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CN113366102A - 包含hla-e和hla-g分子的人工抗原呈递细胞和使用方法 - Google Patents

包含hla-e和hla-g分子的人工抗原呈递细胞和使用方法 Download PDF

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CN113366102A
CN113366102A CN201980090411.5A CN201980090411A CN113366102A CN 113366102 A CN113366102 A CN 113366102A CN 201980090411 A CN201980090411 A CN 201980090411A CN 113366102 A CN113366102 A CN 113366102A
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polypeptide
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exogenous
hla
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CN201980090411.5A
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T.F-Y.陈
T.J.威克姆
R.S.萨尔瓦特
X.张
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Rubius Therapeutics Inc
Original Assignee
Rubius Therapeutics Inc
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Abstract

本公开涉及人工抗原呈递细胞(aAPC)，特别是工程化红系细胞和去核细胞(如，去核红系细胞和血小板)，它们经工程化改造以包含含有HLA‑E或HLA‑G多肽的外源抗原呈递多肽，其可用于激活或抑制某些免疫细胞。

Description

包含HLA-E和HLA-G分子的人工抗原呈递细胞和使用方法
相关申请
本申请要求于2018年12月3日提交的美国临时专利申请号62/774,857的优先权权益。该申请的内容以其整体通过引用并入本文。
序列表
本申请包括以ASCII格式电子提交的序列表，并通过引用以其整体并入本文。所述ASCII拷贝创建于2019年12月3日，命名为129267-01020_SL.txt，大小为37,433字节。
发明背景
抗原呈递细胞(APC)的作用为先天性免疫应答和适应性免疫应答之间的纽带。抗原内化后，APC可在细胞膜上的I类和II类主要组织相容性复合体(MHC)上展示抗原(或由其衍生的肽)以及共刺激信号，以调节免疫细胞(如，激活抗原特异性T细胞)。抗原特异性免疫细胞(如，T细胞)的激活和/或扩增对于治疗某些疾病(如，癌症)可能是期望的。例如，抗原特异性T细胞群体可在离体引发和扩增以获得用于输注到受试者的大量肿瘤特异性T细胞。期望的抗原特异性免疫细胞的激活和/或扩增可通过施用离体产生的APC来实现。例如，树突细胞(DC)已用于离体最大化T细胞(如，CD8+细胞毒性淋巴细胞(CTL))刺激。然而，为了临床应用而离体制备DC仍然具有挑战性(Kim JV et al.Nat Biotechnol.2004；22:403-10)。
多个系统(包括合成生物材料)已经进行了工程化改造以激活和/或扩增期望的免疫细胞群体(如，T细胞)。这些系统可通过模仿DC和T细胞之间的相互作用来起作用。例如，已开发了几种细胞大小的刚性珠如乳胶微珠、包被有聚苯乙烯的磁性微珠和可生物降解的聚(乳酸-共-乙醇酸)微粒。这些珠在诱导免疫细胞激活和/或扩增中的功效似乎高度依赖于所使用材料的性质。例如，大于200nm的珠通常保留在接种部位，而较小的颗粒则可被DC摄取(参见，例如，Reddy et al.(2006)J.Control.Release 112:26-34)。相反，天然APC的膜比这些珠的外表面具有大得多的动态性。因此，仍然需要刺激期望的免疫细胞用于治疗目的的改进的组合物和方法。优选地，这些组合物是自体的且在接受它们的施用以激活和/或诱导期望的免疫细胞群体的受试者中表现出延长的清除率。
发明概述
本公开涉及人工抗原呈递细胞(aAPC)，特别是工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，其经工程化改造以包含HLA-E或HLA-G多肽。在一些实施方案中，aAPC还包括与HLA-E或HLA-G多肽结合的外源抗原性多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞是工程化去核红系细胞，例如网织红细胞或红细胞。在本公开的一些实施方案中，去核细胞(如，经修饰的去核细胞)是网织红细胞、红细胞或血小板。
第一方面，本公开的特征在于人工抗原呈递细胞(aAPC)，其包含工程化去核红系细胞，所述工程化去核红系细胞包含细胞表面上的外源抗原呈递多肽和与所述外源抗原呈递多肽特异性结合的外源抗原性多肽，其中所述外源抗原呈递多肽包含人白细胞抗原-E(HLA-E)多肽。
在一些实施方案中，所述HLA-E多肽包含选自下组的等位基因：E*01:01:01:01、E*01:01:01:02、E*01:01:01:03、E*01:01:01:04、E*01:01:01:05、E*01:01:01:06、E*01:01:01:07、E*01:01:01:08、E*01:01:01:09、E*01:01:01:10、E*01:01:02、E*01:03:01:01、E*01:03:01:02、E*01:03:01:03、E*01:03:01:04、E*01:03:02:01、E*01:03:02:02、E*01:03:03、E*01:03:04、E*01:03:05、E*01:04、E*01:05、E*01:06、E*01:07、E*01:08N、E*01:09和E*01:10。在一些实施方案中，所述HLA-E多肽包含HLA-E*01:01或HLA-E*01:03等位基因。
在一些实施方案中，所述外源抗原性多肽包括自体肽(self-peptide)。在一些实施方案中，所述外源抗原性多肽包括致耐受性多肽。在一些实施方案中，所述外源抗原性多肽包括自身免疫性疾病抗原。在一些实施方案中，所述外源抗原性多肽包括HSP60的前导序列(QMRPVSRVL)(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，所述外源抗原性多肽包括表1中所列的多肽。
在一些实施方案中，所述HLA-E多肽包括一个或多个HLA-Eα域和β2M多肽或其片段。
在一些实施方案中，所述HLA-E多肽与膜锚连接。
在一些实施方案中，所述HLA-E多肽包括单链融合蛋白，所述单链融合蛋白包含经由接头与所述HLA-E多肽连接的外源抗原性多肽。在一些实施方案中，所述单链融合蛋白还包括膜锚。在一些实施方案中，所述接头包括可切割接头。在一些实施方案中，所述膜锚包含血型糖蛋白A(GPA)蛋白或其跨膜域，或者小整合膜蛋白1(SMIM1)或其跨膜域。
在一些实施方案中，所述外源抗原性多肽与所述外源抗原呈递多肽共价结合。在一些实施方案中，所述外源抗原性多肽与所述外源抗原呈递多肽非共价结合。
在一些实施方案中，所述外源抗原性多肽为约8个氨基酸的长度至约24个氨基酸的长度。
在一些实施方案中，所述工程化去核红系细胞在细胞表面上还包含外源T调节性共刺激性多肽。在一些实施方案中，所述外源T调节性共刺激性多肽是IL-17、IL-21、IL-18、IL-2、CD80、CD86、IL-15、TNFα、抗DR3激动剂、4-1BBL、或TGFβ。
在一些实施方案中，所述工程化去核红系细胞在细胞表面上还包含外源共刺激性多肽。在一些实施方案中，所述工程化去核红系细胞在所述细胞表面上还包含外源共抑制性多肽。
在一些实施方案中，所述工程化去核红系细胞是网织红细胞。在一些实施方案中，所述工程化去核红系细胞是红细胞。
另一方面，本公开提供了激活调节性T(Treg)细胞的方法，所述方法包括使Treg细胞与本文所述的aAPC接触，从而激活Treg细胞。
另一方面，本公开提供了抑制免疫细胞的方法，所述方法包括使免疫细胞与本文所述的aAPC接触，从而抑制免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是细胞毒性CD8+T细胞或自然杀伤细胞。
另一方面，本公开的特征在于治疗需要调节的免疫应答的受试者的方法，所述方法包括使受试者的免疫细胞与本文所述的aAPC接触，从而治疗需要调节的免疫应答的受试者。在一些实施方案中，所述免疫细胞是调节性T细胞、细胞毒性CD8+T细胞或自然杀伤细胞。在一些实施方案中，所述接触在体外或在体内进行。
另一方面，本说明书提供了治疗患有自身免疫性疾病或炎性疾病的受试者的方法，所述方法包括：选择人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC是包含抗原呈递多肽和至少一种与所述抗原呈递多肽特异性结合的外源抗原性多肽的工程化去核红系细胞，其中所述抗原呈递多肽包含HLA-E多肽，和向受试者施用aAPC，从而治疗患有自身免疫性疾病或炎性疾病的受试者。
在一些实施方案中，所述受试者患有自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病由Tfh细胞、Th1细胞或Th17细胞介导。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病选自：I型糖尿病、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病(GVHD)、肾炎、多发性硬化、混合性结缔组织病症、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、膜性肾小球肾炎、视神经脊髓炎、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、皮肌炎、巨细胞动脉炎、肉芽肿病伴多血管炎、川崎病、狼疮性肾炎、结节性多动脉炎、坏疽性脓皮病、椎关节炎、系统性红斑狼疮、高安动脉炎。
在一些实施方案中，所述外源抗原性多肽包含HSP60的前导序列(QMRPVSRVL)(SEQID NO:17)。
在一些实施方案中，所述受试者患有变应性病症。在一些实施方案中，所述变应性病症由Th2细胞介导。
在一些实施方案中，所述患者患有炎性疾病。在一些实施方案中，所述炎性疾病是心脏炎性疾病、肝脏炎性疾病、胰腺炎性疾病、皮肤炎性疾病和/或胃肠(GI)道炎性疾病。例如，炎性疾病包括但不限于心肌炎、心肌病、心内膜炎、心包炎、肝硬化、哮喘(嗜酸性或非嗜酸性)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘和COPD重叠综合征(ACOS)、特应性皮炎、鼻息肉、变应性应答、慢性支气管炎、肺气肿、过敏性肺炎、变应性鼻炎、伴有或不伴有鼻息肉的慢性鼻鼻窦炎、炎症性肠病、肠易激综合征、回肠炎、慢性炎性肠病、纤维化、嗜酸性食管炎、血管炎、荨麻疹、Churg-Strauss综合征和炎性痛。
另一方面，本公开的特征在于扩增调节性T(Treg)细胞群体的方法，所述方法包括：从受试者获得细胞群体，其中该群体包含Treg细胞，使群体与本文所述的aAPC接触，其中使群体与aAPC接触诱导Treg细胞增殖，从而扩增Treg细胞群体。在一些实施方案中，所述方法还包括从细胞群体中分离Treg细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用所述Treg细胞。
另一方面，本公开的特征在于制备本文所述的aAPC的方法，所述方法包括：将本文所述的编码外源抗原呈递多肽的外源核酸(如，包含HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽)引入有核红系前体细胞；和在适合于去核和产生外源抗原呈递多肽的条件下培养有核红系前体细胞，从而制备aAPC。
另一方面，本公开的特征在于制备本文所述的aAPC的方法，所述方法包括：将本文所述的编码外源抗原呈递多肽的外源核酸引入有核红系前体细胞；将本文所述的编码外源抗原性多肽的外源核酸引入有核红系前体细胞；和在适合于去核和产生外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽的条件下培养有核红系前体细胞，从而制备aAPC。
另一方面，本公开的特征在于制备本文所述的aAPC的方法，所述方法包括：将本文所述的编码外源抗原呈递多肽的外源核酸引入有核细胞；在适合于去核和产生外源抗原呈递多肽的条件下培养有核红系细胞，从而制备工程化去核红系细胞；和使工程化去核红系细胞与至少一种外源抗原性多肽接触，其中至少一种外源抗原性多肽与存在于工程化去核红系细胞的细胞表面上的外源抗原呈递多肽结合，从而制备aAPC。
在一些实施方案中，所述外源核酸包括DNA。
在一些实施方案中，所述外源核酸包括RNA。
在一些实施方案中，所述引入步骤包括病毒转导。在一些实施方案中，所述引入步骤包括电穿孔。在一些实施方案中，所述引入步骤包括利用以下一种或多种：脂质体介导的转移、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、脂质转染和慢病毒载体。
另一方面，本公开的特征在于人工抗原呈递细胞(aAPC)，其包含工程化去核红系细胞，所述工程化去核红系细胞包含细胞表面上的外源抗原呈递多肽和与所述外源抗原呈递多肽特异性结合的外源抗原性多肽，其中所述外源抗原呈递多肽包含人白细胞抗原-G(HLA-G)多肽。在一些实施方案中，所述HLA-G多肽选自：HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4、HLA-G5、HLA-G6和HLA-G7。在一些实施方案中，所述HLA-G多肽选自：HLA-G1、HLA-G2、HLA-G5和HLA-G6。
在一些实施方案中，本文所述的aAPC，其中外源抗原性多肽包含基序XI/LPXXXXXXL(SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，所述HLA-G多肽包含一个或多个HLA-Gα域和β2M多肽或其片段。在一些实施方案中，所述HLA-G多肽与膜锚连接。
在一些实施方案中，所述HLA-G多肽包括单链融合蛋白，所述单链融合蛋白包含经由接头与所述HLA-G多肽连接的外源抗原性多肽。在一些实施方案中，所述单链融合蛋白还包括膜锚。
在一些实施方案中，所述接头包括可切割接头。
在一些实施方案中，所述膜锚包含血型糖蛋白A(GPA)蛋白或其跨膜域，或者小整合膜蛋白1(SMIM1)或其跨膜域。
在一些实施方案中，所述外源抗原性多肽与所述外源抗原呈递多肽共价结合。在一些实施方案中，所述外源抗原性多肽与所述外源抗原呈递多肽非共价结合。
在一些实施方案中，所述外源抗原性多肽为约8个氨基酸的长度至约24个氨基酸的长度。
在一些实施方案中，所述aAPC能够阻抑与所述aAPC相互作用的T细胞。在一些实施方案中，所述阻抑包括抑制T细胞增殖、使T细胞无应答或诱导T细胞凋亡。在一些实施方案中，所述T细胞是CD8+T细胞。
在一些实施方案中，所述工程化去核红系细胞还包括至少一种外源共抑制性多肽。在一些实施方案中，所述外源共抑制性多肽是IL-10。
在一些实施方案中，所述aAPC能够阻抑与所述aAPC相互作用的B细胞。
在一些实施方案中，所述aAPC能够阻抑与所述aAPC相互作用的NK细胞。
在一些实施方案中，所述aAPC能够阻抑与所述aAPC相互作用的巨噬细胞。
在一些实施方案中，所述aAPC能够阻抑与所述aAPC相互作用的树突细胞。
在一些实施方案中，所述工程化去核红系细胞在细胞表面上还包括检查点分子。在一些实施方案中，所述检查点分子选自：PD-L1、PD-L2和OX40L。
在一些实施方案中，所述工程化去核红系细胞是网织红细胞。在一些实施方案中，所述工程化去核红系细胞是红细胞。
一方面，本说明书提供了阻抑免疫细胞活性的方法，所述方法包括使免疫细胞与本文所述的aAPC接触，从而抑制免疫细胞的活性。在一些实施方案中，所述免疫细胞选自：T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是B细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是NK细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是巨噬细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是树突细胞。
另一方面，本公开的特征在于治疗需要降低的免疫应答的受试者的方法，所述方法包括：使受试者的免疫细胞与本文所述的aAPC接触，从而治疗需要降低的免疫应答的受试者。
在一些实施方案中，所述受试者患有自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病选自：I型糖尿病、类风湿性关节炎、GVHD、肾炎和多发性硬化症。
在一些实施方案中，所述受试者患有炎性疾病。
在一些实施方案中，所述受试者患有变应性病症。
在一些实施方案中，所述受试者需要或已经接受移植(如，器官移植)。
另一方面，本公开的特征在于制备本文所述的aAPC的方法，所述方法包括：将编码外源抗原性多肽的外源核酸引入有核红系前体细胞；和在适合于去核和产生外源抗原性多肽的条件下培养有核红系前体细胞，从而制备工程化去核红系细胞，从而制备aAPC。
另一方面，本公开的特征在于制备本文所述的aAPC的方法，所述方法包括：将编码外源抗原呈递多肽的外源核酸引入有核红系前体细胞；将编码外源抗原性多肽的外源核酸引入有核红系前体细胞；和在适合于去核和产生外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽两者的条件下培养有核红系前体细胞，从而制备工程化去核红系细胞，从而制备aAPC。
另一方面，本公开的特征在于制备本文所述的aAPC的方法，所述方法包括：将编码外源抗原呈递多肽的外源核酸引入有核红系前体细胞；在适合于去核和产生外源抗原呈递多肽的条件下培养培养有核红系前体细胞，从而制备工程化去核红系细胞；和使工程化去核红系细胞与至少一种外源抗原性多肽接触，其中至少一种外源抗原性多肽与存在于工程化去核红系细胞的细胞表面上的外源抗原呈递多肽结合，从而制备aAPC。
在一些实施方案中，所述外源核酸包括DNA。在一些实施方案中，所述外源核酸包括RNA。在一些实施方案中，所述引入步骤包括病毒转导。在一些实施方案中，所述引入步骤包括电穿孔。在一些实施方案中，所述引入步骤包括利用以下一种或多种：脂质体介导的转移、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、脂质转染和慢病毒载体。
在以上方面和实施方案的任何某些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。
附图简述
附图意在说明本公开的一个或多个特征、方面或实施方案，而不旨在限制。
图1是显示包含HLA-E多肽的抗原呈递多肽的示例性构建体的示意图。在该构建体中，外源抗原性多肽与β2M多肽连接，所述β2M多肽与HLA-Eα链的一个或多个α域(如，α1、α2和α3域)连接，所述HLA-Eα链的一个或多个α域与膜锚如GPA或SMIM1连接。
图2A至图2C是显示包含HLA-G多肽的抗原呈递多肽的示例性构建体的示意图。图2A描绘了构建体，该构建体包含与β2M多肽连接的外源抗原性多肽，所述β2M多肽与HLA-Gα链的一个或多个α域(如，α1、α2和α3域的一个或多个)连接，所述HLA-Gα链的一个或多个α域与膜锚如GPA或SMIM1连接。该构建体还包括β2M前导序列。图2B描绘了开放构象(OC)构建体(如，未与外源抗原性多肽融合)，其包含与HLA-Gα链的一个或多个α域(如，α1、α2和α3域的一个或多个)连接的β2M多肽，所述一个或多个α域与膜锚蛋白(如，GPA或SMIM1)连接，其中HLA-G开放构象能够结合抗原性多肽。该构建体还包括β2M前导序列。图2C描绘了包含HLA-G2构建体的抗原呈递多肽，所述HLA-G2构建体包含与膜锚(如，GPA或SMIM1)连接的HLA-G2α1和α2域。该构建体还包括β2m或α前导序列。
发明详述
本公开基于人工抗原呈递细胞(aAPC)的开发，所述人工抗原呈递细胞(aAPC)包括工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，所述细胞在其表面上(如，质膜上)包含HLA-E或HLA-G多肽的。在一个实施方案中，HLA-E或HLA-G多肽与外源抗原性多肽结合。
特别地，本公开至少部分地基于以下令人惊讶的发现：包括HLA-E或HLA-G的工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)特别可调节特定的免疫细胞。
在一些实施方案中，本文所述的aAPC细胞包括HLA-E且可刺激或激活调节性T细胞，如CD8+调节性T细胞(Tregs)。Treg细胞的激活导致抑制或杀死其他免疫细胞，包括滤泡辅助T(Tfh)、Th1细胞和T辅助17(Th17)，它们是已知导致自身反应性的T细胞。在一些实施方案中，本文所述的aAPC细胞包括HLA-E且可抑制或阻抑其他免疫细胞，诸如例如NK细胞和细胞毒性CD8+T细胞。
在其他实施方案中，本文所述的aAPC细胞包括HLA-G且可抑制或阻抑某些免疫细胞群体，如自然杀伤(NK)细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)等。
在一些实施方案中，HLA-G和HLA-E能够抑制NK细胞和细胞毒性CD8+T细胞的细胞毒性功能、抑制NK和T细胞增殖、促进CD8和CD4调节性T细胞产生、和/或抑制DC成熟和抗原呈递。
因此，本文所述的aAPC细胞包括工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，其包括HLA-E和/或HLA-G且可用于治疗炎性疾病或自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，HLA-E多肽是单链融合多肽，其包含与抗原外源肽如热休克蛋白60(HSP60)、自身抗原或其部分(如，HSP60的前导序列)连接的HLA-E多肽。在一些实施方案中，HLA-E多肽是单链融合多肽，其包含以下或由以下组成：HLA-E多肽的胞外域(如，α1、α2和α3域)、β-2微球蛋白(β2M)多肽和膜锚(如，GPA跨膜域)，其中单链融合多肽任选地连接至抗原性外源多肽。已表明包含HLA-E和HSP60前导序列的HLA-E融合蛋白促进调节性T细胞的激活，从而提供保护而免于自身免疫性疾病中的病理学，例如但不限于1型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化和肾炎(参见，例如Jiang et al.2010J.Clin Invest.120(10):3641-3650；Leavenworth et al.J Clin Invest.2013；123(3):1382-1389)。
在其他实施方案中，HLA-G多肽是单链融合多肽，其包含与外源多肽(如具有基序XI/LPXXXXXXL(SEQ ID NO:8)的外源肽)连接的HLA-G多肽。在一些实施方案中，HLA-G多肽是单链融合多肽，其包含以下或由以下组成：HLA-G多肽的胞外域(如，HLA-G1或HLA-G5亚型(isoform)多肽的α1、α2和α3域；HLA-G2或HLA-G6亚型多肽的α1和α3域；HLA-G4亚型多肽的α1和α2域；HLA-G4亚型多肽的α1和α2域；或HLA-G3或HLA-G7多肽的α1域)、β2M多肽和膜锚(如，GPA跨膜域)，其中单链融合多肽任选地连接至抗原性外源多肽。在一些实施方案中，HLA-G多肽是单链融合多肽，其包含以下或由以下组成：HLA-Gα链的一个或多个α域(如，HLA-G1或HLA-G5亚型多肽的α1、α2和/或α3域；HLA-G2或HLA-G6亚型多肽的α1和α3域；HLA-G4亚型多肽的α1和α2域；HLA-G4亚型多肽的α1和α2域；或HLA-G3或HLA-G7多肽的α1域)、β2M多肽和膜锚(如，GPA跨膜域)，其中单链融合多肽任选地连接至抗原性外源多肽。在一些实施方案中，HLA-G多肽是单链融合多肽，其包含以下或由以下组成：HLA-Gα链的一个或多个α域(如，HLA-G1或HLA-G5亚型多肽的α1、α2和/或α3域；HLA-G2或HLA-G6亚型多肽的α1和α3域；HLA-G4亚型多肽的α1和α2域；HLA-G4亚型多肽的α1和α2域；或HLA-G3或HLA-G7多肽的α1域)和膜锚(如，GPA跨膜域)，其中单链融合多肽任选地连接至抗原性外源多肽。在一些实施方案中，HLA-G多肽不与外源多肽连接。HLA-G与各种免疫细胞(自然杀伤(NK)细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞等)上的抑制性受体相互作用。已经描述了三种HLA-G受体：ILT2/CD85j/LILRB1(ILT2)、ILT4/CD85d/LILRB2(ILT4)和KIR2DL4/CD158d(KIR2DL4)。ILT2由B细胞、某些T细胞、某些NK细胞和所有单核细胞/树突细胞表达，但是ILT4是髓样特异性的且仅由单核细胞/树突细胞表达。KIR2DL4主要限于NK细胞的CD56亮子集。ILT2和ILT4是抑制性受体，并且KIR2DL4也可能能够发送抑制性信号。通过与这些受体的相互作用，已显示HLA-G可抑制NK细胞和细胞毒性CD8+T细胞的细胞毒性功能，抑制NK和T细胞增殖，促进生成CD8+和CD4+调节性T细胞，并抑制DC成熟和抗原呈递。在一些实施方案中，包含HLA-G多肽的本文所述的外源抗原呈递多肽能够结合一种或多种HLA-G受体，如ILT4、ILT2和/或KIR2DL4(如，存在于NK细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞、单核细胞和/或树突细胞的表面)。
因此，本文所述的aAPC可抑制某些免疫细胞群体并抑制这些免疫细胞群体的活性，例如自然杀伤(NK)细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突细胞。在另一个实施方案中，本文所述的aAPC可激活或刺激其他免疫细胞群体，如调节性T细胞。
因此，本公开涉及aAPC，特别包含工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，该细胞含有至少一种外源抗原呈递多肽，其是HLA-E或HLA-G多肽。在一些实施方案中，aAPC还包括至少一种外源抗原性多肽。在一些实施方案中，外源抗原性多肽是自体肽，如HSP60肽的前导序列。在一些实施方案中，aAPC还包括至少一种Treg共刺激性多肽，如IL-15或IL-15/IL-15Ra融合多肽。在其他实施方案中，aAPC还包括一种或多种共刺激性多肽。在其他实施方案中，aAPC还包括一种或多种共抑制性多肽。
在一些实施方案中，aAPC经工程化改造以调节(如，激活)CD8+调节性T细胞及其特定群体(如，CD8+、CD122+、Ly49+调节性T细胞)的活性。在其他实施方案中，aAPC经工程化改造以调节(如，抑制)NK细胞、T细胞(如，细胞毒性CD8+T细胞)、B细胞、巨噬细胞和/或DC的活性。
在本公开的一些实施方案中，工程化红系细胞是工程化去核红系细胞，如网织红细胞或红细胞。在本公开的一些实施方案中，去核细胞(如，经修饰的去核细胞)是网织红细胞、红细胞或血小板。
受益于前述说明书和相关附图中呈现的教导，本公开所属领域的技术人员将容易想到本文阐述的APC的许多修饰和其他实施方案。因此，应当理解，本公开不限于所公开的特定实施方案，并且修改和其他实施方案旨在被包括在所附权利要求书的范围内。尽管本文采用了特定术语，但是它们仅以一般性和描述性意义使用，而不是出于限制的目的。
定义
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数引用，除非内容另外明确指出。
替代方案(如，“或”)的使用应理解为意指替代方案之一、两者或其任何组合。
如本文所用，术语“约”在指可测量值如量、持续时间等时，意在涵盖相对于指定值±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，且仍更优选地±0.1％的变化，因为此类变化适合于进行所公开的方法。
如本文所用，除非另有说明，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，以及在适当时其分数(如整数的十分之一和百分之一)。
如本文所用，“包含”意在与“包括”或“含有”同义，并且是包含性或开放性的术语，其指定了随后内容(例如组分)的存在，且不排除或阻止存在本领域已知的或其中公开的另外的未叙述的组分、特征、元件、成员、步骤。
如本文所用，术语“如”、“例如”等旨在指示例性实施方案，而不意图限制本公开的范围。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在实践中可使用与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料来测试本公开，但是本文描述了优选的材料和方法。
如本文所用，术语“密码子优化的”是指在不改变由核酸分子编码的多肽的情况下修改核酸分子的基因或编码区中的密码子以体现宿主生物体(如，人红系细胞)的典型密码子选择。这种优化包括用在宿主生物体的基因中更频繁使用的一个或多个密码子替换至少一个、多于一个或大量的密码子。密码子优化可改进从编码序列转录的转录本RNA分子在表达宿主细胞或生物体中的翻译，或改进编码序列的转录。密码子优化包括但不限于包括为编码序列选择密码子以适合表达宿主生物体的密码子偏好的过程。许多生物表现出偏向或偏好使用特定密码子来编码生长的多肽链中特定氨基酸的插入。密码子偏好或密码子偏向，即生物体之间密码子选择的差异，是遗传密码的简并性所允许的，并且在许多生物体中充分证明。密码子偏好通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，继而认为所述信使RNA(mRNA)的翻译效率尤其取决于被翻译的密码子特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。细胞中所选tRNA的优势通常反映了肽合成中最常用的密码子。因此，可基于密码子优化来定制基因以在给定生物体中进行最优基因表达。
如本文所用，“剂量”是指在给定时间内施用于受试者的特定量的药理学活性材料。除非另有说明，否则所述剂量是指包含如本文所述的HLA-E或HLA-G多肽的多个工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)。在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)的剂量是指工程化红系细胞的有效量。当提及施用剂量时，在本文提供的任何一种方法、组合物或试剂盒的实施方案中，本文提供的任何一种剂量是出现在标签/标签剂量上的剂量。
如本文所用，术语“抗原呈递细胞(APC)”是指可加工和展示与其表面上的主要组织相容性复合物(MHC)分子缔合的外来抗原的细胞。
如本文所用，术语“人工抗原呈递细胞(aAPC)”是指经工程化改造以引入一种或多种HLA-E或HLA-G多肽的细胞。在一些实施方案中，aAPC还包含与HLA-E或HLA-G多肽特异性结合的外源抗原性多肽。
如本文所用，术语“炎性疾病”通常是指以慢性或急性炎症为特征的疾病或病症。在各种实施方案中，炎性疾病是心脏炎性疾病、肝脏炎性疾病、胰腺炎性疾病、皮肤炎性疾病和/或胃肠(GI)道炎性疾病。例如，炎性疾病包括但不限于心肌炎、心肌病、心内膜炎、心包炎、肝硬化、哮喘(嗜酸性或非嗜酸性)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘和COPD重叠综合征(ACOS)、特应性皮炎、鼻息肉、变应性应答、慢性支气管炎、肺气肿、过敏性肺炎、变应性鼻炎、伴有或不伴有鼻息肉的慢性鼻鼻窦炎、炎症性肠病、肠易激综合征、回肠炎、慢性炎性肠病、纤维化、嗜酸性食管炎、血管炎、荨麻疹、Churg Strauss综合征和炎性痛。
如本文所用，术语“自身免疫性疾病”通常是指受试者的免疫系统攻击身体自身细胞，导致组织破坏或损伤的疾病或病症。特别地，在一些实施方案中，术语“自身免疫性疾病”包括由滤泡辅助T(Tfh)、Th1细胞和/或T辅助17(Th17)调节性T细胞的任何自身免疫性疾病(参见，例如Zhang et al.,JImmunol 2017,198(1Supplement)55.13；Jeon et al.,Immune Netw.2016,16(4):219–232；和Noack,et al.,Autoimmunity Reviews,13；6,2014:668-677)，其内容通过引用并入本文。例如，自身免疫性疾病包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、幼年特发性关节炎、类风湿性脊柱炎、强直性脊柱炎、骨关节炎、痛风性关节炎、银屑病关节炎、幼年类风湿性关节炎、I型糖尿病(T1D)、多发性硬化症(MS)、混合性结缔组织病症、移植物抗宿主病(GVHD)、自身免疫性葡萄膜炎、肾炎、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、疱疹性间质角膜炎(HSK)、哮喘、克罗恩病、溃疡性结肠炎、椎关节炎、活动性中轴脊柱关节炎(活动性axSpA)和非放射学中轴脊柱关节炎(nr-axSpA)、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、膜性肾小球肾炎、视神经脊髓炎、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、皮肌炎、巨细胞动脉炎、肉芽肿病伴多血管炎、川崎病、狼疮性肾炎、结节性多动脉炎、坏疽性脓皮病和高安动脉炎。
自身免疫性疾病可使用血液测试、脑脊液分析、肌电图(测量肌肉功能)和脑磁共振成像来诊断，但血液中的抗体检测对于自身抗体(或自体抗体)特别有用。通常，IgG类抗体与自身免疫性疾病有关。
如本文所用，术语“生物样品”是指从受试者分离的任何类型的生物来源的材料，包括例如DNA、RNA、脂质、碳水化合物和蛋白。术语“生物样品”包括从受试者分离的组织、细胞和生物流体。生物样品包括例如，但不限于全血、血浆、血清、精液、唾液、泪、尿液、粪便、汗液、口腔物(buccal)、皮肤、脑脊液、骨髓、胆汁、毛发、肌肉活检、器官组织或本领域普通技术人员已知的生物来源的其他材料。生物样品可从受试者获得用于诊断或研究，或可从健康受试者获得作为对照，或用于基础研究。
如本文所用，术语“点击反应”是指用于共价连接第一和第二部分的一系列反应，以方便产生连接产物。它通常具有以下一个或多个特征：它是快速，特异，高产率，高效，自发，不显著改变连接实体的生物相容性，具有高反应速率，产生稳定产物，有利于产生单一反应产物，具有高原子经济学，化学选择性，模块化，立体选择性，对氧不敏感，对水不敏感，高纯度，仅生成可通过非色谱方法(如，结晶或蒸馏)去除的无害或相对无毒性的副产物，不需要溶剂或可在良性或生理学相容的溶剂(如，水)中进行，在生理条件下稳定。实例包括炔烃/叠氮化物反应、二烯/亲二烯体反应或硫醇/烯烃反应。可使用其他反应。在一些实施方案中，点击反应是快速、特异和高产率的。
如本文所用，术语“点击柄(click handle)”是指在点击反应中能够与第二点击柄反应以产生点击特征(signature)的化学部分。在一些实施方案中，点击柄由偶联剂组成，并且偶联剂还可包含底物反应部分。
如本文所用，术语“细胞因子”是指由细胞分泌的对其他细胞具有多种作用的小的可溶性蛋白物质。细胞因子介导许多重要的生理功能，包括生长、发育、伤口愈合和免疫应答。它们如下起作用：通过与其位于细胞膜中的细胞特异性受体结合，这允许在细胞中开始独特的信号转导级联反应，其最终将导致靶细胞中发生生化和表型改变。细胞因子可在局部和远离释放部位起作用。它们包括I型细胞因子，其涵盖许多白介素以及几种造血生长因子；II型细胞因子，包括干扰素和白介素10；肿瘤坏死因子(“TNF”)相关分子，包括TNFα和淋巴毒素；免疫球蛋白超家族成员，包括白介素1(“IL-1”)；以及趋化因子(在极其多种免疫和炎症功能中起关键作用的分子家族)。取决于细胞状态，相同的细胞因子对细胞可具有不同的作用。细胞因子通常调节其他细胞因子的表达并触发其级联。细胞因子的非限制性实例包括，例如IL-1α、IL-β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12/IL-23P40、IL13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、TGF-β、IFN-γ、GM-CSF、Groα、MCP-1和TNF-α。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包括一种或多种细胞因子(如，IL-15)。在一些实施方案中，细胞因子包含膜锚域。在一些实施方案中，细胞因子存在于细胞表面。
如本文所用，术语“内源”意指化合物(如，小分子)或过程的天然形式。例如，在一些实施方案中，术语“内源”是指核酸或多肽在生物体或生物体基因组天然位置中的天然形式。
如本文所用，术语“工程化细胞”是经遗传修饰的细胞或其后代。
如本文所用，术语“去核细胞”是指缺乏细胞核(如，由于分化过程如红细胞生成)的细胞。在一些实施方案中，去核细胞不能表达多肽。在一些实施方案中，去核细胞为红细胞、网织红细胞或血小板。
如本文所用，“工程化去核细胞”是指源自经遗传修饰的有核细胞或其后代且缺乏细胞核(如，由于分化)的细胞。在一些实施方案中，工程化去核细胞包括由工程化去核细胞来源的经遗传修饰的有核细胞或其后代(如，在去核之前)产生的外源多肽。
如本文所用，“工程化红系细胞”是指经遗传修饰的红系细胞或其后代。工程化红系细胞包括工程化有核红系细胞(如，经基因修饰的红系前体细胞)和工程化去核红系细胞(如，源自经基因修饰的红系前体细胞的网织红细胞和红细胞)。
如本文所用，“工程化去核红系细胞”是指源自经遗传修饰的有核红系细胞或其后代且缺乏细胞核(如，由于分化)的红系细胞。在一些实施方案中，工程化去核红系细胞包含源自经遗传修饰的有核红系细胞或其后代的红细胞或网织红细胞。在一些实施方案中，工程化去核红系细胞并非源自永生化有核红系细胞或其后代。
如本文所用，“红系前体细胞”是指能够分化成网织红细胞或红细胞的细胞。通常，红系前体细胞是有核的。红系前体细胞包括脐带血干细胞、CD34+细胞、造血干细胞(HSC)、脾集落形成(CFU-S)细胞、共同髓系祖细胞(CMP)、胚细胞集落形成细胞、红系爆式集落形成单位(BFU-E)、巨核细胞-红系细胞祖细胞(MEP)、红系集落形成单位(CFU-E)、诱导型多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)，多染性正成红细胞和正染性正成红细胞。在一些实施方案中，红系前体细胞是永生或永生化细胞。例如，永生化成红细胞可通过CD34+造血祖细胞的逆转录病毒转导产生，以表达Oct4、Sox2、Klf4、cMyc并抑制TP53(例如，如Huang et al.(2014)Mol.Ther.22(2):451-63所述，其全部内容通过引用并入本文)。
如本文所用，术语“外源核酸”是指对细胞不是天然的，而是被引入到细胞或细胞祖细胞中的核酸(如，基因)。外源核酸可包括与对细胞天然的内源核酸同源或相同的区域或开放阅读框(如，基因)。在一些实施方案中，外源核酸包含RNA。在一些实施方案中，外源核酸包含DNA。在一些实施方案中，外源核酸整合到细胞基因组中。在一些实施方案中，外源核酸通过细胞机制加工以产生外源多肽。在一些实施方案中，外源核酸不会被引入外源核酸的细胞或作为该细胞后代的细胞所保留。
如本文所用，术语“外源多肽”是指被引入细胞中或细胞上的多肽，或者通过将编码外源多肽的外源核酸引入细胞或细胞的祖细胞中而导致由细胞表达的多肽。在一些实施方案中，外源多肽是由被引入细胞或细胞的祖细胞中的外源核酸编码的多肽，该核酸任选地不被细胞保留。在一些实施方案中，外源多肽是通过化学或酶促手段缀合至细胞表面的多肽。
如本文所用，术语“表达”是指产生多肽的过程，包括转录和翻译。细胞中特定多肽的表达可使用多种方法来增加，包括但不限于增加编码多肽的基因的拷贝数，增加基因的转录，以及增加编码多肽的mRNA的翻译。
如本文所用，关于外源多肽或核酸的术语“第一”、“第二”和“第三”等用于在存在超过一种类型的外源多肽或核酸时方便区分。除非明确说明，使用这些术语无意赋予外源多肽或核酸的特定顺序或方向。
如本文所用，术语“基因”广泛用于指与给定RNA或蛋白的表达相关的核酸的任何区段。因此，基因包括编码表达的RNA的区域(其通常包括多肽编码序列)，并且通常包括其表达所需的调节序列。基因可从多种来源获得，包括从感兴趣的来源进行克隆或从已知或预测的序列信息进行合成，并且可包括设计成具有特定期望参数的序列。
如本文所用，术语“核酸分子”是指脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。它包括但不限于染色体DNA、质粒、载体、mRNA、tRNA、siRNA等，它们可以是重组的，并且当核酸被引入细胞时可从中表达外源多肽。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括在所用剂量和/或浓度下对暴露于其的哺乳动物无毒或无害的任何标准药用赋形剂、载体或稳定剂。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用来指氨基酸残基的聚合物。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”还包括修饰，包括但不限于糖基化、磷酸化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP-核糖基化。应当理解，如众所周知和如上所述，多肽可能不完全是线性的。例如，多肽可能由于泛素化而产生分支，它们可能是环状的，有或没有分支，通常是翻译后事件的结果，包括自然加工事件和非自然发生的由人操作引起的事件。
如本文所用，本文称为“重组”的多肽是指通过重组DNA方法产生的多肽，包括通过依赖于人工重组方法的程序产生的那些，例如聚合酶链反应(PCR)和/或使用限制酶克隆到载体中。
如本文所用，术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，并且指需要诊断、治疗或治疗的任何哺乳动物受试者，特别是人。本文所述的方法适用于人类治疗和兽医应用。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物(如，人受试者)。
如本文所用，术语“治疗有效量”和“有效量”可互换使用，是指足以提供预期益处的活性剂(如，本文所述的工程化红系细胞或去核细胞)的量，例如防止、预防、延迟症状发作或改善病症(如，自身免疫性疾病、炎性疾病、传染性疾病或变应性病症)的症状。在预防或预防性应用中，可向易患疾病、障碍或病症(如，自身免疫性疾病、炎性疾病、传染性疾病或变应性病症)或处于发展这样疾病、病症或病症风险的受试者施用有效量来消除或降低疾病、病症或病症的风险、减轻严重性或延迟发作，包括疾病、病症或病症、其并发症及中间病理表型的生化、组织学和/或行为症状。术语“剂量”和“用量”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“治疗效果”是指治疗的结果，其结果被认为是期望且有益的。治疗效果可包括直接或间接地阻止、减少或消除疾病表现。治疗效果还可包括直接或间接地抑制或消除疾病表现的进展。
对于本文所述的任何治疗剂，可使用初步体外研究和/或动物模型最初确定治疗有效量。还可从人类临床数据确定治疗有效量。可基于所施用药剂的相对生物利用度和效力来调整所施用的剂量。基于上述方法和其他已知方法调整剂量以实现最大功效在普通技术人员的能力范围内。确定治疗效果的一般原则，可以在Goodman和Gilman的ThePharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill(New York)(2001)的第1章中找到，通过引用并入本文。
如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转障碍、疾病或病症(如，自身免疫性疾病、炎性疾病、传染性疾病或变应性病症)，显著改善障碍、疾病或病症的临床症状，或基本上预防障碍、疾病或病症的临床症状的出现，获得有益或期望的临床结果。治疗还指完成以下一项或多项：(a)减轻障碍、疾病或病症(如，自身免疫性疾病、炎性疾病、传染性疾病或变应性病症)的严重程度；(b)限制正在治疗的障碍、疾病或病症的特征症状的发展；(c)限制正在治疗的障碍、疾病或病症的特征症状的恶化；(d)限制先前患有障碍、疾病或病症的受试者中障碍、疾病或病症的复发；(e)限制先前无障碍、疾病或病症症状的受试者的症状复发。
有益或期望的临床结果，如药理学和/或生理学效果，包括但不限于防止可能易患疾病、障碍或病症但尚未经历过疾病、障碍或病症的受试者发生或表现出疾病的症状(预防性治疗)，减轻疾病、障碍或病症的症状，减轻疾病、障碍或病症的程度，使疾病、障碍或病症稳定(即，不恶化)，防止传播疾病、障碍或病症，延迟或减缓疾病、障碍或病症的进展，改善或缓解疾病、障碍或病症，以及它们的组合，以及与未接受治疗的预期存活相比延长存活。
如本文所用，术语多肽的“变体”是指与参考多肽相比具有至少一个氨基酸残基差异的多肽，例如，一个或多个取代、插入或缺失。在一些实施方案中，变体具有与该多肽至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性百分比。变体可包括片段(如，多肽的酶促活性片段(如，酶)。在一些实施方案中，与全长多肽相比，片段在多肽的N端、C端或两端(各自独立地)可缺少多达约1、2、3、4、5、10、20、30、40、50或100个氨基酸残基有。变体可以天然存在或非天然存在。非天然存在的变体可使用本领域已知的诱变方法产生。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。
