CN113365653A - 盐纳米颗粒和组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了由碱金属或碱土金属和卤化物，例如钠和氯化物形成的颗粒。颗粒可具有亲水性涂层或外层，由例如聚醚‑脂质缀合物形成。在优选的实施方案中，脂质是磷脂，例如磷酸乙醇胺，而聚醚是聚乙二醇，例如PEG胺。还提供了通过例如微乳液反应制备颗粒的方法。还公开了包括多个颗粒和药学上可接受的载体的药物组合物。通常，组合物包含有效量的颗粒以治疗有需要的受试者的疾病或病症，特别是癌症。颗粒通常是纳米颗粒，例如，约10nm和250nm之间并且可以是单分散的。

Description

盐纳米颗粒和组合物及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年1月18日提交的美国临时申请62/794,350的权益和优先权，该申请的全部内容通过引用纳入本文。

关于联邦赞助的研究的声明

本发明是在国家科学基金会授予的NSF1552617和美国国立卫生研究院授予的R01EB022596的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

技术领域

本发明大体涉及颗粒组合物及其使用方法，特别是用于治疗癌症。

背景技术

由于非特异性组织毒性，癌症治疗通常受到显著副作用的严重限制，而鉴定对癌细胞具有选择性毒性或选择性使肿瘤对治疗敏感的新药物是癌症研究的重要目标。例如，在一个领域，研究集中于将单克隆抗体的特异性结合活性应用于肿瘤特异性疗法的开发。选取的抗体，如曲妥珠单抗

利妥昔单抗

和西妥昔单抗

已获准用于人类癌症治疗，但均缺乏穿透癌细胞的能力，因此仅限于攻击位于肿瘤细胞的外表面上的靶标。

颗粒疫苗是另一个有前途的领域，它提供了调整预防和治疗包括癌症在内的各种疾病的能力。囊泡和固体可生物降解聚合物平台，分别以脂质体和聚酯为例，是疫苗递送研究中最普遍的两种平台。与脂质体和明矾相比，使用聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)纳米颗粒进行免疫可延长抗体滴度。接种PLGA疫苗的动物的细胞免疫反应量级最高，这也显示出更高频率的效应子样记忆T细胞表型，从而有效清除细胞内细菌。这两种常见颗粒平台的性能差异显示不是由于材料差异，而似乎与抗原递送的动力学有关。脂质体很容易被修饰以封装亲水性小分子，甚至蛋白质。然而，这些制剂的稳定性和包封剂的释放曲线不容易控制。另一方面，可生物降解的固体颗粒，例如由聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)制成的颗粒，高度稳定且具有可控释放特性，但会导致治疗性细胞因子的容易封装和控制释放或组合递送复杂化。

仍然需要改进的癌症治疗技术。

因此，本发明的目的是提供用于癌症治疗的组合物和方法。

发明内容

提供了由碱金属或碱土金属和卤化物形成的盐形成的颗粒，也称为盐颗粒，及其使用方法。在优选的实施方案中，盐颗粒是氯化钠(NaCl)颗粒，优选纳米颗粒。颗粒可以是例如立方体纳米颗粒。在特定实施方案中，碱金属或碱土金属和卤化物(例如钠和氯化物)颗粒具有约1:1的钠:氯化物摩尔比。

盐颗粒可具有亲水性涂层或外层，由例如两亲性聚合物、蛋白质、脂质或其缀合物(如聚醚-脂质缀合物)形成。在优选的实施方案中，脂质是磷脂，例如磷酸乙醇胺，而聚醚是聚乙二醇，例如PEG胺。

还提供了包含多个相同或不同的盐颗粒和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，组合物包括平均流体动力学尺寸在约10nm和约500nm之间，或约25nm和约300nm之间，或约50nm和150nm之间，约75nm和约125nm之间，±5％，10％，15％，20％或25％的颗粒。组合物中的颗粒可以是单分散的。

还提供了制备盐颗粒的方法，以及根据此类方法形成的盐颗粒。例如，在一些实施方案中，NaCl颗粒通过微乳液反应形成。微乳液反应可以包括，例如，将氯化钼(V)添加到包含溶剂、还原剂、表面活性剂和油酸钠的溶剂溶液中。该反应可以不含水。在特定实施方案中，溶剂是己烷和乙醇的混合物。还原剂为十六烷二醇或十四烷二醇，表面活性剂为油胺或油酸。该方法可以包括添加亲水性涂层或外层的步骤，所述亲水性涂层或外层通过将颗粒和脂质-聚醚缀合物在溶剂中混合并去除溶剂而形成。

药物组合物可包含治疗有效量的任何盐颗粒。例如，在一些实施方案中，所述组合物包括有效量的颗粒，以在肿瘤细胞和/或癌细胞中减少线粒体耗氧率(OCR)，减少线粒体呼吸速率(MSR)，降低细胞内ATP水平，增加ROS水平，增加JNK、ERK和/或p38磷酸化水平，增加脂质过氧化，增加DNA损伤，释放细胞色素C，增加胱天蛋白酶-3活性，增加胱天蛋白酶-1活性，增加细胞溶胀和/或气泡形成，诱导细胞破裂和/或完全渗透溶解，增加NLRP3炎症体诱导，增加GSDMD N-末端片段释放，提高IL-1β分泌，增加细胞内K⁺水平，增加钙网蛋白(CRT)的呈递/分泌，增加三磷酸腺苷(ATP)的呈递/分泌，增加高迁移率族蛋白1(HMGB1)的呈递/分泌，或其组合。在一些实施方案中，盐颗粒的量有效增加肿瘤和/或癌细胞的凋亡、坏死和/或细胞焦亡。优选地，组合物以在肿瘤和/或癌细胞中比非肿瘤或非癌症(例如，对照或健康)细胞更大程度改变或影响前述各项的量或/方式施用。

在一些实施方案中，药物组合物的剂型适合于向有需要的受试者施用约0.1mg/kg至约1,000mg/kg，或约1mg/kg至约100mg/kg，或约5mg/kg至约50mg/kg。

还提供了治疗方法。所公开的组合物特别用于治疗癌症。这些方法通常包括向有此需要的受试者施用有效量的所公开的颗粒。受试者可以具有例如骨骼、膀胱、脑、乳房、宫颈、结肠直肠、食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮肤、胃或子宫癌。可以使用任何合适的施用方法，然而，优选的方法是注射或输注。在一些实施方案中，施用是局部施用至需要治疗的位点，例如与肿瘤相邻或直接进入肿瘤。在特定实施方案中，通过膀胱灌注到例如膀胱施用颗粒，以治疗例如膀胱癌。

还提供了制备抗原的方法和根据所述方法形成的抗原。所述方法通常包括使癌细胞与有效量的盐颗粒接触以诱导细胞的死亡。

在优选的实施方案中，癌细胞表现出一种或多种损伤相关分子模式(DAMP)分子的表达或分泌或释放增加。优选的DAMP分子包括，例如，钙网蛋白(CRT)，三磷酸腺苷(ATP)，高迁移率族蛋白1(HMGB1)及其组合。通常，在体外或离体发生接触。癌细胞可以是例如，从需要癌症治疗或预防的受试者中分离。

根据所公开的方法形成的抗原可以是垂死的或死细胞，或溶解产物，提取物，馏分，分离物或其分泌因子的集合。

还提供了利用根据本文方法形成的抗原的疫苗接种方法。疫苗接种通常用于治疗或预防癌症。所述方法通常包括向有需要的受试者施用有效量的抗原，以增加或诱导对抗原的免疫应答。在一些实施方案中，所述受试者也被施用盐颗粒、佐剂或其组合。抗原、颗粒和佐剂的任何组合可以是相同或不同的混合物的一部分。抗原、盐颗粒和佐剂的任何组合可以一起或单独施用。在一些实施方案中，受试者患有癌症。

还提供了组合疗法，包括盐颗粒例如NaCl纳米颗粒与一种或多种另外的治疗剂组合施用。例如，在一些实施方案中，另外的试剂是免疫检查点抑制剂、化学治疗剂或其组合。免疫检查点抑制剂包括但不限于PD-1拮抗剂，CTLA4拮抗剂及其组合。在特定实施方案中，PD-1拮抗剂和/或CTLA拮抗剂是抗体或其抗原结合片段。颗粒和另外的活性剂可以在不同时间或同一时间以及在相同的药物组合物或不同的药物组合物中施用于受试者。

附图说明

图1A是NaCl纳米颗粒(SCNP)的TEM图像，包括单个NaCl纳米颗粒的放大TEM图像的插图。比例尺，100nm。图1B是合成NaCl和NaCl标准品的X射线衍射(XRD)图(PDF：00-005-0628)。图1C和1D是NaCl纳米颗粒的能量色散(EDS)X射线光谱。图1E和1F是显示Na⁺(1E)和Cl^-(1F)的释放曲线图(释放％v.时间(hr))，在pH值为7.0或5.5的乙酸铵缓冲溶液中，检测磷脂涂覆的NaCl纳米颗粒(PSCNP)。定量是基于SBFI-AM和MQAE荧光强度变化(平均值±S.D.，N＝6)。图1G是合成的SCNP，前体油胺、油酸钠和1,2-十四烷二醇的FT-IR光谱(T(％))vs.波数(CM^-1))。图1H是显示SCNP和PSCNP的动态光散射(DLS)分析图。己烷中SCNP的流体动力学尺寸为84.6±9.8nm。磷脂涂层后，水中PSCNP的流体动力学尺寸为98.0±13.1nm。图1I是显示D.I水中PSCNP的电动电位图，+9.7mV。图1J-1M是一系列不同尺寸的SCNP的代表性的TEM图像。比例尺，100nm。图1N-1P是一系列不同尺寸的SCNP的代表性SEM图像。比例尺，100nm。

图2A是示出在24小时的PC-3细胞中通过MTT测定测量的细胞成活力的柱状图。图2B是显示线粒体膜电位变化(Δψm)的柱状图，通过JC-1染色在4小时时评估。当PC-3细胞与160.0μg/ml的PSCNP一起孵育时，JC-1红色/绿色(聚集体/单体)荧光强度比值显著降低。统计数据基于5000个单个细胞的分析(平均值±s.d.)。图2C是示出耗氧率(OCR)变化的线状图，通过海马线粒体应激试验评估。在PSCNP注射之前，将读数归一化为基线OCR。相对于PBS处理的细胞，在用52.5、105.0和160.0μg/ml的PSCNP处理的细胞中，6小时的基线分别降低了2.3±3.3,18.1±5.0,47.9±5.4％(平均±s.d.，n＝6)。图2D是示出MSR变化的柱状图，以6小时时ATP生产(即氧化磷酸化)(平均值±s.d.，n＝6)评估。MSR分别从正常细胞30.0±1.1pmol/min减少至在用52.5、105.0或160.0μg/ml的PSCNP处理的细胞中的10.0±0.7、3.3±1.2和0.9±1.0pmol/min。图2E是显示细胞内ATP水平的柱状图，通过发光ATP检测测定法在4小时时分析。将读数归一化为PBS处理细胞的读数。较高的PSCLP浓度与较低的ATP产生相关。图2F是显示细胞内ROS水平的柱状图，在4小时时通过DCFH-DA测定法分析。将读数归一化为PBS处理的细胞。PSCNP处理后观察到剂量依赖性ROS产生。图2G示出通过Western印迹分析评估的PSCNP对JNK、ERK和P38蛋白激酶的影响的定量分析的柱状图。在分析之前，将PC-3细胞与PSCNP(160μg/ml)一起孵育24。PBS、NaCl盐(160μg/ml)和降解的PSCNP(在实验前通过在水中熟化24小时，160μg/ml)用作对照。图2H是示出脂质过氧化的柱状图，通过脂质过氧化传感器测定法在24小时时评估。图2I是表示在24小时时DNA损伤的柱状图，通过γH2AX染色分析。图2J是示出细胞色素C释放的柱状图，通过Apotrack^TM细胞色素C凋亡ICC抗体试剂盒在24小时时分析。通过ImageJ定量荧光信号(平均值±s.d.，n＝1000个细胞)。图2K是示出胱天蛋白酶-3活性的柱状图，通过在24小时时抗胱天蛋白酶-3抗体染色(平均值±S.D.，N＝5000个细胞)评估。图2L是示出在1、2、4、6和12小时动力学细胞毒性研究的倍数变化(顶部)和死细胞(％)的配对的柱状图。将在0-160μg/ml的剂量范围内的PSCNP与PC-3细胞一起孵育，并通过活/死(钙黄绿素AM/PI)测定法评估0至12小时的细胞成活力。图2M是示出细胞成活力的柱状图，通过MTT测定分析。在与PC-3细胞孵育之前，PSCNP(160.0μg/ml)在PBS中预熟化1、3或8小时。标准MTT测定是在细胞孵育24小时时进行的。研究了PBS、NaCl盐(160.0μg/ml)和表面涂层材料DSPE-PEG2000胺(磷酸脂质)用于进行比较。结果表示为平均值±S.E.M.*，P<0.05。图2N是PSCNP细胞摄取和细胞内降解的柱状图，如通过比较RB-PSCNP(160.0μg/mL)、NaCl(160.0μg/ml)、PBS处理的细胞在1、2、4和6小时的细胞内若丹明B信号所测量的。结果表示为每个细胞的若丹明B强度(n＝5000个细胞)。图2O是比较不同时间点的细胞内Na+浓度的柱状图。结果表示为每个细胞(n＝5000个细胞)的SBFI-AM强度。将PBS和NaCl盐(160.0μg/ml)处理的细胞作为对照进行研究。图2P是比较不同时间点的细胞内Cl^-浓度的柱状图。结果表示为每个细胞(n＝5000个细胞)的MQAE强度。将PBS和NaCl盐(160.0μg/ml)处理的细胞作为对照进行研究。图2Q示出细胞成活力图，在PC-3细胞与浓度为26.3至320μg mL^-1的PSCNP孵育6小时和24小时后，通过MTT测定测量。(*与PBS处理的对照细胞进行比较p<0.05)。图2R是示出癌细胞系T24和UMUC2，和正常细胞系K1970和HPrEC中NaCl NP的细胞摄取的柱状图。

图3A是示出细胞体积变化的图，基于5000个细胞的统计值。将PBS处理的细胞(37500像素)的98％分位数设定为阈值。具有高于阈值的区域的细胞被标记为红色点，低于阈值标记为黑色点。在PSCNP治疗后观察到浓度和时间依赖性细胞扩增。图3B是细胞坏死的柱状图，通过EthD-III染色评估。图3C是示出LDH释放的线状图，通过LDH测定试剂盒WST评估。将PC-3细胞与PSCNP或NaCl盐(6.25-200μg/mL)孵育6小时。将所有读数归一化为PBS处理的对照细胞(*p<0.05)。图3D是示出流式细胞术的结果的柱状图，以评价PSCNP治疗(160.0μg/mL)后胱天蛋白酶-1活化。图3E是示出LDH释放的柱状图，以评估甘氨酸和Ac-YVAD-cmk对细胞坏死的抑制。将PC-3细胞与坏死的细胞死亡抑制剂甘氨酸或胱天蛋白酶-1抑制剂AC-YVAD-CMK预孵育1小时。然后将PSCNP(200μg/mL)与细胞孵育1.5、3和6小时。通过LDH测定试剂盒-WST测量LDH释放(*p<0.05)。图3F是散点图，图3G是线状图，各自示出细胞体积随时间的变化。将PC-3细胞与各种浓度(52.5-160μg/mL)的PSCNP一起孵育。分析在30、60和90min的细胞面积(以像素)，并进行比较(n＝5000个细胞)。图3H是离子浓度诱导的细胞溶解的计算模型的示意图。图3I和3J是示出膜张力与跨膜离子浓度梯度之间的关系的线状图。图3J是图3I的左下方的方框区域的放大。图3I示出了对于不同尺寸的细胞，质膜开始破裂的临界浓度梯度(ΔC)(图3I，右上角的正方形区域)。通过曲线拟合这些数据点，获得了用于预测25μm细胞的临界浓度的有趣曲线。图3K是示出PSCNP对NLRP3炎症体活化和GSDMD-N末端释放的影响的柱状图。结果是在用40.0和80.0μg/mL PSCNP处理2小时的PC-3细胞中相对于PBS对照的NLRP3和GSDMD-N水平的Western印迹的ImageJ分析。图3L是示出IL-1β释放的柱状图，通过ELISA分析。将PC-3与PSCNP(100和200μg/mL)孵育2小时(与PBS处理的对照组相比，*P<0.05)。图3M是比较在不同时间点(PSCNP孵育1、2、4和6小时)的细胞内K+浓度的柱状图。结果表示为每个细胞(n＝5000个细胞)的PBFI-AM强度。将PBS和NaCl盐(160.0μg/mL)处理的细胞作为对照进行研究。图3N是示出质膜电位变化的柱状图。在DibAC₄(3)染色之前，将PC-3细胞与不同浓度的PSCNP孵育150分钟。基于成像结果在ImageJ中分析荧光强度，并归一化为PBS处理的对照细胞。(平均值±s.d.，n＝5000个细胞)。观察到DiBAC₄(3)荧光强度的剂量依赖性降低，表明PSCNP诱导的膜超极化。图3O是示出LDH释放的柱状图，以评估甘氨酸和Ac-YVAD-cmk对细胞坏死的抑制。将PC-3细胞与坏死的细胞死亡抑制剂甘氨酸或胱天蛋白酶-1抑制剂Ac-YVAD-cmk预孵育1小时。然后将PSCNP(160和320μgmL-1)与细胞一起孵育6小时。通过LDH测定试剂盒-WST测量LDH释放(*P<0.05)。

图4是提出的NaCl NP诱导细胞死亡背后的机制的图示。

图5A-5I是显示针对一组细胞系的细胞毒性(细胞成活力vs.PSCNPμg/mL)的柱状图[U87MG,IC₅₀＝50.8(5A)；4T1,IC₅₀＝90.8(5B)；HT29,IC₅₀＝86.2(5C)；B16-F10,IC₅₀＝107.0(5D)；SGC7901,IC₅₀＝140.2(5E)；A549,IC₅₀＝151.5(5F)；RAW246.7,IC₅₀＝251.0(5G)；人原发性前列腺上皮细胞(HPrEC)(5H)；小鼠性孢子器(spermatagonial)干细胞(C18)(5I)，通过MTT测定测量。虽然PSCNP有效地杀死癌细胞，但正常细胞具有高度抗性。IC50值通过Origin 9的剂量反应确定。图5J是示出细胞内钠含量[Na+]_int(pg/细胞)和IC₅₀之间的相关性的线状图。使用Na⁺电极测定的每个细胞系的[Na⁺]_int。K-均值聚类算法用于评估[Na⁺]_int和IC₅₀之间的相关性。图5K和5L是示出体内PC-3肿瘤治疗的结果图：肿瘤体积(mm²)(5K)和体重(g)(5L)随时间(天)的变化。具有相同NaCl剂量(9mg/mL，50μL)的PSCNP或盐水是瘤内注射到PC-3肿瘤异种移植物(n＝5)中。治疗后16天解剖肿瘤。图5M是示出切除的肿瘤重量的柱状图(与盐水对照组相比，*p<0.05)。图5N-5V是示出其它肿瘤模型的体内肿瘤治疗(肿瘤体积(mm²)(5N-5Q，5V)和肿瘤生长曲线(重量(g))(5R-5U)的柱状图，包括U87MG(人成胶质细胞瘤星形细胞瘤)(5N，5R)，B16F10(小鼠黑色素瘤)(5O，5S)，SCC VII(小鼠头部和颈鳞状癌)(5P，5T，5V)和UPPL-1541(小鼠膀胱癌细胞系)(5Q，5U)(*P<0.05)。图5w是示出SCC VII肿瘤模型中的动物存活曲线的图(*P<0.05)。

