，所述病毒结构蛋白包括血凝素、神经氨酸酶、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白中的任意一种或多种。
6.根据权利要求1所述病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法，其特征在于，通过生物系统表达或人工合成的方法获取所述第一亲和蛋白或抗体和第二亲和蛋白或抗体中的至少一种，所述生物系统包括动物乳腺生物反应器系统、大肠杆菌系统、昆虫细胞系统、酵母系统和哺乳动物细胞系统中的任意一种或多种。
7.根据权利要求6所述病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法，其特征在于，所述第一亲和蛋白或抗体和所述第二亲和蛋白或抗体中的任意一种包括重组全长或片段人ACE2蛋白、ACE2-Fc融合蛋白、人工合成ACE2多肽、病毒亲和蛋白和抗体中的至少一种，所述人工合成ACE2多肽如SEQ ID 1-3所示，所述抗体包括筛选出的拮抗新冠病毒刺突蛋白、所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位和S2亚单位及所述病毒结构蛋白的单克隆或多克隆抗体，或拮抗所述新冠病毒刺突蛋白、所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位和S2亚单位及所述病毒结构蛋白中任意一种或多种的片段、变体或衍生物的单克隆或多克隆抗体，所述新冠病毒刺突蛋白的S1亚单位包括受体结合域，所述病毒结构蛋白包括血凝素、神经氨酸酶、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白中的任意一种或多种。
8.根据权利要求1所述病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法，其特征在于，所述金属纳米材料包括胶体金颗粒、银离子颗粒和纳米模拟酶中的至少一种或多种，所述纳米模拟酶包括过氧化物纳米模拟酶或具有催化活性的纳米模拟酶。
9.根据权利要求1所述病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法，其特征在于，所述过氧化物纳米模拟酶或具有催化活性的纳米模拟酶的底物包括过氧化氢，以及TMB、DAB、OPD和CDI中的任意一种或多种。
10.根据权利要求1所述病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法，其特征在于，所述检测工具包括试剂盒和试纸条，通过所述第一标记复合物的冻干剂或悬液封装品、所述参比样本与所述第一标记复合物结合形成的参比标记复合物的冻干剂或悬液封装品、所述第二标记复合物的冻干剂或悬液封装品和所述金属纳米材料的冻干剂或悬液封装品进行所述试剂盒组成溶液的包装及所述试纸条的组装。
11.根据权利要求10所述病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法，其特征在于，所述试纸条的组装包括：
将NC膜粘贴在乙烯基衬垫上；
对所述NC膜包被T线和C线；
对所述NC膜洗涤和干燥；
将吸收垫粘贴在乙烯基背衬上，以与所述NC膜重叠；
通过切割形成所述试纸条，所述试纸条的尺寸为25mm×5mm，将所述试纸条放入铝箔袋中，并加入干燥剂，密封常温放置备用。
12.根据权利要求1所述病毒蛋白抗原检测工具的制备和使用方法，其特征在于，所述检测工具使所述颜色反应在不超过20分钟的时间内完成，以应用于现场快速筛查。
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