如本文所用，关于核酸和氨基酸序列的术语“序列同一性”或“同一性”是指候选序列中在比对序列并在必要时引入空位以获得最大的序列同一性百分比，且不考虑任何保守替代作为序列同一性的一部分后，与参考序列的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸百分比。除了手动之外，用于比较的序列的最佳比对通过以下方法产生：Smith和Waterman(1981,Ads App.Math.2,482)的局部同源性算法，通过Neddleman和Wunsch(1970,J.Mol.Biol.48,443)的局部同源性算法，通过Pearson和Lipman(1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,2444)的相似性搜索方法，或通过使用这些算法的计算机程序(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wis.)。
如本文所用，术语“抗原性多肽”是指能够结合外源抗原呈递多肽的外源多肽。在一些实施方案中，抗原性多肽与外源抗原呈递多肽一起能够诱导免疫应答。
如本文所用，术语“致耐受性多肽”是可促进免疫耐受的任何肽。这些致耐受性效应包括但不限于T细胞的调节，如诱导T细胞无应答、T细胞凋亡和诱导Treg。示例性致耐受性多肽在表1中列出。
如本文所用，术语“外源抗原呈递多肽”是指细胞表面蛋白HLA-E和HLA-G，它们能够结合抗原并将它们展示在细胞表面上以供适当的免疫细胞识别。
术语“HLA-E多肽”、“HLA-E分子”或“HLA-E”(又被称为HLA I类组织相容性抗原，α链E)是指包含α重链(包含一个或多个α1、α2和α3域)的非经典MHC I类分子。HLA-E的全长α重链约为45kDa，其基因包含8个外显子。外显子1编码前导肽，外显子2和3编码与肽结合的α1和α2域，外显子4编码α3域，外显子5编码跨膜区，外显子6和7编码胞质尾。如本文所述，HLA-E多肽可包含少于所有三个内源性α域(即，HLA-E多肽可包含一个、两个或三个α域；在本文中又被称为α重域)。在一些实施方案中，HLA-E多肽包含天然存在的HLA-E多肽的胞外域(如，α1、α2和α3域)并且不包括天然存在的HLA-E多肽的跨膜域和胞质尾。在一些实施方案中，HLA-E多肽包含天然存在的HLA-E多肽的胞外域(如，α1、α2和α3域)并融合至膜锚(如，血型糖蛋白A(GPA)跨膜域)。在一些实施方案中，HLA-E多肽包含天然存在的HLA-E多肽的胞外域(如，α1、α2和α3域)，并且融合至包含HLA-E胞质域的膜锚(如，GPA跨膜域)。如本文所述，HLA-E多肽还包括重α链结合或连接至轻链(即，β-2微球蛋白或β2M多肽)以形成异源二聚体(如，作为单链融合多肽)。在一些实施方案中，HLA-E多肽结合或被结合至外源抗原性多肽和/或被连接或融合至膜锚。在一些实施方案中，HLA-E多肽包含“HLA-E单链融合多肽”，其中HLA-E多肽包含连接至β2M多肽的HLA-E重链的一个或多个α域(如，α1、α2和α3域)，并且任选地β2M多肽与外源抗原性多肽连接。在一些实施方案中，单链融合多肽包括膜锚。
HLA-E在所有MHC I类基因中的多态性最少，仅提供编码三种不同蛋白的11个等位基因(国际免疫遗传学数据库，3.12.0版)。总体而言，已在不同人群中描述了三个等位基因组(HLA-E*01:01、HLA-E*01:03和HLA-E*01:04)。然而，在全球人群中仅发现两个等位基因组(HLA-E*01:01和HLA-E*01:03)。密码子107处的A/G变异定义了HLA-E*01:01和HLA-E*01:03(参见，例如万维网hla.alleles.org/data/txt/e_nuc.txt)，结果是在HLA-E*01:01(HLA-E107R)的位点107处的精氨酸被HLA-E*01:03(HLA-E107G)中的甘氨酸取代(参见，例如Zheng et al.,Cancer Sci.2015May；106(5):522-528)。细胞表面上的HLA-E肽复合物可激活CD8调节性T细胞。调节性T细胞有助于抑制其他免疫细胞，包括Tfh、Th1细胞和Th17细胞，已知这些细胞触发自身免疫(参见Wieten et al.Tissue Antigens,2014,84,523-535)。
术语“HLA-G多肽”、“HLA-G分子”或“HLA-G”(又被称为HLA I类组织相容性抗原，α链G)是指包含含有一个或多个α1、α2和α3域的α重链的非经典MHC I类分子。HLA-G的全长α重链约为45kDa，其基因包含8个外显子。外显子1编码前导肽，外显子2和3编码与肽结合的α1和α2域，外显子4编码α3域，外显子5编码跨膜区，外显子6编码胞质尾。如本文所述，HLA-G多肽可包含少于所有三个内源α域(即，HLA-G多肽可包含一个、两个或三个α域；在本文中又被称为α重域)。在一些实施方案中，HLA-G多肽包含天然存在的HLA-G多肽的胞外域(如，一个或多个α1、α2和α3域)并且排除天然存在的HLA-G多肽的跨膜域和胞质尾。例如，在一些实施方案中，HLA-G多肽包含HLA-G1或HLA-G5亚型多肽的α1、α2和α3域。在一些实施方案中，HLA-G多肽包含HLA-G2或HLA-G6亚型多肽的α1和α3域。在一些实施方案中，HLA-G多肽包含HLA-G4亚型多肽的α1和α2域。在一些实施方案中，HLA-G2多肽包含HLA-G4亚型多肽的α1和α2域。在一些实施方案中，HLA-G多肽包含HLA-G3或HLA-G7多肽的α1域。在一些实施方案中，HLA-G多肽包含天然存在的HLA-G多肽的胞外域(如，一个或多个α1、α2和α3域)并且融合至膜锚(如，血型糖蛋白A(GPA)跨膜域)。在一些实施方案中，HLA-G多肽包含天然存在的HLA-G多肽的胞外域(如，一个或多个α1、α2和α3域)，并且融合至包含HLA-G胞质域的膜锚(如，GPA跨膜域)。如本文所述，HLA-G多肽还包括HLA-G重链结合或连接至轻链(即β-2微球蛋白或β2M多肽)以形成异源二聚体(如，作为单链融合蛋白多肽)。在一些实施方案中，HLA-G多肽未结合或连接至轻链(即，β2M多肽)。在一些实施方案中，HLA-G多肽结合或被结合至外源抗原性多肽，和/或连接至膜锚。在一些实施方案中，HLA-G多肽包含“HLA-G单链融合多肽”，其中HLA-G多肽包含一个或多个α域(如，α1、α2和α3域)连接至β2M多肽的HLA-G重链，并且任选地β2M多肽连接至外源抗原性多肽。在一些实施方案中，单链融合多肽包括膜锚。
HLA-G通常在胎儿来源的胎盘细胞上表达。HLA-G包含约50个等位基因，编码16种不同的全长蛋白、两种截短蛋白和7种亚型，包括HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4、HLA-G5、HLA-G6和HLA-G7(Carosella,Blood 2008,11；10,4862)。膜结合HLA-G1分子及其可溶性对应物HLA-G5具有相同的细胞外结构，这是经典的HLA I类样：3个球状域的重链与β2M多肽非共价结合。其他亚型结构更简单：缺少一个或两个球状域，它们更小，不应结合β2M多肽或呈递肽。在一些实施方案中，包含在如本文所述的aAPC上的HLA-G亚型是HLA-G1或HLA-G2亚型。在一些实施方案中，包含在本文所述的aAPC上的HLA-G亚型是与GPA融合以将分子锚定到细胞膜的可溶性HLA-G5或HLA-G6亚型。HLA-G多聚体，如二聚体，也可包括在本文所述的aAPC细胞上。最常见的HLA-G等位基因是HLA-G1*01:01:01:01等位基因。
本文更详细地描述了外源抗原呈递多肽HLA-E和HLA-G。
如本文所用，术语“共刺激性多肽”是指抗原呈递细胞(如，aAPC)上的任何多肽，其特异性结合免疫细胞(如，MHC分子、B和T淋巴细胞衰减剂(CD272)和Toll样受体)，从而提供除了通过结合包括外源抗原性多肽的外源抗原呈递多肽提供的主要信号之外的信号，介导免疫细胞(如，T细胞)反应，包括但不限于免疫细胞的增殖、激活、分化等。共刺激性多肽尤其还包括与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体。下面更详细地描述了示例性外源共刺激性多肽。
如本文所用，术语“外源共抑制性多肽”是指阻抑免疫细胞的任何多肽，包括抑制免疫细胞活性、抑制免疫细胞增殖、激发免疫细胞或诱导免疫细胞凋亡。下面更详细地描述了示例性外源共抑制性多肽。
如本文所用，术语“Treg共刺激性多肽”是指扩增调节性T细胞(Treg)的外源多肽。在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽通过刺激参与Treg细胞发育的三种信号中的至少一种来刺激Treg细胞。下面更详细地描述了示例性外源Treg共刺激性多肽。
如本文所用，术语“足以刺激免疫细胞”是指促进免疫细胞的细胞反应的信号传导事件或刺激物的量或水平，例如外源刺激性多肽。
如本文所用，术语“激活免疫细胞”或“免疫细胞激活”是指引起或导致免疫细胞的一种或多种细胞反应的过程(如，信号事件)，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒效应分子释放、细胞毒活性和激活标记物的表达。如本文所用，已接收激活信号的免疫细胞表现出一种或多种细胞反应，选自增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和激活标记物的表达。测量免疫细胞激活的合适方法是本领域已知的并且在本文中描述。
如本文所用，术语“扩增免疫细胞”或“免疫细胞扩增”是指免疫细胞经历一系列细胞分裂从而扩增细胞数量的过程。测量免疫细胞扩增的合适方法是本领域已知的并且在本文中描述。
如本文所用，术语“激活”、“刺激”、“增强”、“增加”和/或“诱导”(以及类似术语)可互换使用，通常是指直接或间接地改进或增加相对于自然、预期或平均或相对于对照状况的浓度、水平、功能、活性或行为的动作。“激活”是指通过细胞表面部分的连接诱导的主要应答。例如，在受体的上下文中，此类刺激需要受体的连接和随后的信号转导事件。关于T细胞的刺激，此类刺激是指T细胞表面部分的连接(如，结合TCR/CD3复合物)，其在一些实施方案中随后诱导信号转导事件。此外，刺激事件可以激活细胞并上调或下调分子的表达或分泌。因此，即使在不存在直接的信号转导事件的情况下，细胞表面部分的连接也可导致细胞骨架结构的重组，或在细胞表面部分聚结，其每一个都可用来增强、修饰或改变随后的细胞应答。“激活”包括CD8+T细胞的激活、CD4+T细胞的激活、T细胞的细胞毒性活性的刺激、T细胞的细胞因子分泌的刺激、可检测的效应功能、T细胞分化状态的修饰(例如促进扩增和从T效应细胞至T记忆细胞的分化)，和/或其任何组合。术语“激活的T细胞”尤其是指正在进行细胞分裂的T细胞。
如本文所用，术语“阻抑”、“降低”、“干扰”、“抑制”和/或“减少”(以及类似术语)通常是指直接或间接减少相对于自然、预期或平均或相对于对照状况的浓度、水平、功能、活性或行为的动作。
如本文所用，术语“阻抑免疫细胞”或“抑制免疫细胞”是指引起或导致抑制或阻抑免疫细胞的一种或多种细胞应答或活性或导致免疫细胞无应答化或诱导免疫细胞凋亡的过程(如，信号传导事件)，所述细胞反应或活性选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和激活标志物的表达。用于测量免疫细胞抑制或阻抑的合适测定法是本领域已知的并且在本文中描述。
如本文所用，“调节的免疫应答”是指改变免疫应答的形式或特征，例如刺激或抑制免疫应答，例如，如通过ELISPOT测定(细胞免疫应答)、ICS(细胞内细胞因子染色测定)和主要组织相容性复合物(MHC)四聚体测定法来测定，以检测和量化抗原特异性T细胞，定量抗原特异性CD4+T细胞的血液群体，或以可测量的量定量抗原特异性CD8+T细胞的血液群体，或其中与合适的对照相比时增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少100％。
I.免疫系统的细胞
存在大量组成免疫系统的细胞相互作用。这些相互作用通过在两个方向上进行信号传导的特定受体-配体对发生，因此每个细胞都基于那些信号的时间和空间分布接收指令。
免疫系统的细胞包括淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、密切相关的朗格汉斯细胞、自然杀伤(NK)细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和髓样细胞系的其他成员。另外，一系列特化上皮细胞和基质细胞提供了通常通过分泌调节免疫系统细胞中生长和/或基因激活的关键因子发生免疫的组织环境，其在应答的诱导和效应阶段也起着直接作用(Paul,W.E.,“第1章:Theimmune system:an introduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999),第102页)。
免疫系统的细胞存在于周围组织化的组织中，如脾、淋巴结，肠的潘氏(Peyer’s)斑和扁桃体。淋巴细胞还存在于它们经历发育步骤的中央淋巴样器官、胸腺和骨髓中，所述发育步骤装备它们以介导成熟免疫系统的无数应答。很大一部分淋巴细胞和巨噬细胞组成了血液和淋巴中存在的循环细胞库，从而提供了将免疫活性细胞递送至需要它们的部位并允许局部生成的免疫力变得普遍化的途径(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:anintroduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-RavenPublishers,Philadelphia,(1999),在102页)。
术语“淋巴细胞”是指小的白细胞，其在全身淋巴组织中形成，并且在正常成年人中约占循环血液白细胞总数的22-28％，其在保护身体免受疾病中起着重要作用。个别淋巴细胞是特化的，因为它们定型为通过其遗传物质的重组(如，以产生T细胞受体和B细胞受体)来响应有限的一组结构相关抗原。在免疫系统与给定抗原首次接触之前存在的这种定向通过淋巴细胞表面膜上抗原上决定簇(表位)的特异性受体的存在来表达。每个淋巴细胞都具有独特的受体群，所有受体都具有相同的结合位点。一组淋巴细胞或淋巴细胞的克隆在其受体结合区的结构上与另一克隆不同，并且因此在其可识别的表位中有所不同。淋巴细胞不仅在其受体的特异性上彼此不同，而且在其功能上也不同(Paul,W.E.,“第1章:Theimmune system:an introduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999),在102页)。
公认的淋巴细胞有两大类：作为抗体分泌细胞前体的T淋巴细胞(T细胞)和B淋巴细胞(B细胞)。
调节性T(Treg)细胞
免疫稳态是通过免疫应答的启动和下调之间的受控平衡来维持的。凋亡和T细胞无应答机制(在遇到抗原后T细胞本质上功能失活的耐受机制(Scwartz,R.H.,“T cellanergy”,Annu.Rev.Immunol.,Vol.21:305-334(2003))有助于免疫应答的下调。第三种机制是通过抑制性或调节性CD4+T(Treg)细胞主动抑制激活的T细胞而提供的(综述于Kronenberg,M.et al.,“Regulation of immunity by self-reactive T cells”,Nature,Vol.435:598-604(2005))。组成性表达IL-2受体α(IL-2Rα)链(CD4+CD25+)的CD4+Treg是天然存在的T细胞亚组，其是无应答且抑制性的(Taams,L.S.et al.,“Human anergic/suppressive CD4+CD25+T cells:a highly differentiated and apoptosis-pronepopulation”,Eur.J.Immunol.Vol.31:1122-1131(2001))。耗竭CD4+CD25+Treg导致小鼠中系统性自身免疫性疾病，此外，这些Treg的转移预防自身免疫性疾病的发展。人CD4+CD25+Treg与其鼠对应物相似，在胸腺中生成，并且其特征在于通过细胞-细胞接触依赖性机制抑制响应者T细胞的增殖，无法产生IL-2以及体外的无应答表型。根据CD25的表达水平，人CD4+CD25+T细胞可分为抑制性(CD25高)和非抑制性(CD25低)细胞。叉头(forkhead)转录因子家族的成员FOXP3已显示在鼠和人CD4+CD25+Treg中表达，并且似乎是控制CD4+CD25+Treg发育的主要基因(Battaglia,M.et al.,“Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+Foxp3+regulator T cells of both healthy subjects and type 1diabeticpatients”,J.Immunol.,Vol.177:8338-8347,(2006))。
T淋巴细胞
T淋巴细胞来源于造血组织中的前体，在胸腺中经历分化，然后接种至外周淋巴样组织和循环的淋巴细胞库。T淋巴细胞或T细胞介导各种免疫学功能。这包括帮助B细胞发育为抗体产生细胞的能力、增加单核细胞/巨噬细胞杀微生物作用的能力、抑制某些类型的免疫应答、直接杀伤靶细胞和动员炎性反应。这些作用依赖于特异性细胞表面分子的T细胞表达和细胞因子的分泌(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction”,Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
T细胞与B细胞在其识别抗原的机制上不同。B细胞的受体免疫球蛋白与可溶性分子或颗粒表面上的个别表位结合。B细胞受体识别天然分子表面表达的表位。抗体和B细胞受体经演化以与细胞外液中的微生物结合并对细胞外液中的微生物提供保护，而T细胞识别其他细胞表面的抗原并通过与这些抗原呈递细胞(APC)相互作用并改变其行为来介导其功能。可激活T细胞的外周淋巴样器官中的APC主要有三种类型：树突细胞、巨噬细胞和B细胞。这些中最有效力的是树突细胞，其唯一功能是将外来抗原呈递至T细胞。未成熟的树突细胞位于整个身体的组织中，包括皮肤、肠道和呼吸道。当它们在这些部位遇到入侵的微生物时，其吞噬病原体及其产物，并经由淋巴将其携带至局部淋巴结或肠相关的淋巴样器官。遇到病原体诱导树突细胞从抗原捕获细胞成熟到可激活T细胞的APC。APC在其表面上展示出三种类型的蛋白分子，它们具有激活T细胞成为效应细胞的作用：(1)MHC蛋白，其将外来抗原呈递至T细胞受体；(2)共刺激性蛋白，其与T细胞表面上的互补受体结合；和(3)细胞-细胞粘附分子，其使T细胞能够与APC结合足够长以被激活(“第24章:The adaptive immunesystem,”Molecular Biology of the Cell,Alberts,B.et al.,Garland Science,NY,(2002))。
T细胞基于其表达的细胞表面受体细分为两种不同类别。大多数T细胞表达由α链和β链组成的TCR。小部分T细胞表达由γ链和δ链组成的受体。在α/βT细胞中有2个亚系：表达共受体分子CD4的T细胞(CD4+T细胞)和表达CD8的T细胞(CD8+T细胞)。这些细胞的差异在于它们如何识别抗原以及其效应物和调节功能。
CD4+T细胞是免疫系统的主要调节细胞。它们的调节功能取决于它们的细胞表面分子(如，CD40配体，当T细胞激活时其表达被诱导)的表达，以及它们在激活时分泌的各种细胞因子。
T细胞也介导重要的效应功能，其中一些取决于它们所分泌的细胞因子的模式。细胞因子对靶细胞可以是直接有毒性的并且可以动员有力的炎症机制。
此外，T细胞(尤其是CD8+T细胞)可发育为能够有效裂解表达CTL识别的抗原的靶细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:anintroduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-RavenPublishers,Philadelphia,(1999))。
T细胞受体(TCR)识别由通过蛋白水解与II类或I类MHC蛋白的特化沟结合的抗原衍生的肽组成的复合物。CD4+T细胞仅识别肽/II类复合物，而CD8+T细胞识别肽/I类复合物(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
TCR的配体(即肽/MHC蛋白复合物)是在APC内形成的。通常，II类MHC分子结合由APC通过内吞过程摄取的蛋白衍生的肽。然后，将这些载有肽的II类分子在细胞表面上表达，在那里它们可用于被具有能够识别表达的细胞表面复合物的TCR的CD4+T细胞结合。因此，CD4+T细胞特化为与衍生自细胞外来源的抗原发生反应(Paul,W.E.,“第1章:Theimmune system:an introduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
相比之下，I类MHC分子主要负载有衍生自内部合成蛋白(如，病毒蛋白)的肽。这些肽是通过蛋白体的蛋白水解由胞质蛋白产生并被转运到粗面内质网中。这类肽(通常由长度为九个氨基酸组成)结合到I类MHC分子中，并被带到细胞表面，在那里它们可由表达适当受体的CD8+T细胞识别。这给予T细胞系统(特别是CD8+T细胞)检测表达此类蛋白的细胞的能力，该蛋白不同于生物体其余部分的细胞的蛋白(如，病毒抗原)或突变体抗原(如，活性癌基因产物)，或者以比生物体其余部分的细胞的蛋白(如，病毒抗原)或突变体抗原(如，活性癌基因产物)大得多的量产生，即使这些蛋白以其完整形式既不在细胞表面表达也不被分泌(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction,”FundamentalImmunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
T细胞也可基于其功能分类为辅助T细胞；参与诱导细胞免疫的T细胞；抑制性T细胞；和细胞毒性T细胞。
辅助T细胞
辅助T细胞是刺激B细胞对蛋白和其他T细胞依赖性抗原产生抗体应答的T细胞。T细胞依赖性抗原是免疫原，其中个别表位仅出现一次或有限次数，使得它们无法交联B细胞的膜免疫球蛋白(Ig)或无效地交联。B细胞通过其膜Ig结合抗原，并且复合物经历内吞。在内体和溶酶体区室中，抗原通过蛋白水解酶片段化为肽，并且一种或多种生成的肽被加载到II类MHC分子中，该分子通过该囊泡区室进行运输。然后将所得的肽/II类MHC复合物输出至B细胞表面膜。具有对肽/II类分子复合物特异性的受体的T细胞识别B细胞表面上的该复合物(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction,”FundamentalImmunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia(1999))。
B细胞激活取决于T细胞通过其TCR的结合以及T细胞CD40配体(CD40L)与B细胞CD40的相互作用。T细胞不组成性表达CD40L。相反，CD40L表达作为与表达由T细胞的TCR识别的关联抗原和CD80或CD86两者的APC相互作用的结果而受到诱导。CD80/CD86通常由激活但不静止的B细胞表达，因此涉及激活的B细胞和T细胞的辅助相互作用可导致有效的抗体产生。但是，在许多情况下，T细胞CD40L的初始诱导取决于它们对组成型表达CD80/86的APC(如树突细胞)表面上抗原的识别。然后，此类激活的辅助T细胞可有效地与B细胞相互作用并帮助B细胞。即使效率低下，B细胞膜Ig的交联也可与CD40L/CD40相互作用协同以产生强力的B细胞激活。B细胞应答的后续事件(包括增殖、Ig分泌和所表达的Ig类的类别转换)取决于T细胞衍生的细胞因子的作用或被其增强(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:anintroduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-RavenPublishers,Philadelphia,(1999))。
CD4+T细胞倾向于分化为主要分泌细胞因子IL-4、IL-5、IL-6和IL-10的细胞(TH2细胞)，或者分化为主要产生IL-2、IFN-γ和淋巴毒素的细胞(TH1细胞)。TH2细胞在帮助B细胞发育为产生抗体的细胞方面非常有效，而TH1细胞则是细胞免疫应答的有效诱导剂，涉及单核细胞和巨噬细胞杀微生物活性的增强，并因此提高了细胞内囊泡区室中微生物裂解的效率。尽管具有TH2细胞表型(即IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)的CD4+T细胞是有效的辅助细胞，但TH1细胞也具有作为辅助者的能力(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:anintroduction,“Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-RavenPublishers,Philadelphia,(1999))。
T细胞参与细胞免疫诱导
T细胞还可发挥作用以增强单核细胞和巨噬细胞破坏细胞内微生物的能力。特别是，辅助T细胞产生的干扰素-γ(IFN-γ)增强单个核吞噬细胞破坏细胞内细菌和寄生物的几种机制，包括一氧化氮的生成和肿瘤坏死因子(TNF)产生。由于TH1细胞产生IFN-γ，因此其有效增强杀微生物作用。相反，TH2细胞产生的两种主要细胞因子IL-4和IL-10阻断了这些活性(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction,”FundamentalImmunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
细胞毒性T淋巴细胞
识别来自靶细胞内产生的蛋白的肽的CD8+T细胞具有细胞毒性特性，因为它们导致靶细胞的裂解。CTL诱导的裂解机制涉及通过CTL产生穿孔蛋白，所述穿孔蛋白是可插入到靶细胞膜中并促进该细胞裂解的分子。穿孔蛋白介导的裂解被颗粒酶增强，所述颗粒酶是激活的CTL产生的一系列酶。许多活性CTL还在其表面表达大量的fas配体。CTL表面的fas配体与靶细胞表面的fas的相互作用启动靶细胞的凋亡，从而导致这些细胞的死亡。CTL介导的裂解似乎是破坏病毒感染细胞的主要机制。
淋巴细胞激活
术语“激活”或“淋巴细胞激活”是指通过特异性抗原、非特异性分裂素或同种异体细胞刺激淋巴细胞，从而导致RNA、蛋白和DNA的合成以及淋巴因子的产生；随后是各种效应细胞和记忆细胞的增殖和分化。T细胞激活取决于TCR/CD3复合物与其关联配体的相互作用，所述关联配体是结合在I类或II类MHC分子沟中的肽。通过受体衔接而运动的分子事件是复杂的。最早的步骤之一似乎是酪氨酸激酶的激活，导致一组控制若干信号传导途径的底物的酪氨酸磷酸化。这些包括一组将TCR连接至ras通路的衔接蛋白，即磷脂酶Cγ1，其酪氨酸磷酸化增加其催化活性并参与肌醇磷脂代谢途径，从而导致细胞内游离钙浓度升高和蛋白激酶C的激活，以及控制细胞生长和分化的一系列其他酶。除了受体衔接外，T细胞的完全应答性还需要辅助性细胞递送的共刺激性活性，例如通过APC的CD80和/或CD86衔接T细胞的CD28。
T记忆细胞
通过适应性免疫应答识别并根除病原体后，绝大多数(90-95％)的T细胞经历凋亡，其余细胞形成记忆T细胞库，被称为中央记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM)和驻留记忆T细胞(TRM)(Clark,R.A.,“Resident memory T cells in human health anddisease”,Sci.Transl.Med.,7,269rv1,(2015))。CD45RA在初始T细胞以及CD4和CD8两者中的效应细胞上表达。经历抗原后，中央和效应记忆T细胞获得CD45RO的表达且缺失CD45RA的表达。因此，通常使用CD45RA或CD45RO区分初始群体与记忆群体。CCR7和CD62L是另两个可用于区分中央和效应记忆T细胞的标志物。初始和中央记忆细胞表达CCR7和CD62L，以迁移至次级淋巴样器官。因此，初始T细胞为CD45RA+CD45RO–CCR7+CD62L+，中央记忆T细胞为CD45RA–CD45RO+CCR7+CD62L+，并且效应记忆T细胞为CD45RA–CD45RO+CCR7–CD62L–。
与标准T细胞相比，这些记忆T细胞寿命长，具有独特的表型，如特异性表面标志物的表达，不同细胞因子谱的快速产生，直接效应细胞功能的能力以及独特的归巢分布模式。记忆T细胞在重新暴露于其各自的抗原后表现出快速反应以消除冒犯者的再感染，从而迅速恢复免疫系统的平衡。越来越多的证据证实，自身免疫记忆T细胞阻碍了大多数治疗或治愈自身免疫性疾病的尝试(Clark,R.A.,“Resident memory T cells in human healthand disease”,Sci.Transl.Med.,Vol.7,269rv1,(2015))。
B淋巴细胞
B淋巴细胞衍生自骨髓的造血细胞。成熟B细胞可用表达被其细胞表面识别的表位的抗原激活。激活过程可以是直接的，取决于通过抗原的膜Ig分子的交联(交联依赖性B细胞激活)，或者是间接的，在称为关联辅助的过程中经由与辅助T细胞的相互作用。在许多生理情况下，受体交联刺激和关联辅助协同以产生更强力的B细胞应答(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction,”Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
交联依赖性B细胞激活需要抗原表达与细胞表面受体结合位点互补的表位的多个拷贝，因为每个B细胞表达具有相同的可变区的Ig分子。通过具有重复表位的其他抗原，如微生物的荚膜多糖或病毒包膜蛋白，满足此类需求。交联依赖性B细胞激活是针对这些微生物的主要保护性免疫应答(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction”,Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
关联辅助允许B细胞针对无法交联受体的抗原发出应答，并且同时提供共刺激性信号，其在B细胞受到弱交联事件刺激时挽救其免于失活。关联辅助依赖于B细胞膜免疫球蛋白(Ig)对抗原的结合，抗原的内吞作用及其在细胞的内体/溶酶体区室内片段化成肽。一些所得的肽被加载到一组特化的细胞表面蛋白的沟中，该蛋白被称为II类主要组织相容性复合物(MHC)分子。所得的II类/肽复合物在细胞表面表达，并充当一组T细胞(被称为CD4+T细胞)的抗原特异性受体的配体。CD4+T细胞在其表面具有B细胞II类/肽复合物特异性的受体。B细胞激活不仅依赖于T细胞通过其T细胞受体(TCR)的结合，而且这种相互作用还允许T细胞的激活配体(CD40配体)与其在B细胞上的受体(CD40)结合，从而信号传导B细胞激活。此外，T辅助细胞通过结合B细胞的细胞因子受体来分泌几种调节受刺激的B细胞的生长和分化的细胞因子(Paul,W.E.,“第1章:The immune system:an introduction,“Fundamental Immunology,第4版,Ed.Paul,W.E.,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
在产生抗体的关联辅助期间，CD40配体在激活的CD4+T辅助细胞瞬时表达，并且它与抗原特异性B细胞的CD40结合，从而转导第二共刺激性信号。后一信号通过防止已遇到抗原的生发中心B细胞的凋亡对于B细胞生长和分化以及生成记忆B细胞至关重要。B和T细胞两者中CD40配体的超表达与人SLE患者的致病性自身抗体产生有关(Desai-Mehta,A.etal.,“Hyperexpression of CD40 ligand by B and T cells in human lupus and itsrole in pathogenic autoantibody production,”J.Clin.Invest.Vol.97(9),2063-2073,(1996))。
II.人工抗原呈递细胞(aAPC)
本公开的特征在于aAPC，包含工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，该细胞经工程化改造以包含含有HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽和/或含有HLA-G的外源抗原呈递多肽，并且以激活或抑制特定的免疫细胞群体。在一些实施方案中，细胞经工程化改造以包含含有HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽，并且激活调节性T细胞。在一些实施方案中，细胞经工程化改造以包含含有HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽，并且抑制某些免疫细胞，如NK细胞或细胞毒性CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞经工程化改造以包含含有HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽，并抑制某些免疫细胞，如自然杀伤(NK)细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞和/或树突细胞(DC)。
一方面，本公开提供了包含含有HLA-E多肽或HLA-G多肽的抗原呈递多肽的工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)。
熟练技术人员会理解，基于本文提供的公开内容，一旦配备了本文提供的教导，就可使用多种免疫调节分子来产生aAPC。即，本领域中存在关于涉及免疫细胞激活和诱导的事件和分子的广泛知识，例如激活调节性T细胞，或抑制免疫细胞如自然杀伤(NK)细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞和/或树突细胞(DC)。
在一些方面，本公开提供了aAPC，包含工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，该细胞含有一种或多种外源多肽。本公开的外源多肽包括但不限于外源抗原性多肽、包含HLA-E多肽或HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽。
外源抗原性多肽
在某些实施方案中，本文所述的aAPC包含与外源抗原性多肽结合(如，特异性结合)的抗原呈递多肽(如，包含HLA-E多肽或HLA-G多肽)。在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含HLA-E多肽，并且外源抗原性多肽选自或包含表1中提供的氨基酸序列、或其片段或变体。在一些实施方案中，外源抗原性多肽是致耐受性多肽。在一些实施方案中，外源抗原性多肽源自HSP60(如，HSP60的前导序列)。
表1外源抗原性多肽
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在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含HLA-G多肽并且结合(如，特异性结合)至外源抗原性多肽。在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含HLA-G多肽，并且外源抗原性多肽具有基序XI/LPXXXXXXL(SEQ ID NO:8)。
本领域普通技术人员可使用本领域已知的搜索工具鉴定HLA-E-或HLA-G-结合肽例如，但不限于可通过Nature的万维网Nature.com/articles/2404787/tables/1获得的T细胞表位预测工具。国际专利申请公开号WO2018/005559描述了鉴定HLA-E和HLA-G的结合肽的方法，其内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，外源抗原性多肽为约8至约24个氨基酸的长度。
在其他实施方案中，在HLA-E或HLA-G抗原呈递多肽呈递的外源抗原性多肽是选自本文公开的任何一种抗原的抗原性多肽。例如，在一些实施方案中，多肽是来自选自表1中公开抗原的抗原的抗原性多肽或具有基序XI/LPXXXXXL(SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，外源抗原性多肽源自传染性疾病原(如，病毒、寄生物(如，细胞内寄生物)、朊病毒、细菌(如，细胞内病原性细菌))。在一些实施方案中，外源抗原性多肽源自病毒(如，埃巴病毒或HIV)。在一些实施方案中，外源抗原性多肽源自细菌(如，结核分枝杆菌)。
在一些实施方案中，外源抗原性多肽为8个氨基酸的长度至24个氨基酸的长度，例如为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸的长度。在进一步的实施方案中，将可切割位点引入外源抗原性多肽中。
在一些实施方案中，本文提供的工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包含至少两种类型的外源多肽：至少一种(一种、两种、三种或更多种)含有HLA-E多肽或HLA-G多肽的可负载外源抗原呈递多肽和至少一种(一种、两种、三种或更多种)外源抗原性多肽(如，第一和/或第二外源抗原性多肽)。在一些实施方案中，外源抗原性多肽的一部分能够结合外源抗原呈递多肽的抗原结合槽。在一些实施方案中，至少一种外源抗原性多肽以N端或C端融合包含跨膜域，如I型膜蛋白跨膜域(如，血型糖蛋白A(GPA)跨膜域)或II型膜蛋白跨膜域(如，小整合膜蛋白1(SMIM1)跨膜域)，例如，使得能够结合本文所述的外源抗原呈递多肽的抗原性多肽部分存在于工程化红系细胞或去核细胞表面的外侧。在一些实施方案中，外源抗原性多肽包含跨膜域、接头和能够结合外源抗原呈递多肽的抗原结合槽的氨基酸序列(如，抗原)。本文提供的任何接头可配置在跨膜域和能够结合外源抗原呈递多肽的抗原结合槽的氨基酸序列之间。例如，在一些实施方案中，接头是柔性接头(如，GlySer接头)。在一些实施方案中，接头长度为约30至约100个氨基酸残基。在其他实施方案中，接头长度为约40个氨基酸残基至70个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头是可切割的接头(如，包含酶促切割位点)。在一些实施方案中，外源抗原性多肽可与外源抗原呈递多肽共价连接。在一些实施方案中，外源抗原性多肽不与外源抗原呈递多肽共价连接。
在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包含3个或更多个，例如至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、200、500、或1000个外源抗原性多肽。在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)群体包含3个或更多个，例如至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、200、500、1000、2000、或5000个外源抗原性多肽，例如，其中群体中不同的工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包含不同的外源抗原性多肽，或其中群体中不同的红系细胞包含不同数量的外源抗原性多肽。
在一些实施方案中，外源抗原性多肽包含具有与相应的野生型外源抗原性多肽的氨基酸序列至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
还提供了包含编码本文所述的外源抗原性多肽的核酸序列或由其组成的核酸(如，外源核酸)。在一些实施方案中，核酸包含至少一个启动子(如，组成型或诱导型启动子)，其与编码外源抗原性多肽的开放阅读框或基因可操作地连接。在一些实施方案中，外源抗原性多肽由包含以下或由以下组成的核酸(如，外源核酸)编码：与编码野生型外源抗原性多肽的核酸序列至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核酸序列。在一些实施方案中，外源抗原性多肽由包含以下或由以下组成的核酸(如，外源核酸)编码：与编码野生型外源抗原性多肽的核酸序列至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核酸序列，其中外源抗原性多肽不包括信号序列。在一些实施方案中，核酸是密码子优化的(如，用于在人细胞中表达)。在一些实施方案中，核酸未进行密码子优化。
在一些实施方案中，外源抗原性多肽是野生型天然存在的外源抗原性多肽的同源物或变体。例如，在一些实施方案中，外源抗原性多肽的氨基酸序列可在一个或多个氨基酸残基处不同于野生型外源抗原性多肽参考的氨基酸序列。在一些实施方案中，与野生型外源抗原性多肽的氨基酸序列相比，外源抗原性多肽的氨基酸序列经修饰以包括保守(如，结构相似)的氨基酸取代。例如，结构相似的氨基酸包括：(异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)和缬氨酸(V))；(苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y))；(赖氨酸(K)和精氨酸(R))；(谷氨酰胺(Q)和天冬酰胺(N))；(天冬氨酸(D)和谷氨酸(E))；和(甘氨酸(G)和丙氨酸(A))。在一些实施方案中，与野生型外源抗原性多肽的氨基酸序列相比，外源抗原性多肽的氨基酸序列经修饰以包括非保守氨基酸取代。在一些实施方案中，与野生型外源抗原性多肽的氨基酸序列相比，外源抗原性多肽包括至少一个氨基酸残基的缺失、添加或取代。可如本文所述使用的野生型外源抗原性多肽的同源物和变体包括多态变体、天然或人工突变体和经修饰的多肽，其中一个或多个残基被修饰。例如，在一些实施方案中，外源抗原性多肽包含与野生型外源抗原性多肽至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源抗原性多肽氨基酸序列与野生型外源抗原性多肽氨基酸序列的差异不超过1、2、3、4、5、8、10、20或50个残基，并保留其来源的野生型外源抗原性多肽的功能。
在一些实施方案中，外源抗原性多肽的片段或变体包含衍生该片段或变体的野生型外源抗原性多肽的外源抗原性多肽活性的至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少853％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％。
外源抗原呈递多肽
本公开的外源抗原呈递多肽包括HLA-E多肽或HLA-G多肽。在一些实施方案中，本公开的外源抗原呈递多肽包含含有HLA-E或HLA-G多肽的细胞表面复合物的亚基，其中HLA-E或HLA-G多肽的功能为结合外源抗原性多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽是HLA-E或HLA-G的亚基(如，α域)并且功能是结合外源抗原性多肽。在一些实施方案中，外源抗原性多肽装载在外源抗原呈递多肽的HLA-E或HLA-G多肽上(如，装载到抗原结合槽)，并且HLA-E或HLA-G多肽的功能是呈递外源抗原性多肽。
外源抗原性多肽可与抗原呈递多肽共价或非共价结合。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含功能性HLA-E或HLA-G多肽，并且外源抗原呈递多肽包含一个或多个α域1-3(α1、α2和α3域)或其片段或变体。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包括β-2微球蛋白(β2M)多肽或其片段或变体。在一些实施方案中，一个或多个HLA-E或HLA-Gα亚基(如，一个或多个α域)与β2M多肽结合，例如共价结合或非共价结合。在一些实施方案中，一个或多个HLA-E或HLA-Gα亚基(如，一个或多个α域)未与β2M多肽结合，例如共价结合或非共价结合。