图6A和6B是示出从由NaCl NPS杀死的B16F10(6A)和SCC VII(6B)细胞的ATP释放的柱状图。发现ATP释放是时间和剂量依赖性的方式(13.2-320μg/mL)(与盐水处理的对照组相比，*p<0.05)。图6C和6D是示出NaCl NPS处理后在24小时从B16F10(6C)和SCC VII(6D)细胞中的高迁移率族1蛋白(HMGB-1)释放的图。将NaCl盐用作阴性对照。PBS处理的细胞也用作对照(与PBS处理的对照组相比，*P<0.05)。图6E和6F是在垂死B16F10和SCC VII细胞上的CRT呈递的柱状图。用160μg mL^-1PSCNP处理细胞2小时。

图7A-7D示出了NaCl NP处理诱导的体内抗B16F10疫苗接种方法。图7A是动物实验图，示出了通过冻融(F/T)或PSCNP处理产生的垂死B16F10细胞(2×10⁵)的一次性疫苗接种，随后在对侧皮下(SC)注射活B16F10细胞(2×10⁵)。在第22天收集肿瘤。图7B是示出在对侧的B16F10肿瘤生长的线状图(与PBS处理的对照组相比，*P<0.05)。图7C和7D是示出NaClNP处理诱导的体内抗SCC VII疫苗接种方法的图。图7C是动物实验图，示出由NaCl NP处理产生的垂死SCC VII细胞(2×10⁵)的2轮疫苗接种，其中间隔6天，随后在对侧皮下注射活SCC细胞(2×10⁵)。在第24天收集肿瘤。图7D是示出在对侧的SCC VII肿瘤生长的线状图(与PBS处理的对照组相比，*P<0.05)。

图8A-8B示出了在SCC VII双侧肿瘤模型中NaCl NP的抗肿瘤效果。图8A是示出实验设计的示意图。将细胞与Matrigel混合以进行肿瘤接种。将1×10⁶个细胞接种在动物的右侧作为原发肿瘤，而将0.5×10⁶SCC细胞接种在左侧作为继发性肿瘤。在第0天进行NaClNP或盐水处理。NP组中的每只小鼠注射在50μL盐水中的1.35mg NaCl NP。盐水处理组用作阴性对照。携带肿瘤的小鼠w/o任何处理用作未处理的对照。图8B是示出继发性肿瘤生长的线状图(与NaCl NP处理的对照组相比，*P<0.05)。

图9A是示出实验设计的示意图。携带双侧肿瘤的C3H小鼠(n＝5)在肿瘤接种14天后，在原发肿瘤中瘤内注射一剂盐水或PSCNP(27mg ML-1，50μL)。在第3、7和12天收集肿瘤、脾脏、肿瘤引流淋巴结(TDLN)和血液，用于流式细胞术分析。图9B(盐水)和9C(SCNP)是继发性肿瘤的肿瘤生长曲线。图9D是示出在第12天继发性肿瘤重量(与盐水组相比，*P<0.05)的总结。图9E和9F是示出盐水(9E)和PSCNP(9F)组的动物体重变化的线状图。

图10A-10W是示出第3、7和12天血液和组织样品中白细胞曲线的流式细胞术分析的图，包括：原发肿瘤中的CD8+ T细胞(10A-10E)，CD8+IFN-γ+ T细胞(10F-10J)，CD4+Foxp3+ T细胞(Treg)(10K-10O)，CD8+ T细胞/Treg比值(10P-10T)；CD80+CD86+DC(10U)和CCR7+CD80+CD86+DC(10V)；血液中的B细胞(B220+CD19+)(10W)。该研究在SCC VII双侧肿瘤模型中进行。(*P<0.05)。

图11A和11B是肿瘤生长曲线(11A)和体重(11B)的图，说明了在携带BBN963肿瘤的C57/BL6小鼠中的NaCl NP的治疗结果。PSCNP瘤内施用(3.25mg，50μl，三剂，间隔三天)。抗PD-1抗体腹膜内(10mg/kg，三剂量，间隔三天)给予。

图12A-12D是示出ATP释放的柱状图，在不同的PSCNP浓度(31.25-250μg/ml)用人和鼠膀胱癌细胞系(T-24(12A)，UMUC2(12B)，UPPL-1541(12C)和BBN963(12D))进行测试。图12E是示出CRT呈递的柱状图，用膀胱癌细胞系进行测试。

发明详述

I.定义

如本文所用，术语“肿瘤”或“赘生物”是指含有瘤细胞的组织异常团块(mass)。赘生物和肿瘤可能是良性的、恶化前的或恶性的。

如本文所用，术语“癌症”或“恶性肿瘤”是指这样的细胞：显示不受控制的生长和分裂，侵袭邻近组织，并且经常转移到身体的其他位置。

如本文所用，术语“抗肿瘤药”是指可以抑制或预防癌症生长、侵袭和/或转移的组合物，例如药物或生物制剂。

如本文所用，如本文所用的术语“生物相容性”是指一种或多种材料，其自身既不对宿主(例如，动物或人)产生毒性，也不以产生对宿主具有毒性的浓度的单体或低聚亚基或其他副产物的速率降解(如果材料降解)。

如本文所用，术语“可生物降解”意味着材料降解或分解成其组分亚基，或将材料消化(例如，通过生物化学过程)为更小的(例如，非聚合物)亚基。

如本文所用，术语“微粒”通常是指直径小于约1000微米的颗粒。颗粒可以具有任何形状。

如本文所用，术语“纳米颗粒”通常是指直径为约10nm至约1微米(但不包括)或100nm至约1微米的颗粒。颗粒可以具有任何形状。例如，颗粒可以是立方体。所设想的其他非限制性形状可包括四面体，双锥体，八面体，二十面体和十面体形状。

含有微粒和/或纳米颗粒的组合物可包括一系列粒度范围的颗粒。在某些实施方案中，粒度分布可以是均匀的，例如，在平均体积直径的少于约20％的标准偏差内，并且在其他实施方案中是更均匀的，例如，在中值体积直径的约10％内。

如本文所用，短语“平均粒度”通常是指颗粒群中颗粒的统计学平均粒度(直径)。基本上球形的颗粒的直径可以指物理或流体动力学直径。非球形颗粒的直径可以指流体动力直径。如本文所用，非球形颗粒的直径可以指颗粒表面上的两个点之间的最大线性距离。平均粒度可以使用本领域已知的方法测量，例如动态光散射或电子显微镜，例如扫描电子显微镜(SEM)或透射电子显微镜(TEM)。

如本文所用，短语“单分散”和“均匀尺寸分布”可互换使用，并描述了其中所有颗粒具有相同或几乎相同尺寸的纳米颗粒或微粒的群体。如本文所用，单分散分布是指其中90％分布在中值粒度的15％以内，或在中值粒度的10％以内，或在中值粒度的5％以内的颗粒分布。

如本文所用，短语“药学上可接受”指这样的组合物、聚合物和其他材料和/或剂型，其在有确实根据的医学判断的范围内，适用于与人类和动物组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，具有合理的效益/风险比。

如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或赋形剂，例如液体或固体填料，稀释剂，溶剂或封装材料，其参与从一个器官或身体的一部分携带或运输任何受试者组合物，到另一个器官或身体的一部分。在与受试者组合物的其他成分兼容和不损害患者的意义上，每个载体必须是“可接受的”。

如本文所用，短语“药学上可接受的盐”是现有技术公认的，并且包括化合物的相对无毒的，无机和有机酸加成盐。药学上可接受的盐的实例包括衍生自无机酸(例如盐酸和硫酸)的盐，以及衍生自有机酸(例如乙磺酸，苯磺酸和对甲苯磺酸)的盐。用于形成盐的合适无机碱的实例包括卤化物，氢氧化物，碳酸盐和氨，钠，锂，钾，铯，钙，镁，铝和锌的碳酸氢盐。还可以用合适的有机碱形成盐，包括那些无毒且足够强以形成这种盐的碱。

如本文所用，术语“个体”，“宿主”，“受试者”和“患者”可互换地使用，以指作为施用或治疗靶标的个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人或兽医的患者。

如本文所用，术语“治疗”是指患者的医学管理，旨在治愈，改善，稳定或预防疾病、病理病况或病症。该术语包括积极治疗，即具体涉及改善疾病、病理病况或病症的治疗，并且还包括病因疗法，即涉及消除相关疾病、病理病况或病症的病因的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即设计为减轻症状而不是治愈疾病、病理病况或病症的治疗；预防性治疗，即涉及最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理病况或病症的发展的治疗；和支持性治疗，即用于补充另一种特异性疗法的治疗，所述另一种特异性疗法涉及改善相关疾病、病理病况或病症。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指以适用于任何药物治疗的合理效益/风险比产生一些所需效果的治疗剂的量。有效量可以根据如下因素而变化，例如所治疗的疾病或病况，所施用的特定靶向构建体，受试者的大小或疾病或病症的严重程度。本领域普通技术人员可以凭经验确定特定化合物的有效量而不需要过度实验。在一些实施方案中，术语“有效量”是指治疗剂或预防剂的量，以减少或减小一种或多种疾病或病症的症状，例如减小肿瘤大小(例如，肿瘤体积)。

如本文所用，术语“约”旨在描述在大约+/-10％的范围内高于或低于规定值的值。范围旨在通过上下文清楚地限定，并且没有暗示进一步限制。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如(such as)”)的使用仅仅是为了更好地阐明说明书，并且除非另有说明，否则不会对说明书的范围造成限制。

如本文所用，术语“PD-1拮抗剂”是指减弱由PD-1介导的抑制性信号转导的任何分子，发现于T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、树突细胞(DC)和/或巨噬细胞的表面上。这样的拮抗剂包括破坏由T细胞上的PD-1分子产生的任何抑制信号的分子。因此，PD-1拮抗剂可以是通过PD-1受体信号传导途径抑制、减少、消除或通过其他方式减少抑制性信号转导的分子。在以下情况下可能会导致此类减少：(i)PD-1拮抗剂与PD-1受体结合而不触发信号转导，以减少或阻断抑制性信号转导；(ii)PD-1拮抗剂与PD-1受体的配体(例如激动剂)结合，防止配体与PD-1受体结合(例如，当所述激动剂是B7-H1时)；(iii)PD-1拮抗剂结合或抑制作为调控链一部分的分子的活性，所述调控链在未被抑制时具有刺激或促进PD-1抑制性信号转导的结果；或(iv)PD-1拮抗剂抑制PD-1受体或其配体的表达，尤其是通过降低或消除编码PD-1或其一种或多种天然配体的一种或多种基因的表达。因此，PD-1拮抗剂可以是影响PD-1抑制性信号转导减少的分子，从而增加T细胞对一种或多种抗原的应答。

如本文所用，“CTLA4拮抗剂”是指减少CTLA4介导的T细胞反应抑制的化合物。例如，在T细胞中，CTLA4在与B7配体(例如B7-1和B7-2)结合时传递抑制脉冲。CTLA4拮抗剂是破坏所述配体与活化T细胞上CTLA4的结合的拮抗剂。

II.组合物

哺乳动物细胞维持较低的细胞内与细胞外钠和氯比值，并且高的细胞内与细胞外钾比值(Milo et al.,Cell biology by the numbers.pp.xlii,356pages)。这些不对称离子梯度对细胞功能很重要(Pedersen,et al.,J.Am.Soc.Nephrol.,22,1587(2011))，驱动所需的细胞过程，所述细胞过程包括氨基酸的运输、细胞pH值的维持和细胞体积的控制(Okada,Cell Biochem.Biophys.41，233-258(2004)，Hoffmann and Pedersen,ActaPhysiol 202,465-485(2011))。降低细胞外钠和氯的浓度(例如通过将细胞浸入低渗溶液)会导致细胞骨架破坏、细胞周期停滞和细胞裂解(Galvez et al.，Cell Tissue Res 304,279-285(2001))。提高细胞内渗透压可能会诱导类似的效果，但其很难实现，这是因为离子转运受到活细胞的严格调控。

多年来，已经制备了大量无机纳米颗粒，并研究了它们在细胞和动物中的性质。然而，一些常见的电解质例如NaCl被排除在此活动之外。隐含的假设是电解质纳米颗粒会迅速溶解在水中，其行为与其一致的(consistent)盐类没有区别。然而，下面的实例表明，盐颗粒例如NaCl纳米颗粒可相比于健康的非癌细胞在更大程度上杀死癌细胞。

A.盐颗粒

1.核心组合物

提供了由碱金属或碱土金属和卤化物形成的盐形成的颗粒，也称为盐颗粒，及其使用方法。这些包括，例如，可以由碱金属离子(如锂、钠、钾、铷和铯)和卤化物平衡离子(例如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物)形成的盐颗粒。在一些其他情况下，盐的颗粒可由碱土金属离子(例如镁和钙)和卤化物平衡离子(例如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物)形成。例如，基于钠的盐颗粒可包括氯化钠颗粒、氟化钠颗粒、溴化钠颗粒、碘化钠颗粒及其组合。基于氯化物的颗粒包括氯化钠颗粒、氯化钾(KCl)颗粒和氯化钙(CaCl₂)颗粒。在一些情况下，电解质纳米颗粒或微颗粒由单一类型的盐颗粒(即氯化钠)形成，例如本文所提及的那些。在其他情况下，电解质纳米颗粒或微颗粒由不同类型的盐颗粒(即氯化钠和氯化钾颗粒)的任意组合形成，例如本文中提及的那些。

在优选的实施方案中，盐颗粒是NaCl颗粒，优选NaCl纳米颗粒。尽管本文详细描述的组合物和方法主要集中在NaCl颗粒，特别是NaCl纳米颗粒，但也具体公开了由碱金属或碱土金属和卤化物形成的其他盐形成的颗粒的相应实施方案，例如上面提供的那些，并且可以替代或补充本文提供的组合物和方法中的NaCl颗粒。

盐颗粒，尤其是NaCl纳米颗粒，可用作特洛伊木马策略，以便将离子递送到细胞中以扰乱离子稳态。每个NaCl纳米颗粒都含有数百万个钠和氯原子，但它们不会在用于细胞进入的离子泵或通道处被检查(Gadsby,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,10,344(2009),Yu andCatterall,Genome Biol.4,207(2003))。相反，NaCl纳米颗粒通过内吞作用进入细胞，这潜在地使它们绕过细胞对离子的调节。由于NaCl的高水溶性，这些纳米颗粒在细胞内迅速降解，释放出大量的Na+和Cl-。受内在渗透梯度的限制，这些离子不能自由地穿过质膜，达到广泛干扰细胞功能的渗透压休克。

下面提供的研究表明，NaCl纳米颗粒而不是盐可以有效杀死癌细胞。这是因为纳米颗粒通过内吞作用进入细胞，绕过细胞对离子传输的调节；当在细胞内溶解时，释放的离子会使渗透压激增，导致细胞焦亡，细胞焦亡是一种程序性坏死机制。正常细胞对所述治疗具有高度抵抗力，这种现象被认为主要是由于它们相对于癌细胞而言固有的低Na+水平。体内研究证实NaCl纳米颗粒可用于癌症治疗。

所公开的颗粒的尺寸通常为纳米级，例如，直径为10纳米直至但不包括约1微米。然而，应当理解，在一些实施方案中，对于一些用途，颗粒可以更小或更大(例如，微粒等)。尽管本文公开的许多组合物被称为纳米颗粒组合物，但应理解，在一些实施方案中和对于一些用途，载体可比纳米颗粒稍大。例如，载体组合物还可包括直径在约1微米至约1000微米之间的颗粒。这种组合物可称为微粒组合物。

纳米颗粒通常用于组织间应用和细胞渗透。因此，在一些实施方案中，颗粒是具有从10nm到约1,000nm的任何直径的纳米颗粒。例如，纳米颗粒可以具有10nm至900nm、10nm至800nm、10nm至700nm、10nm至600nm、10nm至500nm、20nm至500nm、30nm至500nm、40nm至500nm、50nm至500nm、50nm至400nm、50nm至350nm、50nm至300nm、或50nm至200nm、10nm至100nm的直径。例如，在一些实施方案中，颗粒为约15nm、25nm、60nm、100nm或介于1nm和1000nm(包括此值)之间的任何其他整数值或值范围。在一些实施方案中，纳米颗粒可具有小于400nm、小于300nm或小于200nm的直径。例如，纳米颗粒的直径可以在50nm和300nm之间。

在一实例中，纳米颗粒的平均直径为约15nm和约800nm之间，或约50nm和约500nm之间，或约50nm和约350nm之间。在一些实施方案中，纳米颗粒的平均直径为约100nm。

在治疗癌症的一些实施方案中，希望颗粒具有适合进入肿瘤微环境的尺寸。在特定实施方案中，颗粒具有适合通过增强渗透性和滞留(EPR)效应进入肿瘤微环境和/或肿瘤细胞的尺寸。EPR是指某些尺寸的分子在肿瘤组织中比在正常组织中积累更多的特性。因此，在用于治疗癌症的示例性组合物中，递送载体可以在约25nm至约500nm的范围内。在另一个实例中，递送载体可以在约50nm至约300nm(包括此值)的范围内。在另一个实例中，递送载体可以在约80nm至约120nm(包括此值)的范围内。在另一个实例中，递送载体可以在约85nm至约110nm(包括此值)的范围内。

优选地，颗粒的大小可以通过内吞作用被癌细胞内化。

粒度可以通过例如动态光散射、电子显微镜例如扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)来测量或确定。

在一些实施方案中，颗粒组合物中的盐颗粒是单分散的。在一些实施方案中，颗粒组合物中的盐颗粒具有各种尺寸(即，多分散的)。

2.制作盐颗粒的方法

所公开的盐颗粒优选由钠和氯化物形成，但也特别设想了诸如上述那些的其他盐。

颗粒通常使用合适的钠和氯化物前体在有机溶剂中形成。在一些实施方案中，油酸钠和氯化钼用作钠和氯化物前体。颗粒可以通过使用例如己烷/乙醇混合溶剂和油胺表面活性剂的反应合成。NaCl纳米颗粒也可称为氯化钠纳米颗粒和SCNP。

微乳液反应可以包括，例如，将氯化钼(V)添加到包含溶剂、还原剂、表面活性剂和油酸钠的溶剂溶液中。在特定实施方案中，溶剂是己烷和乙醇的混合物。还原剂为十六烷二醇或十四烷二醇，表面活性剂为油胺或油酸。尽管在本文中称为微乳液反应，但此类反应可以并且优选地不含水。

在制备SCNP的示例性方法中，将油酸钠、油胺和1,2-十四烷二醇溶解在溶剂溶液中，例如诸如己烷/乙醇的混合溶液。加入氯化钼(V)并与溶液混合(例如，60摄氏度24小时)。通过离心(例如，12000RPM 10分钟)收集粗产物。将颗粒重新分散在合适的溶液中，例如己烷，进行短暂的超声处理，然后离心。可以反复收集和再分散颗粒以减少未反应前体的存在。

这样的反应可以产生具有约1:1的钠和氯化物摩尔比的立方体相疏水性NaCl纳米颗粒。根据该方法形成的颗粒具有窄的尺寸分布和可忽略的杂质，包括例如钼。通过改变反应条件，例如钠/氯化物前体与油胺之间的比值、反应体积、温度和搅拌速度(例如磁力搅拌速度)，尺寸可以从10到1000nm进行调节。