在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含HLA-E多肽。在一些实施方案中，HLA-E多肽为选自下组的HLA-E等位基因：E*01:01、E*01:01:01:01、E*01:01:01:02、E*01:01:01:03、E*01:01:01:04、E*01:01:01:05、E*01:01:01:06、E*01:01:01:07、E*01:01:01:08、E*01:01:01:09、E*01:01:01:10、E*01:01:02、E*01:03、E*01:03:01:01、E*01:03:01:02、E*01:03:01:03、E*01:03:01:04、E*01:03:02:01、E*01:03:02:02、E*01:03:03、E*01:03:04、E*01:03:05、E*01:04、E*01:05、E*01:06、E*01:07、E*01:08N、E*01:09和*01:10等位基因或其片段(如，其一个或多个α域)。在一些实施方案中，HLA-E多肽连接(如，融合)至外源抗原性多肽。例如，在一些实施方案中，包含连接至外源抗原性多肽的HLA-E分子的外源抗原呈递多肽具有图1所示的结构。在一些实施方案中，外源抗原性多肽包含HSP60或源自HSP60的肽(如，HSP60的前导序列)。在一些实施方案中，外源抗原性多肽包含表1中列出的肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含以下的HLA-E多肽：E*01:01、E*01:01:01:01、E*01:01:01:02、E*01:01:01:03、E*01:01:01:04、E*01:01:01:05、E*01:01:01:06、E*01:01:01:07、E*01:01:01:08、E*01:01:01:09、E*01:01:01:10、E*01:01:02、E*01:03、E*01:03:01:01、E*01:03:01:02、E*01:03:01:03、E*01:03:01:04、E*01:03:02:01、E*01:03:02:02、E*01:03:03、E*01:03:04、E*01:03:05、E*01:04、E*01:05、E*01:06、E*01:07、E*01:08N、E*01:09或E*01:10等位基因，并且外源抗原性多肽包含表1所列的肽。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-E多肽的一个或多个α域1-3(如，α1、α2和α3域)和β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-E的一个或多个α域1-3(如，α1、α2和α3域)、β2M多肽和膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-E的一个或多个α域1-3(如，α1、α2和α3域)、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-E的一个或多个α域1-3(如，α1、α2和α3域)、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且与外源抗原性多肽连接(如，经由接头)。
在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含HLA-G多肽。在一些实施方案中，HLA-G多肽是HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4、HLA-G5、HLA-G6或HLA-G7亚型或其片段(如，一种或更多种其α域)。在一些实施方案中，HLA-G是HLA-G多聚体，如二聚体。在一些实施方案中，HLA-G多肽为HLA-G1*01:01:01:01等位基因。在一些实施方案中，HLA-G在残基42处包含未配对的半胱氨酸。在一些实施方案中，HLA-G多肽与外源抗原性多肽连接。在一些实施方案中，外源抗原性多肽具有基序XI/LPXXXXXL(SEQ ID NO:8)，其中X可以是任何氨基酸。例如，在一些实施方案中，包含连接至外源抗原性多肽的HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽具有图2A所示的结构。在其他实施方案中，包含HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽具有图2B所示的结构。在其他实施方案中，包含HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽具有图2C所示的结构。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G多肽的一个或多个α域1-3(如，α1、α2和α3域)并且不包含β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G多肽的一个或多个α域1-3(如，α1、α2和α3域)和β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G多肽的一个或多个α域1-3(如，α1、α2和α3域)和膜锚(如，GPA蛋白或跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G多肽的一个或多个α域1-3(如，α1、α2和α3域)、β2M多肽和膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G多肽的一个或多个α域1-3(如，α1、α2和α3域)、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G多肽的一个或多个α域1-3(如，α1、α2和α3域)、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G多肽的一个或多个α域1-3(如，α1、α2和α3域)、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且与外源抗原性多肽连接(如，经由接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G多肽的一个或多个α域1-3(如，α1、α2和α3域)、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且与外源抗原性多肽连接(如，经由接头)。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G1亚型多肽的α1、α2和α3域，并且不包含β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G1亚型多肽的α1、α2和α3域和β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G1亚型多肽的α1、α2和α3域和膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G1亚型多肽的α1、α2和α3域、β2M多肽和膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G1亚型多肽的α1、α2和α3域、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G1亚型多肽的α1、α2和α3域、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G1亚型多肽的α1、α2和α3域、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且与外源抗原性多肽连接(例如，经由接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含alp HLA-G1亚型多肽的α1、α2和α3域、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且与外源抗原性多肽连接(如，经由接头)。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G2亚型多肽的α1和α3域并且不包含β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G2亚型多肽的α1和α3域和β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G2亚型多肽的α1和α3域和膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G2亚型多肽的α1和α3域、β2M多肽和膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G2亚型多肽的α1和α3域、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G2亚型多肽的α1和α3域、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G2亚型多肽的α1和α3域、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且与外源抗原性多肽连接(如，经由接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G2亚型多肽的α1和α3域、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且与外源抗原性多肽连接(如，经由接头)。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G3亚型多肽的α1域并且不包含β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G3亚型多肽的α1域和β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G3亚型多肽的α1域和膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G3亚型多肽的α1域、β2M多肽和膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G3亚型多肽的α1域、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G3亚型多肽的α1域、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G3亚型多肽的α1域、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且与外源抗原性多肽连接(如，经由接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G3亚型多肽的α1域、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且与外源抗原性多肽连接(如，经由接头)。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G4亚型多肽的α1和α2域并且不包含β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G4亚型多肽的α1和α2域和β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G4亚型多肽的α1和α2域和膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G4亚型多肽的α1和α2域、β2M多肽和膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G4亚型多肽的α1和α2域、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G4亚型多肽的α1和α2域、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G4亚型多肽的α1和α2域、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且与外源抗原性多肽连接(如，经由接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G4亚型多肽的α1和α2域、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且与外源抗原性多肽连接(如，经由接头)。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G5亚型多肽的α1、α2和α3域并且不包含β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G5亚型多肽的α1、α2和α3域和β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G5亚型多肽的α1、α2和α3域及膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G5亚型多肽的α1、α2和α3域、β2M多肽和膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G5亚型多肽的α1、α2和α3域、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G5亚型多肽的α1、α2和α3域、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G5亚型多肽的α1、α2和α3域、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且与外源抗原性多肽连接(如，经由接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G5亚型多肽的α1、α2和α3域、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且连接至外源抗原性多肽(如，经由接头)。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G6亚型多肽的α1和α3域并且不包含β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G6亚型多肽的α1和α3域和β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G6亚型多肽的α1和α3域及膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G6亚型多肽的α1和α3域、β2M多肽和膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G6亚型多肽的α1和α3域、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G6亚型多肽的α1和α3域、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G6亚型多肽的α1和α3域、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且与外源抗原性多肽连接(如，经由接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G6亚型多肽的α1和α3域、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如,柔性接头)，并与外源抗原性多肽连接(例如，经由接头)。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G7亚型多肽的α1域并且不包含β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G7亚型多肽的α1域和β2M多肽。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G7亚型多肽的α1域和膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G7亚型多肽的α1域、β2M多肽和膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G7亚型多肽的α1域、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G7亚型多肽的α1域、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G7亚型多肽的α1域、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且与外源抗原性多肽连接(如，经由接头)。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-G7亚型多肽的α1域、β2M多肽、膜锚(如，GPA蛋白或其跨膜域)和一个或多个接头(如，柔性接头)，并且与外源抗原性多肽连接(如，经由接头)。
在一些实施方案中，使用aAPC进行免疫调节，如激活或抑制一个或多个免疫细胞群体，所述aAPC包含工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，其经工程化改造以包含含有HLA-E或HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽，如本文所述。在一些实施方案中，aAPC包含单一蛋白，其是HLA-E或HLA-G多肽与外源抗原性多肽之间的融合物。在一些实施方案中，复合物的非膜系留组分，例如抗原性多肽或β2微球蛋白，在运输至表面之前在细胞内与另一种媒介物组装，由细胞分泌，然后通过多聚体的膜系留组分捕获在表面上，或以纯化的形式添加到aAPC。
在一些实施方案中，包含HLA-E或HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽包含膜锚、α-链(如，HLA-E的α链或HLA-G的α链)和β2M多肽。在进一步的实施方案中，外源抗原性多肽经由接头连接至包含HLA-E或HLA-G的外源抗原呈递多肽。在相关实施方案中，接头是可切割的接头。在另一个实施方案中，膜锚是血型糖蛋白锚，特别是血型糖蛋白A(GPA)，或膜锚是小整合膜蛋白1(SMIM1)。在一些实施方案中，膜锚包含全长GPA。在其他实施方案中，膜锚包含SMIM1的跨膜域或GPA的跨膜域。
在其他实施方案中，外源抗原呈递多肽包含HLA-E多肽或HLA-G多肽，其中对应于成熟HLA-E或HLA-G多肽的保守α链位点84的氨基酸残基包含氨基酸取代为丙氨酸(A)(如，Y84A)。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽与外源抗原性多肽融合为单链融合多肽，并且单链融合多肽包含(如，从N-末端到C-末端)：外源抗原性多肽、接头、β2M多肽、任选的接头、HLA-E多肽的一个或多个α域1-3(如，α1、α2和α3域)、任选的接头和膜锚(如，GPA或其跨膜域)。在一些实施方案中，HLA-E多肽在对应于成熟HLA-E多肽的保守α链位点84的氨基酸残基处包含氨基酸取代为半胱氨酸(如，Y84C)，并且位于外源抗原性多肽和β2M多肽之间的接头包含至少一个半胱氨酸残基，其能够与对应于成熟HLA-E多肽保守α链位点84的氨基酸残基处的半胱氨酸形成二硫键。在一些实施方案中，位于外源抗原性多肽和β2M多肽之间的接头在外源抗原性多肽的末端(如，N-或C-末端)后的第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个、第八个、第九个、第十个、第十一个或第十二个残基处包含至少一个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，位于外源抗原性多肽和β2M多肽之间的接头在外源抗原性多肽的末端(如，N-或C-末端)后的第二个残基处包含半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽与外源抗原性多肽融合为单链融合多肽，并且单链融合多肽包含(如，从N-末端到C-末端)：外源抗原性多肽、接头、β2M多肽、任选的接头、HLA-G多肽的一个或多个α域1-3(如，α1、α2和α3域)、任选的接头和膜锚(如，GPA或其跨膜域)。在一些实施方案中，HLA-G多肽在对应于成熟HLA-G多肽的保守α链位点84的氨基酸残基处包含氨基酸取代为半胱氨酸(如，Y84C)，并且接头位于外源α链之间。抗原性多肽和β2M多肽包含至少一个半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基能够与对应于成熟HLA-G多肽的保守α链位点84的氨基酸残基处的半胱氨酸形成二硫键。在一些实施方案中，位于外源抗原性多肽和β2M多肽之间的接头在外源抗原性多肽末端(如，N-或C-末端)后的第一个、第二个、第三个、第四个、第五个、第六个、第七个、第八个、第九个、第十个、第十一个或第十二个残基处包含至少一个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，位于外源抗原性多肽和β2M多肽之间的接头在外源抗原性多肽的末端(如，N-或C-末端)之后的第二个残基处包含半胱氨酸残基。在一些实施方案中，包含HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽包含图1中所列的结构。在一些实施方案中，包含HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽包含图2A至图2C中任一个所示的结构。
本公开还包含含有HLA-E或HLA-G多晶型物的外源抗原呈递多肽。
在某些实施方案中，多肽是如本文所述的外源抗原呈递多肽。
外源共刺激性多肽
在一些实施方案中，本文所述的aAPC包括外源共刺激性多肽。外源共刺激性多肽包括抗原呈递细胞(如，aAPC)上的多肽，其特异性结合免疫细胞上的同源共刺激分子，从而提供介导免疫细胞反应的信号，包括但不限于增殖、激活、分化等。共刺激性多肽尤其还包括与免疫细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体。这种抗体优选结合免疫细胞上的共刺激分子并充当其激动剂。
在一些实施方案中，共刺激性多肽刺激或激活免疫，如CD8+调节性T细胞(Treg)。在一些实施方案中，尤其包含共刺激性多肽的aAPC促进免疫细胞增殖。在一些实施方案中，一种或多种(例如，2、3、4或5种或更多种)共刺激性多肽包含以下表2中的激活多肽，或其免疫细胞激活变体(如，片段)。在一些实施方案中，一种或多种(如，2、3、4、或5种或更多种)共刺激性多肽包含结合表2中的靶受体或免疫细胞激活变体(如，片段)的抗体分子(如，激动抗体)。在一些实施方案中，共刺激性多肽包含不同的免疫细胞激活配体，如以其任意组合的表2的一种或多种激活多肽，以刺激或激活免疫细胞，如CD8+调节性T细胞(Tregs)。在一些实施方案中，aAPC包含呈递4-1BBL、OX40L和CD40L或其片段或变体的工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)。在一些实施方案中，这些蛋白通过互补激活途径发出信号。共刺激性多肽可源自内源免疫细胞激活配体或源自针对靶受体的抗体分子。
在一些实施方案中，共刺激性多肽连接至跨膜域，如外源或内源蛋白的跨膜域。在一些实施方案中，共刺激性多肽存在于工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)的细胞表面。
表2共刺激性多肽
激活多肽(配体) T细胞上的靶受体
B7-H2(如，登录号NP_056074.1) ICOS,CD28(如，登录号NP_006130.1)
B7-1(如，登录号NP_005182.1) CD28(如，登录号NP_006130.1)
B7-2(如，登录号AAA86473) CD28(如，登录号NP_006130.1)
CD70(如，登录号NP_001243.1) CD27(如，登录号NP_001233.1)
LIGHT(如，登录号NP_003798.2) HVEM(如，登录号AAQ89238.1)
HVEM(如，登录号AAQ89238.1) LIGHT(如，登录号NP_003798.2)
CD40L(如，登录号BAA06599.1) CD40(如，登录号NP_001241.1)
4-1BBL(如，登录号NP_003802.1) 4-1BB(如，登录号NP_001552.2)
OX40L(如，登录号NP_003317.1) OX40(如，登录号NP_003318.1)
TL1A(如，登录号NP_005109.2) DR3(如，登录号NP_683866.1)
GITRL(如，登录号NP_005083.2) GITR(如，登录号NP_004186.1)
CD30L(如，登录号NP_001235.1), CD30(如，登录号NP_001234.3)
TIM4(如，登录号NP_612388.2) TIM1(如，登录号NP_036338.2)
SLAM(如，登录号AAK77968.1) SLAM(如，登录号AAK77968.1)
CD48(如，登录号CAG33293.1) CD2(如，登录号NP_001315538.1)
CD58(如，登录号CAG33220.1) CD2(如，登录号NP_001315538.1)
CD155(如，登录号NP_001129240.1) CD226(如，登录号NP_006557.2)
CD112(如，登录号NP_001036189.1) CD226(如，登录号NP_006557.2)
CD137L(如，登录号NP_003802.1) CD137(如，登录号NP_001552.2)
在一些实施方案中，一种或多种共刺激性多肽包含激活细胞因子、干扰素、Ig超家族成员、TNF超家族受体或TNF家族成员，如IFNα、IL2、IL6或其任何组合。
下文进一步讨论可用于本公开的激活细胞因子、干扰素、Ig超家族成员、TNF超家族受体或TNF家族成员。在一些实施方案中，一种或多种共刺激性多肽包含一个或多个激活细胞因子、干扰素或TNF家族成员，并且还包含一个或多个激活多肽或配体(如，表2)或其免疫细胞激活变体(如，片段)，或结合靶共刺激免疫细胞受体(如，表2)或其免疫细胞激活变体(如，片段)的一个或多个抗体分子(如，激动抗体)。
免疫细胞扩增
在某些实施方案中，本公开的特征在于可用于特异性诱导免疫细胞增殖的aAPC，如CD8+调节性T细胞(Treg)，包括已知的共刺激分子。该方法包括使待扩增的免疫细胞与呈递特异性结合由免疫细胞表达的共刺激分子的外源多肽的aAPC接触。因此，使免疫细胞与除其他外包含特异性结合在免疫细胞表面表达的同源共刺激分子的共刺激配体的aAPC接触，刺激免疫细胞并诱导免疫细胞增殖，使得易于产生大量特异性免疫细胞。aAPC“特异性”扩增免疫细胞，因为aAPC仅扩增表达特定共刺激分子的免疫细胞。因此，当待扩增的免疫细胞存在于细胞混合物中时，其中一些或大部分不表达共刺激分子，只有感兴趣的免疫细胞会被诱导增殖并增加细胞数量。可使用多种细胞分离和纯化技术，例如本领域已知和/或本文别处描述的那些技术，进一步纯化免疫细胞。
本领域技术人员将理解，基于本文提供的公开内容，在使用aAPC扩增之前不需要鉴定或分离感兴趣的免疫细胞。这是因为aAPC是选择性的，只会扩增表达同源共刺激分子的免疫细胞。
在某些实施方案中，多肽是如本文所述的外源共刺激性多肽。
在一些实施方案中，aAPC细胞联合靶向多种免疫细胞激活途径(如，例如以上表2所述)，例如使用在aAPC上共呈递的配体或抗体分子或两者。
在一些实施方案中，至少一种外源共刺激性多肽选自CD40、ICOS-L、IL-15、4-1BBL、LIGHT、CD80、CD86、CD70、OX40L、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、IL-15Rα融合至IL-15、IL-2、IL-21、ICAM-1的配体、LFA-1的配体及其组合。在一些实施方案中，至少一种外源共刺激性多肽是同源共刺激配体受体的激动剂抗体。例如，在某些实施方案中，共刺激性多肽是针对以下的激动剂抗体：4-1-BB、LIGHT受体(HVEM)、CD80受体、CD86受体、OX40、GITR、TIM4受体(TIM1)、SLAM受体、CD48受体(CD2)、CD58受体(CD2)、CD83受体、CD155受体(CD226)、CD112受体(CD226)、IL-2受体(CD25、CD122、CD132)、IL-21受体、ICAM及其组合。在某些实施方案中，至少一种外源共刺激性多肽为IL-15。在某些实施方案中，至少一种外源共刺激性多肽是抗CD3抗体或抗CD38抗体及其组合。在一些实施方案中，aAPC呈现至少2种、至少3种、至少4种或至少5种外源共刺激性多肽。在一些实施方案中，共刺激蛋白彼此融合，例如IL-21与IL-2融合。
外源共抑制性多肽
在某些实施方案中，本文所述的aAPC包括外源共抑制性多肽。外源共抑制性多肽是抑制免疫细胞的任何多肽，包括抑制免疫细胞活性、抑制免疫细胞增殖、使免疫细胞无应答或诱导免疫细胞凋亡。
在一些实施方案中，外源共抑制性多肽是抗原呈递细胞上的抑制性多肽配体，其特异性结合免疫细胞上的同源共抑制分子。在一些实施方案中，共抑制性多肽配体是表3所示的抑制性多肽。
在一些实施方案中，共抑制性多肽连接至跨膜域，如外源或内源蛋白的跨膜域。在一些实施方案中，共抑制性多肽存在于工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)的细胞表面。
在一些实施方案中，外源共抑制性多肽是特异性结合免疫细胞(如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、DC或NK)上的共抑制受体的激动剂(如，抗体)。
在一些实施方案中，激动剂是结合选自下组的受体的抗体：PD1、CTLA4、TIM3、TGFβ、CEACAM(如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160和2B4。在其他实施方案中，激动剂是结合免疫细胞上的靶受体的抗体，如表3中所示的T细胞、B细胞、巨噬细胞、DC或NK细胞。
在一些实施方案中，外源共抑制性多肽是细胞表面上的检查点分子。在一些实施方案中，检查点分子选自PD-L1、PD-L2和OX40L。在一些实施方案中，外源共抑制性多肽是PD-1、CTLA4、TIM3或LAG3的激动剂。
表3共抑制性多肽
抑制性多肽 T细胞上的靶受体
B7-1 CTLA4,B7H1
B7-2 CTLA4
B7DC PD1
B7H1 PD1,B7-1
HVEM CD160,BTLA
COLLAGEN LAIR1
GALECTIN9 TIM3
CD48,TIM4 TIM4R
CD48 2B4
CD155,CD112,CD113 TIGIT
PDL1 PD1
LAG3
在一些实施方案中，外源共抑制性多肽是阻断共刺激性多肽与其同源共刺激受体结合的抗体。在不同实施方案中，外源共抑制性多肽是阻断4-1BBL、LIGHT、CD80、CD86、CD70、OX40L、GITRL、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD83、CD155、CD112、IL-15Rα融合至IL-15、IL-2、IL-21、ICAM、LFA-1的配体、抗CD3抗体或抗CD28抗体与其受体结合的抗体。
在其他实施方案中，共抑制性多肽选自IL-35、IL-10或VSIG-3。
在其他实施方案中，aAPC细胞组合靶向多种免疫细胞抑制途径(例如，如以上表3所述)，例如使用aAPC上的配体或抗体分子或两者。
在某些实施方案中，多肽是如本文所述的外源共抑制性多肽。
在一些实施方案中，aAPC呈递至少2种、至少3种、至少4种或至少5种外源共抑制性多肽。
Treg共刺激和共抑制性多肽
调节性T细胞(“Treg”)是T细胞的特化亚群，其阻抑免疫系统的激活，从而保持对自身抗原的耐受性。Treg细胞占人和啮齿动物CD4+T细胞的5-10％。Treg细胞占人和啮齿动物CD4+T细胞的5-10％，并且组成性表达CD4和CD25以及涉及其发育和功能的转录因子
FoxP3(CD4+CD25+FoxP3+)。IL-2似乎也在Treg细胞发育和体内平衡中发挥重要作用，因为缺乏IL-2或其受体成分的动物会发展T细胞过度增殖和自身免疫性疾病，这些疾病可通过从初始动物过继转移Treg细胞来调整。同样，缺乏通过CD28/CD80相互作用的信号与Treg细胞的数量和功能减少有关，这表明该受体/配体系统在Treg细胞的发育和功能中起重要作用。
在某些实施方案中，本文所述的aAPC包括外源Treg共刺激性多肽。在某些实施方案中，本公开的特征在于包含能够扩增调节性T细胞(Treg)细胞的Treg共刺激性多肽的aAPC。在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽通过刺激涉及Treg细胞发育的三种信号中的至少一种来扩增Treg细胞。信号1涉及TCR，可用抗体(如，抗CD3抗体)或通过TCR发出信号的抗原刺激。信号2可由几种不同的分子介导，包括免疫共刺激分子，如CD80和4-1BBL。信号3通过细胞因子(如，IL-2或TGFβ)转导。在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽刺激这些信号中的一种。在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽刺激这些信号中的两种。在又一个实施方案中，Treg共刺激性多肽刺激这些信号中的三种。
信号1
用作Treg共刺激性多肽以刺激信号1的抗原包括与目标疾病或病症相关的抗原。例如，自体抗原和胰岛素(特别适合治疗1型糖尿病)、胶原蛋白(特别适合治疗类风湿性关节炎)、髓鞘碱性蛋白(特别适合治疗多发性硬化症)和MHC(治疗和预防外来移植物排斥)。抗原可作为缀合物的一部分施用。任选地，抗原作为HLA-E或HLA-G/抗原复合物的一部分提供。在该实施方案中，HLA-E或HLA-G和抗原可独立地是外源的或同源的。例如，可使用供体HLA-E或HLA-G和同种异体或同源抗原。
信号2
用于刺激信号2的示例性Treg共刺激性多肽包括B7和TNF家族的成员，例如B7和CD28家族成员，如下表4所示，TNF家族成员如表5所示。
表4：Treg共刺激性多肽：B7和CD28家族成员
Figure BDA0003181628170000551
Figure BDA0003181628170000561
表5 Treg共刺激性多肽：TNF家族成员
配体 受体
OX40L OX40(CD134)
4-1BBL 4-1BB(CD137)
CD40L(CD154) CD40
CD27L(CD70) CD27
CD30L CD30
LIGHT HVEM,LTβR,DcR3
GITRL GITR
BAFF(BLyS)** BAFF-R,TACI,BCMA
APRIL** TACI,BCMA
VEGI/TL1A DR3
TNFα(突变体) TNFR2
信号3
用于刺激信号3的示例性Treg共刺激性多肽包括刺激信号3的细胞因子和生长因子，如IL-2、IL-4和TGF-β(包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)。可用于免疫治疗方法的IL-2和IL-4部分是本领域已知的。参见，例如Earle et al.,2005,同上；Thorton et al.,2004,J.Immunol.172:6519-23；Thorton et al.,2004,Eur.J.Immunol.34:366-76。根据一些实施方案，使用细胞因子的成熟部分。
在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽是IL-2，如CD25特异性IL-2。在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽是TNF，如TNFR2特异性TNF。在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽是抗DR3激动剂(VEGI/TL1A特异性)。在一些实施方案中，Treg共刺激肽是41BBL。在一些实施方案中，Treg共刺激肽是TGFβ。在一些实施方案中，Treg共刺激肽是CD80。在一些实施方案中，Treg共刺激肽是CD86。
在其他实施方案中，本公开的特征在于作为抑制Treg细胞的外源多肽的Treg共抑制性多肽。在某些实施方案中，可将Treg抑制用于治疗癌症，例如，通过靶向参与Treg运输的趋化因子。其他Treg抑制剂可靶向表4或表5中列出的任何受体，如抗OX40、抗GITR或抗CTLA4或TLR配体。
在某些实施方案中，多肽是如本文所述的外源Treg共刺激性多肽。
在一些实施方案中，aAPC呈递至少2种、至少3种、至少4种或至少5种外源Treg共刺激性多肽。
在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽或Treg共抑制性多肽连接至跨膜域，例如内源蛋白的跨膜域。在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽或Treg共抑制物存在于工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)的细胞表面。
细胞因子/趋化因子
在某些实施方案中，本文所述的aAPC包括至少一种包含细胞因子、趋化因子或两者的外源多肽。此外，本公开包括用编码至少一种细胞因子、至少一种趋化因子或两者的核酸转导的aAPC。因此，本公开提供了包含外源多肽的aAPC，所述外源多肽包含细胞因子，包括细胞因子的全长、片段、同源物、变体或突变体。细胞因子包括能够影响另一细胞的生物学功能的蛋白。受细胞因子影响的生物学功能可包括但不限于细胞生长、细胞分化或细胞死亡。优选地，本公开的细胞因子能够与细胞表面的特定受体结合，从而影响细胞的生物学功能。
优选的细胞因子尤其包括造血生长因子、白介素、干扰素、免疫球蛋白超家族分子、肿瘤坏死因子家族分子和/或趋化因子等。本公开的更优选的细胞因子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肿瘤坏死因子β(TNFβ)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-7(IL-7)、白细胞介素10(IL-10)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、白介素21(IL-21)、白介素35(IL-35)、干扰素α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)、干扰素γ(IFN-γ)和IGIF等。在一些实施方案中，aAPC包括抗原呈递多肽HLA-E并用IL-15转导。
在一些实施方案中，本公开提供包含外源多肽的aAPC，所述外源多肽包含趋化因子，包括其同源物、变体、突变体或片段，例如α-趋化因子或β-趋化因子，包括但不限于C5a、白细胞介素-8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白1α(MIP1α)、单核细胞趋化蛋白1β(MIP1β)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)、血小板活化因子(PAFR)、N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-[3H]苯丙氨酸(FMLPR)、白三烯B4(LTB4R)、胃泌素释放肽(GRP)、RANTES、嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)、淋巴细胞趋化蛋白(lymphotactin)、IP10、1-309、ENA78、GCP-2、NAP-2和/或MGSA/gro。本领域技术人员将理解，一旦掌握了本文提供的教导，本公开包括包含外源多肽的APC，所述外源多肽包含趋化因子和/或细胞因子，例如本领域熟知的那些，以及将来发现的任何因子。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包含一种或多种(如，2、3、4、5或更多种)来自表6的细胞因子受体亚基或其细胞因子结合变体或片段。在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包含来自表4的单行的2个或3个(如，所有)细胞因子受体亚基或细胞因子结合变体或其功能片段。细胞因子受体可存在于工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)的表面。表达的受体通常具有野生型人受体序列或其能够结合和隔离其靶配体的变体或片段。在一些实施方案中，两个或更多个细胞因子受体亚基彼此连接，如成为融合蛋白。
在一些实施方案中，一种或多种(如，2种或全部)细胞因子与跨膜域(如，GPA跨膜域或本文所述的其他跨膜域)融合，例如，使得细胞因子存在于工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)。在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)还包含靶向部分，例如WO2007030708中(如，其中的第34-45页)描述的寻址部分或靶向部分，该申请通过引用整体并入本文。
表6细胞因子和受体
Figure BDA0003181628170000591
Figure BDA0003181628170000601
Figure BDA0003181628170000611
在一些实施方案中，本文所述的Treg共刺激性多肽、共刺激性多肽、共抑制性多肽或细胞因子或其活性片段，可连接或表达为具有结合对成员的融合蛋白进行根据本公开的应用。示例性结合对是生物素和链霉亲合素(SA)或亲合素。
在一些实施方案中，Treg共刺激性多肽、共刺激性多肽、共抑制性多肽或细胞因子或其活性片段是融合蛋白的一部分，其包括Treg共刺激性多肽、共刺激性多肽、共抑制性多肽或细胞因子和结合对成员，如CSA。融合蛋白可通过本领域已知的多种不同方法中的任一种制备。例如，融合蛋白的多肽的一种或多种组分可化学合成或可使用众所周知的重组核酸技术产生。
缀合物可包括接头，例如结合对成员和共刺激部分之间的肽接头。可选择接头长度和组成以增强该部分任一功能性末端的活性。接头可大于20个氨基酸长。在一些实施方案中，接头通常为约3至约30个氨基酸长，如约5至约20个氨基酸长、约5至约15个氨基酸长、约1至约10个氨基酸长。然而，可使用更长或更短的接头或可完全省掉接头。在这方面可使用诸如已用于连接单链抗体的重链和轻链的柔性接头，如，(Gly4Ser)3。参见，例如Hustonet al.,1988,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883；美国专利号5,091,513,5,132,405,4,956,778；5,258,498和5,482,858。其他接头是FENDAQAPKS(SEQ ID NO:9)或LQNDAQAPKS(SEQ ID NO:10)。免疫球蛋白Fc区(如，CH1、CH2和/或CH3)的一个或多个域也可用作接头。
工程化红系细胞
一些方面，本公开提供了经工程化改造以激活或抑制某些免疫细胞群体的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中所述aAPC包含工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核红系细胞)，其经工程化改造以包含含有HLA-E多肽或HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽，并激活或抑制特定的免疫细胞群体。在一些实施方案中，细胞经工程化改造以包含含有HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽，并激活某些免疫细胞，如调节性T细胞。在一些实施方案中，细胞经工程化改造以包含含有HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽，并抑制某些免疫细胞，如NK细胞和细胞毒性CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞经工程化改造以包含含有HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽，并抑制某些免疫细胞，如自然杀伤(NK)细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞和/或树突细胞(DC)。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包含含有HLA-E多肽或HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽，其呈递表1所公开的外源抗原性多肽或具有基序XI/LPXXXXXL(SEQ ID NO:8)的外源抗原性多肽。
在一些实施方案中，去核细胞是缺乏细胞核的细胞(如，由于分化过程如红细胞生成)。在一些实施方案中，去核细胞不能表达多肽。在一些实施方案中，去核细胞是红细胞、网织红细胞或血小板。工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)可有利地用于治疗自身免疫性疾病、炎性疾病、传染性疾病或变应性病症。具体地，本文所述的工程化红系细胞(如，工程化去核红系胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)可以是非自体的(如，基本上缺乏主要组织相容性复合物(MHC))，在受试者中长时间循环(如，大于30天)，并且可大量生产。此外，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)可以是高度可变形的，使得细胞能够进入受试者体内通过其他治疗手段可能无法进入的位点。
工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包含第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)还包含不同的第二外源多肽。工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)任选地还包含不同的第二和第三外源多肽。工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)任选地还包含不同的第二、第三和第四外源多肽。工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)任选地还包含不同的第二、第三、第四和第五外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)任选地还包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个不同的外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)任选地还包含1-100、1-200个不同的外源多肽。
在某些实施方案中，包含抗原的工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)可在包含HLA-E多肽或HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽的背景下加工和/或呈递抗原，从而产生抗原特异性T细胞并扩大其群体。因此，可将感兴趣的抗原引入本公开的aAPC，其中aAPC在包含HLA-E多肽或HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽的背景下呈递抗原，即，将包含HLA-E多肽或HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽“装载”或结合抗原，并且可将aAPC用于产生抗原特异性T细胞。因此，一些方面，本公开提供了经工程化改造为调节免疫细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，其中细胞呈递包含HLA-E多肽或HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽。
在其他方面，本公开提供了经工程化改造以激活调节性T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，其中工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)呈递外源抗原性多肽和外源共刺激性多肽。
在一些方面，本公开提供了经工程化改造以激活调节性T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，其中细胞呈递外源抗原呈递多肽(如，包含HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽)和外源抗原呈递多肽，其中外源抗原呈递多肽是单链融合多肽。
其他方面，本公开提供了经工程化改造以激活和扩增调节性T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核红系细胞)，其中所述细胞包括外源抗原呈递多肽(如，包含HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽)、外源抗原性多肽和外源共刺激性多肽、外源调节性T细胞共刺激性多肽和/或包含细胞因子的外源多肽。
在一些实施方案中，aAPC能够刺激与aAPC接触的免疫细胞。在其他实施方案中，刺激包括激活CD8+T细胞、激活CD4+T细胞、刺激T细胞的细胞毒活性、刺激由T细胞分泌细胞因子和/或其任何组合。
在其他方面，本公开提供了人工抗原呈递细胞(aAPC)，其经工程化改造以抑制某些免疫细胞群体，如自然杀伤细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)等，其中aAPC包含工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，呈递外源抗原性多肽和外源共抑制性多肽。
在一些方面，本公开提供了人工抗原呈递细胞(aAPC)，其经工程化改造以抑制某些免疫细胞群体，例如自然杀伤细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)等，其中aAPC包含工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，其中所述细胞包括外源抗原呈递多肽(如，包含HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽)和外源抗原性多肽，其中所述外源抗原呈递多肽是HLA-E或HLA-G单链融合多肽。在一些实施方案中，单链融合多肽包含与HLA-E多肽或HLA-G多肽连接的外源抗原性多肽。
在其他方面，本公开提供了经工程化改造以抑制某些免疫细胞群体的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中所述aAPC包括工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞))，其中细胞呈递外源抗原呈递多肽(如，包含HLA-G多肽或HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽)、外源抗原性多肽、外源共抑制性多肽和/或包含细胞因子的外源多肽。
在一些实施方案中，目的是激活或抑制T细胞。为了确保相对于也可表达本文所述的激活或抑制性受体的其他免疫细胞优先靶向T细胞，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)上的外源多肽中的一个可包含靶向部分，如结合T细胞受体(TCR)或另一种T细胞标志物的抗体分子。靶向部分在下文更详细地描述。在一些实施方案中，可增强或抑制特定的T细胞亚型或克隆。在一些实施方案中，工程化红系细胞的一种或多种外源多肽是包含HLA-E或HLA-G多肽的外源多肽，所述HLA-E或HLA-G多肽“负载”抗原肽，所述抗原肽会以抗原特异性方式选择性结合T细胞受体。
在一些方面，本公开提供了人工抗原呈递细胞(aAPC)，其经工程化改造以抑制T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞的活性，其中aAPC包含工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，其中红系细胞包括外源抗原呈递多肽(如，包含HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽)、外源抗原性多肽和表3中公开的外源共抑制性多肽中的至少一种或包含IL10、PDL1或4-1BBL的外源多肽。
在其他方面，本公开提供了经工程化改造以抑制T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞活性的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包含工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，其中红系细胞包括外源抗原呈递多肽(如，包含HLA-G多肽的外源抗原性多肽)，外源抗原性多肽和选自IL10、PDL1或4-1BBL的至少一种外源共抑制性多肽。
在一些实施方案中，aAPC能够阻抑与aAPC接触的T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。在其他实施方案中，aAPC能够阻抑与aAPC相互作用的T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。在进一步的实施方案中，阻抑包括抑制细胞、使细胞无应答或诱导细胞凋亡。
在一些方面，本公开提供了工程化以激活调节性T细胞(Treg细胞)的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC包括工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，其中红系细胞包括外源抗原呈递多肽(如，包含HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽)和外源抗原性多肽。在一些实施方案中，aAPC进一步呈递外源Treg扩增多肽或包含细胞因子(如，IL-15)的外源多肽。
在一些实施方案中，工程化红系细胞包含外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子或外源Treg共刺激性多肽)，其中工程化红系胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)任选地还包含第二外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽)，其中第二外源多肽是本文所述的任何外源多肽。
本公开还应被解释为包括本文所述的外源多肽(或编码其的DNA)的“突变体”、“衍生物”和“变体”，其中突变体、衍生物和变体是共刺激配体、细胞因子、抗原(如，肿瘤细胞、病毒和其他抗原)，它们在一个或多个氨基酸上发生改变(或，当提及编码它们的核苷酸序列时，在一个或多个碱基对上发生变化)，从而产生的肽(或DNA)与本文所述的序列不同，但具有与本文公开的肽相同的生物学特性，因为该肽具有本公开的共刺激配体、细胞因子、抗原等的生物/生化特性(如，包含于aAPC，其中使包含蛋白的aAPC与T细胞接触，介导T细胞的增殖或以其他方式影响T细胞)。使用本领域所熟知的重组DNA方法，例如Sambrook andRussell(2001,Molecular Cloning,A Laboratory Approach,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,N.Y.)和Ausubel et al.(2002,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,NY)中所述的方法。通过改变编码多肽的DNA序列在蛋白或多肽中引入氨基酸变化的方法是本领域所熟知的，并且也在这些和其他专著中描述。
熟练技术人员一旦掌握了本文提供的教导，将理解本公开的aAPC不以任何方式限于任何特定的外源抗原性多肽、细胞因子、共刺激性多肽、特异性结合共刺激分子的抗体等。相反，本公开包含含有许多分子的aAPC，全部在单个启动子/调节序列的控制下，或者在一个以上此类序列的控制下。此外，本公开包括施用一种或多种本公开的aAPC，其中各种aAPC包含不同的分子。即，各种分子(如，共刺激性多肽、外源抗原性多肽、细胞因子等)可以顺式(即，在同一aAPC中和/或由同一连续核酸编码或在同一aAPC内的不同核酸分子上)或反式(即，各种分子包含在不同aAPC中)起作用。
循环时间
在一些实施方案中，本公开的工程化红系细胞或去核细胞(如，去核红系细胞)在施用于受试者后循环至少约1天至约240天(如，至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、61天、62天、63天、64天、65天、66天、67天、68天、69天、70天、71天、72天、73天、74天、75天、76天、77天、78天、79天、80天、81天、82天、83天、84天、85天、86天、87天、88天、89天、90天、91天、92天、93天、94天、95天、96天、97天、98天、99天、100天、101天、102天、103天、104天、105天、106天、107天、108天、109天、110天、111天、112天、113天、114天、115天、116天117天、118天、119天、120天、121天、122天、123天、124天、125天、126天、127天、128天、129天、130天、131天、132天、133天、134天、135天、136天、137天、138天、139天、140天、141天、142天、143天、144天、145天、146天、147天、148天、149天、150天、151天、152天、153天、154天、155天、156天、157天、158天、159天、160天、161天、162天、163天、164天、165天、1676天天、168天、169天、170天、171天、172天、173天、174天、175天、176天、177天、178天、179天、180天、181天、182天、183天、184天、185天、186天、187天、188天、189天、190天、191天、192天、193天、194天、195天、196天、197天、198天、199天、200天、201天、202天、203天、204天、205天、206天、207天、208天、209天、210天、211天、212天、213天、214天、215天、216天、217天、217天、219天、220天、221天、222天、223天、224天、225天、226天、227天、228天、229天、230天、231天、232天、233天、234天、235天、236天、237天、238天、239天或240天。
修饰
一种或多种外源蛋白可包括真核细胞(如，哺乳动物细胞，例如人细胞)特征性的翻译后修饰。在一些实施方案中，一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)外源蛋白是糖基化的、磷酸化的或两者。糖蛋白的体外检测可使用改进的过碘酸-Schiff(PAS)法在SDS-PAGE凝胶和Western印迹上完成。糖蛋白的细胞定位可利用本领域已知的凝集素荧光缀合物来完成。可使用磷酸化特异性抗体通过Western印迹评估磷酸化。
翻译后修饰还包括与疏水基团缀合(如，肉豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、异戊烯化或糖基磷脂酰肌醇化(glypiation))、与辅因子缀合(如，硫辛酰化(lipoylation)、黄素部分(如，FMN或FAD)、血红素C附着、磷酸泛酰巯基乙胺化(phosphopantetheinylation)或亚视黄基(retinylidene)Schiff碱形成)、白喉酰胺形成、乙醇胺磷酸甘油附着、hypusine形成、酰化(如O-酰化、N-酰化或S-酰化)、甲酰化、乙酰化、烷基化(如，甲基化或乙基化)、酰胺化、丁酰化、γ-羧化、丙二酰化、羟基化、碘化、核苷酸加成如ADP-核糖基化、氧化、磷酸酯(O-连接)或氨基磷酸酯(N-连接)形成(如，磷酸化或腺苷酰化)、丙酰化、焦谷氨酸形成、S-谷胱甘肽化、S-亚硝基化、琥珀酰化、硫酸化、ISG化、SUMO化、泛素化、Nedd化(Neddylation)或氨基酸的化学修饰(如，瓜氨酸化、脱酰胺、eliminylation或氨基甲酰化)、二硫键的形成、外消旋化(如，脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸的外消旋化)。在实施方案中，糖基化包括向精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、羟赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或色氨酸添加糖基，产生糖蛋白。在实施方案中，糖基化包括如O-连接的糖基化或N-连接的糖基化。
拷贝数
在一些实施方案中，第一外源多肽和第二外源多肽以重量或拷贝数计，具有约1:1、约2:1至1:2、约5:1至1:5、约10:1至1:10、约20:1至1:20、约50:1至1:50、约100:1至1:100的丰度比。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包含第一外源多肽和第二外源多肽各自至少10个拷贝、100个拷贝、1,000个拷贝、5,000个拷贝、10,000个拷贝、25,000个拷贝、50,000个拷贝或100,000个拷贝。在一些实施方案中，相比第二外源多肽的拷贝数，第一外源多肽的拷贝数不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％以上，或不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍。在一些实施方案中，相比第一外源多肽的拷贝数，第二外源多肽的拷贝数不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％以上，或不超过2、5、10、20、50、100、200、500或1000倍。
在一些实施方案中，第一外源多肽包括约50,000至约600,000个拷贝的第一外源多肽，例如，约50,000、60,000、60,000、80,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、155,000、160,000、165,000、170,000、175,000、180,000、185,000、190,000、195,000、200,000、205,000、210,000、215,000、220,000、225,000、230,000、235,000、240,000、245,000、250,000、255,000、260,000、265,000、270,000、275,000、280,000、285,000、290,000、295,000、300,000、305,000、310,000、315,000、320,000、325,000、330,000、335,000、340,000、345,000、350,000、355,000、360,000、365,000、370,000、375,000、380,000、385,000、390,000、395,000、400,000、450,000、500,000、550,000、600,000个拷贝的第一多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包含约50,000至600,000、约100,000至600,000、约100,000至500,00000、约100,000至150,000、约150,000至300,000、或150,000-200,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红相系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包含至少约75,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红相系细胞包含至少约100,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约125,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约150,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约175,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约200,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约250,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约300,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约400,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约500,000个拷贝的第一外源多肽。在一些实施方案中，第二外源多肽包括约50,000至约600,000个拷贝的第二外源多肽，例如，约50,000、60,000、60,000、80,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、155,000、160,000、165,000、170,000、175,000、180,000、185,000、190,000、195,000、200,000、205,000、210,000、215,000、220,000、225,000、230,000、235,000、240,000、245,000、250,000、255,000、260,000、265,000、270,000、275,000、280,000、285,000、290,000、295,000、300,000、305,000、310,000、315,000、320,000、325,000、330,000、335,000、340,000、345,000、350,000、355,000、360,000、365,000、370,000、375,000、380,000、385,000、390,000、395,000、400,000、450,000、500,000、550,000、600,000个拷贝的第二多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含约50,000至600,000、约100,000至600,000、约100,000至500,000、约100,000至400,000、约100,000至400,000或约100,000至150,000、约150,000至300,000、或150,000-200,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约75,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约100,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约125,000个拷贝的第二外泌体基因多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约150,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约175,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核类红细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包含至少约200,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包含至少约250,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞包含至少约300,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包含至少约400,000个拷贝的第二外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包含至少约500,000个拷贝的第二外源多肽。
基因编辑
在一些方面，本公开的特征在于制备免疫学相容的人工抗原呈递细胞(aAPC)的方法，其中合适的细胞(如，有核红系细胞、红系前体细胞或有核血小板前体细胞)表达外源抗原性多肽(如，包含HLA-E多肽或HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽)，所述方法包括使aAPC与切割编码HLA-E或HLA-G多肽的内源核酸的核酸酶和至少一种gRNA接触，其中编码HLA-E或HLA-G多肽的内源核酸通过基因编辑途径修饰并导致内源HLA-E或HLA-G多肽的水平降低，从而制备免疫学相容的aAPC。
在一些实施方案中，使用靶向一种或多种选择的DNA序列的核酸酶对合适的细胞(如，有核红系细胞、红系前体细胞或有核血小板前体细胞)进行遗传修饰。此类方法可用于在内源基因组基因座的选定位点诱导精确切割。使用可靶向的核酸酶(如，在感兴趣的限定位点处)将DNA插入基因组中，在基因组中替换或从基因组中去除的基因工程称为“基因组编辑”。此类核酸酶的示例包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、工程化大范围核酸酶归巢内切核酸酶和RNA导向核酸酶，如CRISPR(规律间隔成簇短回文重复序列)相关的(Cas)核酸酶，例如，衍生自II型细菌CRISPR/Cas系统(如，Cas9)。
在一些实施方案中，改变首先使用CRISPR引(即，增加HLA-E或HLA-G的内源表达)。然后，用于呈递的抗原也经由CRISPR引入并在内部进行加工。
在一些实施方案中，核酸酶包含DNA切割域和将核酸酶靶向特定DNA序列的DNA结合域(DBD)，从而允许核酸酶以序列特异性方式用于工程化改造基因组改变。DNA切割域可在其靶向序列处或附近产生双链断裂(DSB)或切口。ZFN包含基于锌指(ZF)蛋白的DBD选择或设计的DBD。ZF蛋白的DBD通过一个或多个锌指以序列特异性的方式结合DNA，所述锌指是氨基酸序列的区域，其结构通过锌离子的配位得以稳定。TALEN包含基于黄单胞菌属种(Xanthomonas spp.)的转录激活物样(TAL)效应物(TALE)的DBD选择或设计的DBD。ZFN或TALEN二聚体诱导刺激DNA损伤应答途径的靶向DNA DSB。设计的锌指域的结合特异性将ZFN导向特定的基因组位点。TALE含有多个33-35个氨基酸的重复域，其每一个都识别单个碱基对。像ZFN一样，TALEN诱导靶向的DSB，所述DSB激活DNA损伤应答途径并实现定制改变。工程化位点特异性核酸酶的DNA切割域可包含来自天然存在的内切核酸酶(如，Fok1核酸内切酶或其变体)的催化域。在一些实施方案中，可使用具有设计为改善切割特异性和/或切割活性的突变的Fok1切割域变体(参见例如Guo,J.,et al.(2010)Journal of MolecularBiology 400(1):96-107；Doyon,Y.,et al.,(2011)Nature Methods 8:74-79)。大范围核酸酶是序列特异性内切核酸酶，其特征在于大的识别位点(12至约40个碱基对的双链DNA序列)。在给定的基因组中，位点通常出现不超过一次。可通过引入核酸酶的序列改变(如，在DNA结合域中)，然后选择能够切割天然识别位点的变体的功能性酶，或者通过将来自不同核酸酶的蛋白域缔合或融合来改变大范围核酸酶的特异性。
在一些实施方案中，可将RNA导向核酸酶进行基因组编辑。例如，考虑使用基于CRISPR/Cas的系统。在一些实施方案中，将Cas核酸酶如Cas9(如，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)或脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningiditis)的Cas9或其变体))与包含与感兴趣的序列互补的序列的向导RNA一起引入细胞(RNA有时又被称为单一向导RNA)。互补区域可以是例如约20个核苷酸长。Cas核酸酶，例如Cas9，通过向导RNA引导至特定的感兴趣的DNA序列。可对向导RNA进行工程化改造以使其与基因组中的感兴趣的靶序列(如，任何感兴趣的基因或基因间区域中的序列)具有互补性。Cas蛋白，例如Cas9的核酸酶活性切割DNA，其可使基因失效或将其切开，从而允许插入不同的DNA序列。在一些实施方案中，将包含与不同基因(如，2、3、4、5或更多个基因)互补的序列的多个sgRNA顺序或一起引入同一细胞中。在一些实施方案中，多个基因的改变可从而在同一步骤中产生。
通常，将基于核酸酶的系统用于基因工程，例如基因组编辑，需要将核酸酶引入细胞中并将细胞在一定条件下维持一段时间，所述条件和时间适合于核酸酶切割细胞的DNA。
对于CRISP/Cas系统，还引入了向导RNA。通常通过引入编码核酸酶的核酸将核酸酶引入细胞中。核酸可以可操作地与能够指导在细胞中表达的启动子连接，并且可在质粒或其他载体中引入细胞。在一些实施方案中，可引入编码核酸酶的mRNA。在一些实施方案中，可引入核酸酶本身。可直接引入sgRNA(通过诸如转染的方法)或者可通过从核酸构建体(如，表达载体)表达sgRNA来引入sgRNA。在一些实施方案中，sgRNA和Cas蛋白由已引入细胞的单一表达载体表达，或者在一些实施方案中，由不同的表达载体表达。在一些实施方案中，将包含与不同基因(如，2、3、4、5或更多个基因)互补的序列的多个sgRNA单独或者一起作为RNA或者通过将编码sgRNA的一种或多种核酸构建体引入细胞进行细胞内转录来引入同一细胞中。
通过核酸酶切割后，靶基因座(如，在细胞的基因组中)可经历DNA损伤修复的两个主要途径之一，即非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)。在不存在与在切割位点侧翼的序列包含足够同源性的合适的修复模板以刺激HDR的情况下(参见下面的讨论)，DSB通过NHEJ重新连接，这可能导致插入或缺失。NHEJ可用于例如工程化改造基因敲除或生成活性改变的蛋白。例如，外显子的插入或缺失可导致移码突变或提前终止密码子。可生成两个或多个DSB，以在基因组中产生更大的缺失。
在一些实施方案中，除核酸酶之外，还将包含待在切割位置处插入基因组的感兴趣的序列的核酸(如，质粒或线性DNA)引入细胞。在一些实施方案中，将感兴趣的序列插入基因。感兴趣的序列可至少部分替换基因。在一些实施方案中，核酸包含与切割位点侧翼的序列同源的序列，从而刺激同源定向修复。在一些实施方案中，与切割位点处或附近的细胞基因组中存在的序列相比，核酸含有期望的改变。包含至少部分引入基因组的序列的核酸，例如包含同源序列和期望的改变的核酸序列可被称为“供体序列”。供体序列可在断裂位点处至少部分地物理整合到基因组中，或者可用作修复断裂的模板，导致将供体中存在的全部或部分核苷酸序列引入细胞的基因组。因此，可改变细胞基因组中的序列，并且在某些实施方案中，可将其转化为供体核酸中存在的序列。在一些实施方案中，供体序列可包含在环状DNA(如，质粒)、线性双链DNA(如，线性化质粒或PCR产物)或单链DNA(如，单链寡核苷酸)中。在一些实施方案中，供体序列与基因组中靶位点的任一侧或每一侧具有约10-25bp和约50-100bp的同源性。在一些实施方案中，可使用更长的同源序列，例如，在约100-500bp直至约1-2kB，或更多。在一些实施方案中，将改变引入基因的一个等位基因中。在一些实施方案中，将第一改变引入基因的一个等位基因中，并且将不同的改变引入另一等位基因中。在一些实施方案中，将相同的改变引入两个等位基因中。在一些实施方案中，可在单个步骤中对两个等位基因或靶位点(或更多个)进行遗传修饰。在一些实施方案中，可在单独的步骤中对两个等位基因或靶位点(或更多个)进行遗传修饰。
设计、生成和使用ZFN和/或TALEN的方法描述于，例如WO2011097036；Urnov,FD,etal.,Nature Reviews Genetics(2010),11:636-646；Miller JC,et al.,Nat Biotechnol.(2011)29(2):143-8；Cermak,T.,et al.Nucleic Acids Research(2011)39(12):e82,Sanjana,N.E.et al.A transcription activator-like effector toolbox for genomeengineering.Nat Protoc 7,171-192(2012)及以上任一参考文献。用于基因组工程化的基于ZFN、TALEN和CRISPR/Cas的方法综述于Gaj,T.,et al.,Trends Biotechnol.2013Jul；31(7):397-405.Epub 2013May 9。CRISPR/Cas系统在基因组工程化中的用途描述于，例如Cong L,et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cassystems.Science.2013；339(6121):819-23；Mali P,et al.,RNA-guided human genomeengineering via Cas9.Science.2013；339(6121):823-6；Wang,H.et al.One-stepgeneration of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.Cell 153,910-918(2013)；Ran,F.A.et al.DoubleNicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome EditingSpecificity.Cell 154,1380-1389(2013)；Mali,P.,et al.,Nat Methods.2013；10(10):957-63；Ran,FA,Nat Protoc.2013；8(11):2281-308。在一些实施方案中，仅切割dsDNA的一条链的核酸酶(切口酶)可用于刺激HDR而不激活NHEJ修复途径。可通过灭活双链切割所需的ZFN或TALEN二聚体中的一个核酸酶单体的催化活性或灭活Cas蛋白的催化域来产生切口酶。例如，催化残基之一(RuvC核酸酶域中的D10和HNH核酸酶域中的H840)的突变，例如突变为丙氨酸(D10A、H840A)，将Cas9转化为DNA切口酶。
在一些实施方案中，基于CRISP/Cas的系统可用于调控基因表达。例如，向导RNA与缺乏核酸内切酶活性的无催化活性的Cas9的共表达生成了DNA识别复合物，其可特异性地干扰转录延伸、RNA聚合酶结合或转录因子结合。该系统有时被称为CRISPR干扰(CRISPRi)，其可有效地抑制哺乳动物细胞中靶基因的表达(Qi,S.,et al.,Cell,2013；152(5):1173-83；Larson,MH,et al,Nat Protoc.2013；8(l l):2180-96)。通过将多种效应物域中的任一个附接至无催化活性的Cas9，可产生可以用于实现对基因表达和/或DNA修饰的序列特异性控制的嵌合Cas9蛋白。合适的效应物域包括例如转录激活域(如，包含VP16反式激活域例如VP64的那些)、转录共激活域、转录抑制性或共抑制性域、蛋白-蛋白相互作用域、酶域等。向导RNA将嵌合Cas9蛋白引导至基因组中的感兴趣的位点(如，在表达控制元件(如，启动子)中或附近)，从而效应物域发挥作用，如激活或抑制转录活性(参见，例如Gilbert LA,etal..Cell.2013；154(2):442-51；Maeder ML,et a..,Nat Methods,2013；10(10):977-9)。适当的效应物域可以是天然存在的蛋白中存在的任何效应物域，其能够执行感兴趣的功能(如，抑制或激活转录)。
可选择或分析已经历遗传工程化过程的细胞，以鉴定或分离表达期望的重组基因产物或缺乏已经经由基因工程失去能力的内源基因的表达或具有任何期望的遗传改变的细胞。例如，在一些实施方案中，供体序列或用于递送供体序列的载体可包含可选择标志物，其可用于选择已将包含可选择标志物的供体序列的至少一部分掺入其基因组中的细胞。在一些实施方案中，不使用选择。在一些实施方案中，可例如通过Southern印迹来筛选细胞，以鉴定具有期望的遗传改变的那些细胞或克隆。如果期望，可测试细胞的重组基因产物或内源基因产物的表达水平或活性，或者测试与重组或内源基因产物相关的一种或多种功能特性或通过重组或内源基因产物赋予的一种或多种功能特性，或任何其他感兴趣的标准。合适的分析方法是本领域普通技术人员已知的，并且包括例如Western印迹、流式细胞术、FAGS、免疫荧光显微术、ELISA测定法、基于亲和力的方法，其中细胞与能够与感兴趣的蛋白结合的试剂(其标记或保留表达该蛋白质的细胞)等接触。可基于重组基因产物的身份、内源基因产物和/或感兴趣的功能或特性来选择功能测定法。例如，功能特性可以是与感兴趣的抗原结合的能力或针对表达感兴趣的抗原的靶细胞施加细胞毒性的能力。可以例如通过PGR、Southern印迹或测序来分析细胞，以确定插入的DNA序列的数目、位置，和/或确定是否已经发生所期望的基因组改变。具有期望的改变、表达水平和/或功能特性的一种或多种细胞可经鉴定、繁殖、扩增。细胞或它们的后代可以用于生成细胞系，进行sortagg(sortagging)和/或储存供将来使用。
工程化红系细胞群体
一方面，本发明的特征在于包含本文所述的工程化红系细胞或去核细胞群体，例如多个工程化红系细胞或工程化红系细胞群体。术语“多个”和“群体”在本文互换使用。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞群体可主要包括去核细胞(如，多于70％)、主要包括有核细胞、或包括去核和有核细胞的任何混合物。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞群体可包括网织红细胞、红细胞、或网织红细胞和红细胞的混合物。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞群体可主要包括网织红细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞群体可主要包括红细胞(如，未成熟或成熟红系细胞)。
在一些实施方案中，工程化红系细胞群体基本上由去核细胞组成。在一些实施方案中，工程化红系细胞群体主要或基本上包括去核细胞。例如，在一些实施方案中，工程化红系细胞群体包括至少约70％或更多的去核细胞。在一些实施方案中，本文提供的群体包括至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99或约100％的去核细胞。在一些实施方案中，本文提供的群体包括多于约70％的去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包含多于约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的去核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞群体包括约80％至约100％的去核细胞，例如，约80％至约95％、约80％至约90％、约80％至约85％、约85％至约100％、约85％至约95％、约85％至约90％、约90％至约100％、约90％至约95％、或约95％至约100％的去核细胞。
在一些实施方案中，工程化红系细胞群体包括少于约30％的有核细胞。例如，在实施方案中，工程化红系细胞群体包括少于约1％、约2％、约3％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％或少于约30％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包括少于约1％、约2％、约3％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％或约30％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞群体包括0％至30％的有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞的群体包括约0％至20％的有核细胞，例如，约0％至19％、约0％至15％、约0％至10％、约0％至5％、约0％至4％、约0％至3％、约0％至2％的有核细胞，或约5％至20％、约10％至20％、或约15％至20％的有核细胞。
在一些实施方案中，本公开的特征在于本文所述的工程化红系细胞群体，其中工程化红系细胞的群体包括少于30％的有核细胞和至少70％的去核细胞，或包括少于20％的有核细胞和至少80％的有核细胞，或包括少于15％的有核细胞和至少85％的去核细胞，，或包括少于10％的有核细胞和至少90％的去核细胞，或包括少于5％的有核细胞和至少95％的去核细胞。在一些实施方案中，本公开的特征在于本文所述的工程化红系细胞群体，其中工程化红系细胞的群体包括约0％的有核细胞和约100％的去核细胞、约1％的有核细胞和约99％的去核细胞、约2％的有核细胞和约98％的去核细胞、约3％的有核细胞和约97％的去核细胞、约4％的有核细胞和约96％的去核细胞、约5％的有核细胞和约95％的去核细胞、约6％的有核细胞和约94％的去核细胞、约7％的有核细胞和约93％的去核细胞、约8％的有核细胞和约92％的去核细胞、约9％的有核细胞和约91％的去核细胞、约10％的有核细胞和约90％的去核细胞、约11％的有核细胞和约89％的去核细胞、约12％的有核细胞和约88％的去核细胞、约13％的有核细胞和约87％的去核细胞、约14％的有核细胞和约86％的去核细胞、约85％的有核细胞和约85％的去核细胞、约16％的有核细胞和约84％的去核细胞、约17％的有核细胞和约83％的去核细胞、约18％的有核细胞和约82％的去核细胞、约19％的有核细胞和约81％的去核细胞、或约20％的有核细胞和约80％的去核细胞。
在另一个实施方案中，工程化红系细胞群体主要或实质上包括有核细胞。在一些实施方案中，工程化红系细胞群体基本上由有核细胞组成。在各个实施方案中，工程化红系细胞群体中的有核细胞是红系前体细胞。在一些实施方案中，红系前体细胞选自：多能造血干细胞(HSC)、多能髓样祖细胞、CFU-S细胞、BFU-E细胞、CFU-E细胞、原红细胞、嗜碱性正成红细胞、多染性正成红细胞或正染性正成红细胞。
在某些实施方案中，工程化红系细胞群体包括至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的有核细胞。
应理解的是，在制备本文所述的工程化红系细胞期间，细胞的某些级分可不包括外源多肽(如，由于缺乏表达或转导或与外源核酸缀合)。因此，在一些实施方案中，本文提供的工程化红系细胞群体包括工程化红系细胞和未经修饰的红系细胞的混合物，或经修饰的去核细胞和未经修饰的去核细胞的混合物，即，该群体中的一些细胞级分将不包含(如，表达)外源多肽。例如，在各种实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞群体可包括至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的包含外源多肽的工程化红系细胞或去核细胞，其中群体中剩余的红系细胞或去核细胞不包含外源多肽。在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞的单一单位剂量可包含至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的包含外源多肽的红系细胞或去核细胞，其中剂量中剩余的红系细胞或去核细胞不包含外源多肽。III.制备人工抗原呈递细胞的方法
本公开考虑了制备aAPC的各种方法。一方面，本公开的特征在于制备免疫相容的人工抗原呈递细胞(aAPC)的方法，其中aAPC包含呈递外源抗原性多肽的工程化红系细胞(如，工程化去核类红细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，该方法包括使有核细胞与切割内源核酸的核酸酶和至少一种gRNA接触以导致内源抗原呈递多肽、内源膜锚多肽或内源共刺激或共抑制性多肽的表达；将编码外源抗原性多肽的外源核酸引入有核细胞中；在适合由内源抗原呈递多肽表达和呈递外源抗原性多肽且去核的条件下培养有核细胞，从而制备去核细胞，从而制备免疫相容的aAPC。本文描述了制备aAPC的方法，但是应当理解这些方法是非限制性的。
下面更详细地描述了制备工程化红细胞和去核细胞的过程。
制备去核红系细胞的方法
制备包含外源因子(如，多肽)的去核红系细胞的方法描述于例如国际申请公开号WO2015/073587和WO2015/153102中，其各自通过引用整体并入。
在一些实施方案中，使造血祖细胞，如CD34+造血祖细胞(如，人(如，成年人)或小鼠细胞)与编码一种或多种外源多肽的一种或多种核酸接触，并允许细胞在培养中扩增和分化。在一些实施方案中，CD34+细胞被永生化，如包含人乳头瘤病毒(HPV；如，HPV 16型)E6和/或E7基因。在一些实施方案中，永生化CD34+造血祖细胞是BEL-A细胞系细胞(参见，Trakarnasanga et al.(2017)Nat.Commun.8:14750)。在美国专利号9,951,350和8,975,072中描述了其他永生化CD34+造血祖细胞。在一些实施方案中，使永生化CD34+造血祖细胞与编码一种或多种外源多肽的一种或多种核酸接触，并允许细胞在培养中扩增和分化。
在一些实施方案中，本文所述的红系细胞通过包括使有核红系细胞(如，红系前体细胞)与外源核酸接触的方法制备。在一些实施方案中，外源核酸是密码子优化的。例如，外源核酸可以不改变由该密码子编码的氨基酸但增加该核酸翻译的方式包含一个或多个与野生型密码子不同的密码子，例如，通过使用宿主细胞(如，乳动物细胞，例如红系细胞)优选的密码子。
外源核酸可以是例如DNA或RNA(如，mRNA)。许多病毒可用作基因转移载体，包括逆转录病毒、莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MMLV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒如人免疫缺陷病毒1(HIV1)和泡沫病毒类，例如例如泡沫病毒。
在一些实施方案中，外源核酸与组成型启动子可操作地连接。在一些实施方案中，可将组成型启动子用于驱动靶向部分的表达。