或者，可以使用乙酸钠或油酸钠或另一种脂肪酸钠盐，以及乙酰氯作为前体并且乙醇作为溶剂，通过共沉淀法合成NaCl纳米颗粒。脂肪酸盐包括但不限于肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、酸或其混合物的钠盐。

例如，在示例性方案中，140mg乙酸钠在室温下溶解在20mL乙醇中。向混合物中加入120μL乙酰氯反应10分钟。通过离心(例如，12000RPM10分钟)收集白色粗产物。将颗粒重新分散在合适的溶液中，例如乙醇，进行短暂的超声处理，然后离心。可以反复收集和再分散颗粒以减少未反应前体的存在。

上述反应可以扩展到合成本文讨论的其他电解质纳米颗粒或微颗粒。例如，本文所述的制备NaCl纳米颗粒的方法可适用于以油酸钾作为前体制备类似尺寸范围的KCl纳米颗粒。试剂、表面活性剂均与上述NaCl纳米颗粒合成方法相同。

B.涂层

颗粒可包括涂层。例如，由于油胺或油酸涂层，如上所述合成的NaCl纳米颗粒可以是疏水的。添加到纳米颗粒的亲水层使它们与水溶液更相容。在某些情况下，对于使用乙酸钠共沉淀制成的NaCl纳米颗粒，涂层的疏水性较低。此外，可以添加另外的涂层以延长纳米晶体在水中的半衰期和/或改善细胞对纳米颗粒的吸收。因此，在一些实施方案中，所公开的颗粒具有亲水性涂层或外部涂层。

1.涂层的组合物

涂层可由例如两亲嵌段共聚物、肽、蛋白质、脂质或其组合组成。在一些实施方案中，涂层单独由上述两种或更多种的缀合物或融合物组成或进一步与一种或多种活性剂组合。

a.脂质

涂层可以是或包括一种或多种脂质。可用于制备所公开的具有基于脂质的涂层的纳米颗粒组合物的脂质和其他组分是本领域已知的。合适的中性、阳离子和阴离子脂质包括但不限于甾醇和脂质，例如胆固醇、磷脂、溶血脂、溶血磷脂和鞘脂。中性和阴离子脂质包括但不限于磷脂酰胆碱(PC)(例如鸡蛋PC、大豆PC)，包括但不限于1,2-二酰基-甘油-3-磷酸胆碱；磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇(PI)；糖脂；鞘磷脂(sphingophospholipid)例如鞘磷脂(sphingomyelin)和鞘糖脂(也称为1-神经酰胺基葡萄糖苷)，如神经酰胺吡喃半乳糖苷、神经节苷脂和脑苷脂；含有羧酸基团的脂肪酸、甾醇，例如胆固醇；磷酸乙醇胺，例如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)，1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，包括但不限于1,2-二油酰基磷酸乙醇胺(DOPE)，1,2-二十六烷基磷酸乙醇胺(DHPE)；和磷脂酰胆碱，例如1,2-二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，1,2-二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和1,2-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)。脂质还可以包括各种天然的(例如，组织来源的L-α-磷脂酰：蛋黄、心脏、脑、肝脏、大豆)和/或合成的(例如，饱和和不饱和的1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-酰基-2-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二庚酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱)脂质衍生物。

脂质可以是鞘磷脂代谢物，例如但不限于神经酰胺、鞘氨醇或1-磷酸鞘氨醇。

示例性阳离子脂质包括但不限于N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵盐，也称为TAP脂质，例如甲基硫酸盐。合适的TAP脂质包括但不限于DOTAP(二油酰基-)、DMTAP(二肉豆蔻酰基-)、DPTAP(二棕榈酰基-)和DSTAP(二硬脂酰基-)。脂质体中合适的阳离子脂质包括但不限于二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB)、1,2-二酰氧基-3-三甲基丙烷铵、N-[1-(2,3-二酰氧基)丙基]-Ν,Ν-二甲胺(DODAP),1,2-二酰氧基-3-二甲基丙烷铵，N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA),1,2-二烷氧基-3-二甲基丙烷铵，双十八烷基氨基甘氨酰精胺(DOGS)，3-[N-(N',N'-二甲胺基-乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)；2,3-二油烯基氧基-N-(2-(精胺甲酰胺)-乙基)-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸酯(DOSPA)，β-丙氨酰胆固醇，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，二C₁₄-脒，N-叔丁基(ferf-butyl)-N'-十四烷基-3-十四烷基氨基-丙脒，N-(α-三甲基氨基乙酰基)双(十二烷基)-D-谷氨酸氯化物(TMAG)，二(十四酰基)-N-(三甲基铵基-乙酰基)二乙醇胺氯化物，1,3-二油烯基氧基-2-(6-羧基-鲸蜡(spermyl))-丙酰胺(DOSPER)，和N,N,N',N'-四甲基-,N'-双(2-羟乙基)-2,3-二油烯基氧基-1，4-丁二铵碘化物。在一个实施方案中，阳离子脂质可以是1-[2-(酰氧基)乙基]2-烷基(烯基)-3-(2-羟乙基)-咪唑啉氯化物衍生物，例如，1-[2-(9(Z)-十八烯氧基)乙基]-2-(8(Z)-十七烯基-3-(2-羟乙基)咪唑啉氯化物(DOTIM)和1-[2-(十六酰氧基)乙基]-2-十五烷基-3-(2-羟乙基)咪唑啉氯化物(DPTIM)。在一个实施方案中，阳离子脂质可以是在季胺上含有羟烷基部分的2,3-二烷氧基丙基季铵化合物衍生物，例如1,2-二油酰基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORI)，1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)，1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟丙基溴化铵(DORIE-HP)，1,2-二油烯基-氧基-丙基-3-二甲基-羟丁基溴化铵(DORIE-HB)，1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟基戊基溴化铵(DORIE-Hpe)，1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟基乙基溴化铵(DMRIE)，1,2-二棕榈基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DPRIE)和1,2-二硬酯酰氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DSRIE)。

脂质可以由多于一种脂质的组合形成，例如，带电荷的脂质可以与在生理pH下为非离子或不带电荷的脂质组合。非离子脂质包括但不限于胆固醇和DOPE(1,2-二油酰甘油基磷脂酰乙醇胺)。

可以包括甾醇组分以赋予物理化学和生物学行为。这种甾醇组分可以选自胆固醇或其衍生物，例如麦角甾醇或胆固醇半琥珀酸酯。

涂层可包括单一类型的脂质，或两种或更多种脂质的组合。

b.聚醚和聚季铵盐

涂层可以是或包括聚醚。示例性聚醚包括但不限于环氧乙烷的低聚物和聚合物。在优选的实施方案中，聚醚是聚乙二醇(PEG)。PEG是通过环氧乙烷聚合制备的，并且可以在从300g/mol到10,000,000g/mol的广泛分子量范围内商购，并且可以具有支链、星形或梳形几何形状。PEG名称中经常包含的数字表示它们的平均分子量(例如，n＝9的PEG的平均分子量约为400道尔顿，并标记为PEG400)。大多数PEG包括具有分子量分布的分子(即，它们是多分散的)。尺寸分布可以通过其重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)来统计表征，其比值称为多分散指数(Mw/Mn)。Mw和Mn可以通过质谱法测量。在一些实施方案中，PEG是氨基(聚乙二醇)(也称为PEG胺)。

在一些实施方案中，PEG或PEG胺高达约25,000或更多。在一些实施方案中，PEG或PEG胺为约PEG350至约PEG25,000，或约PEG350至约PEG20,000。在一些实施方案中，PEG或PEG胺为约PEG350至约PEG5000，或约PEG 750和约PEG5000之间，或约PEG1000和PEG3000之间。在特定的实施方案中，PEG是PEG2000。

在特定实施方案中，涂层是聚醚-脂质(例如，磷脂)缀合物涂层。在一些实施方案中，聚醚-磷脂缀合物是DSPE-PEG2000胺。例如，参见下面的实验，其中描述了将DSPE-PEG2000胺涂覆到纳米颗粒表面上。

在一些实施方案中，涂层包括一种或多种聚季铵盐或由一种或多种聚季铵盐形成。聚季铵盐是化妆品成分的国际命名，指用于个人护理行业中使用的几种聚阳离子聚合物。聚季铵盐是新词，用于强调聚合物中季铵中心的存在。INCI已经批准了至少40种不同的聚季铵盐聚合物。不同的聚合物通过“聚季铵盐”一词后面的数值来区分，包括例如聚季铵盐-1至聚季铵盐-20、聚季铵盐-22、聚季铵盐-24、聚季铵盐-27至(through)聚季铵盐-37、聚季铵盐-39和聚季铵盐-42至聚季铵盐-47。在特定实施方案中，聚季铵盐是聚季铵盐-7、-10或-30。

c.两亲嵌段共聚物

在一些实施方案中，盐颗粒周围的亲水层或涂层由两亲嵌段共聚物形成。聚合物是指包含一个或多个重复单元(单体)的分子结构，通过共价键连接。生物相容性聚合物是指当插入或注射到活体受试者中时通常不会引起不良反应的聚合物。共聚物是指由两种或更多种不同单体形成的聚合物。不同的单元可以以随机顺序、交替顺序或作为“嵌段”共聚物排列，即包括一个或多个区域，每个区域均包含第一重复单元(例如，第一单体或单体嵌段)，和一个或多个区域，每个区域包括第二重复单元(例如，第二嵌段)等。嵌段共聚物可以具有两个(二嵌段共聚物)、三个(三嵌段共聚物)或更多数目的不同嵌段。

术语“两亲性”是指同时具有极性部分和非极性部分的分子。在一些实施方案中，极性部分(例如，亲水性部分，例如亲水性聚合物)可溶于水，而非极性部分(例如，疏水性部分，例如疏水性聚合物)不溶于水。极性部分可以带有正式的正电荷或正式的负电荷二者。或者，极性部分可以具有正式的正电荷和负电荷，并且是两性离子或内盐。

两亲性材料的亲水性部分可以在盐颗粒周围形成电晕，从而增加盐颗粒在水溶液中的溶解度。在特定实施方案中，两亲性材料是疏水性、生物可降解聚合物，其末端为亲水性嵌段。

亲水性部分和疏水性部分可以分别是生物相容的亲水性聚合物和疏水性聚合物。示例性的生物相容性聚合物包括但不限于聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚对苯二甲酸亚烷基酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯基卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙交酯、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物，纤维素包括烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素和硫酸纤维素钠盐；聚丙烯酸聚合物，例如丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，例如聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)，聚烯烃如聚乙烯、聚丙烯聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)和聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙酸乙烯酯)、聚氯乙烯聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮、其衍生物、其线性和支化共聚物和嵌段共聚物、以及其混合物。

其他示例性生物可降解聚合物包括但不限于聚酯、聚(原酸酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(己内酯)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基戊酸酯)、聚酐、聚(丙烯酸)、聚乙交酯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚磷腈、其衍生物、其线性和支化共聚物和嵌段共聚物、以及其混合物。在特别优选的实施方案中，共聚物包括一种或多种可生物降解的疏水性聚酯，例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)和聚(乳酸-共-乙醇酸)，和/或与聚环氧烷共轭的这些聚合物，例如如聚乙二醇或嵌段共聚物，如聚环氧丙烷-聚环氧乙烷

可生物降解的低聚或聚合片段或聚合物的分子量可以变化以定制聚合物的性质。

在一些实施方案中，亲水性聚合物或片段或嵌段包括但不限于聚烯烃二醇的均聚物或共聚物，例如聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(丁二醇)，以及丙烯酸酯和丙烯酰胺，例如甲基丙烯酸羟乙酯和羟丙基甲基丙烯酰胺。

两亲性材料的疏水部分可以提供用于装载非极性药物的非极性聚合物基质涂层。

2.活性剂

所公开的盐颗粒可以在没有任何另外活性剂的情况下具有分子甚至治疗作用，因此在一些实施方案中，盐颗粒单独是活性材料并且颗粒不包括(即，不含)另外的活性剂。或者，颗粒可任选地包括一种或多种活性剂。例如，在一些实施方案中，亲水层或涂层是或包括活性剂。在一些实施方案中，一种或多种活性剂与亲水层的组分缀合或附接到层的表面，或掺入、装载或封装到层本身中。在一些这样的实施方案中，颗粒的盐核保持不含另外的活性剂。

在示例性的实施方案中，涂层包括脂质，并且当脂质组分被添加至盐颗粒的表面时，一种或多种活性剂例如通过将活性剂添加至反应混合物中被装载或掺入到脂质层中或脂质层之下。

一种或多种活性剂可以是例如核酸、蛋白质和/或小分子。示例性的活性剂包括例如肿瘤抗原、CD4+T细胞表位、细胞因子、化学治疗剂、放射性核素、小分子信号转导抑制剂、光热光谱分析天线(photothermal antennas)、免疫危险信号传导分子、其他免疫治疗剂、酶、抗生素、抗病毒剂、抗寄生虫剂(蠕虫、原生动物)、生长因子、生长抑制剂、激素、激素拮抗剂、抗体及其生物活性片段(包括人源化、单链和嵌合抗体)、抗原和疫苗制剂(包括佐剂)、肽药物、抗炎药、免疫调节剂(包括与Toll样受体结合的配体(包括但不限于CpG寡核苷酸)以激活先天免疫系统、动员和优化适应性免疫系统的分子、激活或上调细胞毒性T淋巴细胞作用的分子、自然杀伤细胞和辅助T细胞，以及使抑制子或调节性T细胞失活或下调的分子)、促进递送赋形剂摄取到细胞(包括树突细胞和其他抗原呈递细胞)中的试剂、营养物质如维生素和寡核苷酸药物(包括DNA、RNA、反义、适体、小干扰RNA、核糖酶、核糖核酸酶P的外部引导序列和三链体形成剂)。

3.制备涂层的方法

在示例性涂层方法中，将溶剂(例如，己烷)中的SCNP超声处理并与磷脂溶液(例如，DSPE-PEG(2000)胺(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基)聚乙二醇)-2000](铵盐)混合。可以除去溶剂(例如，在减压下(例如，在40℃使用旋转蒸发仪))。可以加入PBS、水或另一种合适的含水载体并混合(例如，超声处理)以重悬颗粒。

所得磷脂涂覆的NaCl纳米颗粒(也称为PSCNP)很好地分散在水溶液中，流体动力学尺寸为98.0±13.1nm，正表面电荷为±9.7mV。

磷脂涂层还使NaCl纳米晶体在水中延长寿命，但不会停止降解过程。实际上，当PSCNP在水中孵育1-2小时时，TEM分析发现纳米晶体表面上的小空腔。进一步孵育导致显著的颗粒崩解和最终完全溶解。优选地，所述涂覆的纳米颗粒具有约1和48小时之间，约1和24小时之间，约1和12小时之间的延长的寿命。在某些情况下，所述涂覆的纳米颗粒具有至少约0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,30,35,40,48小时或更长时间的延长的寿命。

所描述的颗粒涂层可以在所涂覆的盐颗粒上赋予表面电荷。在一些情况下，涂覆的颗粒具有约-60mV和约+60mV之间，-50mV和约+50mV之间，-40mV和约+40mV之间，-30mV和约+30mV之间，约-20mV和约+20mV之间，约-10mV至约+10mV之间，或约-5mV和约+5mV之间的电动电位。在一些情况下，涂覆颗粒的电动电位约为+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，+13，+14或+15mV。

III.制剂

提供了包括所公开的盐颗粒，例如NaCl纳米颗粒的药物组合物。药物组合物可以用于例如通过肠胃外(例如，肌肉内，腹膜内，静脉内(IV)或皮下)注射。

在一些实施方案中，组合物以有效地将组合物递送至靶细胞的量来全身施用，例如通过静脉内或腹膜内施用。

在某些实施方案中，组合物在局部施用，例如，通过皮下注射，或直接注射到待治疗的位点。在一些实施方案中，将组合物直接注射或施用于一种或多种肿瘤。通常，局部注射导致组合物的局部浓度增加，其大于全身施用可以实现的浓度。在一些实施方案中，通过使用导管或注射器将组合物局部递送至适当的细胞。局部向细胞递送这些组合物的其它方法包括使用输注泵(例如，来自Alza Corporation，Palo Alto，Calif.)或将组合物掺入到聚合物植入物中(参见，例如，P.Johnson和JG Lloyd-Jones，EDS.，药物递送系统(Chichester,England:Ellis Horwood Ltd.,1987)，可以实现颗粒持续释放到植入物的邻近区域。

在一些实施方案中，颗粒组合物膀胱内施用至膀胱。这种递送方法对于治疗膀胱癌特别有用。

可以直接向细胞提供盐颗粒例如NaCl纳米颗粒，例如通过将其与细胞接触，或间接地例如通过任何生物学方法的作用。例如，盐颗粒，例如NaCl纳米颗粒，可以配制在生理学上可接受的载体或赋形剂中，并注入细胞周围的组织或流体中。

A.肠胃外施用的制剂

在优选的实施方案中，通过肠胃外注射在水溶液中施用组合物。

制剂可以是悬浮液或乳液的形式。通常，提供药物组合物，其包括有效量的盐颗粒，例如NaCl纳米颗粒，任选地包括药学上可接受的稀释剂，防腐剂，增溶剂，乳化剂，佐剂和/或载体。这些组合物可包括稀释剂无菌水，各种缓冲液(例如，Tris-HCl，乙酸盐，磷酸)，pH和离子强度的缓冲盐水；任选地，添加剂例如洗涤剂和增溶剂(例如，

20,

80也称为聚山梨醇酯20或80)，抗氧化剂(例如，抗坏血酸，焦亚硫酸钠)和防腐剂(例如，硫柳汞(Thimersol)，苄醇)和膨胀物质(例如，乳糖，甘露醇)。非水溶剂或赋形剂的实例是丙二醇，聚乙二醇，植物油，例如橄榄油和玉米油，明胶和可注射有机酯如油酸乙酯。制剂可以在使用前立即冻干和重新溶解/重新悬浮。可以通过例如通过细菌保留过滤器过滤，通过将灭菌剂掺入组合物中，通过辐射组合物，或通过加热组合物来将制剂灭菌。

在一些实施方案中，避免增加盐颗粒的胶体溶液的温度。在一些实施方案中，可以在薄膜中制备脂质盐纳米颗粒，其可任选地进行加热。例如，磷脂可以与纳米颗粒在诸如氯仿的有机溶剂中混合。蒸发氯仿后，将薄膜留在容器内表面上。纳米颗粒可以以这种方式运送。在治疗之前，将水/缓冲溶液加入到容器中以在水溶液中重新分散纳米颗粒。

B.其他制剂

还可以局部施用盐颗粒例如NaCl纳米颗粒。局部施用可包括施用至肺部、鼻、口(舌下，口腔)、阴道或直肠粘膜。通过用经皮或粘膜输送元件配制盐颗粒例如NaCl纳米颗粒，可以使这些施用方法有效。

可以使用设计用于治疗产品的肺部递送的各种机械装置，包括但不限于雾化器，计量剂量吸入器和粉末吸入器，所有这些都是本领域技术人员熟悉的。商业上可获得的装置的一些具体实例是