在一些实施方案中，外源核酸与诱导型或抑制型启动子可操作地连接，例如以驱动氨基酸降解酶的表达。例如，启动子可以是多西环素诱导型，如P-TRE3GS启动子或其活性片段或变体。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白诱导型启动子、糖皮质激素诱导型启动子、孕酮诱导型启动子和四环素诱导型启动子(其也可以是多西环素诱导型)。在一些实施方案中，将诱导剂添加到包含含有诱导型启动子的细胞的培养基中，例如在细胞分化的特定阶段。在一些实施方案中，诱导剂(如，多西环素)以约1-5、2-4或3μg/mL的量添加。在一些实施方案中，阻抑物从包含含有阻抑性启动子的细胞的培养基中去除，例如在细胞分化的特定阶段。在一些实施方案中，在成熟阶段期间，例如成熟阶段的第1-10、2-9、3-8、4-6天或约第5天添加诱导剂或去除阻抑物。在一些实施方案中，在成熟和去核的第1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天之间存在诱导物或不存在阻遏物。在一些实施方案中，诱导物存在或阻遏物不存在持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。在一些实施方案中，从成熟第5天到分化结束存在诱导物或不存在阻遏物。在实施方案中，在成熟第9天存在诱导剂或不存在阻抑剂。在一些实施方案中，当红细胞群包含多种正成红细胞(如，嗜碱、多染性或正染性正成红细胞或其组合)，如群体中10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％或70-80％的细胞是正成红细胞时，添加诱导剂或去除阻抑物。在一些实施方案中，当红系细胞群体包含多种原红细胞，如群体中10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％或70-80％的细胞是原红细胞时，添加诱导剂或去除阻抑物。在一些实施方案中，当红系细胞群体包含多种处于终末分化的成红细胞，如群体中10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％或70-80％的细胞是终末分化的成红细胞时，添加诱导剂或去除阻抑物。在一些实施方案中，红系细胞或红系细胞群体包括额外的外源蛋白，例如反式激活蛋白，如Tet诱导型反式激活蛋白(如，Tet-on-3G反式激活蛋白)。
在一些实施方案中，当红系细胞群体包含内源GPA、band 3或α4整合蛋白中的一种或多种(如，全部)时，添加诱导剂或去除阻抑物。在一些实施方案中，在群体中约84-100％、85-100％、90-100％或95-100％的细胞为GPA阳性的时间期间(如，当群体首次达到该水平时)；在群体中50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、95-100％或98-100％的细胞为band 3阳性的时间期间(如，当群体首次达到该水平时)；和/或在群体中约70-100％、80-90％或约85％的细胞为α4整合蛋白阳性的时间期间(如，当群体首次达到该水平时)，添加诱导剂或去除阻抑物。
GPA、band 3和α4整合蛋白可通过例如流式细胞术测定来检测，例如，国际申请公开号WO2018/009838的实施例10的流式细胞术测定，通过引用并入本文。
在一些实施方案中，细胞使用缀合(如，sortagging或分选酶介导的缀合)产生，例如，如国际申请公开号WO2014/183071或WO2014/183066中所述，其各自通过引用整体并入。在一些实施方案中，细胞通过不包括分选酶介导的结合的方法制备。
在一些实施方案中，细胞通过不包括低渗负载的方法制备。在一些实施方案中，细胞通过不包括低渗透析步骤的方法制备。在一些实施方案中，细胞通过不包括受控细胞变形的方法制备。
在一些实施方案中，将红系细胞扩增至少1000、2000、5000、10,000、20,000、50,000或100,000倍(并且任选地高达100,000、200,000或500,000倍)。在一些实施方案中，细胞数量使用自动细胞计数器测量。
在一些实施方案中，红系细胞群体包括至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％或98％(和任选地高达约80％、90％或100％)的去核红系细胞。在一些实施方案中，红系细胞群体包括70％-100％、75％-100％、80％-100％、85％-100％或90％-100％的去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞群体包括少于1％的活的有核细胞，例如不包含可检测的活的有核细胞。在一些实施方案中，去核通过使用核染色剂的FACS测量。在一些实施方案中，群体中至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％或98％(和任选地高达约70、80、90或100％)的红系细胞包括一种或多种(如，2、3、4或更多种)外源多肽。在一些实施方案中，使用针对多肽的标记抗体通过红系细胞测量多肽的水平。在一些实施方案中，群体中至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％或98％(和任选地高达约70、80、90或100％)的红系细胞被去核并且包含一种或多种(如，2、3、4或更多种)外源多肽。在一些实施方案中，红系细胞群体包含约1x109至2x109、2x109至5x109、5x109至1x1010、1x1010至2x1010、2x1010至5x1010、5x1010至1x1011、1x1011至2x1011、2x1011至5x1011、5x1011至1x1012、1x1012至2x1012、2x1012至5x1012、或5x1012至1x1013个细胞。
工程化红系细胞的物理特征
在一些实施方案中，本文所述的工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)具有本文所述的一种或多种(如，2、3、4或更多种)物理特性，例如，渗透脆性、细胞大小、血红蛋白浓度或磷脂酰丝氨酸含量。尽管不希望受理论束缚，但在一些实施方案中，本文所述的包括外源蛋白的工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)具有与野生型未经处理的红系细胞或去核细胞类似的物理特征。相反，低渗负载的红系细胞有时表现出异常的物理特性，例如增加的渗透脆性、改变的细胞大小、降低的血红蛋白浓度或增加的细胞膜外叶上的磷脂酰丝氨酸水平。
渗透脆性
在一些实施方案中，工程化红系细胞或去核细胞表现出与不包含外源多肽的分离的未培养的红系细胞基本上相同的渗透膜脆性。在一些实施方案中，工程化红系细胞群体或去核细胞中少于50％的细胞裂解物具有小于0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％NaCl的渗透脆性。可使用WO2015/073587(以其整体通过引用并入本文)中实施例59的方法测定渗透脆性。
细胞大小
在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)具有与野生型未处理的去核红系细胞近似的直径或体积。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)群体具有约4、5、6、7或8微米的平均直径，并且任选地，群体的标准差小于1、2或3微米。在一些实施方案中，一种或多种工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)具有约4-8、5-7或约6微米的直径。在一些实施方案中，红系细胞的直径小于约1微米，大于约20微米，在约1微米至约20微米之间、在约2微米至约20微米之间、在约3微米至约20微米之间、在约4微米至约20微米之间、在约5微米至约20微米之间、在约6微米至约20微米之间、在约5微米至约15微米之间、或在约10微米至约30微米之间。在一些实施方案中，使用Advia 120血液系统测量细胞直径。
在一些实施方案中，红系细胞的平均红细胞体积的体积大于10fL、20fL、30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fL、或大于150fL。在一些实施方案中，红系细胞的平均红细胞体积小于30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fL、160fL、170fL、180fL、190fL、200fL、或小于200fL。在一些实施方案中，红系细胞的平均红细胞体积为80至100、100至200、200至300、300至400或400至500飞升(fL)。在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)群体具有此段落所列出的平均红细胞体积，并且群体的标准差小于50fL、40fL、30fL、20fL、10fL、5fL、或2fL。在一些实施方案中，使用血液学分析仪(如，Coulter计数器)测量平均红细胞体积。
血红蛋白浓度
在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)具有与野生型未经处理的红系细胞或去核细胞类似的血红蛋白含量。在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包含至少约20、22、24、26、28或30pg，且任选地高达约30pg的总血红蛋白。在一些实施方案中，使用WO2015/073587(以其整体通过引用并入本文)的实施例33的德拉布坎(Drabkin’s)试剂方法测定血红蛋白水平。
磷脂酰丝氨酸含量
在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)在其细胞膜的外叶上具有与野生型未处理的红系细胞或去核细胞大致相同的磷脂酰丝氨酸含量。磷脂酰丝氨酸主要位于野生型未处理的红系细胞的细胞膜的内叶上，并且低渗负载可导致磷脂酰丝氨酸分布至它可引发免疫应答的外叶上。在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)群体包含少于约30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞对膜联蛋白V染色呈阳性。在一些实施方案中，通过染色优先结合PS的膜联蛋白-V-FITC并通过流式细胞术测量FITC荧光，例如使用WO2015/073587(以其整体通过引用并入本文)的实施例54的方法，来评估磷脂酰丝氨酸暴露。
其他特征
在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞，或者工程化红系细胞或去核细胞群体包含一种或多种(如，全部)内源GPA(C235a)、转铁蛋白受体(CD71)、Band 3(CD233)或整合蛋白α4(C49d)。可例如如国际申请公开号WO2018/009838(以其整体通过引用并入本文)的实施例10中所述测量这些蛋白。GPA阳性细胞和Band 3阳性细胞的百分比通常在红系细胞成熟期间增加，而整合蛋白α4阳性的百分比通常在整个成熟期间保持较高。
在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％GPA+(即,CD235a+)细胞。在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含约50％至约100％(如约60％至约100％、约65％至约100％、约70％至约100％、约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的GPA+细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测GPA的存在。
在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的CD71+细胞。在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包括约70％至约100％(如，约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的CD71+细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测CD71(转铁蛋白受体)的存在。
在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的CD233+细胞。在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含约70％至约100％(如，约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的CD233+细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测CD233(Band 3)的存在。
在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的CD47+细胞。在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含约70％至约100％(如，约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的CD47+细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测CD47(整合蛋白相关蛋白)的存在。
在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的CD36-(CD36阴性)细胞。在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含约70％至约100％(如，约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的CD36-(CD36阴性)细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测CD36的存在。
在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的CD34-(CD34阴性)细胞。在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含约70％至约100％(如，约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的CD34-(CD34阴性)细胞。在一些实施方案中，使用FACS检测CD34的存在。
在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的CD235a+/CD47+/CD233+细胞。在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含约70％至约100％(如，约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的CD235a+/CD47+/CD233+细胞。
在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含至少约50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的CD235a+/CD47+/CD233+/CD34-/CD36-细胞。在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含约70％至约100％(如，约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约75％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约95％至约98％)的CD235a+/CD47+/CD233+/CD34-/CD36-细胞。
在一些实施方案中，包含红系细胞的工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的棘红细胞。在一些实施方案中，工程化去核红系细胞或去核细胞群体包含少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的pyrenocyte。
通用供体红系细胞
在一些实施方案中，本文所述的红系细胞或去核细胞对于将施用细胞的受试者是自体的和/或同种异体的。例如，与受试者同种异体的红系细胞包括一种或多种血型特异性红系细胞(如，细胞可与受试者具有相同的血型)或一种或多种通用供体红系细胞。在一些实施方案中，与参照细胞相比，本文所述的去核红系细胞具有降低的免疫原性，例如具有降低的一种或多种血型抗原水平。
使用同种异体细胞进行输血时，可选择相容的ABO血型，以防止急性血管内溶血性输血反应。ABO血型的定义基于血型抗原A和B(位于与红细胞表面的糖蛋白和糖脂相关的寡糖链末端的单糖碳水化合物结构)的存在与否(综述见Liu et al.,Nat.Biotech.25:454-464(2007))。由于O型红细胞既不包含抗原A也不包含抗原B，因此它们可安全地输入任何ABO血型的接受者，例如A、B、AB或O型受者。O型红细胞被认为是通用的，可用于所有输血。因此，在一些实施方案中，本文所述的红系细胞是O型。相反，A型红系细胞可给予A型和AB型接受者，B型红系细胞可给予B型和AB型接受者，AB型红系细胞可给予AB型接受者。
在某些情况下，将非O型红系细胞转化为通用血型可能是有益的。酶促去除A型和B型红系细胞表面上的免疫优势单糖可用于产生O型样红系细胞群体(参见，例如Liu etal.,Nat.Biotech.25:454-464(2007))。可使用来自生咖啡豆的α-半乳糖苷酶转化B型红系细胞。可选择地或另外地，如果存在于红系细胞上，来自脑膜败血伊丽莎白菌(E.meningosepticum)细菌的α-N-乙酰半乳糖胺酶和α-半乳糖苷酶的酶活性可用于分别去除免疫显性A和B抗原(Liu et al.,Nat.Biotech.25:454-464(2007))。在一个实例中，在α-N-乙酰基半乳糖胺酶和α-半乳糖苷酶(约300μg/ml填充红系细胞)存在下，在200mM甘氨酸(pH6.8)和3mM NaCl中于26℃温育本文所述的分离的填充红系细胞60分钟。处理后，红系细胞用盐水离心冲洗3至4次，根据标准血库技术进行ABO分型。
虽然ABO血型系统在输血和移植中是最重要的，但在一些实施方案中，它可用于在待施用的红系细胞和接受者之间匹配其他血型，或者选择或制备一个或更多其他(如，次要)血型通用的红系细胞。第二血型是Rh系统，其中个体可以是Rh+或Rh-。因此，在一些实施方案中，本文所述的红系细胞是Rh-。在一些实施方案中，红系细胞是O型和Rh-型。
在一些实施方案中，本文所述的红系细胞对一种或多种次要血型抗原呈阴性，例如Le(ab-)(Lewis抗原系统)、Fy(ab-)(Duffy系统)、Jk(ab-)(Kidd系统)、MN-(MNS系统)、Kk-(Kell系统)、Lu(ab-)(Lutheran系统)和H-抗原阴性(Bombay表型)，或其任何组合。在一些实施方案中，红系细胞也是O型和/或Rh-型。例如，次要血型描述于例如Agarwal et al“Blood group phenotype frequencies in blood donors from a tertiary carehospital in north India”Blood Res.2013Mar；48(1):51–54，和Mitra et al“Bloodgroups systems”Indian JAnaesth.2014Sep-Oct；58(5):524–528，其各自通过引用整体并入本文。
分离红细胞
可使用各种方法来分离成熟的红细胞，如例如细胞洗涤器、连续流动细胞分离器、密度梯度分离、荧光激活细胞分选(FACS)、Miltenyi免疫磁性耗竭(MACS)或这些方法的组合(参见，例如van der Berg et al.,Clin.Chem.33:1081-1082(1987)；Bar-Zvi et al.,J.Biol.Chem.262:17719-17723(1987)；Goodman et al.,Exp.Biol.Med.232:1470-1476(2007))。
可通过简单的离心从全血中分离出红细胞(参见，例如van der Berg et al.,Clin.Chem.33:1081-1082(1987))。例如，可将EDTA抗凝全血在4℃下以800xg离心10分钟。去除富含血小板的血浆和血沉棕黄层，并用等渗盐水溶液(NaCl，9g/L)将红细胞洗涤三次。
可选择地，可使用密度梯度离心和各种分离介质(如，例如Ficoll、Hypaque、Histopaque、Percoll、Sigmacell或其组合)来分离红细胞。例如，将一定体积的Histopaque-1077在等体积的Histopaque-1119的顶部上分层。将等体积的等渗盐水溶液(NaCl，9g/L)中1:1稀释的EDTA抗凝全血在Histopaque的顶部上分层，并将样品在室温下以700x g离心30分钟。在这些条件下，粒细胞迁移到1077/1119界面，淋巴细胞、其他单个核细胞和血小板保留在血浆/1077界面，并且红细胞沉淀。用等渗盐水溶液将红细胞洗涤两次。
可选择地，可通过使用Percoll阶梯梯度离心分离红细胞(参见，例如Bar-Zvi etal.,J.Biol.Chem.262:17719-17723(1987))。例如，将新鲜血液与含有75mM柠檬酸钠和38mM柠檬酸的抗凝溶液混合，并且在Hepes缓冲盐水中短暂洗涤细胞。通过用α-纤维素和Sigmacell(1:1)的混合物吸附以去除白细胞和血小板。通过在Sorvall SS34转子中通过45/75％Percoll阶梯梯度以2500rpm离心10分钟，进一步从网织红细胞和残留的白细胞中分离出红细胞。红细胞在沉淀中回收，而网织红细胞带在45/75％界面处，其余白细胞带在0/45％界面处。通过在Hepes缓冲盐水中进行几次洗涤将Percoll从红细胞中去除。其他可用于产生密度梯度以分离红细胞的材料包括OPTIPREP(60％的碘克沙醇水溶液)(来自Axis-Shield,Dundee,Scotland)。
例如，可使用流式细胞术将红细胞与网织红细胞分开(参见，例如Goodman elal.,Exp.Biol.Med.232:1470-1476(2007))。在这种情况下，将全血离心(550x g，20分钟，25℃)以从血浆中分离细胞。将细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水溶液中，并进一步在Ficoll-Paque(1.077密度)上进行分级分离，例如，通过离心(400x g，30分钟，25℃)将红细胞与白细胞分离。将得到的细胞沉淀重悬于补充有10％胎牛血清的RPMI中，并基于大小和粒度在FACS仪如例如Becton Dickinson FACSCalibur(BD Biosciences,Franklin Lakes,N.J.,USA)上分选。
可通过免疫磁性耗竭分离红细胞(参见，例如Goodman,el al.,(2007)Exp.Biol.Med.232:1470-1476)。在这种情况下，具有细胞类型特异性抗体的磁珠用于消除非红细胞。例如，使用本文所述的密度梯度将红细胞与大多数其他血液组分分离，然后对任何残留的网织红细胞进行免疫磁性耗竭。于25℃下用人抗体血清预处理细胞20分钟，然后用针对网织红细胞特异性抗原(如，CD71和CD36)的抗体进行处理。抗体可直接附着于磁珠或与PE缀合，其与例如带有抗PE抗体的磁珠反应。抗体-磁珠复合物能够选择性地从例如红细胞群体中提取残留的网织红细胞。
还可使用单采血液分离术分离红细胞。单采血液分离术的过程涉及从受试者或供体中取出全血，使用离心或细胞分选术分离血液组分，去除一个或多个分离部分，并将剩余组分输回受试者或供体中。当前有许多仪器用于此目的，如例如来自Baxter的Amicus和Alyx仪(Deerfield,Ill.,USA)、来自Gambro BCT的Trima Accel仪(Lakewood,Colo.,USA)以及来自Haemonetics的MCS+9000仪(Braintree,Mass.,USA)。为了达到适当的细胞纯度，可能必需其他纯化方法。
网织红细胞是未成熟的红细胞，约占人体中红细胞的1％。网织红细胞在骨髓中发育并成熟。一旦释放到循环中，网织红细胞迅速经历终末分化为成熟的红细胞。像成熟的红细胞一样，网织红细胞也没有细胞核。与成熟的红细胞不同，网织红细胞保持进行蛋白合成的能力。在一些实施方案中，工程化红系细胞包括去核网织红细胞。
基于网织红细胞成熟时细胞密度的差异，可从外周血中分离出不同龄的网织红细胞。网织红细胞可以使用通过各种密度梯度的差异离心从外周血中分离出来。例如，Percoll梯度可以用于分离网织红细胞(参见例如，Noble el al.,Blood 74:475-481(1989))。通过将Percoll(Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)稀释至最终浓度10mM三乙醇胺、117mM NaCl、5mM葡萄糖和1.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)来制备密度为1.096和1.058g/ml的无菌等渗Percoll溶液。这些溶液的渗透压在295至310mOsm之间。例如，将5毫升的第一Percoll溶液(密度1.096)添加到无菌的15ml锥形离心管中。例如，2毫升的第二Percoll溶液(密度1.058)在较高密度的第一Percoll溶液上分层。2至4毫升的全血在试管顶部分层。将试管在带有外摆试管架(swing-out tube holder)的冷冻离心机中以250x g离心30分钟。网织红细胞和一些白细胞迁移到两个Percoll层之间的界面。将界面处的细胞转移至新试管中，并用具有5mM葡萄糖、0.03mM叠氮化钠和1mg/ml BSA的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次。残留的白细胞在尺寸排阻柱上通过PBS层析去除。
可选择地，可使用免疫磁分离方法通过阳性选择来分离网织红细胞(参见，例如Brun et al.,Blood 76:2397-2403(1990))。该方法利用了成熟前网织红细胞表面上相对于红细胞表达的大量转铁蛋白受体。包被有针对转铁蛋白受体的抗体的磁珠可用于从混合的血细胞群体中选择性分离网织红细胞。针对多种哺乳动物物种(包括人)的转铁蛋白受体的抗体可从商业来源获得(例如，Affinity BioReagents,Golden,Colo.,USA；Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)。转铁蛋白抗体可直接与磁珠连接。可选择地，转铁蛋白抗体可经由第二抗体间接与磁珠连接。例如，可将针对人转铁蛋白的小鼠单克隆抗体10D2(Affinity BioReagents,Golden,Colo.,USA)与包被有绵羊抗小鼠免疫球蛋白G(Dynal/Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)的免疫磁珠混合。然后将免疫磁珠与白细胞耗竭的红细胞级分温育。将珠子和红细胞于22℃下温和混合温育60-90分钟，然后使用磁场将附着有网织红细胞的珠子分离。可使用例如DETACHaBEAD溶液(来自Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)从磁珠中去除分离的网织红细胞。可选择地，可使用本文所述的方法从CD34+造血干细胞的体外生长和成熟中分离网织红细胞。
终末分化的去核红细胞可基于其DNA含量与其他细胞分离。在非限制性实例中，首先用重要的DNA染料如Hoechst 33342(Invitrogen Corp.)标记细胞。Hoechst 33342是与双链DNA结合时发出蓝色荧光的渗透细胞的核复染物。培养物中未分化的前体细胞、巨噬细胞或其他有核细胞通过Hoechst 33342染色，而去核红细胞则为Hoechst阴性。可通过使用荧光激活的细胞分选仪或其他细胞分选技术从去核红细胞中分离出Hoechst阳性细胞。可通过透析或其他合适的方法从分离的红细胞中去除Hoechst染料。
本文所述多肽的媒介物
尽管在本文的许多实施方案中，一种或多种(如，两种或更多种)外源多肽位于红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)之上或之中，但应理解，本文所述的任何多肽或外源多肽的组合也可以位于另一个媒介物之上或另一个媒介物之中。媒介物可包含例如细胞、红系细胞、小体、纳米颗粒、微团、脂质体或外泌体。例如，在一些方面，本公开提供了如在其表面上包含本文所述的一种或多种试剂的媒介物(如，细胞、红系细胞、小体、纳米颗粒、微团、脂质体或外泌体)。在一些实施方案中，一种或多种试剂包括选自本文所述的外源多肽的试剂，或其片段或变体。在一些实施方案中，媒介物包含本文所述的两种或更多种试剂，例如本文所述的任何一对试剂。
在一些实施方案中，媒介物包括工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞。
细胞的异质群体
尽管在本文的许多实施方案中，一种或多种(如，两种或更多种)外源多肽位于单个细胞之上或之中，但应理解，本文所述的任何多肽或多肽的组合也可以位于多个细胞上。例如，在一些方面，本公开提供了多个红系细胞或去核细胞，其中第一细胞群体包含第一外源多肽(如，包含第一外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽，或它们的组合)，而第二细胞群体包含第二外源多肽(如，包含第二外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽，或它们的组合)。在一些实施方案中，多个细胞包含本文所述的两种或更多种多肽，例如，本文所述的任何一对多肽。在一些实施方案中，群体中少于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％的细胞包含第一外源多肽和第二外源多肽两者。
包囊在膜中的细胞
在一些实施方案中，将本文所述的工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)或其他载体包囊在膜，如半透膜中。在一些实施方案中，膜包含多糖，如阴离子多糖藻酸盐。在一些实施方案中，半透膜不允许细胞通过，但允许小分子或大分子例如代谢物、蛋白或DNA通过。在一些实施方案中，膜描述于Lienert et al.,“Synthetic biology in mammalian cells:next generation research tools andtherapeutics”Nature Reviews Molecular Cell Biology 15,95–107(2014)，以其整体通过引用并入本文。
红细胞前体细胞
本文提供了工程化红细胞前体细胞，以及制备工程化红细胞前体细胞的方法。
多能干细胞通过红细胞生成过程产生红细胞。干细胞看起来像小淋巴细胞且缺乏红细胞的功能能力。干细胞具有无限分裂的能力，这是成熟细胞所缺乏的。干细胞产生的一些子细胞随世代和时间获得红系特征。骨髓中大多数红系细胞具有独特的形态，但即使在尚未获得红系谱系独特的形态特征的细胞中也可见到红系细胞成熟的定型。这些细胞通过它们在体外形成的集落类型所识别。识别出两种此类细胞。红系爆发形成单位(BFU-E)来自干细胞，并产生红系集落形成单位(CFU-E)。CFU-E产生了原正成红细胞(具有独特形态的最不成熟的红系细胞)。BFU-E和CFU-E形成骨髓细胞的很小一级分。从形态上讲，在用罗曼诺夫斯基(Romanovsky)染色剂染色的骨髓中可鉴定出五种红系细胞前体。从最不成熟到最成熟的五个阶段是原红细胞、嗜碱性正成红细胞(早期成红血细胞)、多染性正成红细胞(多染性成红血细胞)、正染性正成红细胞(晚期成红血细胞)和网织红细胞。BFU-E(红系爆发形成单位)、CFU-E(红系集落形成单位)、原正成红细胞(原红细胞)、嗜碱性正成红细胞、多染性正成红细胞和正染性正成红细胞受谱系限制。
下表7总结了红细胞前体的形态特征。
表7
细胞 核
造血干细胞(HSC) 是
CMP(共同髓样祖细胞) 是
CFU-S(脾集落形成细胞；髓样前体细胞) 是；可分化为红细胞、血小板、巨噬细胞。
BFU-E(红系爆发形成单位) 是
CFU-E(红系集落形成单位) 是
原正成红细胞(原红细胞) 是；细微染色质，多个核仁
嗜碱性正成红细胞 是；颗粒染色质，无核仁
多染性正成红细胞 是；染色质明显团簇，有深色染色区域
正染性正成红细胞 是；无特征的核，具有致密染色质
正常人红细胞表达CD36，其为单核细胞、血小板和内皮细胞的粘附分子(vanSchravendijk MR et al.,Blood.1992Oct 15；80(8):2105-14)。因此，在一些实施方案中，抗CD36抗体可用于鉴定人红细胞。
可根据本文所述的方法修饰本领域已知的能够分化为红细胞的任何类型的细胞，即任何红细胞前体细胞，以产生工程化红细胞前体细胞。在某些实施方案中，根据本文所述的方法修饰的红细胞前体细胞是处于分化为红细胞的过程中的细胞，即，细胞是已知在哺乳动物红细胞生成期间存在的类型的细胞。例如，细胞可以是多能造血干细胞(HSC)或CD34+细胞、多能髓样祖细胞、CFU-S细胞、BFU-E细胞、CFU-E细胞、原正成红细胞(原红细胞)、嗜碱性正成红细胞、多染性正成红细胞、或正染性正成红细胞。可使用本领域已知的方法，即使用已知促进红细胞生成的分子，例如SCF、促红细胞生成素、IL-3和/或GM-CSF，在体外将本文提供的经修饰的红细胞前体细胞分化为工程化去核红系细胞(如，网织红细胞或红细胞)，如下所述。可选择地，本文所述的组合物中提供了经修饰的红细胞前体细胞，并且在体内施用于受试者后能够分化为红细胞。
培养
生成本文所述的工程化红系细胞的来源包括循环红系细胞。合适的细胞来源可如本文所述从受试者衍生的造血或红系祖细胞分离，衍生自永生化红系细胞系或衍生自诱导多能干细胞，任选地进行培养和分化。用于使用细胞培养技术产生红细胞的方法在本领域中是所熟知的，例如，Giarratana et al.,Blood 2011,118:5071,Huang et al.(2014)Mol.Ther.22(2):451-63,or Kurita et al.,PLOS One 2013,8:e59890。方案根据生长因子、起始细胞系、培养期和所得细胞特征所在的形态特征而有所不同。还建立了用于血液生产的培养系统，该系统可以替代供体输血(Fibach et al.1989Blood 73:100)。近来，CD34+细胞分化为网织红细胞阶段，随后成功输到人类受试者中(Giarratana et al.,Blood2011,118:5071)。
本文提供了用于红系细胞和工程化红系细胞的培养方法。可从造血祖细胞中培养红系细胞，所述造血祖细胞包括例如CD34+造血祖细胞(Giarratana et al.,Blood 2011,118:5071)、诱导多能干细胞(Kurita et al.,PLOS One 2013,8:e59890)和胚胎干细胞(Hirose et al.2013Stem Cell Reports 1:499)。适合于扩增和分化祖细胞的生长和分化因子的混合物是本领域已知的。合适的扩增和分化因子的实例包括但不限于干细胞因子(SCF)、白介素(IL)如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、CSF、G-CSF、促红细胞生成素(TPO)、GM-CSF、促红细胞生成素(EPO)、Flt3、Flt2、PIXY 321和白血病抑制因子(LIF)。
通过使祖细胞与确定的因子在多步培养过程中接触，可由造血祖细胞(如，CD34+细胞)培养红系细胞。例如，在一些实施方案中，可用三步法由造血祖细胞培养红系细胞，如以下概述。
第一步可包括使培养物中的细胞与1-1000ng/mL的干细胞因子(SCF)、1-100U/mL的促红细胞生成素(EPO)和0.1-100ng/mL的白介素3(IL-3)接触。第一步任选地包括使培养物中的细胞与结合并激活核激素受体的配体接触，所述受体如，例如糖皮质激素受体、雌激素受体、孕激素受体、雄激素受体或孕烷x受体。这些受体的配体包括，如皮质类固醇，如，例如10nM-100μM的地塞米松或10nM-100μM的氢化可的松；雌激素，如，例如10nM-100μM的beta-雌二醇；孕激素，如例如10nM-100μM的孕酮、10nM-100μM的羟基孕酮、10nM-100μM的5a-二氢孕酮、10nM-100μM的11-脱氧皮质酮，或合成的孕激素(progestin)，如，例如10nM-100μM的醋酸氯地孕酮；雄激素，如，例如10nM-100μM的睾酮、10nM-100μM的二氢睾酮或10nM-100μM的雄烯二酮；或孕烷x受体配体，如，例如10nM-100μM的利福平、10nM-100的贯叶金丝桃素(hyperforin)、10nM-100μM的St.John's Wort(金丝桃素)或维生素E样分子如例如10nM-100的生育酚。第一步还可任选地包括使培养物中的细胞与胰岛素样分子接触，所述胰岛素样分子如，例如1-50μg/mL的胰岛素、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子1(IGF-1)、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子2(IGF-2)或1-50μg/mL的机械生长因子。第一步可进一步任选地包括使培养物中的细胞与0.1-5mg/mL的转铁蛋白接触。
第一步可任选地包括使培养物中的细胞与一种或多种白介素(IL)或生长因子接触，如例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-B)、肿瘤坏死因子α(TNF-A)、巨核细胞生长发育因子(MGDF)、白血病抑制因子(LIF)和Flt3配体。每种白介素或生长因子通常可以0.1-100ng/mL的浓度提供。第一步还可任选地包括使培养物中的细胞与血清蛋白或非蛋白质分子接触，如，例如胎牛血清(1-20％)、人血浆(1-20％)、plasmanate(1-20％)、人血清(1-20％)、白蛋白(0.1-100mg/mL)或肝素(0.1-10U/mL)。
第二步可包括使培养物中的细胞与1-1000ng/mL的干细胞因子(SCF)和1-100U/mL的促红细胞生成素(EPO)接触。第二步还可任选地包括使培养物中的细胞与胰岛素样分子接触，如，例如1-50μg/mL的胰岛素、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子1(IGF-1)、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子2(IGF-2)或1-50μg/mL的机械生长因子。第二步可进一步任选地包括使培养物中的细胞与0.1-5mg/mL的转铁蛋白接触。第二步还可任选地包括使培养物中的细胞与血清蛋白或非蛋白分子接触，如例如胎牛血清(1-20％)、人血浆(1-20％)、plasmanate(1-20％)、人血清(1-20％)、白蛋白(0.1-100mg/mL)或肝素(0.1-10U/mL)。
第三步可包括使培养物中的细胞与1-100U/mL的促红细胞生成素(EPO)接触。第三步可任选地包括使培养物中的细胞与1-1000ng/mL的干细胞因子(SCF)接触。第三步可进一步任选地包括使培养物中的细胞与胰岛素样分子接触，如例如1-50μg/mL的胰岛素、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子1(IGF-1)、1-50μg/mL的胰岛素样生长因子2(IGF-2)或1-50μg/mL的机械生长因子。第三步还可任选地包括使培养物中的细胞与0.1-5mg/mL的转铁蛋白接触。第三步还可任选地包括使培养物中的细胞与下述血清蛋白或非蛋白分子接触，如，例如胎牛血清(1-20％)、人血浆(1-20％)、plasmanate(1-20％)、人血清(1-20％)、白蛋白(0.1-100mg/mL)或肝素(0.1-10U/mL)。
在一些实施方案中，扩增和分化呈递一种或多种外源多肽的工程化红系细胞的方法不包括在包含骨髓增殖性受体(mpl)配体的培养基中培养工程化红系细胞。
培养过程可任选地包括通过本领域已知的方法使细胞与以下分子接触：例如，DNA分子、RNA分子、mRNA、siRNA、微小RNA、lncRNA、shRNA、激素或小分子(其激活或敲低一种或多种基因)。靶基因可包括例如编码转录因子、生长因子或生长因子受体的基因，其包括但不限于，例如，GATA1、GATA2、CMyc、hTERT、p53、EPO、SCF、胰岛素、EPO-R、SCF-R、转铁蛋白-R、胰岛素-R。
在一些实施方案中，将CD34+细胞置于含有不同量的IMDM、FBS、谷氨酰胺、BSA、全转铁蛋白(holotransferrin)、胰岛素、地塞米松、β-雌二醇、IL-3、SCF和促红细胞生成素的培养物中，分三个单独的分化阶段共22天。
在一些实施方案中，将CD34+细胞置于含有不同量的IMDM、FBS、谷氨酰胺、BSA、全转铁蛋白、胰岛素、地塞米松、β-雌二醇、IL-3、SCF和促红细胞生成素的培养物中，分三个单独的分化阶段共14天。
在一些实施方案中，将CD34+细胞置于含有不同量的IMDM、FBS、谷氨酰胺、BSA、全转铁蛋白、胰岛素、地塞米松、β-雌二醇、IL-3、SCF和GCSF的培养物中，分三个单独的分化阶段共15天。
在一些实施方案中，将红系细胞扩增至少100、1000、2000、5000、10,000、20,000、50,000或100,000倍(以及任选地高达100,000、200,000或500,000倍)。在一些实施方案中，使用自动细胞计数器测量细胞数。
在一些实施方案中，可能期望在培养过程中在体外仅部分分化红系祖细胞(如，造血干细胞)，从而允许在体内引入受试者时发生进一步分化(如，分化为网织红细胞或完全成熟的红细胞)(参见，例如Neildez-Nguyen et al.,Nature Biotech.20:467-472(2002))。将理解的是，在本文所述的不同实施方案中，体外成熟和/或分化可在期望的任何阶段被阻止。例如，分离的CD34+造血干细胞可如本文其他地方所述在体外扩增，例如在含有各种因子的培养基中扩增以达到期望的分化阶段，所述因子包括，例如白介素3、Flt3配体、干细胞因子、促红细胞生成素、促红细胞生成素、转铁蛋白和胰岛素生长因子。所产生的工程化红系细胞的特征可在于CD36和GPA的表面表达，以及特定期望细胞类型特有的其他特征，并且可输注至允许终末分化为成熟红细胞的受试者。
在一些实施方案中，工程化红系细胞从红系祖细胞部分扩增至去核之前(但不包括去核)的成熟的任何阶段，因此保留有核细胞，如红细胞前体细胞。在某些实施方案中，所得到的细胞是有核的，并且红系谱系受限。在某些实施方案中，所得到的细胞选自多能髓样祖细胞、CFU-S细胞、BFU-E细胞、CFU-E细胞、原正成红细胞(原红细胞)、嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞和正染性正成红细胞。最终的分化步骤，包括去核，仅在将工程化红系细胞施用于受试者后才发生，也就是说，在此类实施方案中，去核步骤在体内发生。在另一个实施方案中，工程化红系细胞在体外通过去核阶段扩增和分化成为例如网织红细胞。在工程化红系细胞分化为网织红细胞阶段的此类实施方案中，成为红细胞的最终分化步骤仅在将工程化红系细胞施用于受试者后才发生，也就是说，终末分化步骤在体内发生。在另一个实施方案中，工程化红系细胞在体外通过终末分化阶段进行扩增和分化以成为红细胞。
将进一步认识到，在一些实施方案中，工程化红系细胞可从红系细胞祖细胞(如，造血干细胞)扩增和分化，以成为不同谱系的造血细胞，例如成为血小板。用于成熟和分化各种谱系如血小板的造血细胞的方法是本领域技术人员所熟知的。本文所述的表达外源多肽的此类工程化血小板被认为涵盖在本公开中。
外源多肽的表达
在一些实施方案中，通过使合适的分离的细胞(如，有核红系细胞、红系前体细胞、或有核血小板前体细胞)与编码本公开的多肽的外源核酸(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽，或其组合)接触，来生成本文所述的工程化红系细胞。
在一些实施方案中，外源多肽由DNA编码，该DNA与有核红系前体细胞或有核血小板前体细胞接触。在一些实施方案中，外源多肽由RNA(如，mRNA)编码，该RNA与有核红系细胞、红系前体细胞、有核血小板前体细胞接触。
在一些实施方案中，外源多肽与血小板、有核红系细胞、红系前体细胞、有核血小板前体细胞、网织红细胞或红细胞接触。
在一些实施方案中，外源多肽包含表位标签序列，其可以是以下中的一种或其组合：HA-标签、绿色荧光蛋白标签、Myc-标签、几丁质结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、poly(His)标签、硫氧还蛋白、poly(NANP)、FLAG-标签、V5-标签、Avi标签、钙调蛋白-标签、聚谷氨酸-标签、E-标签、S-标签、SBP-标签、Sof标签-1、Sof标签-3、Strep-标签、TC-标签、VSV-标签、Xpress-标签、Isopep标签、Spy标签、生物素羧基载体蛋白、Nus-标签、Fc-标签或Ty-标签。在一些实施方案中，编码外源多肽的外源核酸包含与表位标签序列融合的外源多肽基因序列的3'端(如，在N-末端或C-末端)，其可以是以下中的一种或其组合：HA-标签、gGreen荧光蛋白标签、Myc-标签、几丁质结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、聚(His)标签、硫氧还蛋白、聚(NANP)、FLAG-标签、V5-标签、Avi标签,钙调蛋白-标签、聚谷氨酸-标签、E-标签、S-标签、SBP-标签、Sof标签-1、Sof标签-3、Strep-标签、TC-标签、VSV-标签、Xpress-标签、Isopep标签、Spy标签、生物素羧基载体蛋白、Nus-标签、Fc-标签或Ty-标签。在一些实施方案中，外源多肽包含表位标签，例如HA表位标签(YPYDVPDYA(SEQ ID NO:1))、cMyc标签(EQKLISEEDL(SEQ ID NO:2))或Flag标签(DYKDDDDK(SEQ IDNO:3))。可将表位标签用于使用针对表位标签的抗体通过流式细胞术、Western印迹或免疫沉淀容易地检测和定量表达。
外源多肽可由通过电穿孔、化学或聚合转染、病毒转导、机械膜破坏或其他方法引入红系细胞的转基因表达；由通过电穿孔、化学或聚合转染、病毒转导、机械膜破坏或其他方法引入细胞中的mRNA表达的外源多肽；通过引入外部因子如转录激活物、转录阻遏物或分泌途径增强物而由天然基因座过表达的外源多肽；和/或由生产细胞或其他外部系统合成、提取或产生并掺入红系细胞中的多肽。