雾化器(Mallinckrodt Inc.,St.Louis,Mo.)；

II雾化器(Marquest Medical Products,Englewood,Colo.)；

计量剂量吸入器(Glaxo Inc.，Research Triangle Park，N.C.)；和

粉末吸入器(FisonsCorp.，Bedford，Mass.)。Nektar，Arkermes和Mannkind都具有批准的或在临床试验中的可吸入的胰岛素粉末制剂，该技术可以应用于本文所述的制剂。

施用至粘膜的制剂可以掺入片剂、凝胶、胶囊、悬浮液或乳液中。标准药物辅料可从任何配方者获得。

口服制剂可以是口香糖、凝胶条、片剂、胶囊或锭剂的形式。口服制剂可包括辅料或可赋予肠道保护或增强通过肠胃道的递送的对颗粒的其他修饰，包括肠道上皮和粘膜(参见Samstein,et al.,Biomaterials,29(6):703-8(2008)。

还可以制备透皮制剂。这些通常是药膏、乳液、喷雾剂或贴剂，所有这些都可以使用标准技术制备。透皮制剂可包括渗透增强剂。

IV.使用方法

A.治疗方法

颗粒组合物可用于治疗疾病和病症，包括体内癌症。典型的体内方法包括向有需要的受试者施用有效量的盐颗粒，例如NaCl纳米颗粒，以减少疾病或病症的一种或多种症状。

所公开的组合物及其治疗方法在癌症的背景下特别有用，包括肿瘤治疗。因此，提供了治疗癌症的方法。

在成熟的动物中，通常在大多数器官和组织中的细胞更新和细胞死亡之间保持平衡。身体中各种类型的成熟细胞具有给定的寿命；当这些细胞死亡时，新细胞由各种类型干细胞的增殖和分化产生。在正常情况下，新细胞的产生经调节使得任何特定类型的细胞的数量保持恒定。然而，偶尔，出现不再响应正常生长控制机制的细胞。这些细胞产生可扩展到相当大尺寸的细胞的克隆，产生肿瘤或赘生物。不能无限生长并且不会广泛侵袭健康周围组织的肿瘤是良性的。持续生长并且变得逐渐侵入性的肿瘤是恶性的。术语癌症具体是指恶性肿瘤。除了不受控制的生长之外，恶性肿瘤还能表现出转移。在该过程中，小癌细胞簇离开肿瘤，侵入血液或淋巴管，并携带到其他组织，在那里它们继续增殖。以这种方式，一个位点的原发肿瘤可以产生另一个位点的继发性肿瘤。

所公开的组合物和方法可用于治疗良性和恶性肿瘤。所公开的方法通常包括向需要的受试者施用有效量的组合物，以减少肿瘤或癌症的一种或多种症状或分子或生理指标。例如，用于治疗癌症的治疗有效量的所公开的组合物通常会杀死肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞的增殖或转移或其组合。组合物和方法可通过延迟或抑制受试者中肿瘤的生长，降低肿瘤的生长或大小，抑制或减少肿瘤转移，和/或抑制或减少与肿瘤发育或生长相关的症状来用于治疗患有良性或恶性肿瘤的受试者。

癌症的症状可能是物理的，例如肿瘤负荷，或生物学的例如肿瘤细胞的细胞凋亡或坏死。例如，可以施用有效量的组合物，以杀死癌细胞，改善具有癌症的受试者的存活或其组合。在一些实施方案中，该量可有效降低肿瘤和/或癌细胞中线粒体耗氧率(OCR)，降低线粒体呼吸速率(MSR)，降低细胞内ATP水平，增加ROS水平，增加JNK、ERK和/或P38磷酸化水平，增加脂质过氧化，增加DNA损伤，释放细胞色素C，增加胱天蛋白酶-3的活性，增加胱天蛋白酶-1活性，增加细胞溶胀和/或气泡形成，诱导细胞破裂和/或完全渗透溶解，增加NLRP3炎症体诱导，增加GSDMD N-末端片段释放，增加IL-1β分泌，增加细胞内K+水平，增加钙网蛋白(CRT)的呈递/分泌，增加腺苷三磷酸(ATP)的呈递/分泌，增加高迁移率族蛋白1(HMGB1)的呈递/分泌，或其组合。优选地，组合物以比非肿瘤或非癌症(例如，对照或健康)细胞在肿瘤和/或癌细胞中更大程度改变或实现前述各项的量或/方式施用。

在一些实施方案中，该量可有效增加肿瘤和/或癌细胞的细胞凋亡、坏死和或细胞焦亡。优选地，组合物以比非肿瘤或非癌症(例如，对照或健康)细胞在肿瘤和/或癌细胞中更大程度增加前述各项的量或/方式施用。

在一些实施方案中，肿瘤和/或癌细胞比非肿瘤或非癌症(例如，对照或健康)细胞具有更高的[Na⁺]_int。

组合物的实际有效量可以根据以下因素而变化，包括所配制的具体的、特定的组合物，施用方式和治疗的受试者的年龄，重量，状况，以及施用途径和疾病或病症。

可以将有效量的组合物与对照进行比较。合适的对照是本领域已知的。典型的对照是组合物施用之前和之后受试者的病况或症状的比较。病况或症状可以是生物化学，分子，生理或病理读数。在另一个实施方案中，对照是施用不同治疗剂的匹配受试者。因此，本文公开的组合物可以与用于待治疗的疾病或病症的其他领域公认的治疗进行比较。

随着进一步研究的进行，关于治疗各种患者的各种病况的适当剂量水平，普通技术人员考虑到接受者的治疗情况、年龄和总体健康，将能够确定适当的剂量。所选择的剂量取决于所需的治疗效果、施用途径和所需的治疗期间。

在一些实施方案中，将盐颗粒例如NaCl纳米颗粒以约0.1mg/kg至约1,000mg/kg，或约1mg/kg至约100mg/kg或约5mg/kg至约50mg/kg或1至1,000(包括此值)之间的任何整数mg/kg的剂量施用至有需要的受试者。

在下面的工作实施例中，将NaCl纳米颗粒在小鼠肿瘤模型中以重量在约15g至30g的每只小鼠50μL 9-30mg/ml NaCl纳米颗粒溶液的剂量施用。因此，在说明性肿瘤模型中，约15-100mg/kg的剂量是治疗有效的。

B.疫苗接种

NaCl纳米颗粒在癌症治疗背景下的一种吸引人的性质是它们诱导免疫原性细胞死亡(ICD)。虽然大多数化学治疗剂诱导非免疫原性或耐受性细胞死亡，但它们中的一小部分在杀死癌细胞时刺激免疫应答，并且坏死是一种免疫原性过程(Inoue and Tani,CellDeath Differ.,21,39(2014),Zhang,et al.,Cell Res.,28,9(2018))。最近的研究表明，ICD来自这些选定的药物促进某些损伤相关分子模式(DAMP)分子(最重要的是CRT、ATP和HMGB1)的表达/分泌的能力。这些ICD信号将危险状态传达给生物体，促进募集专业抗原呈递细胞(APC)(重要的是树突细胞(DCS))至肿瘤。ICD信号还促进了DC的活化和抗原交叉呈递，并因此引发抗原特异性免疫。换句话说，ICD产生原位疫苗，该疫苗促进选择性的，免疫介导的癌细胞根除。

以下实验实施例说明NaCl纳米颗粒是强大的ICD试剂。死于NaCl纳米颗粒的癌细胞与升高的ATP、HMGB1和CRT呈递/分泌(图6A-6E，图12A-12E)相关。此外，将NaCl纳米颗粒杀死的癌细胞皮下注射到免疫活性小鼠中，并且所述接种保护小鼠针对活肿瘤细胞的随后攻击(图7A-7D&表3)。当将NaCl纳米颗粒直接注射到肿瘤中时，治疗促进了抗癌免疫，减慢了接种到相对侧面的继发肿瘤的生长(图8A-8B&表4)。所有这些结果都表明，除了直接杀死癌细胞之外，NaCl纳米颗粒还可以刺激抗癌免疫，有助于局部和远处部位的肿瘤控制。

因此，可以将本文所述的盐颗粒例如NaCl纳米颗粒作为疫苗的组分施用。本文公开的疫苗可单独包括盐颗粒例如NaCl纳米颗粒，和任选地抗原和/或佐剂。附加地或替代地，疫苗可单独包括颗粒诱导的抗原或与颗粒组合。例如，在一些实施方案中，抗原源自在施用颗粒优选氯化钠纳米颗粒后死亡的受试者中的癌细胞。因此，不需要施用另外的抗原。在其他实施方案中，将抗原和/或佐剂施用至有需要的受试者。

在一些实施方案中，抗原源自体外或离体的癌细胞。癌细胞可以是通过例如细胞凋亡、坏死或另一种机制诱导死亡的癌细胞。例如，在一些实施方案中，细胞在体外或离体与有效量的盐颗粒例如NaCl纳米颗粒接触，以诱导细胞死亡。死亡和/或垂死(dying)的癌细胞或其溶解产物，提取物，馏分，分离物或分泌因子可以作为抗原施用于有需要的受试者。癌细胞或细胞衍生的抗原可以单独施用至受试者，或与颗粒和/或另外的佐剂组合施用于受试者。在优选的实施方案中，死亡和/或垂死的癌细胞与有效量的盐颗粒例如NaCl纳米颗粒接触，以升高ATP，HMGB1和/或钙网蛋白(CRT)的呈递/分泌。

癌细胞可以从待治疗的受试者(例如，个性化药物)或另一个受试者中分离，或者可以来自细胞系或其他来源。在一些实施方案中，在用颗粒治疗之前在体外或离体培养和/或繁殖分离的细胞。

1.抗原

抗原可以是肽，蛋白质，多糖，糖，脂质，核酸或其组合。抗原可以衍生自转化的细胞，例如癌症或白血病细胞，并且可以是全细胞或其免疫原性组分。合适的抗原在本领域中是已知的，可从商业政府和科学来源获得。抗原可以是衍生自肿瘤的纯化或部分纯化多肽，或者可以是通过在异源表达系统中表达编码多肽抗原的DNA产生的重组多肽。抗原可以是编码全部或一部分抗原蛋白的DNA。DNA可以是载体DNA的形式，例如质粒DNA。

抗原可以作为单一抗原提供，或者可以组合提供。还可以作为多肽或核酸的复合混合物提供抗原。

抗原可以是肿瘤抗原，包括肿瘤相关或肿瘤特异性抗原，例如但不限于α-辅肌动蛋白-4，Bcr-Abl融合蛋白，Casp-8，β-连环蛋白，cdc27，cdk4，cdkn2a，coa-1，dek-can融合蛋白，EF2，ETV6-AML1融合蛋白，LDLR-岩藻糖转移酶AS融合蛋白，HLA-A2，HLA-A11，hsp70-2，KIAAO205，Mart2，Mum-1,2和3，Neo-PAP，I类肌球蛋白，OS-9，pml-RARα融合蛋白，PTPRK，K-ras，N-ras，磷酸丙糖异构酶，Bage-1，Gage 3,4,5,6,7，GnTV，Herv-K-mel，Lage-1，Mage-A1,2,3,4,6,10,12，Mage-C2，NA-88，NY-Eso-1/Lage-2，SP17，SSX-2，和TRP2-Int2，黑素瘤A(MelanA)(MART-I)，gp100(Pmel 17)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，p15(58)，CEA，RAGE，NY-ESO(LAGE)，SCP-1，Hom/Mel-40，PRAME，P53，H-Ras，HER-2/neu，BCR-ABL，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR，EB病毒抗原，EBNA，人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7，TSP-180，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，nm-23H1，PSA，TAG-72-4，CA 19-9，CA 72-4，CAM 17.1，NuMa，K-ras，β-连环蛋白，CDK4，Mum-1，p16，TAGE，PSMA，PSCA，CT7，端粒酶，43-9F，5T4,791Tgp72，α-胎蛋白，13HCG，BCA225，BTAA，CA 125，CA 15-3(CA 27.29\BCAA)，CA 195，CA 242，CA-50，CAM43，CD68\KP1，CO-029，FGF-5，G250，Ga733(EpCAM)，HTgp-175，M344，MA-50，MG7-Ag，MOV18，NB\70K，NY-CO-1，RCAS1，SDCCAG16，TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白)，TAAL6，TAG72，TLP，和TPS。

在一些实施方案中，抗原是新抗原或患者特异性抗原。最近的技术改进使得可以鉴定对由于肿瘤特异性突变而产生的患者特异性新抗原的免疫应答，并且新兴数据表明，对这种新抗原的识别是临床免疫治疗的主要因素(Schumacher and Schreidber,Science,348(6230):69-74(2015)。新抗原负载提供了选择性地增强针对这类抗原的T细胞反应性的途径。

传统上，癌症疫苗具有靶向的肿瘤相关抗原(TAA)，其不仅可以在肿瘤细胞上表达，而且在正常组织中表达(Ito,et al.,Cancer Neoantigens:APromising Source ofImmunogens for Cancer Immunotherapy.J Clin Cell Immunol,6:322(2015)doi:10.4172/2155-9899.1000322)。TAA包括癌症-睾丸抗原和分化抗原，即使自身抗原具有对不同的患者有用的益处，但需要具有高亲和力TCR(T细胞受体)的扩增的T细胞来克服宿主的中枢和外周耐受性，这会削弱抗肿瘤T细胞活性并增加自身免疫反应的风险。

因此，在一些实施方案中，抗原被宿主免疫系统认为是“非自身的”，并且优选能够绕过胸腺中的中枢耐受性。实例包括病原体相关的抗原，突变生长因子受体，突变的K-ras或个体基因型衍生的抗原。通常在肿瘤转化期间累积数百倍的肿瘤基因的体细胞突变可能发生在蛋白质编码区域中。无论是错义还是移码，每个突变都有可能产生肿瘤特异性抗原。这些突变抗原可以称为“癌症新抗原”Ito,et al.,Cancer Neoantigens:A PromisingSource of Immunogens for Cancer Immunotherapy.J Clin Cell Immunol,6:322(2015)doi:10.4172/2155-9899.1000322。基于新抗原的癌症疫苗有可能诱导与常规共用抗原靶向疫苗相比更稳健和特异性的抗肿瘤T细胞应答。基因组学和生物信息学的最新发展，包括大规模平行测序(MPS)和表位预测算法，在鉴定和选择新抗原方面提供了重大突破。

鉴定、选择和验证抗原的方法是本领域已知的。参见，例如，Ito,et al.,CancerNeoantigens:A Promising Source of Immunogens for Cancer Immunotherapy.J ClinCell Immunol,6:322(2015)doi:10.4172/2155-9899.1000322，其全部内容具体通过引用纳入本文。例如，如Ito等所讨论的，鉴定新抗原的非限制性实例包括筛选、选择和任选地验证候选免疫原。首先，筛选整个基因组/外显子序列曲线以分别通过肿瘤和正常组织的MPS鉴定肿瘤特异性体细胞突变(癌症新抗原)。其次，计算算法用于预测突变衍生的肽与患者自己的HLA和/或TCR的亲和力。突变衍生的肽可以用作本文公开的组合物和方法的抗原。第三，合成突变的肽和野生型肽可用于通过体外T细胞测定或体内免疫来验证鉴定的抗原的免疫原性和特异性。

2.佐剂

任选地，本文所述的疫苗可包括佐剂。佐剂可以是，但不限于以下一种或多种：油乳液(例如，弗氏佐剂)；皂苷制剂；病毒体和病毒样颗粒；细菌和微生物衍生物；免疫刺激寡核苷酸；ADP-核糖基化毒素和解毒衍生物；明矾；BCG；含矿物组合物(例如，矿物盐，如铝盐和钙盐，氢氧化物，磷酸盐，硫酸盐等)；生物粘附和/或粘膜粘着剂；微粒；脂质体；聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂；聚磷腈；胞壁肽；咪唑并喹诺酮化合物；和表面活性物质(例如溶血卵磷脂，复合多元醇(pluronic polyol)，聚阴离子，肽，油乳液，钥孔戚血蓝素和二硝基酚)。

佐剂还可包括免疫调节剂，例如细胞因子，白介素(例如，IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12等)，干扰素(例如，干扰素-γ)，巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。可以施用包括B7家族的多肽的共刺激分子。这种蛋白质佐剂可以作为全长多肽或其活性片段提供，或以DNA的形式提供，例如质粒DNA。

C.待治疗的受试者

可以根据肿瘤所衍生的组织的胚胎来源对治疗的肿瘤例如恶性肿瘤进行分类。癌是从内胚层或外胚层组织，如皮肤或内脏和腺体的上皮层产生的肿瘤。不太常见的肉瘤源自中胚层结缔组织，例如骨骼，脂肪和软骨。白血病和淋巴瘤是骨髓造血细胞的恶性肿瘤。白血病作为单细胞增殖，而淋巴瘤倾向于作为肿瘤团块生长。恶性肿瘤可能出现在身体的许多器官或组织中以产生癌症。

可以用所提供的组合物和方法治疗的癌症的类型包括但不限于癌症，例如血管癌，例如多发性骨髓瘤以及腺癌和肉瘤。

癌症可以是例如骨骼、膀胱、脑、乳房、宫颈、结肠直肠、食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮肤、胃或子宫癌。

在一些实施方案中，所公开的组合物用于同时治疗多种癌症类型。组合物还可用于治疗在多个位置的转移瘤或肿瘤。

施用的频率可以是例如每天，每周，每两周或每月一次，两次，三次，四次或更多次。在一些实施方案中，将组合物每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30或31天一次施用于受试者。在一些实施方案中，施用频率是每周一次，两次或三次，每两周一次，两次或三次，或者每四周一次，两次或三次。在一些实施方案中，将组合物每周1-3次，优选2次施用至患有癌症的受试者。

D.组合疗法

还公开了组合疗法。所公开的组合物可包括或可以单独施用于有需要的受试者或与一种或多种另外的治疗剂组合。根据待治疗的病况、病症或疾病选择另外的治疗剂。例如，脂质体-药物组合物可以与治疗癌症的一种或多种另外的药剂共同施用。在优选的实施方案中，另外的治疗剂靶向不同的途径，使得疗法的组合效果大于每一种单独的效果。

术语“组合”或“组合的”用于指两种或更多种试剂的伴随，同时或序贯给药。因此，组合可以伴随地(例如，作为混合物)，单独但同时地(例如，通过单独的静脉注射管进入相同的受试者)，或顺序地(例如，首先给出一种化合物或试剂，然后给出第二种)施用。另外的治疗剂可以局部或全身性地施用于受试者，或涂覆或掺入或进入装置或移植物中。另外的试剂可以是聚合物纳米颗粒，脂质体或另一种递送赋形剂的一部分，或作为游离药物。

不同的活性剂可以具有相同或不同的作用机制。在一些实施方案中，组合导致对疾病或病症治疗的累加效应。在一些实施方案中，组合导致对疾病或病症的治疗大于累加效应。在特定的实施方案中，与单独施用盐颗粒例如NaCl纳米颗粒相比，另外的活性剂增加或改善或进一步改善或增加免疫刺激或免疫增强反应。

盐颗粒，例如NaCl纳米颗粒，以及一种或多种另外的活性剂可以作为治疗方案的一部分施用于受试者。治疗方案通常是指治疗疾病或用于实现所需生理变化或疾病症状的变化的方法。例如，在颗粒实施方案中，所述方案导致免疫系统对抗原或免疫原的增加或增强的反应，参与这种反应的一种或多种细胞或细胞类型的数目增加或活性增加，其中所述治疗或方法包括向动物，例如哺乳动物，尤其是人，施用足够量的方案的两种或更多种化学试剂或组分，以有效地治疗疾病或产生生理变化或改变这种疾病的症状，其中化学试剂或组分一起施用，例如作为相同组合物的一部分，或者同时或在不同时间单独和独立施用(即，一种试剂或组分的施用与一种或多种试剂或组分的施用间隔开有限的时间)。优选地，当单独或间隔施用时，施用一种或多种试剂或组分的结果大于任何试剂或组分的结果。通常，其中一种试剂是颗粒，优选氯化钠纳米颗粒。

盐颗粒，例如NaCl纳米颗粒和/或另外的活性剂可以在每日一起或单独施用有限的时间段，例如多至3天，或多至5天，或多至7天，或多至10天，或多至15天或多至20天或多至25天，都是具体设想的。在一些实施方案中，颗粒组合物和/或另外的活性剂每1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30或31天施用一次。在一些实施方案中，给药频率是每周一次，或每两周一次，或者每四周一次，或者每周两次。在一些实施方案中，单次施用是有效的。在一些实施方案中，需要两次或更多次施用。

所有这些盐颗粒，例如NaCl纳米颗粒，组合物的施用都可以在施用另外的活性剂之前或之后发生。或者，一个或多个剂量的活性剂可以与颗粒组合物暂时交错施用，以形成均匀或非均匀的治疗过程，由此施用一个或多个剂量的活性剂，然后是一个或多个剂量的颗粒组合物，其次是一个或多个剂量的另外的活性剂；或者反之亦然，均根据施用试剂的研究人员或临床医生所选择或期望的任何时间表。

在一些实施方案中，颗粒组合物在施用另外的活性剂之前或之后至少1,2,3,5,10,15,20,24或30分钟，小时，天或周施用。在一些实施方案中，在施用颗粒组合物之前或之后至少1,2,3,5,10,15,20,24或30分钟，小时，天或周施用另外的活性剂。

在一些实施方案中，另外的活性剂以约0.1mg/kg至100mg/kg的范围，或约0.1mg/kg至1mg/kg；或约10mg/kg至100mg/kg；或0.1-1mg/kg至10-100mg/kg施用(例如，每日一次；或每周2,3,4,5或更多次；或每月2,3,4,5或更多次等，如以上更详细地讨论的)。

示例性的另外的活性剂提供如下。

1.免疫检查点抑制剂

组合疗法和治疗方案可用于在有需要的受试者中诱导、增加或增强免疫应答(例如，增加或诱导T细胞应答，例如T细胞增殖或活化)。示例性受试者包括患有如上详细描述的癌症或传染病的那些受试者。免疫应答(例如，增加或诱导的T细胞应答)可以针对癌症或疾病抗原。免疫应答可有效治疗癌症或感染。在一些实施方案中，免疫应答是针对癌症或疾病感染的细胞，并且可以减少癌症或疾病的一种或多种症状(例如，肿瘤负荷，肿瘤进展，疾病进展等)。

例如，所公开的NaCl组合物可以与一种或多种另外的免疫应答刺激或增强剂，例如，检查点(PD1，CTLA4，TIM3等)抑制剂组合施用。因此，一种或多种免疫应答刺激或增强剂可以是降低受试者中免疫抑制反应的另外的试剂。参见例如，图11A-11B。

a.PD-1拮抗剂

在一些实施方案中，另外的活性剂是PD-1拮抗剂。T细胞的活化通常取决于T细胞受体(TCR)与通过主要组织相容性复合物(MHC)呈现的抗原肽接触的抗原特异性信号，而该反应的程度由从各种共刺激分子发出的正和负抗原独立性信号控制。后者是CD28/B7家族的成员。相反，程序性死亡-1(PD-1)是受体CD28家族的成员，当在T细胞上诱导时，提供负免疫应答。PD-1与其配体之一(B7-H1或B7-DC)之间的接触诱导抑制响应，其降低T细胞倍增和/或T细胞响应的强度和/或持续时间。合适的PD-1拮抗剂描述于美国专利号8,114,845、8,609,089和8,709,416中，并且包括结合并阻断PD-1的配体的化合物或试剂，以干扰或抑制配体与PD-1受体的结合，或直接结合并阻断PD-1受体，而不通过PD-1受体诱导抑制性信号转导。

在一些实施方案中，PD-1受体拮抗剂直接与PD-1受体结合而不触发抑制性信号转导，并且还与PD-1受体的配体结合以减少或抑制配体通过PD-1受体触发信号转导。通过减少与PD-1受体结合并触发抑制性信号转导的配体的数量和/或量，通过PD-1信号转导递送的负信号衰减更少的细胞，并且可以实现更稳健的免疫应答。

据信，通过与主要组织相容性复合物(MHC)呈递的肽抗原紧密地接近的PD-1配体(例如B7-H1或B7-DC)的结合来驱动PD-1信号传导(例如，参见，Freeman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,105:10275-10276(2008))。因此，防止PD-1和T细胞膜上的TCR共同连接的蛋白质、抗体或小分子也是有用的PD-1拮抗剂。

在优选的实施方案中，PD-1受体拮抗剂是通过结合PD-1的配体或PD-1本身而减少或干扰PD-1受体信号转导的小分子拮抗剂或抗体，尤其是其中PD-1与TCR的共连接不遵循这种结合，从而不触发通过PD-1受体的抑制性信号转导。本发明方法设想的其他PD-1拮抗剂包括与PD-1或PD-1配体结合的抗体，和其他抗体。

合适的抗PD-1抗体包括但不限于以下出版物中描述的那些：

PCT/IL03/00425(Hardy et al.,WO/2003/099196)

PCT/JP2006/309606(Korman et al.,WO/2006/121168)

PCT/US2008/008925(Li et al.,WO/2009/014708)

PCT/JP03/08420(Honjo et al.,WO/2004/004771)

PCT/JP04/00549(Honjo et al.,WO/2004/072286)

PCT/IB2003/006304(Collins et al.,WO/2004/056875)

PCT/US2007/088851(Ahmed et al.,WO/2008/083174)

PCT/US2006/026046(Korman et al.,WO/2007/005874)

PCT/US2008/084923(Terrett et al.,WO/2009/073533)

Berger et al.,Clin.Cancer Res.,14:30443051(2008)。

抗PD-1抗体的具体实例是MDX-1106(参见Kosak，US 20070166281(2007年7月19日公开)第42段)，一种人抗PD-1抗体，其优选以3mg/kg的剂量施用。

示例性的抗B7-H1抗体包括但不限于以下出版物中描述的那些：

PCT/US06/022423(WO/2006/133396，2006年12月14日公开)

PCT/US07/088851(WO/2008/083174，2008年7月10日公开)

US 2006/0110383(2006年5月25日公开)

抗B7-H1抗体的具体实例是MDX-1105(WO/2007/005874，2007年1月11日公开)，一种人抗B7-H1抗体。

对于抗B7-DC抗体，参见7,411,051、7,052,694、7,390,888和美国公开号2006/0099203。

抗体可以是双特异性抗体，其包括与桥接到抗体的PD-1受体结合的抗体，所述与PD-1受体桥接的抗体与PD-1配体例如B7-H1结合。在一些实施方案中，PD-1结合部分减少或抑制通过PD-1受体的信号转导。

其他示例性PD-1受体拮抗剂包括但不限于B7-DC多肽，包括这些的同系物和变体，以及任何前述的活性片段，以及掺入其中任何一种的融合蛋白。在优选的实施方案中，融合蛋白包含与抗体例如人IgG的Fc部分偶联的B7-DC的可溶性部分，并且不掺入人B7-DC的全部或部分跨膜部分。

PD-1拮抗剂也可以是哺乳动物B7-H1的片段，优选来自小鼠或灵长类动物，优选人，其中片段结合并阻断PD-1，但不会导致通过PD-1的抑制性信号转导。片段也可以是融合蛋白例如Ig融合蛋白的一部分。

其他有用的PD-1拮抗剂包括那些与PD-1受体的配体结合的拮抗剂。这些包括PD-1受体蛋白，或其可溶性片段，其可以与PD-1配体(例如B7-H1或B7-DC)结合，并防止与内源PD-1受体结合，从而防止抑制性信号转导。B7-H1也显示结合蛋白质B7.1(Butte et al.,Immunity,Vol.27,pp.111-122,(2007))。这种片段还包括PD-1蛋白质的可溶性ECD部分，其包括突变，例如A99L突变，所述突变增加与天然配体的结合(Molnar et al.,PNAS,105:10483-10488(2008))。可以结合B7-H1配体并防止与内源PD-1受体结合从而防止抑制信号转导的B7-1或其可溶性片段也是有用的。

PD-1和B7-H1反义核酸，DNA和RNA，以及siRNA分子也可以是PD-1拮抗剂。这种反义分子防止在T细胞上表达PD-1，以及产生T细胞配体，例如B7-H1，PD-L1和/或PD-L2。例如，与载体例如聚乙烯亚胺复合的siRNA(例如，长度为约21个核苷酸，其对编码PD-1的基因或编码PD-1配体的基因是特异的，其寡核苷酸可容易地商购)(参见Cubillos-Ruiz et al.,J.Clin.Invest.119(8):2231-2244(2009))，容易被表达PD-1以及PD-1的配体的细胞摄取，减少这些受体和配体的表达，实现T细胞中抑制性信号转导的减少，从而活化T细胞。

示例性PD-1抑制剂包括但不限于，

·派姆单抗(Pembrolizumab)(原名MK-3475或Lambrolizumab，健痊得(Keytruda))由Merck开发，并于2014年首次被美国食品和药物管理局批准用于治疗黑素瘤，

·纳武单抗(Nivolumab)(Opdivo)是由Bristol-Myers Squibb开发的，并于2014年首次被FDA批准用于对黑素瘤的治疗，

·pidilizumab，由Cure Tech开发，

·AMP-224，由GlaxoSmith Kline开发，

·AMP-514，由GlaxoSmith Kline开发，

·PDR001，由Novartis开发，

·cemiplimab，由Regeneron和Sanofi开发

示例性PD-L1抑制剂包括但不限于，

·阿特珠单抗(Atezolizumab)(Tecentriq)是一种完全人化IgG1(由RocheGenentech开发的免疫球蛋白1抗体)，2016年，FDA批准阿特珠单抗用于尿路上皮癌和非小细胞肺癌，

·阿维鲁单抗(Avelumab)(Bavencio)是由默克雪兰诺(Merck Serono)和辉瑞开发的全人IgG1抗体，FDA批准阿维鲁单抗(Avelumab)用于治疗转移的merkel细胞癌，胃癌III期临床试验失败了，

·得瓦鲁单抗(Durvalumab)(Imfinzi)是AstraZeneca开发的全人IgG1抗体，FDA批准得瓦鲁单抗(Durvalumab)用于治疗放化疗后的尿路上皮癌和不可切除的非小细胞肺癌，

·BMS-936559，由Bristol-Myers Squibb开发，

·CK-301，由Checkpoint Therapeutics开发，

参见例如Iwai,et al.,Journal of Biomedical Science,(2017)24:26,DOI10.1186/s12929-017-0329-9。

b.CTLA4拮抗剂

其他可用于介导免疫应答中T细胞的作用的分子也被设想作为活性剂。例如，在一些实施方案中，所述分子是与非PD-1的免疫应答介导分子结合的试剂。在一些实施方案中，所述试剂靶向或减少通过CTLA4的信号传导。所述试剂的活性或功能可类似于上述PD-1，但靶向CTLA4而不是PD-1。例如，活性剂可以抑制、减少、消除或减少通过CTLA4受体信号传导途径的抑制性信号转导。在以下情况下可能会导致此类减少：(i)CTLA4拮抗剂与CTLA4受体结合而不触发信号转导，以减少或阻断抑制性信号转导；(ii)CTLA4拮抗剂与CTLA4受体的配体(例如激动剂)结合，阻止配体与受体结合；(iii)CTLA4拮抗剂结合或抑制作为调控链一部分的分子的活性，所述调控链在未被抑制时具有刺激或促进CTLA4抑制信号转导的结果；或(iv)CTLA4拮抗剂抑制CTLA4受体或其配体的表达，尤其是通过降低或消除一种或多种编码CTLA4或其一种或多种天然配体的基因的表达。因此，CTLA4拮抗剂可以是影响CTLA4抑制性信号转导减少的分子，从而增加T细胞对一种或多种抗原的应答。

在优选的实施方案中，所述分子是CTLA4的拮抗剂，例如拮抗性抗CTLA4抗体。设想用于本发明方法的抗CTLA4抗体的实例包括如PCT/US2006/043690(Fischkoff等，WO/2007/056539)中所述的抗体。

抗PD-1、抗B7-H1和抗CTLA4抗体的剂量是本领域已知的并且可以在0.1至100mg/kg的范围内，优选更短的范围1至50mg/kg，更优选10至20mg/kg的范围。人受试者的合适剂量在5至15mg/kg之间，最优选是抗体(例如，人抗PD-1抗体，如MDX-1106)的10mg/kg。

可用于本发明方法的抗CTLA4抗体的具体实例是伊匹木单抗(Ipilimumab)，也称为MDX-010或MDX-101，一种人抗CTLA4抗体，优选以约10mg/kg的剂量施用，和曲美木单抗(Tremelimumab)，一种人抗-CTLA4抗体，优选以约15mg/kg的剂量施用。另参见Sammartino等，Clinical Kidney Journal,3(2):135-137(2010)，2009年12月在线出版。

在其他实施方案中，拮抗剂是小分子。已显示一系列小的有机化合物与B7-1配体结合以防止与CTLA4结合(参见Erbe等，J.Biol.Chem.，277:7363-7368(2002)。这种小有机物可以单独施用或与抗CTLA4抗体一起施用，以减少T细胞的抑制性信号转导。

c.其他免疫检查点调节剂

其他免疫检查点靶标包括但不限于ICOS、OX40、GITR、4-1BB、CD40、CD27-CD70、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、B7-H3、KIR等，并且单独地或与抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA化合物组合靶向癌症治疗。参见，例如，Iwai,et al.,Journal of Biomedical Science.24(1):26.doi:10.1186/s12929-017-0329-9；Donini,et al.,J Thorac Dis.2018May；10(Suppl13):S1581-S1601.doi:10.21037/jtd.2018.02.79。因此，在一些实施方案中，颗粒与靶向ICOS、OX40、GITR、4-1BB、CD40、CD27-CD70、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、B7-H3、KIR或PARP的化合物或其组合组合施用，单独或与靶向PD-1、PD-L1和/或CTLA的化合物组合施用。

2.常规癌症疗法

其他治疗剂包括常规癌症治疗剂，例如化学治疗剂、细胞因子、趋化因子和放射治疗。大多数化疗药物可分为：烷化剂、抗代谢药物、蒽环类药物、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂和其他抗肿瘤试剂。所有这些药物都以某种方式影响细胞分裂或DNA合成和功能。另外的疗法包括单克隆抗体和新型酪氨酸激酶抑制剂，例如甲磺酸伊马替尼(

或

)，它们直接靶向某些类型癌症(慢性骨髓性白血病、胃肠道间质瘤)中的分子异常。

代表性的化学治疗剂包括但不限于安吖啶、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、克瑞他酶(crisantaspase)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、道诺霉素、多西他赛、阿霉素、表鬼臼毒素、表阿霉素、依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、亚叶酸、阿霉素脂质体、柔红霉素脂质体、环己亚硝脲、二氯甲基二乙胺、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、喷司他丁、甲基苄肼、雷替曲塞、赛特铂、链脲菌素、替尼泊苷、丙卡巴肼、雷替曲塞、沙铂、链脲佐菌素、替尼泊苷、优福定、替莫唑胺、替尼泊苷、噻替哌、硫鸟嘌呤、拓扑替康、苏消安、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、他克唑和其衍生物、曲妥单抗

西妥昔单抗、和利妥昔单抗(

或

)、贝伐单抗(AVA

)及其组合。代表性的促凋亡剂包括但不限于fludarabinetaurosporine、放线菌酮、放线菌素D、乳糖神经酰胺、15d-PGJ(2)及其组合。

V.试剂盒

还公开了包括所公开的组合物的剂量单位，例如，冻干的或在用于运输和储存和/或施用的药学上可接受的载体中。试剂盒的组分可以单独包装并且可以是无菌的。在一些实施方案中，包含有效量的组合物的药学上可接受的载体被运输并储存在无菌小瓶中。无菌小瓶可包含足够用于一个或多个剂量的组合物。组合物可以以适合施用的体积运输和储存，或者可以以在施用前稀释的浓度提供。在另一个实施方案中，含有药物的药学上可接受的载体可以在注射器中运输和储存。

提供了包含各种容量的注射器或带有可变形侧面的容器(例如塑料容器或塑料侧容器)的试剂盒，这些容器可以被挤压以迫使液体组合物从孔中流出。注射器的尺寸和设计取决于施用途径。任何试剂盒都可以包括使用说明。

可以通过以下编号的段落进一步理解所公开的组合物和方法。

1.纳米颗粒，其由碱金属或碱土金属和卤化物形成。

2.根据段落1所述的纳米颗粒，其中所述碱金属是锂、钠、钾、铷或铯，并且所述卤化物是氟化物、氯化物、溴化物或碘化物。

3.根据段落1所述的纳米颗粒，其中所述碱土金属是镁或钙，并且所述卤化物是氟化物、氯化物、溴化物或碘化物。

4.根据段落1所述的纳米颗粒，其包括氯化钠、氟化钠、溴化钠、碘化钠、氯化钾或氯化钙。

5.根据段落4所述的纳米颗粒，其包括氯化钠。

6.纳米颗粒，其由钠和氯化物形成。

7.根据段落1-6中任一项所述的纳米颗粒，其中碱金属或碱土金属与卤化物的摩尔比为约1:1。

8.根据段落1-7中任一项所述的纳米颗粒，其中所述颗粒是立方体的。

9.根据段落1-8中任一项所述的纳米颗粒，其还包括亲水性涂层或外层。

10.根据段落9所述的纳米颗粒，其中所述层或涂层包括两亲嵌段共聚物、肽、蛋白质、脂质或其组合。

11.根据段落10所述的纳米颗粒，其中所述层或涂层包括脂质，例如磷脂。

12.根据段落6所述的纳米颗粒，其中所述磷脂是磷酸乙醇胺。

13.根据段落9-12中任一项所述的纳米颗粒，其中所述层或涂层包括PEG，例如PEG胺。

14.根据段落9-13中任一项所述的纳米颗粒，其中所述层或涂层包括脂质-PEG缀合物，例如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)PEG(2000)胺，或由其组成。

15.药物组合物，其包含多个根据段落1-14中任一项所述的纳米颗粒。

16.根据段落15所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒的平均流体动力学尺寸在约10nm和约500nm之间，或在约25nm和约300nm之间，或在约50nm和150nm之间，在约75nm和约125nm之间，±5％，10％，15％，20％或25％。

17.根据段落15或16所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒是单分散的。

18.根据段落15-17中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒通过微乳液反应形成。

19.根据段落18所述的药物组合物，其中所述微乳液反应包括将氯化钼(V)添加到包含溶剂、表面活性剂和油酸钠且任选地不含水的溶剂溶液中。

20.根据段落19所述的药物组合物，其中所述溶剂是己烷和乙醇的混合物。

21.根据段落19或20所述的药物组合物，其中所述表面活性剂是油胺或油酸。

22.根据段落15-21中任一项所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒包含亲水性涂层或外层，其任选地通过将纳米颗粒和脂质-PEG缀合物一起在溶剂中混合并去除溶剂而形成。