在某些实施方案中，引入步骤包括病毒转导。在一些实施方案中，引入步骤包括电穿孔。在另一个实施方案中，引入步骤包括利用以下一种或多种：脂质体介导转移、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、脂肪感染和慢病毒载体。
在一些实施方案中，引入步骤包括通过转染慢病毒载体引入编码第一外源多肽的第一外源核酸。
可通过转染单拷贝或多拷贝基因、用病毒转导或电穿孔引入编码外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽)的外源核酸(如，包含DNA或RNA)。在哺乳动物细胞中表达外源蛋白的方法是本领域所熟知的。例如，通过CD34+祖细胞的病毒转导来诱导造血细胞中外源因子IX的表达，参见Chang et al.,Nat Biotechnol 2006,24:1017。
在一些实施方案中，DNA或RNA是密码子优化的。
在一些实施方案中，两个或更多个多肽在单个核酸(如，单个载体)中编码。在一些实施方案中，单个载体对于每个基因具有单独的启动子，具有最初转录成在中间具有蛋白酶切割位点的单个多肽的两个蛋白，使得随后的蛋白水解加工产生两个蛋白或任何其他合适的构型。在一些实施方案中，当存在多于一个多肽(如，两个或更多个)时，多肽可在单个核酸(如，单个载体)中编码。当外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和/或外源Treg共刺激性多肽由同一外源核酸(如，载体)编码时，存在多种可能的子策略可用于多肽的共表达。在一些实施方案中，单个外源核酸(如，载体)对于编码外源核酸的每个基因具有单独的启动子。在一些实施方案中，外源核酸编码两个(或更多个)外源多肽，从而“自切割”2A元件设置在编码外源多肽的顺反子之间。2A元件被认为是通过使核糖体跳过2A元件C端肽键的合成来发挥作用，导致2A序列的末端与下游的下一个多肽之间的分离(参见，例如Holst et al.(2008)Nat.Immunol.6:658-66)。在一些实施方案中，重组核酸包含编码第一外源多肽的基因和编码第二外源多肽的基因，其中第一外源多肽是抗原呈递多肽或其变体，其中第二外源多肽是外源抗原性多肽或其变体，其中第二基因与编码第一外源多肽的基因由病毒衍生的2A元件(gagggcagaggaagtcttctaacatgcgg tgacgtggaggsgsstcccggccct(SEQ ID NO:4)隔开。多个2A元件是本领域已知的并且可如本文所述使用，包括T2A、P2A、E2A和F2A(参见，例如Liuet al.(2017)Sci.Rep.7(1):2193)。
对于经由两个启动子的双重表达，可将MSCV启动子用作第一启动子，EF1启动子用作第二启动子，但本公开不受这两个示例性启动子的限制。另一策略是通过在编码多肽的两个基因之间插入内部核糖体进入位点(IRES)来表达两个或更多个外源多肽。还有一种策略是将两个或多个外源多肽表达为由接头隔开的直接肽融合物。
在一些实施方案中，两个或更多个多肽由两个或更多个外源核酸编码，例如，每个载体编码一种外源多肽。
对于经由两个启动子的双重表达，可将MSCV启动子用作第一启动子，EF1启动子用作第二启动子，但是本公开不受这两个示例性启动子的限制。另一策略是通过在编码多肽的两个基因之间插入内部核糖体进入位点(IRES)来表达两个或多个外源多肽。还有一种策略是将两个或多个外源多肽表达为由接头隔开的直接肽融合体。
在一些实施方案中，两个或更多个多肽由两个或更多个外源核酸编码，例如，每个载体编码一种外源多肽。
在某些实施方案中，使用慢病毒载体，其包含选自下组的启动子：β-珠蛋白启动子、鼠干细胞病毒(MSCV)启动子、长臂猿白血病病毒(GALV)启动子、人延伸因子1α(EF1α)启动子组成的组的启动子,CAG CMV即刻早期增强子和鸡β-肌动蛋白(CAG)和人磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子。
在一些实施方案中，两个或更多个多肽由两个或更多个核酸编码，例如，每个载体编码多肽之一。
可将核酸(如，用于产生外源多肽的DNA表达载体或mRNA)引入适合于产生本文所述外源多肽的祖细胞(如，红系细胞祖细胞或血小板祖细胞等)。可经由如本文提供的常规重组技术从原始来源分离祖细胞或从扩增的祖细胞群体获得祖细胞。在一些情况下，可设计表达载体，使它们可通过本领域已知的方法通过同源或非同源重组掺入细胞基因组中。
在一些实施方案中，使造血祖细胞(如，CD34+造血干细胞)与编码一种或多种外源多肽的一种或多种核酸接触，并使细胞在培养物中扩增和分化。
在一些情况下，例如，对于作为包含一种或多种外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽，外源共抑制性多肽、外源调节性T细胞扩增多肽、细胞因子和外源占位多肽)的红系细胞的aAPC，编码可选择性靶向和切割基因组的多肽的核酸，例如CRISPR/Cas9、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶，用于指导将编码外源多肽的表达载体的外源核酸插入特定的基因组位置，例如CR1基因座(1q32.2)、血红蛋白基因座(11p15.4)。因此，在一方面，本公开的特征在于制备免疫学相容的人工抗原呈递细胞(aAPC)的方法，其中aAPC包含含有外源抗原性多肽的工程化红系细胞，所述方法包括使有核红系细胞、红系前体细胞或有核血小板前体细胞与切割内源HLA-E或HLKA-G的核酸酶和至少一种gRNA接触，其中内源HLA-E或HLKA-G核酸通过基因编辑途径修复，并导致内源HLA-E或HLKA-G核酸的表达水平降低。
在一些实施方案中，可将一种或多种外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽)克隆到质粒构建体中进行转染。用于将表达载体转移到适合产生本文所述的aAPC的细胞中的方法包括但不限于病毒介导的基因转移、脂质体介导的转移、转化、基因枪、转染和转导，例如病毒介导的基因转移，如基于DNA病毒(如，腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒)的载体以及基于逆转录病毒的载体的使用。基因转移模式的实例包括，如裸DNA、CaPO4沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔，原生质体融合、脂质转染和细胞显微注射。
在一些实施方案中，可将编码每种外源多肽的重组DNA克隆到慢病毒载体质粒中，以整合到红系细胞中。在一些实施方案中，慢病毒载体包含编码单个外源多肽以整合到红系细胞中的DNA。在其他实施方案中，慢病毒载体包含两种、三种、四种或更多种本文所述的外源多肽，以整合到红系细胞中。在一些实施方案中，可以将编码一种或多种外源多肽的重组DNA克隆到编码可选择性状如抗生素抗性基因的质粒DNA构建体中。在一些实施方案中，可将编码外源多肽的重组DNA克隆到适于在红系细胞中稳定表达每种重组蛋白的质粒构建体中。
在一些实施方案中，可采用慢病毒系统，其中将具有外源多肽序列(如，一个、两个、三个、四个或更多个外源多肽序列)的转移载体、包膜载体和/或一个或多个包装载体各自转染到宿主细胞中以用于病毒生产。在一些实施方案中，可以通过磷酸钙沉淀转染、基于脂质的转染或电穿孔中的任一种将慢病毒载体转染到宿主细胞中，并温育过夜。对于其中外源多肽序列可以伴有荧光报道物的实施方案，可以在过夜温育后检查宿主细胞的荧光检查。可以每8-12小时收获包含病毒颗粒的宿主细胞的培养基2或3次，并离心以沉淀分离的细胞和碎片。然后可根据需要直接使用、冷冻或浓缩培养基。
可在允许分化和去核的合适条件下(如，本文所述的体外培养过程)培养经受编码外源多肽的外源核酸转移的祖细胞。
可用编码一种或多种外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽，细胞因子和外源Treg共刺激性多肽)的mRNA转染分离的红系前体细胞(如，CD34+造血细胞)以产生aAPC。信使RNA可衍生自含有对应于一种或多种外源多肽的编码序列的cDNA质粒构建体的体外转录。例如，可将对应于外源多肽的cDNA序列插入含有与特定RNA聚合酶相容的启动子序列的克隆载体中。例如，克隆载体ZAP EXPRESSpBK-CMV(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)含有分别与T3和T7RNA聚合酶相容的T3和T7启动子序列。对于有义mRNA的体外转录，将质粒在对应于外源多肽编码序列末端的终止密码子下游的限制性位点处线性化。使用可商购的试剂盒，如例如RNAMAXX高产率转录试剂盒(来自Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)，从线性DNA模板转录mRNA。在一些情况下，可以期望产生5'-m7GpppG-帽的mRNA。这样，可以使用例如来自Ambion(Austin,Tex.,USA)的mMESSAGE mMACHINE高产率带帽RNA转录试剂盒进行线性化cDNA模板的转录。转录可于37℃下以20-100μl的反应体积进行30分钟至4小时。通过用DNase I短暂处理以消除线性化的DNA模板，然后在存在氯化锂、乙酸钠或乙酸铵的情况下于70％乙醇中沉淀，从反应混合物中纯化转录的mRNA。可以使用琼脂糖甲醛凝胶或可商购的Novex预制TBE凝胶(例如Novex,Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)进行电泳来评估转录的mRNA的完整性。
可使用多种方法，包括例如脂质转染和电穿孔将编码一种或多种外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽)的信使RNA引入红系前体细胞(如，CD34+造血干细胞)(van Tandelooet al.,Blood 98:49-56(2001))。为了进行脂质转染，例如，将5μg的Opti-MEM(Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)中体外转录的mRNA与阳离子脂质DMRIE-C(Invitrogen)以1:4的比率温育5-15分钟。可选择地，多种其他阳离子脂质或阳离子聚合物可用于用mRNA转染细胞，包括例如DOTAP、各种形式的聚乙烯亚胺和聚L-赖氨酸(Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)和Superfect(Qiagen,Inc.,Valencia,Calif.,USA；参见，例如Bettinger et al.,Nucleic Acids Res.29:3882-3891(2001))。将得到的mRNA/脂质复合物与细胞(1-2×106个细胞/ml)于37℃下温育2小时，洗涤并返回培养。对于电穿孔，例如，将500μl的Opti-MEM(Invitrogen,Carlsbad,Calif.,USA)中的约5至20x106个细胞与约20μg的体外转录的mRNA混合，并在0.4厘米的比色杯中使用例如Easyject Plus设备(EquiBio,Kent,United Kingdom)进行电穿孔。在一些情况下，可能有必要测试各种电压、电容和电穿孔体积，以确定将特定mRNA转染的有用条件。通常，有效地用mRNA转染细胞所需的电穿孔参数似乎比DNA电穿孔所需的电穿孔参数对细胞的危害小(van Tandeloo etal.,Blood 98:49-56(2001))。
可选择地，可使用肽介导的RNA递送策略将mRNA转染到红系前体细胞(如，CD34+)(参见，例如Bettinger et al.,Nucleic Acids Res.29:3882-3891(2001))。例如，可将阳离子脂质聚乙烯亚胺2kDA(Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)与蜂毒肽(AltaBiosciences,Birmingham,UK)组合以提高mRNA转染的效率，特别是在有丝分裂后原代细胞中。可使用二硫化物交联剂如，例如异双功能交联剂琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯，将蜂毒肽与PEI缀合。将体外转录的mRNA与蜂毒肽-PEI预温育5至15分钟，以形成RNA/肽/脂质复合物。然后于37℃，5％CO2湿润的环境下将此复合物添加到无血清培养基中的细胞2至4小时，然后将其除去，并允许转染的细胞继续在培养物中生长。
在一些实施方案中，通过使合适的分离的红系前体细胞或血小板前体细胞与编码一种或多种外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽)的外源核酸接触来产生aAPC。在一些实施方案中，外源多肽由DNA编码，该DNA与有核红系前体细胞或有核血小板前体细胞接触。在一些实施方案中，外源多肽由RNA编码，该RNA与血小板、有核红系细胞或有核血小板前体细胞接触。
可使用各种DNA技术(包括瞬时或稳定转染和基因治疗方法)将一种或多种外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽)遗传引入终末分化之前的红系前体细胞、血小板前体或有核红系细胞。外源多肽可在红系细胞或血小板的表面上和/或细胞质中表达。
可将病毒基因转移用于用编码一种或多种外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽)的DNA转染细胞。可将许多病毒用作基因转移媒介物，包括例如莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒如人免疫缺陷病毒1(HIV1)和泡沫病毒类如泡沫病毒(参见例如，Osten et al.,HEP 178:177-202(2007))。例如，逆转录病毒可以有效地转导包括人细胞在内的哺乳动物细胞并整合到染色体中，从而赋予稳定的基因转移。
可将一种或多种外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽)转染至红系前体细胞、血小板前体或有核红系细胞、表达并随后在本文所述的工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)中保留和展示。合适的载体是莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)载体主链(Malik et al.,Blood 91:2664-2671(1998))。基于MMLV(致癌逆转录病毒)的载体目前用于基因疗法临床试验中(Hossle et al.,News Physiol.Sci.17:87-92(2002))。例如，可使用标准分子生物学技术在MMLV载体主链中产生含有编码外源多肽的cDNA的DNA构建体。将构建体转染到包装细胞系(如，例如PA317细胞)中，并且将病毒上清液用于转染生产细胞(如，例如PG13细胞)。PG13病毒上清液与已经如本文所述分离并培养或新鲜分离的红系前体细胞、血小板前体或有核红系细胞一起温育。可使用FACS分析(荧光激活的细胞分选)，例如用针对外源多肽的荧光标记抗体来监测外源多肽的表达(如果其位于aAPC的表面上)。可使用类似的方法来表达位于aAPC内部的外源多肽。
任选地，可使用基于病毒的方法转染荧光跟踪分子如，例如绿色荧光蛋白(GFP)(Tao et al.,Stem Cells 25:670-678(2007))。使用包装细胞(如，例如Phoenix-Eco细胞系(由Orbigen分销,San Diego,Calif.))包装含有编码增强的绿色荧光蛋白(EGFP)或红色荧光蛋白(如，DsRed-Express)的DNA的异位逆转录病毒载体。包装细胞系稳定地表达适当的病毒包装所需的病毒蛋白，包括例如gag、pol和env。来自已沉积病毒颗粒的Phoenix-Eco细胞的上清液用于转导如红系细胞前体、血小板前体或有核红系细胞。在一些情况下，可在特定包被的表面进行转导如，例如重组纤连蛋白的片段，以提高逆转录病毒介导的基因转移的效率(如，RetroNectin,Takara Bio USA,Madison,Wis.)。将细胞与逆转录病毒Phoenix-Eco上清液加合适的辅因子一起在包被RetroNectin的板中温育。第二天可以重复进行转导。在这种情况下，可通过FACS评估表达EGFP或DsRed-Express的细胞的百分比。其他可用于评估转导效率的报告物基因包括，例如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶和萤光素酶以及低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)和人细胞表面CD24抗原(Bierhuizen etal.,Leukemia 13:605-613(1999))。
非病毒载体可用于将遗传物质引入合适的红系细胞、血小板或其前体中以产生aAPC。非病毒介导的基因转移与病毒介导的基因转移的不同之处在于，质粒载体不含蛋白、毒性较小、易于扩大规模并且没有宿主细胞的偏好。质粒载体的“裸DNA”本身不能有效地将编码多肽的遗传物质递送至细胞，因此与能够进入细胞的基因递送方法相组合。可使用多种递送方法将非病毒载体转移到合适的红系细胞、血小板或其前体中，包括化学和物理方法。
可使用合成的大分子(如，阳离子脂质和聚合物)将编码一种或多种外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽)的非病毒载体引入合适的红系细胞、血小板或其前体中(Papapetrou et al.,Gene Therapy 12:S118-S130(2005))。阳离子脂质体例如通过电荷相互作用与DNA形成复合物。带正电的DNA/脂质复合物与负细胞表面结合，并通过内吞作用被细胞吸收。该方法可用于例如转染造血细胞(参见，例如Keller et al.,Gene Therapy6:931-938(1999))。对于红系细胞、血小板或其前体，将质粒DNA(在25-100μL的无血清培养基(如，例如OptiMEM(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)中约0.5μg)与阳离子脂质体(在25μL的无血清培养基中约4μg)如可商购的转染试剂Lipofectamine.TM.(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)混合并允许温育至少20分钟以形成复合物。将DNA/脂质体复合物添加到合适的红系细胞、血小板或其前体中，并温育5-24小时，之后可测定多肽的转基因表达。可选择地，可使用其他可商购脂质体转染剂(例如，In vivo GeneSHUTTLE.,Qbiogene,Carlsbad,Calif.)。
任选地，阳离子聚合物(如，聚乙烯亚胺(PEI))可用于有效转染红系细胞祖细胞，例如造血和脐带血来源的CD34+细胞(参见，例如Shin et al.,Biochim.Biophys.Acta1725:377-384(2005))。从人脐带血中分离出人CD34+细胞，并在补充有200ng/ml干细胞因子和20％热失活的胎牛血清的Iscove改良的Dulbecco培养基中培养。将编码外源多肽的质粒DNA与大小在0.8K至750K之间的支链或线性PEI(Sigma Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA；Fermetas,Hanover,Md.,USA)温育。将PEI制备为4.2mg/ml蒸馏水的储备溶液，并使用HCl轻微酸化至pH 5.0。可在室温下以不同的氮/磷酸盐比率将DNA与PEI混合30分钟，基于以下计算：1μg的DNA含有3nmol磷酸盐，1μl的PEI储备液含有10nmol胺氮。用DNA/阳离子复合物接种分离的CD34+细胞，以280x g离心5分钟，并在培养基中温育4个或更多个小时直到评估多肽的基因表达。
可使用物理方法(如，粒子介导的转染、“基因枪”、生物射弹(biolistics)或粒子轰击技术)将质粒载体引入合适的红系细胞、血小板或其前体中(Papapetrou,et al.,(2005)Gene Therapy 12:S118-S130)。在这种情况下，编码多肽的DNA被吸收到金颗粒上，并通过粒子枪施用于细胞。该方法可以用于例如转染红系细胞祖细胞，例如衍生自脐带血的造血干细胞(参见，例如Verma et al.,Gene Therapy 5:692-699(1998))。这样，分离出脐带血并在磷酸盐缓冲盐水中稀释三倍。使用抗CD34单克隆抗体组合包被有第二抗体的磁性微珠和磁性分离系统(例如，Miltenyi MiniMac系统,Auburn,Calif.,USA)纯化CD34+细胞。可如本文所述培养富含CD34+的细胞。为了转染，通过用氯化钙和亚精胺处理，将编码多肽的质粒DNA沉淀到颗粒例如金珠上。在用乙醇洗涤包被有DNA的珠子之后，可以使用例如Biolistic PDS-1000/He系统(Bio-Rad,Hercules,Calif.,USA)将珠子递送到培养的细胞中。可以使用报告物基因如，例如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白来评估转染效率。
任选地，可使用电穿孔方法将质粒载体引入合适的红系细胞、血小板或其前体中。电穿孔在细胞膜上产生瞬时孔，从而允许将各种分子(包括例如DNA和RNA以及抗体和药物)引入细胞。这样，如本文所述分离并培养CD34+细胞。紧接在电穿孔之前，通过在室温下以250x g离心10分钟来分离细胞，并以0.2-10x106个活细胞/ml重悬于电穿孔缓冲液中，如例如补充有1.0％人血清白蛋白(HSA)的X-VIVO 10。将质粒DNA(1-50μg)与500μl细胞悬液一起添加到适当的电穿孔比色杯中。电穿孔可以使用例如ECM 600电穿孔仪(Genetronics,San Diego,Calif.,USA)以200V至280V的电压范围和25至70毫秒的脉冲长度来完成。许多可替代的电穿孔仪器是可商购的，并且可以用于该目的(例如，Gene Pulser XCELL,BioRad,Hercules,Calif.；Cellject Duo,Thermo Science,Milford,Mass.)。可选择地，也可使用以下参数对分离的CD34+细胞进行有效的电穿孔：4mm比色杯，1600μF，550V/cm和每500μl细胞10μg DNA，以1x105个细胞/ml(Oldak et al.,Acta Biochimica Polonica 49:625-632(2002))。
核转染(电穿孔的一种形式)也可用于转染合适的红系细胞、血小板或其前体。在这种情况下，在细胞类型特异性溶液中使用能够使DNA(或其他试剂)直接转运至核从而降低在细胞质中可能降解的风险的电参数进行转染。例如，人CD34细胞核转染试剂盒(来自Amaxa Inc.)可以用于转染合适的红系细胞、血小板或其前体。在这种情况下，将人CD34细胞核转染溶液中的1-5x106个细胞与1-5μg的DNA混合，并使用制造商确定的预编程设置在核转染仪器中进行转染。
可用常规表达载体对红系细胞、血小板或其前体进行非病毒转染，所述常规表达载体除非整合到基因组中否则不能在哺乳动物细胞中自我复制。或者，可以用附加型载体转染红系细胞、血小板或其前体，所述附加型载体可以作为自主复制的遗传单位而保留在宿主核中而不整合到染色体中(Papapetrou et al.,Gene Therapy 12:S118-S130(2005))。这些载体利用了从在潜伏感染后通常在细胞中染色体外复制的病毒衍生的遗传元件，所述病毒如，例如EBV、人多瘤病毒BK、牛乳头瘤病毒1(BPV-1)、单纯疱疹病毒1(HSV)和猿猴病毒40(SV40)。哺乳动物人工染色体也可用于非病毒基因转移(Vanderbyl et al.,Exp.Hematol.33:1470-1476(2005))。
编码一种或多种外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽)的外源核酸可通过本领域已知的标准分子生物学方法组装成表达载体，如限制性消化、重叠延伸PCR和Gibson组装。
外源核酸可包含编码一种或多种外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽)的基因，所述外源多肽通常不在例如红系细胞的细胞表面表达，与编码内源或天然膜蛋白的基因融合，使得外源多肽在细胞表面表达。例如，可将编码外源抗原性多肽的外源基因克隆在1型膜蛋白前导序列后的N端，2型膜蛋白的C端或GPI连接的膜蛋白的GPI附着位点的上游。在某些实施方案中，编码膜定位的外源多肽(如，包含I型膜蛋白跨膜域的多肽)的外源核酸包含前导序列(又被称为信号肽，如β2M前导序列或GPA前导序列)，用于将外源多肽靶向细胞膜。在一些实施方案中，前导序列通过细胞信号肽酶从成熟的外源多肽中切割出来。
可使用标准的克隆方法在两个融合基因之间引入柔性氨基酸接头。例如，柔性接头是聚甘氨酸聚丝氨酸接头，如[Gly4Ser]3(SEQ ID NO:5)，其通常用于从全长抗体中生成单链抗体片段(Antibody Engineering:Methods&Protocols,Lo 2004)，或ala-gly-ser-thr多肽，如用于产生单链Arc阻遏物的多肽(Robinson&Sauer,PNAS 1998)。在一些实施方案中，与没有柔性接头的等同构建体相比，柔性接头为多肽提供了更大的柔性和空间自由度。
表位标签可置于两个融合基因之间如，例如编码HA表位标签的氨基酸序列-氨基酸YPYDVPDYA(SEQ ID NO:1)、CMyc标签-氨基酸EQKLISEEDL(SEQ ID NO:2)或Flag标签-氨基酸DYKDDDDK(SEQ ID NO:3)。可将表位标签用于使用针对表位标签的抗体通过流式细胞仪、Western印迹或免疫沉淀方便地检测和定量表达。
在一些实施方案中，aAPC包含一种或多种外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽)和至少一种其他异源多肽。至少一种其他异源多肽可以是荧光蛋白。荧光蛋白可用作报告物以评估转导效率。在一些实施方案中，如果两者均由相同的转录物生成，则将荧光蛋白用作报告物以评估外源多肽的表达水平。在一些实施方案中，至少一种其他多肽是异源的并且提供功能如，例如多种抗原、多种捕获靶标、酶级联。在一些实施方案中，重组核酸包含编码抗原性多肽的基因和第二基因，其中第二基因通过病毒来源的T2A序列(gagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggsgsstcccggccct(SEQ ID NO:4))与编码抗原性多肽的基因分开，其翻译后被切割成两个成熟蛋白。
在一些实施方案中，编码外源抗原呈递多肽的外源核酸包含HLA-E多肽或HLA-G多肽的基因序列，其与Kell序列的3’端融合并使用PCR扩增。在一些实施方案中，编码外源抗原呈递多肽的外源核酸包含HLA-E多肽或HLA-G多肽的基因序列，其与聚甘氨酸/丝氨酸接头融合，随后是Kell序列的3’端，并使用PCR扩增。在一些实施方案中，编码外源抗原呈递多肽的外源核酸包含与表位标签序列融合的HLA-E多肽或HLA-G多肽的基因序列的3’端，其可以是以下中的一种或组合：HA标签、绿色荧光蛋白标签、Myc标签、甲壳质结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶、聚(His)标签、硫氧还蛋白、聚(NANP)、FLAG标签、V5标签、Avi标签、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签、E标签、S标签、SBP标签、Softag-1、Softag-3、Strep标签、TC标签、VSV标签、Xpress标签、Isopep标签、SpyTag、生物素羧基载体蛋白、Nus标签、Fc标签或Ty标签。将整个构建体融合到Kell序列的3’端，然后使用PCR进行扩增。例如，随后将编码各种外源抗原呈递多肽的外源基因构建体加载到慢病毒载体中，并用于转导细胞群体。
在一些实施方案中，将红系细胞群体与慢病毒载体一起温育，所述慢病毒载体包含编码一种或多种外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽)的外源核酸，其具体质粒可包括pLKO.1puro、PLKO.1--TRC克隆载体、pSico、FUGW、pLVTHM、pLJM1、pLion11、pMD2.G、pCMV-VSV-G、pCI-VSVG、pCMV-dR8.2 dvpr、psPAX2、pRSV-Rev和pMDLg/pRRE以生成aAPC。可以10、100、1,000、10,000pfu施用载体，并温育12小时。
在某些实施方案中，aAPC是呈递与一种或多种外源抗原性多肽缀合的外源抗原呈递多肽的红系细胞。在其他实施方案中，aAPC是包含外源抗原呈递多肽、外源抗原性多肽和至少一种作为缀合物对的一部分的外源共刺激性多肽的红系细胞。在其他实施方案中，aAPC是包含外源抗原呈递多肽、外源抗原性多肽和至少一种作为缀合物对的一部分的外源共抑制性多肽的红系细胞。在一些实施方案中，红系细胞是去核细胞。在一些实施方案中，红系细胞是有核细胞。
缀合可以化学或酶促实现。化学缀合可在使用或不使用接头的情况下通过外源抗原呈递多肽和一种或多种外源抗原性多肽的共价键合来实现。化学缀合可在使用或不使用接头的情况下通过共刺激性多肽和结合对成员的共价键合来实现。化学缀合可在使用或不使用接头的情况下通过共抑制性多肽和结合对成员的共价键合来实现。此类缀合物的形成在本领域技术人员的技术范围内，并且已知各种技术可用于完成缀合，其中特定技术的选择取决于待缀合的材料。向多肽(C端或N端)添加氨基酸，所述氨基酸含有可离子化的侧链(如，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、组氨酸或酪氨酸)且不包含在多肽序列的活性部分中，以其未质子化的状态用作有效力的亲核试剂以参与与附接到聚合物(如，同双功能或异双功能的PEG)上的反应基团的各种生物缀合反应(如，Lutolf and Hubbell,Biomacromolecules 2003；4:713-22,Hermanson,Bioconjugate Techniques,London.Academic Press Ltd；1996)。
在一实施方案中，外源抗原呈递多肽可通过生物素-链霉亲合素桥与一种或多种外源抗原性多肽结合。在其他实施方案中，共刺激性多肽和结合对成员通过生物素-链霉亲合素桥结合。在其他实施方案中，共抑制性多肽和结合对成员通过生物素-链霉亲合素桥结合。
例如，生物素化抗原性多肽可通过链霉亲合素桥与外源抗原呈递多肽的非特异性生物素化表面连接。生物素缀合可通过许多化学方法发生(参见，例如Hirsch et al.,Methods Mol.Biol.295:135-154(2004))。可使用胺反应性生物素化试剂队外援抗原呈递多进行生物素化如，例如EZ-Link Sulfo-NHS-SS-生物素(磺基琥珀酰亚胺基2-(生物素酰胺)-乙基-1,3-二硫代丙酸酯；Pierce-Thermo Scientific,Rockford,Ill.,USA；参见，例如Jaiswal et al.,Nature Biotech.21:47-51(2003))。例如，分离的红系细胞可在4℃下磷酸盐缓冲盐水中1mg/ml的硫代-NHS-SS中温育30分钟。通过用Tris缓冲盐水洗涤细胞来去除过量的生物素试剂。然后在存在链霉亲合素的情况下使生物素化细胞与生物素化的外源抗原性多肽反应，以形成呈递外源抗原呈递多肽的aAPC，所述外源呈递多肽通过生物素-链霉亲合素桥与一种或多种外源抗原性多肽结合。
还可使用偶联剂将外源多肽与细胞连接来产生本文所述的红系细胞。例如，可使用点击化学。例如，当外源多肽复杂或难以表达多肽，例如多肽，如多聚体多肽；大多肽；在体外衍生的多肽；对红系细胞可能具有毒性或无法在红系细胞中有效表达的外源多肽时，偶联剂可用于将外源多肽偶联至细胞。用于功能化红系细胞的点击化学和其他缀合方法描述于国际申请号PCT/US2018/000042，该申请要求2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
因此，在一些实施方案中，本文所述红系细胞的每个细胞包含多达、至少、超过或约5,000、10,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000种偶联剂。在一些实施方案中，红系细胞通过以下方法制备：a)使第一偶联剂与红系细胞偶联，从而形成药物制剂、产物或中间体。在一实施方案中，方法还包括：b)使细胞与偶联于第二偶联剂的外源多肽接触，例如在适合于第一偶联剂与第二偶联剂反应的条件下。在一些实施方案中，使两种或更多种外源多肽偶联至细胞(如，使用点击化学)。在一些实施方案中，使第一外源多肽偶联至细胞(如，使用点击化学)，并且第二外源多肽包含由外源核酸表达的多肽。
在一些实施方案中，偶联剂包括叠氮化物偶联剂。在一些实施方案中，叠氮化物偶联剂包括叠氮烷基部分、叠氮芳基部分或叠氮杂芳基部分。示例性叠氮化物偶联剂包括3-叠氮丙酸磺基-NHS酯、叠氮乙酸NHS酯、叠氮基-PEG-NHS酯、叠氮基丙胺、叠氮基-PEG-胺、叠氮基-PEG-马来酰亚胺、双砜-PEG-叠氮化物或其衍生物。偶联剂还可包含烯烃部分，例如反式环烯烃部分、氧杂降冰片二烯部分或四嗪部分。其他偶联剂可在点击化学工具(可获自万维网clickchemistrytools.com)或Lahann,J(ed)(2009)Click Chemistry forBiotechnology and Materials Science中找到，其各自以其整体通过引用并入本文。
在一些实施方案中，外源抗原性多肽经由共价连接而附接到细胞(如，红系细胞)，以产生包含呈递一种或多种外源抗原性多肽(如，第一外源抗原性多肽或第一抗原性多肽和第二外源抗原性多肽)的红系细胞的aAPC。例如，可使用含有亲电基团的偶联化合物将抗原性多肽衍生化并与红细胞或血小板结合，所述亲电基团将与红系细胞或血小板上的亲核物质反应形成相互键合的关系。这些亲电基团的代表是αβ不饱和羰基、烷基卤化物和硫醇试剂，如取代的马来酰亚胺。另外，偶联化合物可经由多肽中的一个或多个官能团，如氨基、羧基和酪氨酸基团与抗原性多肽偶联。为此目的，偶联化合物应包含游离羧基、游离氨基、芳族氨基和其他能够与酶官能团反应的基团。还可制备高电荷的抗原性多肽以通过静电键合固定化在如红系细胞或血小板上，以产生经修饰的去核细胞。这些衍生物的示例包括聚赖氨酰和聚谷氨酰酶。
衍生物中包含的反应性基团的选择取决于用于使亲电子与红系细胞或血小板上的亲核基团偶联以进行固定化的反应条件。一个控制因素是期望在偶联通过与红系细胞或血小板的附着而固定化外源多肽之前不使偶联剂失活。此类偶联固定化反应可以多种方式进行。通常，偶联剂可用于在外源多肽与红系细胞或血小板之间形成桥。在这种情况下，偶联剂应具有可使之与外源多肽反应的官能团，如羧基。制备用于缀合的外源多肽的一种方法包括利用偶联剂中的羧基形成与外源多肽反应的混合酸酐，其中使用能够形成混合酸酐的激活物。此类激活物的代表是氯甲酸异丁酯或其他氯甲酸酯，其与偶联剂如5,5'-(二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、对氯汞苯甲酸酯(CMB)或间马来酰亚胺基苯甲酸(MBA)产生混合酸酐。偶联剂的混合酸酐与外源多肽反应以产生反应性衍生物，该反应性衍生物继而可与红系细胞或血小板的亲核基团反应以固定化外源多肽。
可用碳二亚胺等激活物激活外源抗原性多肽的官能团，如羧基。随后，桥接试剂的官能团(如，氨基)将与外源多肽的活化基团反应形成反应性衍生物。另外，偶联剂应具有第二反应性基团，其将与红系细胞或血小板的适当亲核基团反应形成桥。此类反应性基团的典型代表是烷基化剂如碘乙酸，αβ不饱和羰基化合物如丙烯酸等，硫醇试剂如汞、取代的马来酰亚胺等。
可选择地，可激活抗原性多肽上的官能团，以便与诸如红系细胞或血小板上的亲核物质直接反应，从而消除对形成桥的化合物的需要。为此目的，使用活化剂如伍德沃德(Woodward)试剂K或类似的试剂，其使外源多肽中的羧基形成烯醇酯，如与混合酸酐区分。随后，外源多肽的烯醇酯衍生物与诸如红系细胞或血小板的亲核基团反应以实现抗原性多肽的固定化，从而形成经修饰的去核细胞。
在一些实施方案中，外源多肽(如，第一和/或第二外源多肽)连接到膜锚，如GPA跨膜域(GPA)，作为N端或C端融合，例如，使得外源多肽位于去核细胞(如，经修饰的去核细胞)表面。
在一些实施方案中，通过使红系细胞或去核细胞与抗原性多肽和任选的有效负载接触来产生包含呈递一种或多种外源抗原性多肽的红系细胞或去核细胞的aAPC，其中接触不包括使用以下附接位点将抗原性多肽与红系细胞缀合，所述附接位点包含Band 3(CD233)、水通道蛋白-1、Glut-1、Kidd抗原、RhAg/R1i50(CD241)、Rli(CD240)、Rh30CE(CD240CE)、Rh30D(CD240D)、Kx、血型糖蛋白B(CD235b)、血型糖蛋白C(CD235c)、血型糖蛋白D(CD235d)、Kell(CD238)、Duffy/DARCi(CD234)、CR1(CD35)、DAF(CD55)、红细胞糖苷脂、CD44、ICAM-4(CD242)、Lu/B-CAM(CD239)、XG1/XG2(CD99)、EMMPRIN/neurothelin(CD147)、JMH、糖基转移酶、Cartwright、Dombrock、C4A/CAB、Scianna、MER2、stomatin、BA-1(CD24)、GPIV(CD36)、CD108、CD139或H抗原(CD173)。
在一些实施方案中，aAPC包含呈递一种或多种外源抗原性多肽的工程化红系细胞或去核细胞，其中一种或多种外源抗原性多肽酶促缀合至细胞和/或至外源抗原呈递多肽。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)呈递一种或多种外源抗原性多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽酶促缀合至外源抗原呈递多肽(如，包含HLA-E多肽或HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽)。
在具体实施方案中，可通过本文提供的各种化学和酶促方法将抗原性多肽缀合至外源抗原呈递多肽，包括但不限于与双功能交联剂(如，例如NHS酯-马来酰亚胺异双功能交联剂)化学缀合，以将伯胺基与还原的硫醇基连接。这些方法还包括酶促策略(如，例如由分选酶介导的转肽酶反应)，以使包含受体序列(如，LPXTG(SEQ ID NO:6)或LPXTA(SEQ IDNO:7))的一个多肽与包含N端供体序列(如，GG或GGG)的多肽连接，参见，例如Swee et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 110(4)1428-1433 2013，其内容通过引用整体并入。可用于分选酶介导的缀合反应的其他受体序列和供体序列，以及利用分选的方法描述于Antos etal.2016,Curr Opin Struct Biol.38；111-118，其内容通过引用整体并入。在某些实施方案中，外源性抗原呈递多肽的N端包含N端供体序列GG或GGG。在一些实施方案中，外源抗原呈递多肽上的N-末端供体序列GG或GGG与含有受体序列LPXTG(SEQ ID NO:6)或LPXTA(SEQID NO:7)的外源抗原性多肽经由分选酶介导的反应(如，分选酶A介导的反应)连接。
在一些实施方案中，可使用Butelase 1将外源抗原性多肽缀合至外源抗原呈递多肽，例如Nguyen et al.2016Nature Protocols 11:1977-88所述。Butelase 1是来自蝶豆(Clitoria ternatea)的连接酶(参见，例如UniProtKB登录号A0A060D9Z7)。Butelase 1介导的环化需要在被缀合的多肽之一的C末端有一个三肽识别序列Asx-His-Val(其中Asx是Asp或Asn)。Butelase 1对被缀合的第二多肽的N-末端表现出非常宽松的特异性，其中第二多肽的N-末端包含X1X2，其中X1是任何氨基酸，X2是I、L、V或C。
本文提供的将外源抗原性多肽缀合至外源抗原呈递多肽的方法还包括组合方法如，例如分选酶介导的点击化学柄(叠氮化物和炔烃)分别在抗原和细胞上缀合，然后通过环加成反应将外源抗原性多肽与抗原呈递多肽化学键合，例如，参见Neves et al.,Bioconjugate Chemistry,24(6),pp 934–941 2013。分选酶介导的蛋白修饰描述于国际申请号PCT/US2014/037545和国际申请号PCT/US2014/037554中，两者均通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可将催化键形成多肽(如，SpyTag/SpyCatcher系统)用于将外源抗原性多肽连接至外源抗原呈递多肽。SpyTag多肽序列可包含在工程化红系细胞或去核细胞的细胞外表面。SpyTag多肽可例如融合至外源抗原呈递多肽的N末端。抗原性多肽可与SpyCatcher融合。SpyTag与SpyCatcher多肽反应后会形成将外源抗原性多肽附着至外源抗原呈递多肽的共价键。
本文所述的工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)也可使用一种或多种如本文所述进行如点击化学的偶联剂来产生，以将外源抗原性多肽附着至外源抗原呈递多肽。在一些实施方案中，进行例如转谷氨酰胺酶介导的结合和岩藻糖基化介导的结合的偶联剂，可用于将外源抗原性多肽结合至外源抗原呈递多肽，其后使用本文所述的进行例如点击化学的偶联剂之一，可将抗原呈递多肽结合外源抗原性多肽的复合物附着至细胞表面。
在具体实施方案中，本文所述的任何外源多肽(如，外源抗原性多肽)可通过各种化学和酶促方式缀合至诸如工程化红系细胞或去核细胞的表面，包括但不限于用双功能交联剂(如，NHS酯-马来酰亚胺异双功能交联剂)连接伯胺基与还原的硫醇基的化学缀合。这些方法还包括酶促策略，如由分选酶介导的转肽酶反应，以将含有受体序列LPXTG(SEQ IDNO:6)或LPXTA(SEQ ID NO:7)的一种多肽与含有N-末端供体序列GGG的多肽连接，参见，例如Swee et al.,PNAS 2013。方法还包括组合方法如，例如分选酶介导的点击化学柄(叠氮化物和炔烃)分别在抗原和细胞上的缀合，然后通过环加成反应将抗原化学键合至细胞，参见，例如Neves et al.,Bioconjugate Chemistry,2013。分选酶介导的蛋白修饰描述于国际申请号PCT/US2014/037545和国际申请号PCT/US2014/037554，二者通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，通过缀合包含氨基酸、肽、蛋白、多核苷酸、碳水化合物、标签、金属原子、造影剂、催化剂、非多肽聚合物、识别元件、小分子、脂质、接头、标记、表位、抗原、治疗剂、毒素、放射性同位素、颗粒或包含反应性化学基团(如，点击化学柄)的部分的分选酶底物来修饰蛋白。
如果需要，可在细胞内或细胞外(如，红系细胞或血小板之上或之内)表达形成催化键的多肽域。存在许多形成催化键的多肽，包括转肽酶、分选酶和异肽酶，包括衍生自Spy0128(从酿脓链球菌分离的蛋白)的那些多肽。
已证明，分裂Spy0128的自催化异肽键形成亚基(CnaB2域)导致两个截然不同的多肽，其彼此保留特异性催化活性。该系统中的多肽被称为SpyTag和SpyCatcher。混合后，SpyTag和SpyCatcher在SpyTag的Asp117和SpyCatcher的Lys31之间进行异肽键形成(Zakeri and Howarth,JACS 2010,132:4526)。该反应与细胞环境兼容并且对蛋白/肽结合具有高度特异性(Zakeri,B.；Fierer,J.O.；Celik,E.；Chittock,E.C.；Schwarz-Linek,U.；Moy,V.T.；Howarth,M.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2012,109,E690-E697)。SpyTag和SpyCatcher已显示指导弹性蛋白样蛋白的翻译后拓扑修饰。例如，将SpyTag放置在N端并将SpyCatcher放置在C端指导形成环状弹性蛋白样蛋白(Zhang et al,Journal of theAmerican Chemical Society,2013)。
可互换组分SpyTag和SpyCatcher，使得其中分子A和SpyTag融合且分子B和SpyCatcher融合的系统与分子A和SpyCatcher融合且分子B和SpyTag融合的系统在功能上等同。出于本文的目的，当使用SpyTag和SpyCatcher时，应理解，互补分子可在其位置被替代。
形成催化键的多肽，如SpyTag/SpyCatcher系统，可用于将外源多肽(如，抗原性多肽)附着到诸如红系细胞(如，工程化红系细胞)的表面，以产生aAPC。SpyTag多肽序列可在红系细胞的细胞外表面表达。可以例如将SpyTag多肽融合至1型或3型跨膜蛋白(如，血型糖蛋白A)的N端，融合至2型跨膜蛋白(如，Kell)的C端，并框内插入多通道跨膜蛋白的细胞外末端或细胞外环中，例如Band 3融合至GPI受体多肽，例如CD55或CD59融合至脂质链锚定的多肽或融合至外周膜蛋白。编码SpyTag融合物的核酸序列可在aAPC内表达。抗原性多肽可与SpyCatcher融合。编码SpyCatcher融合蛋白的核酸序列可从表达SpyTag融合蛋白的同一红系细胞中表达和分泌。可选择地，可在诸如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或无细胞的生产系统中外源地产生编码SpyCatcher融合物的核酸序列。SpyTag和SpyCatcher多肽反应后，将形成共价键，该键将抗原性多肽附着至红系细胞表面以形成aAPC。包含抗原性多肽融合物的工程化红系细胞或去核细胞是包含缀合的抗原性多肽的aAPC的示例。