23.根据段落15-22中任一项所述的药物组合物，其包含药学上可接受的载体。

24.根据段落15-23中任一项所述的药物组合物，其包含治疗有效量的纳米颗粒。

25.根据段落15-24中任一项所述的药物组合物，其包含有效量的纳米颗粒，以在肿瘤细胞和/或癌细胞中降低线粒体耗氧率(OCR)、降低线粒体呼吸速率(MSR)、降低细胞内ATP水平、增加ROS水平、增加JNK、ERK和/或p38磷酸化水平，增加脂质过氧化，增加DNA损伤，释放细胞色素c，增加胱天蛋白酶-3活性，增加胱天蛋白酶-1活性，增加细胞溶胀和/或气泡形成，诱导细胞破裂和/或完全渗透溶解，增加NLRP3炎症体诱导，增加GSDMD N端片段释放，增加IL-1β分泌，增加细胞内K+水平，或其组合。

26.根据段落15-25中任一项所述的药物组合物，其包含有效量的纳米颗粒以增加肿瘤和/或癌细胞的细胞凋亡、坏死和/或细胞焦亡。

27.根据段落25或26所述的药物组合物，其中相对于非肿瘤和/或非癌细胞，在肿瘤细胞和/或癌细胞中线粒体耗氧率(OCR)，降低线粒体呼吸速率(MSR)，降低细胞内ATP水平，增加ROS水平，增加JNK、ERK和/或p38磷酸化水平，增加脂质过氧化，增加DNA损伤，释放细胞色素c，增加胱天蛋白酶-3活性，增加胱天蛋白酶-1活性，增加细胞溶胀和/或气泡形成，诱导细胞破裂和/或完全渗透溶解，增加NLRP3炎症体诱导，增加GSDMD N-末端片段释放，增加IL-1β分泌，增加细胞内K+水平，增加细胞凋亡，增加坏死，增加细胞焦亡或其任何组合被更大程度地改变或影响。

28.根据段落15-27中任一项所述的药物组合物，其剂型适合于施用约0.1mg/kg至约1,000mg/kg，或约1mg/kg至约100mg/kg，或约5mg/kg至约50mg/kg至有需要的受试者。

29.根据段落15-28中任一项所述的药物组合物，其包含一种或多种另外的活性剂。

30.根据段落29所述的药物组合物，其中所述一种或多种另外的活性剂包括免疫检查点抑制剂、化学治疗剂或其组合。

31.根据段落30所述的药物组合物，其包含选自PD-1拮抗剂、CTLA4拮抗剂及其组合的免疫检查点抑制剂。

32.根据段落31所述的药物组合物，其中所述PD-1拮抗剂和/或CTLA拮抗剂是抗体或其抗原结合片段。

33.制备抗原的方法，其包括使癌细胞与有效量的根据段落1-14中任一项所述的纳米颗粒或根据段落15-32中任一项所述的药物组合物接触以诱导细胞死亡。

34.根据段落33所述的方法，其中所述纳米颗粒有效增加一种或多种损伤相关分子模式(DAMP)分子的表达或分泌。

35.根据段落34所述的方法，其中所述DAMP分子包括钙网蛋白(CRT)、三磷酸腺苷(ATP)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)及其组合。

36.根据段落33-35中任一项所述的方法，其中接触发生在体外或离体。

37.根据段落33-36中任一项所述的方法，其中所述癌细胞是从需要癌症治疗或预防的受试者中分离的。

38.抗原，其包括根据段落33-37中任一项所述的方法形成的垂死或死细胞，或其溶解产物、提取物、馏分、分离物或分泌因子的集合。

39.为受试者接种疫苗的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的根据段落38所述的抗原以增加或诱导对抗原的免疫应答。

40.根据段落39所述的方法，其包括向受试者施用根据段落15-32中任一项所述的药物组合物。

41.根据段落39或40所述的方法，其进一步包括向受试者施用佐剂。

42.根据段落40或41所述的方法，其中抗原、药物组合物和佐剂的任何组合一起施用。

43.根据段落42所述的方法，其中抗原、药物组合物和佐剂的任何组合是相同或不同混合物的一部分。

44.根据段落40和41所述的方法，其中抗原、药物组合物和佐剂的任何组合分开施用。

45.根据段落39-44中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症。

46.治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用根据段落15-32中任一项所述的药物组合物。

47.根据段落46所述的方法，其中所述药物组合物在所述受试者中诱导针对癌症的免疫应答。

48.根据段落45-47中任一项所述的方法，其中所述受试者患有骨骼、膀胱、脑、乳房、宫颈、结肠直肠、食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮肤、胃或子宫癌。

49.根据段落39-48中任一项所述的方法，其中施用是注射或输注。

50.根据段落39-49中任一项所述的方法，其中施用是局部施用至需要治疗的部位。

51.根据段落50所述的方法，其中所述部位是肿瘤。

52.根据段落39-51中任一项所述的方法，其中所述施用是全身性的。

53.根据段落39-52中任一项所述的方法，进一步包括施用一种或多种另外的活性剂。

54.根据段落53所述的方法，其中所述一种或多种另外的活性剂包括免疫检查点抑制剂、化学治疗剂或其组合。

55.根据段落54所述的方法，其包括选自PD-1拮抗剂、CTLA4拮抗剂及其组合的免疫检查点抑制剂。

56.根据段落55所述的方法，其中PD-1拮抗剂和/或CTLA拮抗剂是抗体或其抗原结合片段。

57.根据段落53-56中任一项所述的方法，其中在不同时间向受试者施用所述颗粒和所述另外的活性剂。

58.根据段落53-56中任一项所述的方法，其中将所述颗粒和另外的活性剂同时施用于受试者。

59.根据段落53-56中任一项所述的方法，其中所述颗粒和所述另外的活性剂形成相同药物组合物的一部分。

60.根据段落46-59中任一项所述的方法，其中通过膀胱灌注向受试者施用所述颗粒，任选地其中所述受试者患有膀胱癌。

通过参考以下非限制性实施例可以进一步理解本发明。

实施例

Jiang,et al.,“NaCl Nanoparticles as a Cancer Therapeutic,”AdvMater.2019Nov；31(46):e1904058.doi:10.1002/adma.201904058.2019年9月25日Epub以及与之相关的支持信息通过引用全部纳入本文。

以下实施例以及本文的其他公开使用以下缩写词：

缩写词列表

统计分析

对于体外研究，除非另有说明，所有测量均一式六份进行。从高内涵BioApplication Studio 2.0获得的数据被导出并使用JMP统计分析包(SAS Institute，North Carolina)进一步分析。半最大抑制浓度(IC₅₀)由Doseresp使用Origin 9确定。中值致死浓度(LC₅₀)使用GraphPad Prism5(San Diego，California)通过曲线拟合程序计算。测量值表示为平均值±SD。一种加尾学生t检验用于组间比较，0.05或更小的P值代表统计显著性。

实施例1：NaCl纳米颗粒的合成和降解。

材料和方法

氯化钠纳米颗粒(SCNP)的合成

在典型的合成中，20mg油酸钠(TCI，97％，批号：W76EGFQ)、1mL油胺(70％，Sigma-Aldrich，批号：STBF9554V)和50mg 1,2-十四烷二醇(90％，Sigma-Aldrich)溶解在含有10mL己烷(99.9％，Fisher)和10mL乙醇(99.9％，Fisher)的混合溶液中。向混合物中加入15mg氯化钼(V)(95％，Sigma-Aldrich，批号：MKBQ9967V)，在60℃磁力搅拌溶液24小时。通过以12000RPM离心10分钟收集粗产物。通过短暂的超声处理将颗粒重新分散在己烷中，并重复离心/己烷洗涤过程3次以去除未反应的前体。

磷脂涂层的氯化钠纳米颗粒(PSCNP)

将上述合成的在己烷中的SCNP(10mL)超声处理30秒，然后与80μL磷脂溶液(1mg/mL)DSPE-PEG(2000)胺(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](铵盐)，Avanti，批号：180PEPEPEG2NH2-64)混合。对于若丹明B标记的PSCNP(RB-PSCNP)，Liss Rhod PE(1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(丽丝胺若丹明B磺酰基,铵盐，Avanti，批号：F160LRPE-33)氯仿溶液(40μL,1mg/mL)也加入到10mL SCNP中。将混合物超声处理30秒。使用Buchi R II旋转蒸发仪在40℃下减压除去溶剂。然后将10mL PBS/水加入烧瓶中，将混合物超声处理30秒。除非另有说明，否则新鲜制备的PSCNP用于表征、体外和体内研究。除非另有说明，否则所有颗粒剂量均基于NaCl浓度计算。

NP的表征

使用放置在切割载玻片上的干燥样品，用Cu Kα1辐射

在BrukerD8-Advance上进行X射线衍射(XRD)分析。扫描电子显微镜(SEM)和能量色散X射线光谱EDS元素映射图像是在配备了Oxford EDS系统的FEI Teneo场发射SEM上获得的。透射电子显微镜(TEM)在FEI Tecnai20透射电子显微镜上进行，在加速电压为200kV操作。高分辨率TEM分析在日立(Hitachi)透射电子显微镜H9500上进行，在加速电压300kV操作。粒度和电动电位测量在Malvern Zetasizer Nano ZS系统上进行。在Nicolet iS10 FT-IR光谱仪上记录傅里叶变换红外(FT-IR)光谱。

稳定性和释放实验。

PSCNP分散在100μl醋酸铵缓冲液(pH＝5.5或pH＝7)中，并加入到Slide-A-Lyzer^TMMINI透析装置(MWCO＝2K，Cat#69550，Thermofisher，US)中。将混合物(unite)放入含有4.5mL醋酸铵缓冲液的5mL Eppendorf管中。在室温下将管放在振荡器(20rpm)上。在不同时间点(0、10分钟、0.5、1、2、4、6、12、24小时)，从Eppendorf管中取出400μL的PSCNP溶液来测试游离离子浓度。Na+电极(HORIBA LAQUAtwin Na-11)用于测量游离Na+离子，而MQAE(N-(乙氧基羰基甲基)-6-甲氧基喹啉鎓溴化物，Setareh Biotech，批号：50610)用于测量溶液中游离Cl-离子。所有测量均按照制造商的方案进行，并重复六次。

结果

氯化钠纳米颗粒(SCNP)是通过微乳液反应合成的。反应在己烷/乙醇混合溶剂中进行，油酸钠和氯化钼作为钠和氯化物前体，油胺作为表面活性剂。通过透射电子显微镜(TEM)确定，典型的反应产率≈77±10.6nm SCNP(图1A)。动态光散射(DLS)发现它们的流体动力学尺寸为～84.6±9.8nm NaCl纳米颗粒，尺寸分布窄(图1H)。其他尺寸的NaCl纳米颗粒(15至800nm)可通过调整反应条件制备，制备了约15nm、约25nm、约60nm和约100nm、约200nm、约300nm和约800nm的单分散颗粒以说明上述情况(图1J-1P)。X射线粉末衍射(XRD)发现颗粒的晶体结构为立方相NaCl(Fm-3m，PDF No.：00-005-0628，图1B)。能量色散光谱(EDS)确认，产品中钠和氯化物的摩尔比约为1:1(图1C、1D、表1)，包括钼在内的杂质可忽略不计。

表1：EDS分析光谱(图1D)确认Na与Cl原子的摩尔比约为1:1。

由于油胺涂层，合成的NaCl纳米颗粒是疏水性的(傅立叶变换红外光谱，图1G)。为了将纳米颗粒转移到水溶液中，将聚乙二醇化磷脂，DSPE-PEG2000胺层赋予纳米颗粒表面。由此产生的磷脂涂层的NaCl纳米颗粒(指定为PSCNP)可以很好地分散在水溶液中，与未涂层的SCNP相比，它们的流体动力学尺寸为98.0±13.1nm(图1H)，表面正电荷为+9.7mV(图1I)。磷脂涂层使NaCl纳米晶体在水中具有更长的寿命，但不会停止崩解过程。事实上，当PSCNP在水中孵育1-6小时时，TEM分析发现纳米晶体表面上有小空腔。进一步孵育导致显著的颗粒崩解(6小时后变成更小的碎片)并最终在24小时内完全溶解。

为了更好地理解该过程，分别使用SBFI-AM和MQAE作为Na⁺和Cl^-传感器在无钠和无氯乙酸铵缓冲液(pH＝7.0或5.5)中评估离子释放。两种离子的相当释放曲线均在约12小时达到稳定水平(图1E、1F)。值得注意的是，将pH值降低到5.5并没有加速纳米颗粒的降解(图1E、1F)。

实施例2：NaCl纳米颗粒被细胞摄取并且可具有细胞毒性。

材料和方法

细胞培养

4T1(鼠乳腺癌)、HT29(人结肠直肠腺癌)、A549(人肺癌)、SGC7901(人胃腺癌)、PC-3(人前列腺腺癌)、UPPL-1541(鼠膀胱癌)、t24、UMUC2细胞在RPMI-1640(Corning，10-040-CV)中生长。U87MG(人胶质母细胞瘤)和RAW264.7细胞(鼠巨噬细胞)在DMEM(Corning，10-013-CV)中生长。B16-F10(鼠黑素瘤)和BBN963细胞在高糖DMEM(

30-2002^TM)中生长。SCC VII细胞(鼠头颈部鳞状细胞癌)在

DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)/Hams F-12 50/50Mix(Corning，10-090-CV)中生长。所有细胞培养基均补充有10％胎牛血清(FBS)和100单位/mL青霉素和100单位/mL链霉素(MediaTech,USA)。人原代前列腺上皮细胞(HPrECs、ATCC、PCS440010)用前列腺上皮细胞生长试剂盒(ATCC PCS440040)保持在无血清条件下。鼠原代尿路上皮上皮细胞K1970维持在DMEM/F12 70/30培养基中。该培养基还含有氢化可的松(1000×)、胰岛素(5mg/ml)、两性霉素B(250μg/ml)、庆大霉素(10mg/ml)、霍乱毒素(11.7μM)和Y-27632mM。原代前列腺上皮细胞(HPrECs、ATCC、PCS440010)用前列腺上皮细胞生长试剂盒(ATCC PCS440040)保持在无血清条件下。小鼠精原细胞系(C18-4)是从6天大的Balb/c小鼠的睾丸中分离出来的生殖细胞建立的(Hofmann等，Stem Cells 23,200-210(2005)，并且细胞被培养在含有5％FBS和100U/ml链霉素和青霉素的DMEM(Corning，10-013-CV)中。所有细胞都保持在37℃的湿润、5％二氧化碳气氛中。

MTT测定研究细胞毒性。

将细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度接种于96孔板中并孵育过夜。然后用分散在PBS中的PSCNP、在PBS中预熟化的PSCNP(1、3、8和24小时)或NaCl盐处理细胞，剂量范围为3.25-320μg·NaCl/mL 24小时。MTT测定(3-4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑，Sigma)按照制造商的方案进行。通过酶标仪(Synergy Mx，BioTeK)测量570nm处的吸光度。所有测量均一式六份进行。

活/死测定以评估时间依赖性细胞毒性。

使用活/死成活力/细胞毒性试剂盒(Biotum，目录号：30002)评估PSCNP的时间依赖性细胞毒性。与剂量为52.5、105.0或160.0μg/mL(NaCl浓度，下同)的PSCNP孵育后，PC-3细胞用PBS洗涤两次并分别用2μM钙黄绿素AM和3μM PI染色，用于活细胞和死细胞检测。所有细胞均与10μM Hoechst 33342(Life Technologies)共染色用于细胞核观察。进行定量延时荧光显微镜检查，并使用HCS StudioTM 2.0Target Activation BioApplication模块(Thermo Scientific，MA)在用PSCNP处理0、2、4、6和12小时后在Arrayscan^TM VTI HCS读取器上自动获取序贯图像。PBS和10μM CdCl₂(称为Cd)分别作为阴性和阳性对照进行分析。对于所有测量，使用40倍物镜(NA0.5)、滨松ORCA-ER数码相机结合0.63倍耦合器和CarlZeiss显微镜光学系统在自动对焦和高分辨率模式分析每孔的49个场和大约5000个细胞。通道二(Ch2)使用BGRFR 485-20滤光片进行钙黄绿素AM染料(活细胞)成像。通道三(Ch3)使用BGRFR 549-15过滤器进行乙啡啶同型二聚体-III(死细胞)成像。使用HCS Studio2.0Target Activation BioApplication(Thermo Scientific,MA)分析高内涵多通道分析(HCA)。

PSCNP、Na+、Cl-、K+的细胞内浓度

荧光染色、图像采集和高内涵分析。

显微镜研究是在带有活细胞室和HCS Studio^TM2.0细胞分析软件的

VTI HCS读取器(Thermo Scientific)上进行的。对于所有测量，使用40倍物镜(NA 0.5)、结合0.63倍耦合器的滨松ORCA-ER数码相机和Carl Zeiss显微镜光学器件在自动对焦和高分辨率的模式在三通道中分析了每孔49个场和大约5000个细胞。在对象检测之前应用图像平滑以减少对象碎片。通道一(Ch1)使用BGRFR 386-23过滤器进行Hoechst 33342染色，用于自动对焦、对象识别和分割。Ch2使用BGRFR 485-20过滤器进行SBFI-AM、PBFI-AM(钾结合的苯并呋喃间苯二酸乙酰氧基甲酯，Setareh Biotech，批号：5027)和MQAE成像。Ch3使用BGRFR 549-15过滤器进行RB-PSCNP成像。使用HCSStudio2.0Target Activation BioApplication(Thermo Scientific,MA)分析高内涵多通道分析(HCA)。基于单细胞的HCA提供了多个参数来表征细胞核、细胞数量以及每个细胞的总强度或平均强度。总强度定义为细胞内的所有像素。平均强度定义为细胞内的所有像素除以细胞的总面积。具体而言，对于PSCNP细胞摄取，PC-3细胞与RB-PSCNP孵育0、2、4和6小时。然后，

Green DND-26(分子探针)和Hoechst 33342染料共染色10分钟。每10分钟获取荧光图像。所有测量均一式六份进行。对于细胞内Na⁺、Cl^-和K⁺的表征，PC-3细胞用RB-PSCNP处理0、2、4和6小时。然后将细胞与0.04％Pluronic F-127(Sigma，批号：SLBB4267V)中的10μM SBFI-AM，10mM MQAE或0.04％Pluronic F-127中的10μM PBFI-AM孵育，分别用于Na⁺、Cl^-和K⁺染色。最终的荧光信号由Ch2测量。

结果

从PC-3细胞(人前列腺腺癌细胞系)开始，研究了PSCNP对细胞成活力的影响。MTT测定发现PSCNP具有显著的细胞毒性，IC₅₀为160.0μg/mL(NaCl浓度，下同；图2A、图2Q)。钙黄绿素AM/PI活/死测定也观察到了类似的结果(图2L)。作为比较，160μg/mL的NaCl盐和游离磷脂对PC-3细胞没有毒性(图2M)。当PSCNP在细胞孵育前熟化时，细胞毒性会减轻。例如，当PSCNP在加入培养基之前在PBS中孵育1、3和8小时时，细胞成活力分别增加到60.6％、82.4％和89.2％；当预孵育时间超过8时时，颗粒对细胞完全无毒(图2M)。这些观察表明，PSCNP的细胞毒性与NaCl纳米晶体有关，但与组成电解质或磷脂无关。

检查了细胞对PSCNP的摄取及其在细胞内的命运。PSCNP用若丹明B标记，细胞核内体/溶酶体用LysoTracker染色。收集延时(time-relapse)活细胞图像并分析每个细胞的荧光强度(n＝5000)。观察到细胞内若丹明B信号的时间和浓度依赖性增加，以及若丹明B和LysoTracker信号之间良好的空间重叠(图2N)。这表明PSCNP通过内吞作用被细胞摄取，这与其他人用不同磷脂包被纳米颗粒的观察结果一致(Oh and Park,Int JNanomed 9,51-63(2014))。同时，SBFI-AM和MQAE染色显著发现细胞内Na+(图2O)和Cl-浓度((2P)一致地增加，MQAE信号与Cl-浓度呈负相关(Kim等，BMC Neurosci.16,90(2015))。广义线性回归分析也显示若丹明B与SBFI-AM或MQA信号之间具有良好的相关性，表明PSCNP在细胞内逐渐降解并释放成分离子。

图2R是柱状图，说明了癌细胞系T24和UMUC2以及正常细胞系K1970和HPrEC中NaClNP的细胞摄取。

实施例3：NaCl纳米颗粒诱导癌细胞凋亡。

材料和方法

线粒体电位(Δψm)。

线粒体膜电位的变化通过JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(Biotium，货号：30001)测量。通过将10μL浓缩染料加入1mL不含FBS的RPMI培养基中制备JC-1工作溶液。PSCNP(52.5、105或160μg/mL)、PBS和NaCl(PBS中的160.0μg/mL)与细胞一起孵育6小时。移除培养基并替换为JC-1工作溶液，再孵育15分钟。通过分析Ch2(绿色，JC-1单体染料)和Ch3(红色，JC-1聚集染料)信号，在Array Scan VTI读取器上分析染色的细胞。通过HCS Studio2.0Target Activation BioApplication软件(Thermo Scientific,MA)分析红/绿比率。

耗氧率(OCR)。

PC-3细胞(20,000个/孔)接种在Seahorse XFe 24测定板中，并在250μL RPMI1640培养基中培养过夜。洗涤细胞并用添加了2mg/mL葡萄糖、1mM谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠(pH7.4)的Seahorse基础培养基孵育1小时。在连续3次测量基础代谢率后，将PSCNP(52.5、105或160μg/mL)或PBS与细胞混合。每30分钟测量代谢率，直至6小时。对于每次测量，细胞依次用2μM寡霉素、3μM FCCP(羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙)和3μM抗霉素/3μM鱼藤酮处理，每个阶段分析3次。支持ATP产生的呼吸速率计算为寡霉素处理之前/之后的OCR差异。所有测量均一式六份进行。

ATP水平。

发光ATP检测试剂盒(Abcam,ab113849)用于按照制造商的方案确定细胞ATP含量。PC-3细胞在96孔板中以每孔1×10⁴个细胞的密度生长，并与不同浓度的PSCNP(52.5、105或160μg/mL NaClμg/mL)一起孵育6小时。将50μL裂解缓冲液加入每个孔中，并在定轨振荡器上以700RPM振荡孵育5分钟。然后，将50μL重构的底物溶液加入每个孔中，并将混合物在黑暗中振荡15分钟。在酶标仪(Synergy Mx，BioTeK)上测量每个孔的发光强度，并将其归一化为对照细胞中的发光强度。

ROS生成和脂质过氧化。

PC-3细胞在96孔板中以每孔1×10⁴个细胞的密度进行传代培养，然后与浓度为52.5、105.0或160μg/mL的PSCNP孵育4小时。将处理过的细胞与10μM DCFH-DA(2',7'-二氯荧光素二乙酸酯，Sigma)一起孵育，并在酶标仪(Synergy Mx，BioTeK)上测量529nm荧光强度。细胞与浓度为52.5、105或160μg/mL的PSCNP孵育6小时，用于脂质过氧化分析。将处理过的细胞与10μM脂质过氧化传感器(Life Technologies)在完全生长培养基中在37℃下孵育30分钟。用PBS洗涤细胞一次，然后分析还原态(红色，ex/em：530/590nm)和氧化态(绿色，ex/em：488/560nm)的荧光强度。数据表示为红色/绿色荧光强度比。

DNA损伤和胱天蛋白酶-3活化。

进行γ-H2AX和胱天蛋白酶-3双免疫染色以确认DNA损伤和胱天蛋白酶-3凋亡途径的活化。PC-3细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度接种于96孔板中，培养过夜。然后将细胞与剂量为52.5、105或160μg/mL的PSCNP孵育24小时。处理后的PC-3细胞在室温下用4％多聚甲醛固定30分钟，然后用PBS重复洗涤3次。固定后，细胞通过PBS中的0.1％Triton X-100渗透，与小鼠抗磷酸组蛋白H2AX抗体(Ser139，γ-H2AX，Millipore，Massachusetts)和小鼠抗裂解胱天蛋白酶-3抗体(Cell Signaling，#9664)在PBS/BSA/0.5％Tween 20溶液中于4℃孵育过夜。用PBS/BSA洗涤两次后，将细胞与山羊抗兔Dylight 650、小鼠抗兔Dylight 488(Thermo Scientific，MA)和Hoechst 33342在PBS/BSA溶液中室温孵育90分钟。进行流式细胞术(Beckman Coulter CytoFLEX)用于信号定量。

由PSCNP诱导的细胞色素c释放。

PC-3细胞以每孔4×10⁵个细胞的密度接种在2孔室载玻片(Nunc^TMLab-Tek^TMIIChamber Slide^TMSystem，ThermoFisher)中，过夜生长。然后将细胞与浓度为26.3、52.5或160μg/mL的PSCNP孵育6小时。按照制造商的方案，通过ApoTrack^TM细胞色素c细胞凋亡ICC抗体试剂盒(ab110417)分析细胞色素c。在Zeiss LSM 710共聚焦显微镜上以100倍放大率拍摄共聚焦图像，并通过ImageJ进行分析以比较荧光强度。

蛋白质印迹分析。

使用的抗体是磷酸-JNK1/2(Thr183/Tyr185)(Cell Signaling；4668),JNK1/2(Cell Signaling；9252),磷酸-ERK1/2(Cell Signaling；4370),ERK1/2(Cell Signaling；4695))、磷酸p38 MAPK(Cell Signaling；4511)、p38 MAPK(Cell Signaling；8690)、切割的胱天蛋白酶-3(Cell Signaling,9661)、α-微管蛋白(Abcam,7291)、NLRP3(D4D8T)兔mAb(Cell Signaling，15101)。PC-3细胞与浓度为160μg/mL的PSCNP孵育6小时。然后分析细胞的细胞应激，特别是对JNK/p38 MAPK通路的影响。PBS、NaCl溶液(160μg/mL)和在PBS中预熟化的PSCNP(160μg/mL)用作阴性对照。对于NLRP3炎症体研究，PC-3细胞与浓度为40或80μg/mL的PSCNP孵育2小时。PBS、NaCl溶液(80μg/mL)和在PBS中预熟化的PSCNP(80μg/mL)用作阴性对照。通过在补充有1x蛋白酶抑制剂混合物(Amresco)的RIPA缓冲液中匀浆细胞来制备细胞裂解物。使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)测定蛋白质浓度。蛋白质裂解物上样到10％SDS-PAGE上并转移到PVDF膜上。与膜的非特异性结合通过与5％脱脂牛奶在室温下孵育1小时而被阻断。将膜与制造商指定稀释度的一抗在4℃下孵育16小时。在室温下二抗孵育1小时后，膜用ECL试剂(Thermo Fisher Scientific)处理并暴露于X射线胶片(Santa Cruz)。所有成像结果均通过ImageJ分析。

结果

细胞内渗透压的增加将广泛影响细胞功能。最敏感的细胞器之一是线粒体，其膜电位(ΔΨm)对细胞质渗透压变化敏感。事实上，JC-1染色发现，当细胞与160.0μg/mLPSCNP孵育2小时时，ΔΨm很大程度上去极化(图2B)。这导致线粒体功能停止。具体而言，海马(Seahorse)线粒体应激试验表明，在与160.0μg/mL PSCNP孵育6小时内，线粒体耗氧率(OCR)和线粒体呼吸速率(MSR)分别降低了47.9％和91.0％(图2C、2D)。降低的OCR和MSR反过来影响线粒体呼吸链复合体I和III中ATP和活性氧(ROS)的产生。相对于对照细胞，细胞内ATP水平在4小时时降低了36.0％(图2E)，而ROS水平增加了22.3％(图2F)。蛋白质印迹发现JNK、ERK和p38磷酸化水平显著增加(图2G)，这是氧化应激升高的迹象(Benhar等，EMBORep.3,420-425(2002)，Mates等，Arch.Toxicol.86,1649-1665(2012))。在PSCNP处理的细胞中检测到广泛的脂质过氧化(图2H)和DNA损伤(γH2AX染色，图2I)进一步证实了这一点。另一方面，消散的线粒体膜导致细胞色素c的释放(图2J)。所有这些影响都集中在诱导细胞凋亡上，这是通过在24小时时胱天蛋白酶-3活性的显著增加表明的(图2G、2K)。

实施例4：NaCl纳米颗粒诱导癌细胞焦亡。

材料和方法

细胞形态变化和细胞扩增。

PC-3细胞形态变化通过在

VTI HCS读取器上，与PSCNP(160.0μg/mL)孵育2至6小时之间每20分钟拍摄一次明场图像进行监测。使用明场图像生成延时视频以显示形态变化。对于细胞体积变化，不同浓度(52.5、105和160μg/mL)的PSCNP与PC-3细胞一起孵育，通过HCS Studio^TM2.0细胞分析软件(Thermo Scientific)分析了不同时间点的单个细胞体积(n＝5000，以像素测量)。PBS处理的细胞(37500像素)的98％分位数用作基准。

细胞的TEM图像。

PC-3细胞与PSCNP(160μg/mL)孵育0、2、4或6小时。用含有5％蔗糖(w/v，pH 7.25)的0.1M二甲基胂酸盐-HCl缓冲液短暂冲洗细胞培养物。立即将缓冲液从培养皿中倒出，并替换为含有2.5％戊二醛的0.1M二甲基胂酸盐-HCl缓冲液(pH 7.25)的固定剂。细胞在室温下固定1小时。从培养皿中取出固定剂，用缓冲液短暂冲洗细胞，然后在缓冲的2％(v/v)四氧化锇中在4℃下后固定1小时。使用橡胶淀帚从培养皿中脱离细胞。将样品移入Eppendorf弹扣盖(snap-cap)微量离心管中并离心10分钟以将细胞浓缩成样品沉淀，然后进行以下每次更改：样品用蒸馏水冲洗3次，每次10分钟；在分级乙醇系列中脱水，每一步10分钟：25％、50％、75％、95％、100％和100％，然后在100％丙酮中进行两次变化，每次10分钟；在丙酮和Spurrs树脂(Electron Microscopy Sciences)中浸润1小时或过夜：75％丙酮和25％Spurrs、50％丙酮和50％Spurrs、75％丙酮和25％Spurrs、100％Spurrs、100％Spurrs。将样品包埋在新鲜的100％Spurrs树脂中，并在Eppendorf管中在60℃下聚合24小时。将样品从试管中取出并用Loctite强力胶固定在有机玻璃圆柱体(Ted Pella)上。用剃刀刀片修剪沉淀的细胞区域并使用Reichert-Jung Ultracut S超薄切片机切片。在狭槽网格上取六十纳米厚的切片，并使其干燥到涂有聚醋酸甲基乙烯脂的铝架上。用乙酸双氧铀和柠檬酸铅对网格进行后染色，并使用JEOL JEM 1011透射电子显微镜在80kV使用具有3000x3000分辨率的AMT中间安装数码相机进行观察。

质膜电位。

使用DiBAC₄(3)(双-(1,3-二丁基巴比妥酸)三次甲基氧喏，Invitrogen，批号：14D1001)测量质膜电位变化。在添加不同浓度(52.5、105和160μg/mL)和时间点(30-150分钟)的PSCNP后，PC-3细胞与5μMDiBAC₄(3)在37℃下孵育30钟。DiBAC₄(3)的绿色荧光通过

VTI HCS读取器进行测量，并使用HCS Studio^TM2.0细胞分析软件进行分析。

细胞凋亡/坏死细胞死亡。

使用细胞凋亡、坏死和健康细胞定量试剂盒(Biotium，目录号：30018)通过膜联蛋白V/EthD-III染色评估细胞凋亡/坏死。将PC-3细胞(5×10⁴)接种在组织培养皿(Corning，35mm×10mm)上并过夜生长。将PSCNP(160.0μg/mL)添加到培养皿中。根据制造商的方案制备工作染料溶液。简而言之，在100μL稀释的结合缓冲液中，加入5μL Hoechst 33342、5μLFITC-膜联蛋白V和5μL乙啡啶同型二聚体-III(EthD-III)。与PSCNP孵育0、2、4和6小时后，用PBS洗涤细胞，并与染料工作溶液孵育15分钟。使用Hoechst 33342的DAPI通道、膜联蛋白V-FITC的FITC通道和EthD-III的TRITC通道在荧光显微镜上获取荧光图像。

组织蛋白酶B释放和胱天蛋白酶-1活化。

Magic红色组织蛋白酶B试剂盒和

胱天蛋白酶-1测定试剂盒购自ImmunoChemistry Technologies,LLC(Bloomington,MN)。PC-3细胞以每孔5×10⁴个细胞的密度接种在8孔室载玻片(Nunc^TMLab-Tek^TMII Chamber Slide^TMSystem，ThermoFisher)中，并培养过夜。然后将细胞与PSCNP(160μg/mL)或NaCl盐(160μg/mL)孵育2小时。尼日利亚菌素(20μM)用作阳性对照(24小时孵育)。按照制造商的方案，材料处理的细胞在37℃下用Magic红色或

胱天蛋白酶-1染色。然后将细胞固定在4％多聚甲醛PBS溶液中，并用含有DAPI(H-1200)(Vector Laboratories,US)的VECTASHIELD抗褪色封固剂封固。共焦图像是在Zeiss LSM 710共焦显微镜上以100倍放大率拍摄的。

通过流式细胞术测量的胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3/7活化。

对于胱天蛋白酶-1分析，PC-3细胞以每孔1×10⁶个细胞的密度接种在6孔板中过夜，然后与PSCNP(160μg/mL)孵育1小时或6小时。

胱天蛋白酶-1试剂盒用于按照制造商的方案进行细胞染色。使用FITC通道在Beckman Coulter CytoFLEX系统上收集和分析所有细胞。使用FlowJo v10分析胱天蛋白酶-1活化的结果。对于胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-3/7并排比较研究，PC-3细胞以每孔1×10⁶个细胞的密度接种在6孔板中并培养过夜。将细胞与PSCNP以160μg·NaCl/mL孵育6小时，或以52.5μg/mL孵育24小时。H₂O₂(0.5mM，24小时孵育)和尼日利亚菌素(20μM，24小时孵育)分别用作胱天蛋白酶-3/7和胱天蛋白酶-1阳性对照。

胱天蛋白酶-1和FLICA 660胱天蛋白酶-3/7检测试剂盒(ImmunoChemistry Technologies,LLC)用于细胞染色。在Beckman Coulter CytoFLEX系统上收集所有细胞并进行分析，使用488nm激发用于胱天蛋白酶-1测量，使用633nm激发用于胱天蛋白酶-3/7测量。所有数据均使用FlowJo v10进行分析。

IL-1β分泌。

实验前一天将PC-3细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度接种于96孔板中。将细胞与PSCNP(105或160μg/mL)一起孵育6小时。将NaCl盐(160μg/mL)和尼日利亚菌素(20μM)孵育24小时分别作为阴性和阳性对照进行研究。收集上清液并使用R&D Systems人IL-1betaDuoSet ELISA(Minneapolis，MN)定量IL-1β含量。

LDH测定。

(a)LDH释放研究。

PC-3细胞在96孔板中以每孔1×10⁴个细胞的密度铺板过夜。将细胞与剂量为13.2、26.3、52.5、105、160、220或320μg/mL的PSCNP孵育6小时。使用相同剂量的PBS和NaCl盐作为对照。收集上清液并通过LDH测定试剂盒-WST(CT01-05，Dojindo，Japan)分析LDH含量。将结果归一化为PBS处理的对照细胞。

(b)坏死抑制研究。

PC-3细胞在96板中以每孔1×10⁴个细胞的密度铺板过夜。这些细胞用坏死抑制剂甘氨酸(5mM)或胱天蛋白酶-1抑制剂Ac-YVAD-cmk(30μg/mL)预处理1小时，然后与PSCNP(160或320μg/mL)孵育6小时。没有甘氨酸或Ac-YVAD-cmk处理的细胞作为对照进行研究。收集上清液并通过LDH测定试剂盒-WST(CT01-05，Dojindo，Japan)分析LDH含量。将结果归一化为PBS处理的对照细胞。

计算模拟讨论

模型和方法论

图3H中描述的模拟框包含18,000个形成球形细胞的脂质分子。此外，还包括289,000个水珠来模拟水环境。在模拟框的三个方向上应用周期性边界条件。质量、长度和时间尺度均在模拟中归一化，长度单位为σ，质量单位为脂质珠的质量单位，能量单位为ε。所有其他量均以这些基本单位表示。Velocity-Verlet算法用于执行时间积分，Langevin恒温器用于控制系统温度T。积分时间步长为

Δt＝0.01τ

(1)

(其中τ是15ns)。

所有模拟均使用LAMMPS包(Plimpton，J Comput Phys 117，1-19(1995))进行。细胞的半径为50σ。所示细胞在膜上含有足够的脂质以模拟真实细胞中发生的机械破裂。Yuan等(Fu等，Comput Phys Commun 210，193-203(2017))使用类似的近似法来研究红细胞的机械变形。

计算模型中的每个脂质分子由一个头珠后接两个尾珠表示(Cooke和Deserno，JChem Phys 123，(2005))。模拟中使用了以下电位来描述脂质珠之间的相互作用：

脂质的大小通过Weeks-Chandler-Andersen电位固定

其中∈是势阱的深度，b是颗粒间电位为零的有限距离，r_ij是颗粒之间的距离。为保证圆柱脂质形状，b设为b_头，头＝b_头，尾＝0.95σ和b_尾，尾＝σ。单个脂质中的三个珠子通过两个FENE键连接：

刚度为k_fene＝30ε/σ²和发散长度R_max＝1.5σ。脂质被谐波弹簧拉伸

弯曲刚度为k_拉伸＝10ε/σ²，头珠和第二尾珠之间的平衡长度r₀＝4σ。疏水效应通过尾珠之间的吸引力相互作用得到补偿，为

它描述了有吸引力的电位，对于r＞r_c深度∈平滑地逐渐变细为零。在这种情况下，衰减范围W设置为1.6σ。通过Lennard-Jones电位函数描述了细胞膜中溶剂和脂质头之间的相互作用

(其中b设置为b_水，头＝σ)。

离子浓度梯度与水通量之间的关系

假设钠和氯化物的浓度在空间上是均匀的，细胞膜对水是半透性的，这意味着水颗粒可以自由穿过膜。在模拟中，这个过程是通过逐步将水珠添加到细胞质来表示的。在数学上，某些钠和氯化物浓度下的渗透压∏可以使用Van’t Hoff方程估算(Stroka等，Cell157，611-623(2014))：

Π＝cRT (7)

(其中c是渗透压，R是气体常数，T是绝对温度)。为了简化问题，没有考虑静水压力。净化学渗透压差∏_进入-∏_出去驱动水通量穿过半透膜因此，单位时间内通过单位面积膜的水体积可以建模为与化学渗透压差成正比

(其中表示q表示细胞渗透率，为10^-510^-4m/s；V_W表示水的摩尔体积，18.016mL(Stroka等，Cell 157，611-623(2014))。假设细胞是对称的球体，注入细胞内部的水的总体积可以估算为

(其中D是细胞直径)。因此，跨质膜的浓度差可以表示为

关于膜破裂的膜张力概念在细胞生物学文献中被广泛使用。根据拉普拉斯定律，膜张力γ与细胞内的压力和细胞半径直接成正比。它可以计算为

(p是膜上的压力)。

后者可以计算为

(σ_xx，σ_yy和σ_zz是应力)。

对于不同大小的细胞，图3I-3J显示了质膜开始破裂时的临界浓度梯度(Δc)(红色方形阴影)。通过曲线拟合这些数据点，获得了一条有趣的曲线，使我们能够预测25μm细胞的临界浓度。

结果

显微成像发现在与PSCNP孵育后仅几个小时，PC-3细胞就出现了广泛的肿胀和巨泡形成，这表明许多细胞死于坏死而不是凋亡。具体而言，延时成像和像素强度分析(n＝5000个细胞)发现，当起始PSCNP浓度为160.0μg/mL时，平均细胞面积在30、60和90分钟时增加了10.8、29.5和58.4％(图3A、图3F、3G)。最终，流入物导致细胞破裂和完全渗透溶解。这是通过在PSCNP孵育4-6小时之间的活细胞成像和TEM记录的。通过膜联蛋白V/EthD-III双染色和LDH测定也证实了细胞膜破裂(图3B、3C)。令人印象深刻的是，当细胞与200μg/mLPSCNP孵育6小时时，记录到100％LDH释放(图3C)。为了更好地理解该过程，通过LAMMPS包(Plimpton,J Comput Phys 117,1-19(1995))建立了粗粒脂质体模拟模型。(图3H)。评估了跨质膜的浓度梯度变化(Δc)与膜张力(γ)之间的关系，并用于预测质膜开始破裂的阈值。模拟估计当Δc在50mM–500mM范围内时，细胞会破裂(图3I-3J)。这与实验结果非常吻合，实验结果在4-6小时之间检测到超过50mM的Δc(表2)。

表2.与PSCNP(160.0μg/mL)孵育后细胞内离子浓度的时间依赖性增加。

*浓度是通过图2O和3M中的荧光强度变化估算的。假设SBFI-AM(Iamshanova等，Eur Biophys J Biophy 45,765-777(2016))和PBFI-AM(Kasner and Ganz,Pbfi.Am JPhysiol 262,F462-F467(1992))的线性响应.