在一些实施方案中，可在工程化红系细胞或去核细胞中Gatal启动子的控制下，将SpyTag多肽表达为与血型糖蛋白A的N端的融合物。与SpyCatcher多肽序列融合的外源多肽(如，外源抗原性多肽、外源抗原呈递多肽、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽、细胞因子和外源Treg共刺激性多肽)可在同一红系细胞中Gatal启动子的控制下表达。当两种融合多肽均表达后，异肽键将在SpyTag和SpyCatcher多肽之间形成，从而在红系细胞表面和外源多肽之间形成共价键。
在一些实施方案中，可在红系细胞中Gatal启动子的控制下，将SpyTag多肽表达为与血型糖蛋白A的N端融合。与SpyCatcher多肽序列融合的外源多肽(如，外源抗原性多肽、细胞因子、外源共刺激性多肽、外源共抑制性多肽和外源Treg共刺激性多肽)可在合适的哺乳动物细胞表达系统(如，HEK293细胞)中表达。红系细胞上表达SpyTag融合多肽后，可使SpyCatcher融合多肽与细胞接触。在合适的反应条件下，SpyTag和SpyCatcher多肽之间会形成异肽键，从而在红系细胞表面和外源多肽之间形成共价键。包含抗原性多肽融合物的工程化红系细胞或去核细胞是包含缀合抗原性多肽的aAPC的示例。
IV.使用人工抗原呈递细胞的方法
本公开涵盖使用本文所述的aAPC的各种方法。如本领域技术人员将理解，基于本文提供的公开内容，可针对本文所述的每种应用特定调整aAPC的施用剂量和时机。更具体地，期望使用包括在一个或几个aAPC上的某些分子提供免疫调节。具有本文提供的教导和本领域可获得知识的技术人员可容易地确定的所需方法。
一方面，本公开的特征在于用于激活免疫细胞(如，Treg细胞)的方法，该方法包括使细胞与经工程化改造为激活免疫细胞(如，调节性T细胞(Treg))的aAPC接触，从而激活免疫细胞。在一些实施方案中，aAPC包含含有HLA-E多肽的外抗原呈递多肽和外源抗原性多肽，如选自表1中所列的那些多肽，例如HSP60肽或源自HSP60的肽(如，HSP60的前导序列)。
另一方面，本公开的特征在于抑制免疫细胞的方法，该方法包括使免疫细胞与经工程化改造为抑制免疫细胞活性的aAPC接触，从而抑制免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。在一些实施方案中，aAPC包含含有HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽。在一些实施方案中，aAPC包含含有HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽和外源抗原性多肽。
本公开还涵盖用于特异性诱导表达已知共刺激分子的免疫细胞(如，T细胞)增殖的方法。该方法包括使包含诸如至少一种表达已知的共刺激分子的免疫细胞的免疫细胞群体与经工程化改造为呈递共刺激分子的配体的aAPC接触。如本文其他地方所公开，在aAPC表达至少一种与免疫细胞上的共刺激分子特异性结合的共刺激配体的情况下，共刺激分子与其同源共刺激性配体的结合诱导免疫细胞的增殖。因此，感兴趣的免疫细胞经诱导以增殖，而不必首先从细胞群体中纯化细胞。而且，该方法提供了一种快速测定法，用于确定群体中是否有任何细胞表达特定的感兴趣的共刺激分子，因为将细胞与aAPC接触将诱导增殖和检测正在生长的细胞，从而鉴定出样品中存在表达感兴趣的共刺激分子的免疫细胞。以此方式，可扩增和分离其中在细胞表面上至少一种共刺激分子是已知的任何感兴趣的免疫细胞。
本公开还包括用于特异性扩增免疫细胞(如，T细胞)群体亚组的方法。更具体地，该方法包括使包含至少一种感兴趣的亚组的免疫细胞的免疫细胞群体与能够扩增该免疫细胞的aAPC或至少表达至少一种与免疫细胞表面的同源共刺激分子特异性结合的共刺激性配体的aAPC接触。共刺激分子与其结合配偶体共刺激性配体的结合诱导了免疫细胞的增殖，从而特异性地扩增免疫细胞群体亚组，如T细胞群体亚组。基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将理解，T细胞亚组包括表达CD4的T辅助(TH1和TH2)细胞、细胞毒性T淋巴(CTL)(Tc1或Tc2)细胞、调节性T(Treg)细胞、TC/S、初始细胞、记忆细胞、中央记忆细胞、效应记忆细胞和γΔT细胞。在一些实施方案中，免疫细胞群体是T细胞群体，如调节性T细胞群体。因此，使用本公开的方法可容易地产生富集特定免疫细胞亚组的细胞群体。
在某些实施方案中，免疫细胞(如，T细胞)扩增至约100至约1,000,000倍，或约1,000和约1,000,000倍，例如1,000和约100,000倍。
本公开还包括用于鉴定共刺激性配体或其组合的方法，其特异性诱导激活免疫细胞亚组。简言之，该方法包括使免疫细胞群体与呈递至少一种共刺激性配体的aAPC接触，并将与aAPC接触的免疫细胞亚组的增殖水平与未与aAPC接触的其他方面相同的免疫细胞亚组的增殖水平进行比较。与未与aAPC接触的其他方面相同的免疫细胞亚组的增殖水平相比，与aAPC接触的免疫细胞亚组的增殖水平更高，这表明在共刺激性配体上特异性诱导该免疫细胞所属的免疫细胞亚组的激活。
该方法允许鉴定特异性扩增免疫胞亚组的共刺激性配体，其中先前不知道哪个因素扩增该免疫细胞亚组。本领域技术人员将理解，为了使筛选的次数最少，优选转导尽可能多的编码共刺激性配体的核酸，从而可减少测定的次数。此外，该方法通过组合各种蛋白(如，刺激性配体、共刺激性配体、抗原、细胞因子等)来允许评估哪些因子组合将使aAPC或aAPC的组合最有效地扩增免疫细胞亚组。通过这种方式，可检查每个T细胞亚组对生长和激活的各种要求。此外，为了评估免疫细胞扩增，可使用CFSE染色。在一些实施方案中，将aAPC与CD8+T细胞(如，来自患有疾病如自身免疫性疾病、传染性疾病如病毒传染性疾病(如，疱疹基质角膜炎、埃巴病毒或HIV)，或变态性疾病的受试者)混合。为了比较细胞扩增的初始速率，对细胞进行CFSE染色以确定每种aAPC诱导所有免疫细胞增殖的程度。CFSE染色提供了更多的定量终点，并允许同时对扩增的细胞进行表型分析。刺激后每天，从每种培养物中取出等分细胞，并通过流式细胞术进行分析。CFSE染色使细胞高度发荧光。细胞分裂后荧光减半，因而细胞分裂的次数越多荧光就越少。每种aAPC诱导免疫细胞(如，T细胞)增殖的能力通过测量分裂一次、两次、三次等的细胞数量进行定量。认为在特定时间点诱导最多细胞分裂的aAPC是最有效力的扩增物。
为了确定这些aAPC促进免疫细胞长期生长的能力，生成了细胞生长曲线。这些实验的设置与CFSE实验完全相同，但未使用CFSE。培养每隔2-3天，将免疫细胞从各自的培养物中取出，并使用Coulter计数器进行计数，该计数器测量存在的细胞数量和细胞的平均体积。平均细胞体积是何时重复刺激细胞的最佳预测指标。通常，适当刺激免疫细胞时，它们的细胞体积增加三倍。当此体积减少到初始爆发的一半以上时，可能有必要重复刺激免疫细胞以维持对数线性扩增(Levine et al.,1996,Science 272:1939-1943；Levine etal.,1997,J.Immunol.159:5921-5930)。计算每种aAPC诱导20个群体加倍所需的时间。每种aAPC诱导免疫细胞扩增在该水平的相对差异是特定aAPC进行临床试验的重要标准。
由每种aAPC扩增的细胞表型的特征在于确定特定亚组是否优先扩增。在每次重复刺激之前，使用Appay等(2002,Nature Med.8,379-385)提出的CD27和CD28定义和Sallusto等(1999,Nature 401:708-712)提出的CCR7定义对扩增的免疫细胞群体进行表型分析，以定义扩增的免疫细胞的分化状态。将穿孔素和颗粒酶B细胞内染色用于进行总体测量以评估溶细胞潜能。
一方面，该方法包括在不首先表征免疫细胞亚组表面上的共刺激分子的情况下，使各种aAPC与免疫细胞亚组接触。而且，本公开涵盖方法，其中在使aAPC与细胞接触之前检查存在于免疫细胞亚组表面上的共刺激分子。因此，本公开提供了用于确定各种免疫细胞亚组(如，T细胞亚组)的生长需求的新测定法。
另一方面，本公开的特征在于治疗需要调节或改变的免疫应答的受试者的方法，该方法包括使受试者的免疫细胞与本文所述的APC接触，从而治疗需要调节的免疫应答的受试者。在一些实施方案中，在体外或体内接触。在一些实施方案中，在体外接触。在一些实施方案中，在体内接触。
另一方面，本公开的特征在于治疗需要调节的免疫应答的受试者的方法，该方法包括a)确定受试者的HLA状态，b)选择与受试者免疫学相容的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC是表达第一外源抗原性多肽的工程化红系细胞，以及c)将aAPC施用于受试者，从而治疗需要调节的免疫应答的受试者。
另一方面，本公开的特征在于治疗需要调节的免疫应答的受试者的方法，该方法包括a)确定受试者中抗原的表达谱，b)选择人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中aAPC是工程化去核红系细胞或去核细胞，其包含外源抗原呈递多肽和第二外源抗原性多肽，以及c)将aAPC施用于受试者，从而治疗需要调节的免疫应答的受试者。
在其他方面，本发明还提供了通过细胞表面部分连接来扩增免疫细胞群体的方法。另外，目的是提供诱导受试者的免疫细胞群体长期快速指数增殖至足够数量以用于研究目的的方法，该方法包括从受试者分离免疫细胞群体，通过使免疫细胞离体接触至少一种向免疫细胞提供初级激活信号的外源多肽来激活免疫细胞群体；和用至少一种提供共刺激性信号的第二外源多肽刺激激活的免疫细胞，从而使已接受初级激活信号的免疫细胞受刺激以迅速增殖。特别地，目的是提供当受试者是人类时的此类方法，并且其中该方法还包括利用激活的免疫细胞在受试者中鉴定抗原。此外，当受试者感染具有与其相关的至少一种抗原的疾病或病症时，所提供的方法进一步包括利用激活的免疫细胞来鉴定至少一种抗原。抗原可包含例如并不限于肿瘤抗原、与自身免疫性疾病症或状况有关的抗原，或传染性疾病或病原体。该方法还包括筛选至少一种抗原作为靶分子用于研究目的，或用于基于至少一种抗原开发疫苗。
施用包含(如，呈递)外源试剂(如，多肽)的工程化去核红系细胞和去核细胞的方法描述于例如WO2015/073587和WO2015/153102，其各自通过引用整体并入本文。
本文所述的方法可包括制备包括本文所述的多个工程化去核红系细胞或去核细胞的药物组合物。
治疗可受益于调节免疫细胞反应的病症
在一些实施方案中，每1、2、3、4、5或6个月向患者施用工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)。
在一些实施方案中，工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)包括约1x109至2x109、2x109至5x109、5x109至1x1010、1x1010至2x1010、2x1010至5x1010、5x1010至1x1011、1x1011至2x1011、2x1011至5x1011、5x1011至1x1012、1x1012至2x1012、2x1012至5x1012、或5x1012至1x1013个细胞。
在一些实施方案中，以足以在2周至一年(例如，一个月至一年或更长时间，例如，至少2周、4周、6周、8周、3个月、6个月、1年、2年)的时间段内维持患者血液中所施用红系细胞功能的剂量方案(施用的剂量和周期)向患者施用工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)。
在一些实施方案中，将工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)以2个或更多个剂量(如，2、3、4或更多个剂量)施用于患者。在进一步的实施方案中，将工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)以2个或更多个剂量施用于患者，其中在第1剂量之后确定T细胞增殖处于峰值时的时间施用第2剂量。可使用技术人员已知的方法确定T细胞增殖峰值。例如，T细胞增殖峰值可通过3H-胸苷掺入增殖的T细胞或通过用荧光染料5,6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记增殖的T细胞来确定。
在一些方面，本公开提供了治疗本文所述的疾病或病症的方法，其包括向有此需要的受试者施用本文所述的组合物，例如本文所述的aAPC。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，疾病或病症是炎性疾病。在一些实施方案中，疾病或病症是传染性疾病。
在一些方面，本公开提供了本文所述aAPC在治疗本文所述的疾病或病症(如，自身免疫性疾病，炎性疾病、变应性病症或传染性疾病)中的用途。在一些方面，本文提供了本文所述aAPC在制备用于治疗本文所述的疾病或病症(如，自身免疫性疾病，炎性疾病、变应性病症或传染性疾病)的药物中的用途。
自身免疫性疾病
在过去的二十年，在一系列自身免疫性疾病的治疗方面取得了重大进步，因此改善了许多患者的生活质量。尽管取得了成功，但当前针对自身免疫性疾病的治疗方法具有一般或者特异地免疫抑制作用，使患者暴露于机会感染和血液系统癌的风险增加，如JAK抑制剂、抗TNF抗体和抗CD20靶向抗体的情况。在多达三分之一的病例中，自身免疫性疾病患者对治疗无应答，并且大多数有反应的患者最终随时间失去反应。
尽管大多数自身免疫性疾病的起因仍然未知，但普遍认为临床疾病是对自身细胞失去耐受的结果。公认的疾病模型假设环境事件触发了遗传易感性，其导致T细胞介导的免疫抑制的崩溃。原则上，恢复外周耐受性应当为患者提供完全或部分的治愈。
多年来，已经研究了一系列竞争性方法来恢复外周耐受性。这些措施包括口服施用或直接注射具有或不具有免疫抑制作用的蛋白或肽，产生带有肽的纳米颗粒以及工程化调节性T细胞的过继转移。迄今为止，尚未证明这些方法在后期临床试验中是成功的，但是该领域仍在继续发展。肽和纳米颗粒的直接施用面临生物分布、稳定性、呈递和定向挑战，这限制了细胞间信号传导的有效性。至今，过继转移方法都是自体的，并且受到限制其他细胞疗法应用的一些相同处理和可扩展性问题的阻碍。
因此，在某些实施方案中，本公开的aAPC提供了治疗自身免疫性疾病的新颖且改善的方法。提供的用于治疗自身免疫性疾病的方法具有许多优点包括，例如抗原呈递多肽(如，包含负载外源抗原性多肽的HLA-E多肽或HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽)的有效呈递，以及循环中aAPC的极长半衰期，因此提供延长暴露于适当呈递的抗原的时间。
因此，在某些实施方案中，本公开提供了包含红系细胞(如，去核红系细胞)的aAPC，该红系细胞通常经遗传工程化改造以在细胞表面上包含含有HLA-E多肽或HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽。在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含与一种或多种外源抗原性多肽结合的HLA-E多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含表1中列出的抗原性多肽。在一些实施方案中，一种或多种外源抗原性多肽包含HSP60自身抗原或其部分，如前导序列。在一些实施方案中，抗原呈递多肽包含与一种或多种外源抗原性多肽结合的HLA-G多肽，其中一种或多种外源抗原性多肽之一包含具有氨基酸序列基序XI/LPXXXXXXL(SEQ IDNO:8)的肽。
另一方面，将aAPC设计为刺激调节性T细胞，从而使免疫系统偏向回到更耐受的状态。因此，在一些实施方案中，aAPC还包含至少一种本文所述的共刺激性多肽。在这方面，在优选实施方案中，至少一种外源共刺激性多肽扩增调节性T细胞(Treg)，并且是例如本文所述的外源Treg共刺激性多肽。
又一方面，将aAPC设计为扩增和刺激T细胞，例如细胞毒性CD8+T细胞。在这方面，自身免疫性疾病优选是由Tfh、Th1和Th17 CD4细胞调节或触发的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，aAPC还包含本文所述的至少一种外源共刺激性多肽。在一些实施方案中，至少一种外源共刺激性多肽扩增细胞毒性CD8+T细胞。
一些方面，本公开提供了治疗患有自身免疫性疾病的受试者的方法，其包括向该受试者施用有效数量的本文所述的红系细胞，从而治疗该自身免疫性疾病。在此类方法中，可用于治疗自身免疫性疾病的aAPC包含外源抗原呈递多肽和抗原性多肽，其中抗原性多肽可以是表1中列出的抗原或其抗原性部分，或具有氨基酸序列基序XI/LPXXXXXXL(SEQ IDNO:8)的肽。
免疫激活的疾病还包括炎性疾病如例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻或其他特发性炎性肠病。免疫激活的疾病还包括变应性疾病，如例如哮喘、花生变态反应、贝类变态反应、花粉变态反应、乳蛋白变态反应、昆虫叮咬变态反应和乳胶变态反应、动物皮屑变态反应、黑胡桃和英国胡桃(English walnut)变态反应、巴西坚果变态反应、腰果变态反应、栗子变态反应、尘螨变态反应、蛋变态反应、鱼类变态反应、榛子变态反应、霉菌变态反应、花粉变态反应、草变态反应、贝类变态反应、大豆变态反应、树坚果(tree nut)变态反应和小麦变态反应、或由T辅助2(Th2)细胞介导的变应性疾病。
免疫激活疾病还包括响应于为治疗原发性状况而施用的治疗性蛋白的免疫激活，其降低了治疗性蛋白的功效，如例如血友病A中的凝血因子VIII、血友病B中的凝血因子IX、类风湿性关节炎和其他炎性疾病中的抗肿瘤坏死因子alpha(TNFa)抗体、高歇氏病(Gaucher's disease)中的葡萄糖脑苷脂酶、用于酶替代疗法的任何重组蛋白或急性成淋巴细胞性白血病(ALL)中的天冬酰胺酶。
在一些实施方案中，患者患有自身免疫性疾病或病症或自身抗体介导的疾病或病症，其中患者的免疫系统对内源(自身)分子(如，蛋白抗原)具有活性，使得免疫系统攻击内源分子，诱导炎症，损害组织并以其他方式引起自身免疫或自身抗体疾病或病症的症状。免疫应答可由与内源分子结合的抗体驱动，或者可由攻击表达内源分子的细胞的过度活跃的T细胞驱动，或者可由其他免疫细胞(如，调节性T细胞、NK细胞、NKT细胞或B细胞)驱动。在这些实施方案中，对应于内源(自身)分子的抗原性蛋白或其片段可在包含红系细胞的aAPC上表达，从而呈递一种或多种外源多肽，如本文所述。当向患有疾病或病症的患者一次或多次施用时，aAPC将足以诱导对抗原性蛋白的耐受性，从而使其不再诱导免疫系统的激活，并因此将治疗或减轻潜在疾病或病症的症状。在某些实施方案中，将aAPC用于刺激T调节细胞，从而使免疫系统偏向回到内源(自身)分子的更耐受状态。
在其他实施方案中，患者患有变应性疾病，例如对动物皮屑、黑胡桃、巴西坚果、腰果、栗子、尘螨、蛋、英国胡桃、鱼、榛子、昆虫毒液、乳胶、乳、霉菌、花生、花粉、草、贝类、大豆、坚果或小麦的变态反应。患有变态反应的患者在与过敏原的抗原片段接触后可引发免疫应答，例如通过饮食、皮肤接触、注射或环境暴露。免疫应答可涉及IgE抗体、敏化的肥大细胞、脱粒、组胺释放和过敏反应，以及诸如T细胞、B细胞、树突细胞、调节性T细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞和NKT细胞等典型免疫细胞。变应性反应可引起不适或可以严重到足以致死，因此需要患者及其家人和看护者时刻保持警惕。在这些实施方案中，抗原蛋白或其片段可呈递于本公开的aAPC的红系细胞上。在一次或多次施用于变应性疾病或病症的患者时，这些细胞群体足以诱导对抗原蛋白的耐受性，从而使其在暴露后不再诱导免疫系统的激活，因此可治疗或改善潜在的变应性疾病或病症的症状。
在一些实施方案中，患者患有传染性疾病，如病毒传染性疾病。
受试者
本文所述的方法旨在与可体验到这些方法的益处的任何受试者一起使用。因此，“受试者”、“患者”和“个体”(可互换使用)包括人以及非人类受试者，尤其是家养动物。
在一些实施方案中，受试者和/或动物是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、兔、绵羊或非人灵长类，例如猴、黑猩猩或狒狒。在其他实施方案中，受试者和/或动物是非哺乳动物。在一些实施方案中，受试者和/或动物是人。在一些实施方案中，人是儿童。在其他实施方案中，人是成年人。在其他实施方案中，人是老年人。在其他实施方案中，人可被称为患者。
在某些实施方案中，人的年龄范围为约0个月至约6个月龄、约6至约12个月龄、约6至约18个月龄、约18至约36个月龄、约1至约5岁龄、约5至约10岁龄、约10至约15岁龄、约15至约20岁龄、约20至约25岁龄、约25至约30岁龄、约30至约35岁龄、约35至约40岁龄、约40至约45岁龄、约45至约50岁龄、约50至约55岁龄、约55至约60岁龄、约60至约65岁龄、约65至约70岁龄、约70至约75岁龄、约75至约80岁龄、约80至约85岁龄、约85至约90岁龄、约90至约95岁龄、或约95至约100岁龄。
在其他实施方案中，受试者是非人动物，因此本公开涉及兽医用途。在具体实施方案中，非人动物是家养宠物。在具体实施方案中，非人动物是家畜动物。在某些实施方案中，受试者是不能接受化学疗法的人癌症患者，例如患者对化学疗法无反应或病情严重以不具有合适的化学疗法的治疗窗口(如，经历太多的剂量或方案限制的副作用)。在某些实施方案中，受试者是患有晚期和/或转移性疾病的人癌症患者。
在一些实施方案中，选择用aAPC进行治疗的受试者，其中aAPC包含工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，其包括一个或多个本公开的外源多肽，如抗原呈递多肽，如HLA-E或HLA-G。在某些实施方案中，选择用aAPC进行治疗自身免疫性疾病、炎性疾病、变应性病症或传染性疾病的受试者，其中aAPC包含工程化红系细胞(如，工程化去核红系细胞)或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)，其包含本文公开的一个或多个外源多肽，如外源抗原呈递多肽，如包含HLA-E多肽或HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽。
V.药物组合物
本公开涵盖了包含本公开的aAPC作为活性成分的药物组合物的制备和用途。此类药物组合物可以适合于施用于受试者的形式由单独的活性成分组成，作为至少一种活性成分(如，有效剂量的aAPC)的组合，或者药物组合物可包含活性成分以及一种或多种药学上可接受的载体、一种或多种其他(活性和/或非活性)成分或这些的一些组合。
在一些实施方案中，本公开的特征在于药物组合物，其包含多个本文所述的aAPC和药物载体。在其他实施方案中，本公开的特征在于药物组合物，其包含如本文所述的aAPC群体和药物载体。应当理解，如本文其他地方所述的任何单个aAPC、多个aAPC或aAPC群体可存在于本文所述的药物组合物中。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含工程化或经修饰的红系细胞和未经工程化或未经修饰的红系细胞。例如，在不同实施方案中，单个单位剂量的aAPC可包含约、至少或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的工程化红系细胞或经修饰的红系细胞，其中组合物中其余的红系细胞未经工程化或未经修饰。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含aAPC，其包含工程化去核红系细胞或去核细胞(如，经修饰的去核细胞)与有核红系细胞。例如，在不同实施方案中，单个单位剂量的工程化红系细胞(如，去核和有核红系细胞)可包含约或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的去核红系细胞，其中组合物中其余的红系细胞是有核的。
本公开的药物组合物可以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。尽管可通过临床试验确定适当的剂量，但是施用的量和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病类型和严重性等因素来确定。
药物组合物的施用可以任何方便的方式进行，包括通过气雾吸入、注射、摄入、输血、植入或移植。本公开的组合物可以皮下、皮内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹腔内施用于患者。可将药物组合物直接注射到肿瘤或淋巴结中。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指可与活性成分组合，并且在组合后可用于向受试者施用活性成分的化学组合物。
本文所述的药物组合物的配制剂可通过药理学领域中已知的或此后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与载体或一种或多种其他辅助成分缔合，然后，如果必要或期望，将产品成型或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于对人进行伦理施用的药物组合物，但是本领域技术人员将理解，此类组合物通常适合于向所有种类的动物施用。为了使组合物适合于向各种动物施用，适合于向人施用的药物组合物的修饰是众所周知的，并且普通技术的兽医药理师可仅通过普通(如果有任何)实验来设计和进行此类修饰。预期施用本公开的药物组合物的受试者包括但不限于人和其他灵长类，哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，如非人灵长类、牛、猪、马、绵羊、猫和狗、鸟类，包括商业相关的鸟类，如鸡、鸭、鹅和火鸡；鱼类，包括农场饲养的鱼和观赏鱼以及甲壳类动物，例如农场饲养的贝类。
可用于本公开的方法的药物组合物可适合于口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺、鼻内、病灶内、口腔、眼、静脉内、器官内或另一施用途径的配制剂制备、包装或出售。其他预期的配制剂包括预计的纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫学的配制剂。
本公开的药物组合物可作为单个单位剂量或作为多个单个单位剂量散装制备、包装或出售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将被施用于受试者的活性成分的剂量或该剂量的方便的分数，例如该剂量的一半或三分之一。
本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的载体和任何另外的成分的相对量将根据所治疗受试者的身份、大小和状况而变化并进一步取决于组合物施用的途径。举例来说，组合物可包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。
除活性成分外，本发明的药物组合物还可包含一种或多种其他药物活性剂。特别考虑的其他试剂包括止吐药和清除剂，如氰化物和氰酸盐清除剂和AZT、蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、白介素-2、干扰素、细胞因子等。
可使用常规技术来制备本公开的药物组合物的控释或缓释配制剂。
如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括特征在于对受试者的组织进行物理破坏并通过组织中的破坏进行药物组合物的施用的任何施用途径。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物，通过手术切口施用组合物，通过穿透组织的非手术伤口施用组合物等来施用药物组合物。特别地，肠胃外给药预期包括但不限于皮下、腹膜内、肌内、胸骨内注射和肾透析输注技术。
适用于肠胃外施用的药物组合物的配制剂包含与药学上可接受的载体(如，无菌水或无菌等渗盐水)组合的活性成分。此类配制剂可以适合于推注施用或连续施用的形式制备、包装或出售。可注射配制剂可以以单位剂型(如，在安瓿或含有防腐剂的多剂量容器中)制备、包装或出售。肠胃外施用的配制剂包括但不限于悬浮液、溶液、油性或水性媒介物中的乳液、糊剂和可植入的缓释或可生物降解配制剂。此类配制剂可进一步包含一种或多种另外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。
药物组合物可以无菌可注射的水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或出售。该悬浮液或溶液可根据已知技术进行配制，并且除了活性成分外，还可包含另外的成分，如本文所述的分散剂、湿润剂或悬浮剂。可使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(如，水或1,3-丁二醇)来制备此类无菌可注射配制剂。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和不挥发性油，如合成的甘油单酯或甘油二酯。其他有用的可胃肠外施用的配制剂包括那些以微晶形式，在脂质体制剂中或作为可生物降解的聚合物系统的组分包含活性成分的配制剂。用于缓释或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物或疏水材料，如乳液、离子交换树脂、微溶聚合物或微溶盐。
可将本公开的aAPC和/或使用aAPC扩增的T细胞施用于动物，优选人。当施用使用本公开的aAPC扩增的T细胞时，施用的细胞量可在约100万至约3000亿个细胞的范围内。在施用aAPC本身的情况下，无论是否在其中扩增T细胞，可以约100,000至约10亿个细胞的量施用它们，其中将细胞输注到动物，优选地，有此需要的人类患者中。尽管精确施用的剂量取决于许多因素，包括但不限于动物的类型和所治疗疾病状态的类型、动物的年龄和施用途径。
可每天多次对动物施用aAPC，或可较不频繁地施用aAPC，如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次或甚至更不频繁，如每几个月一次，或甚至一年一次或更少。剂量的频率对技术人员而言是显而易见的，并且将取决于许多因素，如但不限于所治疗疾病的类型和严重性、动物的类型和年龄等。
可将aAPC(或由此扩增的细胞)与各种其他化合物(细胞因子、化学治疗和/或抗病毒药物等)共同施用。或者可在aAPC(或由此扩增的细胞)之前1小时、1天、1周、1个月或甚至更长时间或其任何排列施用化合物。此外，可在施用aAPC(或由此扩增的细胞)之后的1小时、1天、1周或甚至更长时间或其任何排列施用化合物。频率和施用方案对本领域技术人员而言是显而易见的，并且将取决于许多因素，如但不限于所治疗疾病的类型和严重性、动物的年龄和健康状态、待施用的一种或多种化合物的身份、各种化合物和aAPC(或由此扩增的细胞)的施用途径等。
此外，基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将认识到，在将aAPC施用于哺乳动物的情况下，对细胞进行处理，以使其处于“无生长状态”；也就是说，当施用于哺乳动物细胞时，细胞不能分裂。如本文其他地方所公开的，一旦施用于哺乳动物，可以对细胞进行辐照以使其不能生长或分裂。在本领域中已知其他方法，包括半抗原化(例如，使用二硝基苯基和其他化合物)，以使待施用的细胞，特别是对人施用的细胞不能生长，并且这些方法在本文中不再进一步讨论。而且，已经致使不能体内分裂的aAPC的施用的安全性已经在I期临床试验中确定，该临床试验使用用编码本文讨论的一些分子的质粒载体转染的aAPC。
联合疗法
在一些实施方案中，本公开提供了进一步包括向受试者施用另外的试剂的方法。在一些实施方案中，本公开涉及共同施用和/或共同配制。
在一些实施方案中，当与另一种试剂共同施用时，aAPC的施用协同起作用，并且以比当将此类试剂用作单一疗法时通常使用的剂量低的剂量来施用。
在上述方面和实施方案的一些实施方案中，红系细胞是去核红系细胞。在上述方面和实施方案的一些实施方案中，红系细胞是有核红系细胞。
在一些实施方案中，本公开的特征在于药物组合物，其包含多个本文所述的工程化红系细胞和药物载体。在其他实施方案中，本公开的特征在于药物组合物，其包含本文所述的工程化红系细胞的群体和药物载体。应当理解，如本文其他地方所述的任何单个工程化红系细胞、多个工程化红系细胞或工程化红系细胞的群体可以存在于本文所述的药物组合物中。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含工程化(即，经修饰的)红系细胞和未经修饰的红系细胞。例如，在不同实施方案中，单个单位剂量的红系细胞(如，修饰的和未修饰的红系细胞)可包含约、至少或不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的工程化红系细胞，其中组合物中剩余的红系细胞未经工程化。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含工程化去核红系细胞和有核红系细胞。例如，在各种实施方案中，单个单位剂量的工程化红系细胞(如，去核和有核红系细胞)可包含约或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的去核红系细胞，其中组合物中剩余的红系细胞是有核的。
VI.试剂盒
本公开包括各种试剂盒，其包含本公开的aAPC、施加器(applicator)和描述使用试剂盒执行本公开方法的说明材料。尽管下面描述了示例性试剂盒，但是根据本公开，其他有用的试剂盒的内容对于本领域技术人员将是显而易见的。这些试剂盒中的每一个都包括在本公开内。
本公开包括试剂盒，其用于使用aAPC(包含含有HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽)特异性诱导调节性T细胞的激活或使用aAPC(包含含有HLA-E多肽或HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽)特异性诱导其他免疫细胞(如，T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和/或树突细胞)的抑制。根据本公开所公开的方法使用该试剂盒。简言之，该试剂盒可用于将本公开的aAPC施用于免疫细胞，如调节性T细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和/或树突细胞。此外，使用该试剂盒产生的免疫细胞可施用于动物以实现治疗效果。
试剂盒还包括用于将aAPC施用于免疫细胞的施加器。试剂盒中包括的特定施加器将取决于，例如用于施用aAPC的方法和由aAPC扩增的免疫细胞，并且此类施加器是本领域所熟知的，并且除其他外，还可包括：移液器、注射器、滴管等。此外，试剂盒包括用于试剂盒使用的说明材料。这些说明书仅使本文提供的公开具体化。
试剂盒包括药学上可接受的载体。以如本文其他地方所述的适当量提供组合物。此外，施用途径和施用频率如本文先前其他地方所述。
试剂盒涵盖包含大量分子的aAPC，如但不限于本文所述的那些。然而，掌握了本文提供的教导的技术人员将容易理解，本公开绝不限于这些或任何其他分子组合。而是，本文阐述的组合是出于说明性目的，并且它们绝不限制本公开涵盖的组合。
出于所有目的，在本说明书中引用的所有出版物和专利申请以其整体通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物或专利申请均被明确地和单独地指出出于所有目的通过引用并入。本文讨论的出版物仅针对其在本申请的提交日期之前的公开而提供。本文中的任何内容均不得解释为承认本文所述的发明人由于先前的公开或由于任何其他原因而无权先于此类公开。
实施例
实施例1：产生遗传工程化以包含HLA-E-GPA融合蛋白的红系细胞
转导红系细胞以包含融合蛋白，该融合蛋白包含外源抗原呈递多肽，特别是包含与充当膜锚的全长血型糖蛋白A(GPA)蛋白融合的HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽(HLA-E-GPA融合蛋白)。例如，包含融合至GPA的HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽可如图1所示排列，其提供了用于包括连接至β2M多肽和至GPA膜锚的HLA-E多肽的一个或多个α域(如，α1、α2和α3域)的示例性设计。
如以下“方法”部分所述进行细胞培养和转导，以产生包含用GPA锚定的细胞表面上的HLA-E的红系细胞。
将结合APC标记或PE标记的抗HLA-E抗体用于验证工程化红系细胞中包含含有HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽。
方法
慢病毒载体的产生
将编码HLA-E-GPA融合蛋白的基因克隆到来自System Biosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点中。通过用pPACKH1(System Biosciences)和pCDH慢病毒载体(包含编码HLA-E-GPA融合蛋白的核酸)转染细胞在293T细胞中产生慢病毒。然后将细胞置于新鲜培养基中。更换培养基后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟收集病毒上清液。收集上清液，于-80℃等分冷冻。
红系细胞的扩增和分化
从AllCells公司冷冻购买来自正常人供体的动员外周血细胞的人CD34+细胞。扩增/分化过程包括3个阶段。第一阶段，解冻的CD34+红系前体细胞在包含重组人胰岛素、人转铁蛋白、重组人重组人干细胞因子和重组人白细胞介素3的Iscove’s MDM培养基中培养。第二阶段，红细胞在添加血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白、人重组干细胞因子、人重组红细胞生成素和L-谷氨酰胺的Iscove’s MDM培养基中培养。第三阶段，红系细胞在添加人转铁蛋白、重组人胰岛素、人重组促红细胞生成素和肝素的Iscove’s MDM培养基中培养。将培养物保持在37℃的5％CO2培养箱中。
红系前体细胞的转导
在上述培养过程的步骤1期间转导红系前体细胞。将培养基中的红系前体细胞与慢病毒上清液和聚凝胺混合。通过旋转接种于室温下以2000rpm的速度旋转平板90分钟来实现感染。接种后，将细胞于37℃下温育过夜。
抗体结合
APC标记或PE标记的抗HLA-E抗体的结合用于验证工程化红细胞中包含含有HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽。通过针对APC荧光或PE荧光的流式细胞术测量抗体结合。基于染色的未转导的细胞设置门控。
实施例2：产生遗传工程化以包含HLA-G-GPA融合蛋白的红系细胞
结果
转导红系细胞以包含融合蛋白，该融合蛋白包含外源抗原呈递多肽，特别是包含与充当膜锚的GPA蛋白融合的HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽(HLA-G-GPA融合蛋白)。例如，包含融合至GPA的HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽可如图2B所示排列，其提供了用于包括与GPA膜锚和β2M多肽连接的HLA-G多肽的一个或多个α域(如，α1、α2和α3域)的示例性设计。
如以下“方法”部分所述进行细胞培养和转导，以产生在细胞表面上包含含有用GPA跨膜域锚定的HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽的红系细胞。
将结合APC标记或PE标记的抗HLA-G抗体用于验证工程化红细胞中包含含有HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽。
方法
慢病毒载体的产生
将编码HLA-G-GPA融合蛋白的基因克隆到来自System Biosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点。通过用pPACKH1(System Biosciences)和pCDH慢病毒载体(包含编码HLA-G-GPA融合蛋白的核酸)转染在293T细胞中产生慢病毒。然后将细胞置于新鲜培养基中。在更换培养基后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟收集病毒上清液。收集上清液，于-80℃等分冷冻。
红系细胞的扩增和分化
从AllCells公司冷冻购买来自正常人供体的动员外周血细胞的人CD34+细胞。扩增/分化过程包括3个阶段。第1阶段，在包含重组人胰岛素、人转铁蛋白、重组人重组人干细胞因子和重组人白细胞介素3的Iscove’s MDM培养基中培养解冻的CD34+红系前体细胞。第2阶段，在添加血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白、人重组干细胞因子、人重组红细胞生成素和L-谷氨酰胺的Iscove’s MDM培养基中培养红细胞。第3阶段，在添加人转铁蛋白、重组人胰岛素、人重组促红细胞生成素和肝素的Iscove’s MDM培养基中培养红系细胞。将培养物保持在37℃的5％CO2培养箱中。
红系前体细胞的转导
在上述培养过程的步骤1期间转导红系前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺混合。通过旋转接种于室温下以2000rpm的速度旋转平板90分钟来实现感染。接种后，将细胞于37℃下温育过夜。
抗体结合
APC标记或PE标记的抗HLA-G抗体的结合用于验证工程化红系细胞中包含含有HLA-G多肽的外源抗原呈递多肽。通过针对APC荧光或PE荧光的流式细胞术测量抗体结合。基于染色的未转导的细胞设置门控。
实施例3：产生遗传工程化以包含HSP60-HLA-E-GPA融合蛋白的红系细胞
结果
转导红系细胞以包含融合蛋白，该融合蛋白包含外源抗原性多肽，HSP60的前导序列，其融合至外源抗原呈递多肽，特别是包含融合至充当膜锚的GPA的HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽(HSP60-HLA-E-GPA融合蛋白)，图1显示作为单链融合物的抗原性多肽(如，HSP60前导序列肽)和包含HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽的示例性设计的示意图，其中外源肽(HSP60前导序列)连接至β2M多肽，所述β2M多肽连接至HLA-E多肽的一个或多个α域(如，α1、α2和α3域)，所述α域连接至GPA膜锚。如以下“方法”部分所述进行细胞培养和转导，以产生包含HSP60的前导序列的红系细胞，所述HSP60的前导序列由外源抗原呈递多肽呈递，所述外源抗原呈递多肽包含用GPA跨膜域锚定的细胞表面上的HLA-E多肽。
APC标记或PE标记的抗HLA-E抗体的结合用于验证工程化红系细胞中包含含有HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽。
方法
慢病毒载体的产生
将编码HSP60-HLA-E-GPA融合蛋白的基因克隆到来自System Biosciences的具有MSCV启动子序列的慢病毒载体pCDH的多克隆位点。在293T细胞中通过用pPACKH1(SystemBiosciences)和pCDH慢病毒载体(含有HSP60-HLA-E-GPA基因)转染细胞产生慢病毒。然后将细胞置于新鲜培养基中。在更换培养基后48小时，通过以1,500rpm离心5分钟收集病毒上清液。收集上清液，于-80℃等分冷冻。
红系细胞的扩增和分化
从AllCells公司冷冻购买来自正常人供体的动员外周血细胞的人CD34+细胞。扩增/分化过程包括3个阶段。第1阶段，在包含重组人胰岛素、人转铁蛋白、重组人重组人干细胞因子和重组人白细胞介素3的Iscove’s MDM培养基中培养解冻的CD34+红系前体。第2阶段，在补充血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白、人重组干细胞因子、人重组红细胞生成素和L-谷氨酰胺的Iscove’s MDM培养基中培养红系细胞。第3阶段，在添加人转铁蛋白、重组人胰岛素、人重组促红细胞生成素和肝素的Iscove’s MDM培养基中培养红系细胞。将培养物保持于37℃的5％CO2培养箱。
红系前体细胞的转导
在上述培养过程的步骤1期间转导红系前体细胞。将培养基中的红系细胞与慢病毒上清液和聚凝胺混合。通过旋转接种于室温下以2000rpm的速度旋转平板90分钟来实现感染。接种后，将细胞于37℃下温育过夜。
抗体结合
APC标记或PE标记的抗HLA-G抗体的结合用于验证工程化红系细胞中包含含有HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽。通过针对APC荧光或PE荧光的流式细胞术测量抗体结合。基于染色的未转导的细胞设置门控。
实施例4：包含HLA-E-HSP60融合蛋白的红系细胞在体外激活CD8+调节性T细胞
转导红系细胞以包含融合蛋白(HSP60-HLA-E-GPA融合蛋白)，该融合蛋白包含融合至外源抗原呈递多肽的外源抗原性多肽(HSP60的前导序列)，该外源抗原呈递多肽包含融合至GPA跨膜域的HLA-E多肽，如实施例3所述。
使用基于人CD8+调节性T细胞的增殖试验评估功能活性。细胞用荧光染料5,6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记。响应于工程化红系细胞而增殖的那些细胞显示CFSE荧光强度的降低，这通过流式细胞术直接测量。可选择地，可将放射性胸苷掺入用于评估用工程化以包含HSP60-HLA-E-GPA融合蛋白的红系细胞刺激的CD8+调节性T细胞的生长速率。
还使用体外Treg抑制试验评估功能活性。此类测定描述于Collinson和Vignali(Methods Mol Biol.2011；707:21-37，通过引用整体并入本文)中。
实施例5：在1型糖尿病的体外模型中测试遗传工程化改造以包含HLA-E-HSP60-GPA融合蛋白的红系细胞
转导红系细胞以包含融合蛋白(HSP60-HLA-E-GPA融合蛋白)，该融合蛋白包含融合至外源抗原呈递多肽的外源抗原性多肽(HSP60的前导序列)，该外源抗原呈递多肽包含融合至GPA跨膜域的HLA-E多肽，如实施例3所述。
使用来自具有CD8+调节性T细胞缺陷的1型糖尿病(T1D)患者的细胞，利用体外自身/非自身鉴别试验评估功能活性，并与正常对照组比较其特异性抑制HLA-E(包括装载HSP60的靶标)的能力。该测定描述于Jiang et al.(J.Clin Invest.,2010,120(10):3641-3650，通过引用以其整体并入本文)。简言之，来自T1D患者的CD8+调节性T细胞通过用包括HLA-E-HSP60-GPA融合蛋白或缺乏外源抗原性多肽的类似构建体(对照)的红系细胞引发在体外加强。在CD8+T细胞抑制试验中测试加强的CD8+调节性T细胞系的特异性。
实施例6：在小鼠CIA模型中测试经工程化改造以包含HLA-E-HSP60-GPA融合蛋白的红系细胞
类风湿性关节炎(RA)是主要以关节炎症和侵蚀为特征的自身免疫性疾病。更有效的RA治疗方法可能需要消除自身反应性T细胞，而这又取决于对调节性T细胞的精确定义，这些细胞可以靶向并消除诱发疾病的致病性T细胞亚组。调节性T细胞和效应细胞对自身免疫性关节炎的贡献，可在完善建立的胶原诱导关节炎(CIA)小鼠模型中进行研究。这种鼠疾病模型与人RA共有几个相似之处，包括破坏自我耐受性、产生自身抗体、多个关节的炎症变化以及伴随关节翳形成的骨和软骨侵蚀。
使用点击方法(用于功能化红系细胞的点击化学描述于国际申请号PCT/US2018/000042，其要求于2017年2月17日提交的美国临时申请号62/460589和于2017年7月8日提交的美国临时申请号62/542142的优先权，通过引用以其整体并入本文)将鼠红系细胞与呈递HSP60肽的前导序列的外源抗原呈递多肽HLA-E(HLA-E-HSP60-GPA融合蛋白)缀合。
使用小鼠CIA模型在体内评估功能活性，如Leavenworth等(J Clin Invest.2013；123(3):1382-1389，通过引用整体并入本文)所述。简言之，通过皮内注射150μg在CFA中乳化的cCII，然后21天后用100μg在IFA中乳化的cCII加强，在8-12周龄的B6小鼠中诱导CIA。第27天(加强后7天)通过尾静脉静脉内施用开始用与呈递HPS60肽的前导序列的包含HLA-E多肽的外源抗原呈递多肽缀合的红系细胞给药。在研究跨度内施用剂量1次或多次，所述研究跨度的范围可以为给药之间的2-14天。将CIA关节炎评分和自身抗体产生用作疾病进展的测量。还进行CD8+调节性T细胞数量和表型的离体分析。通过CD8+CD122+Ly49+和HSP60四聚体阳性描绘CD8+调节性T细胞的概况。
另一评估方法通过过继转移体外扩增的CD8+调节性T细胞。简言之，将包含HLA-E-HSP60-GPA融合蛋白的红系细胞用于在体外扩增HSP60特异性CD8+调节性T细胞。将少量(5×104/小鼠)HSP60-HLA-E-GPA特异性CD8+调节性T细胞过继转移至CIA小鼠，用于监测自身抗体产生和自身免疫性关节炎的进展。
每周进行2-3次CIA评分，评分系统如下：0，正常；1，足中部或踝关节轻度肿胀和/或红斑，2，从踝关节延伸到跖骨关节的中度水肿性肿胀；和3，包括脚踝、脚和趾的明显肿胀。每只小鼠以最大得分12对每个肢体评分。
实施例7：在小鼠EAE模型中测试经工程化改造以包含HLA-E-HSP60-GPA融合蛋白的红系细胞
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是最常用于研究潜在药物治疗多发性硬化症(MS)功效的模型。由于其与MS的许多相似之处，EAE用于研究自身免疫、CNS炎症、脱髓鞘、细胞运输和耐受诱导的发病机理。EAE的特征在于麻痹(在某些模型中，麻痹是复发缓解型)、CNS炎症和脱髓鞘。将在C57BL/6小鼠(Hooke Laboratories)中进行EAE诱发的Hooke KitsTM用于在雌性C57BL/6小鼠中诱发EAE。使用此方法，通过如下在C57BL/6小鼠中诱导EAE：在完全弗氏佐剂(CFA)中用MOG35-55或MOG1-125乳剂免疫，接着在免疫当天首次和第二天再次施用PBS中的百日咳毒素。典型的EAE发作是在免疫后9至14天，每只小鼠在发作后3至5天达到疾病峰值。峰值持续1至3天，然后部分恢复。最初部分恢复后，约25％的小鼠会显示EAE严重性增加(复发)。这通常在免疫后20至27天发生。使用10至12只小鼠的组，每笼4至6只小鼠。
包含HSP60-HLA-E-GPA融合蛋白的红系细胞如实施例6所述制备，并在适合于红系细胞的缓冲液中配制。在EAE发作时开始用去核红系细胞进行治疗。如果测试红系细胞逆转慢性EAE进程的能力，则应在疾病发作后7至14天开始治疗。在小鼠出现EAE时(滚动入组)或在免疫后的固定时间将小鼠分配至治疗组，但始终以平衡的方式获得具有相似EAE发作时间和相似EAE发作评分的组。如果入组在EAE发作后，则在入组前也要平衡小鼠的最大评分。
临床评分＝1时进行给药，如以下表8中所示。
动物的给药可以进行总共1至3次(如，剂量之间2至14天)。
使用以下一种或多种确定对包含HSP60-HLA-E-GPA的工程化去核红系细胞的作用的评估：(1)EAE评分；(2)体重变化；和(3)组织学分析，如以下详述。
EAE评分
通常，EAE按照0至5的量表评分，包括当临床情况介于两个定义的评分之间时的“中间”得分(即0.5、1.5、2.5、3.5)。对于每只个体小鼠，评分方法根据疾病的阶段(发作/峰值对恢复)略有不同。为了避免无意识的评分偏见，通过不知晓哪只小鼠接受了哪种治疗的人对小鼠进行盲评分。
表8小鼠EAE评分-发作和峰值
Figure BDA0003181628170001351
Figure BDA0003181628170001361
Figure BDA0003181628170001371
在EAE的恢复阶段，大多数小鼠的尾巴将不再瘫软，但也不正常。感觉僵硬，被“钩住”。后腿可以开始移动(踩踏)，但小鼠无法行走。任何一种变化都使得分变得困难。因此，如果是这种情况，则对这些小鼠使用对以上评分标准的以下修改：
表9小鼠EAE得分-修改
Figure BDA0003181628170001372
体重
在EAE过程期间，体重的变化反映出疾病的严重程度。免疫后的第二天，小鼠通常失去少量体重。这似乎是由于所施用的佐剂和百日咳毒素的作用。然后，小鼠稳步增加其体重，直到疾病发作。在EAE发作的那天，小鼠持续失去1-2g的体重(体重的5-10％)。随着EAE严重程度的发展，体重减轻持续，疾病峰值时体重减轻达到其发病前体重的20％左右。体重减轻最有可能是由于麻痹和食物摄入减少以及炎症的急性期期间促炎性细胞因子(如，TNF)的大量产生。达到疾病峰值后，即使临床得分没有改善，小鼠也逐渐增重。体重的此增加可能是由于炎症的下调，这导致血液中较低的促炎细胞因子水平。未经处理或经媒介物处理的小鼠在免疫后28天通常具有约90％的免疫前体重。
组织学
研究结束时(通常在免疫后约28天左右)或媒介物组达到疾病峰值时(通常在免疫后14至18天)进行组织学分析。EAE中的炎症通常始于脊髓的腰部区域，并在疾病峰值时扩散到整个脊髓。
疾病发作时，炎性病灶的数量与疾病的严重程度密切相关。病灶的数量在疾病峰值之前有所增加，此时在整个脊髓中通常发现6-15个炎性病灶/切片。EAE的慢性阶段(从疾病峰值后的几天开始)，许多炎性病灶消退，通常在免疫后约28天时在每个脊髓切片中导致3-4个炎性病灶。
因为在病程的早期存在最多的炎性病灶，所以如果在研究结束时进行组织学分析，则EAE发作较晚的小鼠在脊髓中通常具有比可从其临床得分预期的更多的炎性病灶。例如，在28天的研究中，免疫后27天EAE发作且最终临床评分为2的小鼠比免疫后9天EAE发作且最终评分为3.5的小鼠可能具有更多的炎性病灶。类似地，在研究结束前不久复发的小鼠(复发定义为临床得分增加1分或更多分)在研究结束时通常比患有稳定的慢性疾病的小鼠具有更多的炎性病灶，即使两者在研究结束时具有相同的临床得分。
脱髓鞘在疾病发作后的前两天内通常未发现，但在疾病峰值期(EAE发作后4至5天)发现，并在EAE的慢性期期间持续。脱髓鞘得分在峰值和免疫后28天之间变化不大，平均通常为1.2至2.5。
在Luxol fast blue染色切片(LFB)和H&E切片中均对脱髓鞘进行评分。在LFB切片中，脊髓白质染色为深蓝色，脱髓鞘区域为较浅蓝色，并与较大的空泡有关。在H&E染色的切片中，带有大空泡的正常结构的破坏表明脱髓鞘。
凋亡细胞在H&E切片中鉴别，并且通常在疾病发展的前两天期间未发现。它们在峰值时和慢性EAE阶段期间发现。每个切片中凋亡细胞的平均数量通常为2至4。
施用包含HSP60-HLA-E-GPA融合蛋白的红系细胞将导致以下的一种或多种：与媒介物处理的对照小鼠相比，EAE评分改善或炎性病灶数量降低。
序列表
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1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 39
Ala Gly Asn Leu Gly Gly Gly Val Val Thr Ile Glu Arg Ser Lys
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 40
Ala Gln Ala Ala Ala Pro Ala Ser Val Pro Ala Gln Ala Pro Lys
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 41
Pro Arg Lys Ile Glu Glu Ile Lys Asp Phe Leu Leu Thr Ala Arg
1 5 10 15
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 42
Ser Glu Gly Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ser Lys
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 43
Val Leu Lys Gln Val His Pro Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 44
Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg
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<211> 14
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 45
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<211> 14
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<400> 46
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<400> 47
Val Leu Lys Gln Val His Pro Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 48
Arg Lys Thr Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu Lys
1 5 10
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<211> 14
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 49
Ser Ala Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 50
Ala Ser Ala Glu Thr Val Asp Pro Ala Ser Leu Trp Glu Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 51
Thr Val Val Asn Lys Asp Val Phe Arg Asp Pro Ala Leu
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 52
Lys Thr Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu Lys
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<211> 13
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 53
Glu Gly Ile Pro Ala Leu Asp Asn Phe Leu Asp Lys Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 54
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 55
Pro Val Ala Val Met Ala Glu Ser Ala Phe Ser Phe Lys
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<213> 人工序列
<220>
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<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 56
Gln Thr Val Ala Val Gly Val Ile Lys Ala Val Asp Lys
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 57
Ile Leu Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 58
Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 59
Lys Gln Val His Pro Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 60
Val Gly Gly Thr Ser Asp Val Glu Val Asn Glu Lys
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 61
Asn Ser Val Val Glu Ala Ser Glu Ala Ala Tyr Lys
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 62
Ala Leu Arg Tyr Pro Met Ala Val Gly Leu Asn Lys
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 63
Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val Gln Thr Lys
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 64
Pro Glu Leu Ala Lys Ser Ala Pro Ala Pro Lys
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 65
Ser Glu Met Glu Val Gln Asp Ala Glu Leu Lys
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 66
Gln Thr Tyr Ser Thr Glu Pro Asn Asn Leu Lys
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 67
Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 68
Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg
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<211> 10
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 69
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 70
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1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 71
Thr Ala Glu Ile Leu Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys
1 5 10 15
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 72
Ile Leu Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 73
Ala Leu Ala Gly Cys His Leu Glu Asp Thr Gln Arg Lys Leu Gln Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 74
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1 5 10 15
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 75
Lys Met Lys Leu Arg Asn Thr Val His Leu Ser Tyr Leu Thr Val
1 5 10 15
<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 76
Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 77
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 78
Trp Thr Pro Gly Pro Ser Ala Gly Val Thr Gly Ile Ala
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 79
Ile Leu Arg Thr Ile Gly Lys Glu Ala Phe
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 80
Arg Ser Cys Gly Tyr Ala Cys Thr Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 81
Phe Pro Asn Gly Phe Ser Phe Ile His
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 82
Ser His Gly Pro Tyr Ile Lys Leu Ile
1 5
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 83
Ala Gln Ala Ala Ala Pro Ala Ser Val Pro Ala Gln Ala Pro Lys
1 5 10 15
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 84
Ala Tyr Val Arg Leu Ala Pro Asp Tyr Asp Ala Leu Asp Val Ala Asn
1 5 10 15
Lys
<210> 85
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 85
Ala Tyr Val Arg Leu Ala Pro Asp Tyr Asp Ala Leu Asp Val Ala Asn
1 5 10 15
<210> 86
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 86
Ala Ser Gly Asn Tyr Ala Thr Val Ile Ser His Asn Pro Glu Thr Lys
1 5 10 15
<210> 87
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 87
Ala Gly Asn Leu Gly Gly Gly Val Val Thr Ile Glu Arg Ser Lys
1 5 10 15
<210> 88
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 88
Pro Arg Lys Ile Glu Glu Ile Lys Asp Phe Leu Leu Thr Ala Arg
1 5 10 15
<210> 89
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 89
Asn Ile Asp Asp Gly Thr Ser Asp Arg Pro Tyr Ser His Ala
1 5 10
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 90
Thr Val Val Asn Lys Asp Val Phe Arg Asp Pro Ala Leu
1 5 10
<210> 91
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 91
Ala Leu Arg Tyr Pro Met Ala Val Gly Leu Asn Lys
1 5 10
<210> 92
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 92
Gln Thr Tyr Ser Thr Glu Pro Asn Asn Leu Lys
1 5 10
<210> 93
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 93
Pro Glu Leu Ala Lys Ser Ala Pro Ala Pro Lys
1 5 10
<210> 94
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 94
Lys Gln Val His Pro Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys
1 5 10
<210> 95
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 95
Val Leu Lys Gln Val His Pro Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys
1 5 10
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 96
Ser Glu Gly Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ser Lys
1 5 10
<210> 97
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 97
His Ala Val Ser Glu Gly Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ala
1 5 10 15
<210> 98
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 98
His Ala Val Ser Glu Gly Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ser
1 5 10 15
<210> 99
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 99
His Ala Val Ser Glu Gly Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ala
1 5 10 15
Lys
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 100
His Ala Val Ser Glu Gly Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ser
1 5 10 15
Lys
<210> 101
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 101
His Ala Val Ser Glu Gly Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ala
1 5 10 15
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 102
Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg
1 5 10
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 103
Ser Gln Ala Pro Leu Pro Cys Val Leu
1 5
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 104
Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu
1 5
<210> 105
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 105
Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ala Lys Gly Lys
1 5 10
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 106
Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu
1 5
<210> 107
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 107
Ala Gln Ala Ala Ala Pro Ala Ser Val Pro Ala Gln Ala Pro Lys Arg
1 5 10 15
Thr Gln Ala Pro Thr Lys Ala Ser Glu
20 25
<210> 108
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 108
Lys Leu Glu Lys Glu Glu Glu Glu Gly Ile Ser Gln Glu Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Glu Gln
<210> 109
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 109
Gly Asp Arg Ser Glu Asp Phe Gly Val Asn Glu Asp Leu Ala Asp Ser
1 5 10 15
Asp Ala Arg
<210> 110
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 110
Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn
1 5 10 15
Pro Lys
<210> 111
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 111
Ser Thr Ala Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg
1 5 10 15
<210> 112
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 112
Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg
1 5 10 15
<210> 113
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注解="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 113
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1 5

Claims (95)

1.人工抗原呈递细胞(aAPC)，所述人工抗原呈递细胞包含工程化去核红系细胞，其包含细胞表面上的外源抗原呈递多肽和与所述外源抗原呈递多肽特异性结合的外源抗原性多肽，其中所述外源抗原呈递多肽包含人白细胞抗原-E(HLA-E)多肽。
2.权利要求1所述的aAPC，其中所述HLA-E多肽包含选自下组的等位基因：E*01:01:01:01、E*01:01:01:02、E*01:01:01:03、E*01:01:01:04、E*01:01:01:05、E*01:01:01:06、E*01:01:01:07、E*01:01:01:08、E*01:01:01:09、E*01:01:01:10、E*01:01:02、E*01:03:01:01、E*01:03:01:02、E*01:03:01:03、E*01:03:01:04、E*01:03:02:01、E*01:03:02:02、E*01:03:03、E*01:03:04、E*01:03:05、E*01:04、E*01:05、E*01:06、E*01:07、E*01:08N、E*01:09和E*01:10。
3.权利要求1所述的aAPC，其中所述HLA-E多肽包含HLA-E*01:01或HLA-E*01:03等位基因。
4.权利要求1所述的aAPC，其中所述外源抗原性多肽包括自体肽。
5.权利要求1所述的aAPC，其中所述外源抗原性多肽包括致耐受性多肽。
6.权利要求1至3中任一项所述的aAPC，其中所述外源抗原性多肽包括自身免疫性疾病抗原。
7.权利要求1至3中任一项所述的aAPC，其中所述外源抗原性多肽包括HSP60的前导序列(QMRPVSRVL)(SEQ ID NO:17)。
8.权利要求1至3中任一项所述的aAPC，其中所述外源抗原性多肽包括表1中所列的多肽。
9.权利要求1至8中任一项所述的aAPC，其中所述HLA-E多肽包括一个或多个HLA-Eα域和β2M多肽或其片段。
10.权利要求9所述的aAPC，其中所述HLA-E多肽与膜锚连接。
11.权利要求9所述的aAPC，其中所述HLA-E多肽包括单链融合蛋白，所述单链融合蛋白包含经由接头与所述HLA-E多肽连接的外源抗原性多肽。
12.权利要求11所述的aAPC，其中所述单链融合蛋白还包括膜锚。
13.权利要求11所述的aAPC，其中所述接头包括可切割接头。
14.权利要求9至13中任一项所述的aAPC，其中所述膜锚包括血型糖蛋白A(GPA)蛋白或其跨膜域，或小整合膜蛋白1(SMIM1)或其跨膜域。
15.权利要求1所述的aAPC，其中所述外源抗原性多肽与所述外源抗原呈递多肽共价结合。
16.权利要求1所述的aAPC，其中所述外源抗原性多肽与所述外源抗原呈递多肽非共价结合。
17.权利要求1至16中任一项所述的aAPC，其中所述外源抗原性多肽为约8个氨基酸的长度至约24个氨基酸的长度。
18.权利要求1至17中任一项所述的aAPC，其中所述工程化去核红系细胞在所述细胞表面上还包含外源T调节性共刺激性多肽。
19.权利要求18所述的aAPC，其中所述外源T调节性共刺激性多肽是IL-17、IL-21、IL-18、IL-2、CD80、CD86、IL-15、TNFα、抗DR3激动剂、4-1BBL或TGFβ。
20.权利要求1至17中任一项所述的aAPC，其中所述工程化去核红系细胞在所述细胞表面上还包含外源共刺激性多肽。
21.权利要求1至17中任一项所述的aAPC，其中所述工程化去核红系细胞在所述细胞表面上还包含外源共抑制性多肽。
22.前述权利要求中任一项所述的aAPC，其中所述工程化去核红系细胞是网织红细胞。
23.前述权利要求中任一项所述的aAPC，其中所述工程化去核红系细胞是红细胞。
24.激活T调节性(Treg)细胞的方法，所述方法包括使所述Treg细胞与权利要求1至23中任一项所述的aAPC接触，从而激活所述Treg细胞。
25.抑制免疫细胞的方法，所述方法包括使所述免疫细胞与权利要求1至23中任一项所述的aAPC接触，从而抑制所述免疫细胞。
26.权利要求25所述的方法，其中所述免疫细胞是细胞毒性CD8+T细胞或自然杀伤细胞。
27.治疗需要调节的免疫应答的受试者的方法，所述方法包括使所述受试者的免疫细胞与权利要求1至23中任一项所述的aAPC接触，从而治疗需要调节的免疫应答的受试者。
28.权利要求27所述的方法，其中所述免疫细胞是T调节性细胞、细胞毒性CD8+T细胞或自然杀伤细胞。
29.权利要求24至28中任一项所述的方法，其中所述接触在体外或在体内进行。
30.治疗患有自身免疫性疾病或炎性疾病的受试者的方法，所述方法包括：
a)选择人工抗原呈递细胞(aAPC)，其中所述aAPC是包含抗原呈递多肽和至少一种与所述抗原呈递多肽特异性结合的外源抗原性多肽的工程化去核红系细胞，其中所述抗原呈递多肽包含HLA-E多肽，和
b)向所述受试者施用所述aAPC，
从而治疗所述患有自身免疫性疾病或炎性疾病的受试者。
31.权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述受试者患有自身免疫性疾病。
32.权利要求30所述的方法，其中所述自身免疫性疾病由Tfh细胞、Th1细胞或Th17细胞介导。
33.权利要求30所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自：I型糖尿病、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病(GVHD)、肾炎、多发性硬化症、混合性结缔组织病症、寻常型天疱疮、大疱性类天疱疮、膜性肾小球肾炎、视神经脊髓炎、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、皮肌炎、巨细胞动脉炎、肉芽肿病伴多血管炎、川崎病、狼疮性肾炎、结节性多动脉炎、坏疽性脓皮病、椎关节炎、系统性红斑狼疮、高安动脉炎。
34.权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述外源抗原性多肽包括HSP60的前导序列(QMRPVSRVL)(SEQ ID NO:17)。
35.权利要求27至29中任一项所述的方法，其中所述受试者患有变应性病症。
36.权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述受试者患有炎性疾病。
37.权利要求33所述的方法，其中所述炎性疾病是心脏炎性疾病、肝脏炎性疾病、胰腺炎性疾病、皮肤炎性疾病和/或胃肠(GI)道炎性疾病，例如，炎性疾病包括但不限于心肌炎、心肌病、心内膜炎、心包炎、肝硬化、哮喘(嗜酸性或非嗜酸性)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘和COPD重叠综合征(ACOS)、特应性皮炎、鼻息肉、变应性应答、慢性支气管炎、肺气肿、过敏性肺炎、变应性鼻炎、伴有或不伴有鼻息肉的慢性鼻鼻窦炎、炎症性肠病、肠易激综合征、回肠炎、慢性炎性肠病、纤维化、嗜酸性食管炎、血管炎、荨麻疹、Churg-Strauss综合征和炎性痛。
38.扩增调节性T(Treg)细胞群体的方法，所述方法包括：
从受试者获得细胞群体，其中所述群体包含Treg细胞，
使所述群体与权利要求1至23中任一项所述的aAPC接触，其中使所述群体与所述aAPC接触诱导所述Treg细胞的增殖，
从而扩增所述Treg细胞群体。
39.权利要求38所述的方法，其还包括从所述细胞群体中分离所述Treg细胞。
40.权利要求38或39所述的方法，其还包括将所述Treg细胞施用于所述受试者。
41.制备权利要求1至9中任一项所述的aAPC的方法，所述方法包括：
将编码所述外源抗原呈递多肽的外源核酸引入有核红系前体细胞；和
在适合于去核和产生所述外源抗原呈递多肽的条件下培养所述有核红系前体细胞，从而制备所述aAPC。
42.制备权利要求1至9中任一项所述的aAPC的方法，所述方法包括：
将编码所述外源抗原呈递多肽的外源核酸引入有核红系前体细胞；
将编码所述外源抗原性多肽的外源核酸引入所述有核红系前体细胞；和
在适合于去核和产生所述外源抗原呈递多肽和所述外源抗原性多肽的条件下培养所述有核红系前体细胞，从而制备所述aAPC。
43.制备权利要求1至9中任一项所述的aAPC的方法，所述方法包括：
将编码所述外源抗原呈递多肽的外源核酸引入有核细胞；
在适合于去核和产生所述外源抗原呈递多肽的条件下培养所述有核红系前体细胞，从而制备工程化去核红系细胞；和
使所述工程化去核红系细胞与至少一种外源抗原性多肽接触，其中所述至少一种外源抗原性多肽与存在于所述工程化去核红系细胞的细胞表面上的外源抗原呈递多肽结合，
从而制备所述aAPC。
44.权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述外源核酸包括DNA。
45.权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述外源核酸包括RNA。
46.权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述引入步骤包括病毒转导。
47.权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述引入步骤包括电穿孔。
48.权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述引入步骤包括利用以下一种或多种：脂质体介导的转移、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、脂质转染和慢病毒载体。
49.人工抗原呈递细胞(aAPC)，其包含工程化去核红系细胞，所述工程化去核红系细胞包含细胞表面上的外源抗原呈递多肽和与所述外源抗原呈递多肽特异性结合的外源抗原性多肽，其中所述外源抗原呈递多肽包含人白细胞抗原-G(HLA-G)多肽。
50.权利要求49所述的aAPC，其中所述HLA-G多肽选自：HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4、HLA-G5、HLA-G6和HLA-G7。
51.权利要求49所述的aAPC，其中所述HLA-G多肽选自：HLA-G1、HLA-G2、HLA-G5和HLA-G6。
52.权利要求49至51中任一项所述的aAPC，其中所述外源抗原性多肽包含基序XI/LPXXXXXXL(SEQ ID NO:8)。
53.权利要求49至52中任一项所述的aAPC，其中所述HLA-G多肽包含一个或多个HLA-Gα域和β2M多肽或其片段。
54.权利要求53所述的aAPC，其中所述HLA-G多肽与膜锚连接。
55.权利要求53所述的aAPC，其中所述HLA-G多肽包括单链融合蛋白，所述单链融合蛋白包含经由接头与所述HLA-G多肽连接的外源抗原性多肽。
56.权利要求55所述的aAPC，其中所述单链融合蛋白还包括膜锚。
57.权利要求55所述的aAPC，其中所述接头包括可切割接头。
58.权利要求53至57中任一项所述的aAPC，其中所述膜锚包含血型糖蛋白A(GPA)蛋白或其跨膜域，或小整合膜蛋白1(SMIM1)或其跨膜域。
59.权利要求49所述的aAPC，其中所述外源抗原性多肽与所述外源抗原呈递多肽共价结合。
60.权利要求49所述的aAPC，其中所述外源抗原性多肽与所述外源抗原呈递多肽非共价结合。
61.权利要求49至60中任一项所述的aAPC，其中所述外源抗原性多肽为约8个氨基酸的长度至约24个氨基酸的长度。
62.权利要求49至60中任一项所述的aAPC，其中所述aAPC能够阻抑与所述aAPC相互作用的T细胞。
63.权利要求62所述的aAPC，其中所述阻抑包括抑制T细胞增殖、使T细胞无应答、或诱导T细胞凋亡。
64.权利要求63所述的aAPC，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
65.权利要求49至64中任一项所述的aAPC，其中所述工程化去核红系细胞还包括至少一种外源共抑制性多肽。
66.权利要求65所述的aAPC，其中所述外源共抑制性多肽是IL-10。
67.权利要求49至66中任一项所述的aAPC，其中所述aAPC能够阻抑与所述aAPC相互作用的B细胞。
68.权利要求49至66中任一项所述的aAPC，其中所述aAPC能够阻抑与所述aAPC相互作用的NK细胞。
69.权利要求49至66中任一项所述的aAPC，其中所述aAPC能够阻抑与所述aAPC相互作用的巨噬细胞。
70.权利要求49至66中任一项所述的aAPC，其中所述aAPC能够阻抑与所述aAPC相互作用的树突细胞。
71.权利要求49至70中任一项所述的aAPC，其中所述工程化去核红系细胞在所述细胞表面上还包括检查点分子。
72.权利要求71所述的aAPC，其中所述检查点分子选自：PD-L1、PD-L2和OX40L。
73.权利要求49至72中任一项所述的aAPC，其中所述工程化去核红系细胞是网织红细胞。
74.权利要求49至72中任一项所述的aAPC，其中所述工程化去核红系细胞是红细胞。
75.阻抑免疫细胞活性的方法，所述方法包括使所述免疫细胞与权利要求49至74中任一项所述的aAPC接触，从而阻抑所述免疫细胞的活性。
76.权利要求75所述的方法，其中所述免疫细胞选自：T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突细胞。
77.权利要求76所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
78.权利要求76所述的方法，其中所述免疫细胞是B细胞。
79.权利要求76所述的方法，其中所述免疫细胞是NK细胞。
80.权利要求76所述的方法，其中所述免疫细胞是巨噬细胞。
81.权利要求76所述的方法，其中所述免疫细胞是树突细胞。
82.治疗需要降低的免疫应答的受试者的方法，所述方法包括：使所述受试者的免疫细胞与权利要求49至74中任一项所述的aAPC接触，从而治疗需要降低的免疫应答的受试者。
83.权利要求82所述的方法，其中所述受试者患有自身免疫性疾病。
84.权利要求82所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自：I型糖尿病、类风湿性关节炎、GVHD、肾炎和多发性硬化症。
85.权利要求82所述的方法，其中所述受试者患有炎性疾病。
86.权利要求82所述的方法，其中所述受试者患有变应性病症。
87.权利要求82所述的方法，其中所述受试者需要移植或已经经历移植。
88.制备权利要求49至74中任一项所述的aAPC的方法，所述方法包括：
将编码所述外源抗原性多肽的外源核酸引入有核红系前体细胞；和
在适合于去核和产生所述外源抗原性多肽的条件下培养所述有核红系前体细胞，从而制备工程化去核红系细胞，
从而制备所述aAPC。
89.制备权利要求49至53、58至59和61至74中任一项所述的aAPC的方法，所述方法包括：
将编码所述外源抗原呈递多肽的外源核酸引入有核红系前体细胞；
将编码所述外源抗原性多肽的外源核酸引入所述有核红系前体细胞中；和
在适合于去核和产生所述外源抗原呈递多肽和所述外源抗原性多肽两者的条件下培养所述有核红系前体细胞，从而制备工程化去核红系细胞，
从而制备所述aAPC。
90.制备权利要求49至53中任一项所述的aAPC的方法，所述方法包括：
将编码所述外源抗原呈递多肽的外源核酸引入有核红系前体细胞；
在适合于去核和产生所述外源抗原呈递多肽的条件下培养所述有核红系前体细胞，从而制备工程化去核红系细胞；和
使所述工程化去核红系细胞与至少一种外源抗原性多肽接触，其中所述至少一种外源抗原性多肽与存在于所述工程化去核红系细胞的细胞表面上的所述外源抗原呈递多肽结合，
从而制备所述aAPC。
91.权利要求88至90中任一项所述的方法，其中所述外源核酸包括DNA。
92.权利要求88至90中任一项所述的方法，其中所述外源核酸包括RNA。
93.权利要求88至90中任一项所述的方法，其中所述引入步骤包括病毒转导。
94.权利要求88至90中任一项所述的方法，其中所述引入步骤包括电穿孔。
95.权利要求88至90中任一项所述的方法，其中所述引入步骤包括利用以下一种或多种：脂质体介导的转移、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、脂质转染和慢病毒载体。
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