**细胞在等渗溶液中孵育(Jentsch等，Nat Rev Mol Cell Bio 17,293-307(2016),Armstrong,P Natl Acad Sci USA 100,6257-6262(2003))。因此，Δc在0h时等于0。

***假设细胞外离子浓度保持不变(Jentsch等，Nat Rev Mol Cell Bio17,293-307(2016),Armstrong,P Natl Acad Sci USA 100,6257-6262(2003))。

然而，细胞溶解不仅仅是一个物理过程；相反，它至少部分是由细胞焦亡介导的，也称为胱天蛋白酶-1依赖性细胞死亡(Labbe等，Prog Inflamm Res Ser,17-36(2011)，Miao等，Rev 243，206-214(2011),Schroder等,Cell,140,821(2010))。细胞焦亡是程序性坏死的一种形式，具有炎症体诱导、促炎细胞因子释放和胱天蛋白酶-1活化的特征(Man等，Immunol.Rev.277,61-75(2017))。活化的胱天蛋白酶-1促进gasdermin-D(GSDMD)的N端释放，其易位至质膜并穿孔，导致水流入(Liu,X.等.Nature 535,153-158(2016),Shi等,Nature 526,660-665(2015))。通过FAM-FLICA胱天蛋白酶-1染色，PSCNP处理的细胞具有显著增加的胱天蛋白酶-1活性。流式细胞术显示，在与PSCNP(160μg/mL，图3D)孵育4小时后，胱天蛋白酶-1的活性增加了76.4％。还评估了两种坏死抑制剂甘氨酸和Ac-YVAD-cmk肽的影响。虽然甘氨酸是一种通用的坏死抑制剂(Weinberg et al.,Cell.Mol.Life Sci.73,2285-2308(2016))，但Ac-YVAD-cmk选择性抑制胱天蛋白酶-1的激活(Zhang et al.,SciRep-Uk,6 24166(2016))。两种药物均能有效抑制细胞溶解，分别将LDH释放减少72.9％和60.9％(图3E、3O)。NLRP3炎症体诱导、GSDMD N-末端片段释放(图3K)和IL-1β分泌升高(图3L)也证实了细胞焦亡途径的活化。

通常，通过Toll样受体(TLR)或NOD样受体(NLR)在检测病原体感染时，会在免疫细胞中观察到细胞焦亡(Bergsbaken等，Microbiol.7,99-109(2009),Bortoluci和Medzhitov,Cell.Mol.Life Sci.67,1643-1651(2010))。PSCNP如何触发癌细胞中的胱天蛋白酶-1活化尚不清楚。一种可能性是PSCNP诱导的渗透压导致核内体/溶酶体破裂，导致组织蛋白酶B释放到细胞质中(Szabo和Csak，Journal of Hepatology 57,642-654(2012))。组织蛋白酶B诱导NLRP3炎症体的形成(Mirshafiee等，Acs Nano12,3836-3852(2018))，进而活化胱天蛋白酶-1。该模型得到Magic红色染色的支持，该染色在PSCNP处理的细胞中发现组织蛋白酶B的扩散分布模式(与未处理细胞中的点状分布相反)。此外，延时(time-relapsed)细胞成像记录了PSCNP处理细胞中LysoTracker阳性染色水平降低，这也表明核内体/溶酶体破裂。另一种可能性是胱天蛋白酶-1活化是由K⁺外流触发的。这是基于观察到，除了Na⁺和Cl^-，在与PSCNP孵育后细胞内K⁺水平也升高(图3M)，这可能是Na⁺/K⁺泵活性响应于增加的Na⁺浓度的结果。这将进一步加剧钾电荷分离，导致超极化的质膜，这得到了DiBAC₄染色结果的支持(图3N)。增强的钾梯度将促进K⁺流出，这是细胞焦亡的已知触发因素(Munoz-Planillo等，Immunity 38,1142-1153(2013)，Bergsbaken等，Nat Rev Microbiol7,99-109(2009))。值得注意的是，在常规细胞焦亡中不会发生线粒体破坏和细胞色素c释放(Jesenberger等，JExp Med 192,1035-1045(2000),Cervantes等,Cell Microbiol.10,41-52(2008))。这表明PSCNP治疗同时激活细胞凋亡和细胞焦亡途径(图4)：在高PSCNP剂量和早期时间点，细胞主要死于胱天蛋白酶-1依赖性细胞焦亡，而在低剂量和更长的时间点，由于累积氧化应激和DNA/脂质损伤，细胞死于胱天蛋白酶-3依赖性细胞凋亡。

实施例5：NaCl纳米颗粒对癌细胞与正常细胞的杀伤作用。

材料和方法

细胞内的钠含量

一组细胞系，包括4T1、HT29、A549、SGC7901、PC-3、U-87MG、B16-F10、RAW264.7、HPrECs和C18-4细胞，在75cm² Corning细胞培养瓶中37℃下湿润、含5％二氧化碳的环境下培养。当细胞达到85％汇合时收集细胞并使用血球计数细胞数。离心(1200rpm，5分钟)后，细胞沉淀用5mL不含Na⁺的HEPES缓冲液洗涤3次。最终的细胞沉淀悬浮在D.I.水中并通过探针超声均质化。使用Na⁺电极(HORIBA LAQUAtwin Na-11)测量细胞内钠浓度[Na⁺]_int。将结果归一化为细胞数以获得每个细胞系的细胞内钠含量([Na⁺]_int)。

纳米颗粒的细胞摄取

一组细胞系，包括T24、UMUC2、K1970和HPrEC，在6孔板中在37℃下在湿润的5％二氧化碳气氛中培养。200μg/ml的Rhod-PE标记的NaCl NP与每个细胞系孵育2小时。收集细胞以运行流式细胞术。

结果

还用一组其他细胞系检查了PSCNP的细胞毒性(图5A-5I)。正常细胞如HPrECs(人原代前列腺上皮细胞系)和C18-4(小鼠精原(spermatogonial)干细胞)的成活力在测试浓度范围内(3.25至320μg/mL，图5A-5I)受到的影响最小。作为比较，所有癌细胞都被PSCNP有效杀死，IC₅₀值范围从50到160μg/mL(图5A-5I)。这种选择性毒性很有趣。一个原因是快速增殖的细胞倾向于摄取更多的纳米颗粒(Chaves等，Int JNanomed 12,5511-5523(2017))。但这并不能解释为什么RAW264.7细胞(一种吞噬巨噬细胞系)也对PSCNP具有相对抗性(图5A-5I)。另一个可能的因素是癌细胞具有高细胞内钠浓度([Na⁺]_int)，这使得它们天生更容易受到渗透休克的影响。在70年代，Cone等提出升高的[Na⁺]_int和相对去极化的质膜是癌细胞的特征(Cone,Journal of theoretical biology 30,151-181(1971),Cone,Ann NY AcadSci 238,420-435(1974),Cone and Cone,Science 192,155-158(1976))。

后续元素分析研究证实了这一点(Cameron等，Cancer Res 40,1493-1500(1980))，一些报道称癌细胞中的[Na⁺]_int/[K⁺]_int比值可能是正常细胞的5倍高(Zsagy等，JCell Biol 90,769-777(1981))。实际上，所有测试的癌细胞都显示出比巨噬细胞和原代细胞更高的[Na⁺]_int(图5J)。K均值聚类清楚地揭示了癌细胞和原代细胞在细胞毒性方面的差异及其与细胞[Na⁺]_int的相关性。在癌细胞中，[Na⁺]_int和IC₅₀之间存在中等相关性，Pearson相关系数R²为0.31(图5J)。这些结果支持[Na⁺]_int作为癌细胞对PSCNP治疗敏感的重要因素。据信，癌细胞采用高[Na⁺]_int作为抗凋亡措施(凋亡的特征是细胞收缩)，这使得它们本质上容易受到PSCNP诱导的细胞坏死的影响。

对细胞摄取的流式细胞术研究发现，相对于包括正常尿路上皮细胞在内的正常上皮细胞，膀胱癌细胞对PSCNP的摄取显著升高(图2R)。

实施例6：NaCl纳米颗粒是癌症治疗剂。

材料和方法

体内治疗研究。

动物研究是根据乔治亚大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的协议进行的。将动物维持在无病原体条件下。PC-3肿瘤模型通过将50μLPBS中的2×10⁶个细胞皮下注射到5-6周龄雄性无胸腺裸鼠(Charles River)的右侧产生。按照与PC-3模型相同的方法在雌性无胸腺裸鼠(Charles River)中生成U-87MG肿瘤模型。B16F10肿瘤模型是通过将50μLPBS中的2×10⁵个细胞皮下注射到5-6周龄雌性C57BL/6小鼠(Charles River)的右侧来生成的。SCC VII肿瘤模型是通过将50μLPBS中的2×10⁵个细胞皮下注射到5-6周龄雌性C3H/HeN小鼠(Charles River)的右侧来生成的。UPPL-1541肿瘤模型是通过将50μL PBS中的1×10⁶个细胞皮下注射到5-6周龄雌性C57BL6小鼠(Charles River)的右侧来生成的。

对于治疗研究，携带PC-3肿瘤的小鼠被随机分为2组(每组n＝5)。当平均肿瘤体积为约100mm³时，在第0、2和4天瘤内注射PSCNP(9mg/mL，50μL)。对于对照，注射相同体积的盐水。对于PSCNP和盐水，在肿瘤的五个部位进行注射以确保良好的覆盖。每两天检查一次肿瘤大小和体重。用卡尺二维测量肿瘤，肿瘤体积估算为(长)×(宽)²/2。U-87MG肿瘤模型采用与PC-3肿瘤模型相同的治疗方法。B16F10、SCC VII肿瘤模型在平均肿瘤体积约为40mm³时用PSCNP治疗，而UPPL-1541肿瘤模型在100mm³时治疗。PSCNP(27mg/mL,50μL)在第0天瘤内注射，同时注射相同体积的盐水作为对照组。肿瘤大小和体重测量与PC-3模型相同。在PC-3肿瘤治疗实验结束时，进行尸检。解剖肿瘤进行形态学和组织学检查。特别是，将这些组织切成4μm切片用于H&E、TUNEL染色(原位凋亡检测试剂盒，ab206386，Abcam，美国)和胱天蛋白酶-1染色。胱天蛋白酶-1IHC染色试剂盒购自美国Abcam。该试剂盒包括抗胱天蛋白酶-1抗体(ab1872)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab6721)、兔特异性HRP/DAB(ABC)检测IHC试剂盒(ab64261)和甲基绿派洛宁(RNA DNA染色)(ab150676)。所有染色均遵循制造商方案。

结果

PSCNP作为体内肿瘤消融方法进行了测试。与常规化疗不同，PSCNP的毒性是暂时的：它们对癌细胞诱导快速和致命的损伤，然后还原为完全良性的NaCl盐，不会引起慢性或全身毒性。为了研究，建立了用PC3细胞建立的皮下肿瘤模型。将PC-3细胞引入雄性裸鼠(n＝5)的右侧。当肿瘤大小达到100mm³时，每隔一天将PSCNP(50μL,9mg/mL)肿瘤内(i.t.)注射到动物体内，共注射3次。对于对照，NaCl盐水(9mg/mL)是以相同的NaCl剂量肿瘤内注射。相对于对照，PSCNP治疗在第16天抑制了66％的肿瘤生长(图5K、5M)。死后苏木精/伊红(H&E)染色在肿瘤组织中显示出大面积的核收缩和片段化。此外，TUNEL和抗胱天蛋白酶-1测定均在PSCNP治疗的肿瘤中发现广泛的阳性染色，表明细胞通过凋亡和细胞焦亡而死亡，这与体外观察结果一致。同时，在整个研究过程中没有检测到体重下降(图5L)，并且在主要器官中没有发现毒性迹象。在其他肿瘤模型中观察到类似的治疗结果，包括U87MG(人胶质母细胞瘤)、B16F10(小鼠黑素瘤)、SCC VII(小鼠头颈部鳞状细胞癌)和UPPL-1541(小鼠膀胱癌)(图5N-5U)。

实施例7：NaCl纳米颗粒诱导ATP、HMGB-1的释放和CRT的表达。

材料和方法

流式细胞术评估中细胞表面的CRT表达。

流式细胞术评估中细胞表面的CRT表达。将T24、UMUC2、UPPL-1541、BBN963、B16F10和SCC VII细胞以每孔1×10⁶接种到6孔板中。孵育过夜后，将细胞用NaCl颗粒(PSCNP)(160μg/mL)处理2小时。PBS处理的细胞用作对照。所有细胞均通过细胞铲收集，并与Alexa

647偶联的抗CRT抗体(ab196159，1/500，Abcam)在4℃下孵育30分钟。在洗涤和在流式细胞仪上评估之前，将细胞在含有50μg/mL碘化丙啶的500μL PBS中孵育。与PBS处理的对照细胞相比，数据以柱状图表示。

ATP和HMGB-1释放。

将细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度接种于96孔板中并孵育过夜。然后用分散在PBS中的PSCNP以13.2-320μg/mL的剂量范围处理细胞1、2、4小时和24小时。孵育1-4小时后收集细胞上清液，并按照制造商的方案在ATP 1step发光检测系统、100mL ATP检测试剂盒(PerkinElmer,US)中进行测试。创建了培养基中ATP的10倍系列稀释系列(1μM至1pM)以建立标准曲线并计算上清液中ATP的绝对量。通过酶标仪(Synergy Mx，BioTeK)测量发光。所有测量均一式六份进行。根据制造商的说明，在培养24小时后收集细胞上清液并在ELISA试剂盒(IBL International GmbH)中进行测试。NaCl盐和PBS用作对照。

结果

一个有趣的观察结果是，总体而言，同基因肿瘤模型(UPPL-1541、B16F10和SCCVII)的治疗结果比异种移植肿瘤模型(PC-3、U87MG)好得多。以SCC VII肿瘤为例，PSCNP治疗后20％的小鼠变得无肿瘤并存活超过8个月(图5W)。这些结果表明，在免疫活性小鼠中，PSCNP不仅可以杀死癌细胞，还可以刺激抗癌免疫。坏死是一种高度免疫原性过程(Inoue和Tani,Cell Death Differ.,21,39(2014),Zhang等,J.Han,Cell Res.,28,9(2018))。

此外，据观察，死于PSCNP的癌细胞显示出钙网蛋白(CRT)的表面呈递增加(图6E和6F)，以及三磷酸腺苷(ATP)的分泌增加(图6A)和高迁移率族蛋白1(HMGB-1)的分泌增加(图6B)，所有这些都是免疫原性细胞死亡或ICD的认可的标志(Kroemer,et al.,Annu.Rev.Immunol.,31,51(2013))。

图6E和6F是垂死B16F10和SCC VII细胞的CRT呈递的柱状图。用160μg mL-1PSCNP处理细胞2小时。图6A和6B显示了B16F10和SCC VII细胞经PSCNP(13.2–320μg mL-1；*p<0.05)处理1、2和4小时后的时间和剂量依赖性ATP释放。

NaCl NP处理在膀胱癌细胞系中诱导显著增加的ATP分泌(图12A-12D)和在膀胱癌细胞系(图12E)和B16F10(图6E)中在垂死癌细胞中诱导增加的CRT呈递(图12E、6E)。

图6C和6D显示了在PSCNP处理(13.2–320μg mL-1)后24小时从B16F10和SCC VII细胞中释放的HMGB-1。NaCl盐和PBS被作为对照研究。

非常高浓度处的HMGB-1分泌减少是由于24小时时大量细胞死亡。(*与PBS处理的对照细胞相比，p<0.05)从之前的研究中注意到，CRT、HMGB-1和ATP可以与树突细胞(DC)上的模式识别受体(PRR)(例如CD91(Pawaria和Binder，Nat.Commun.2,521(2011),Berwin,etal.,EMBO J.22,6127(2003),Gardner and Ruffell,Trends Immunol.,37,855(2016))和用于CRT、RAGE的SR-A(Berwin,et al.,EMBO J.22,6127(2003),Hu,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,392,329(2010))、用于HMGB-1的TLR2/4/9(Inoue andTani,Cell Death Differ.,21,39(2014))和用于ATP的P2RX7/P2RY2(Inoue and Tani,Cell Death Differ.,21,39(2014),Gardner and Ruffell,Trends Immunol.,37,855(2016))结合。这会促进DC迁移、成熟和抗原向T细胞的交叉呈递，进而增强针对肿瘤的细胞免疫(Gardner和Ruffell,Trends Immunol.,37,855(2016),McDonnell,et al.,Clin.Dev.Immunol.,2010,539519(2010))。

实施例8：NaCl纳米颗粒诱导对癌症的疫苗接种应答。

材料和方法

诱导免疫应答的体内疫苗接种方法。

动物研究是根据乔治亚大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的协议进行的。疫苗接种计划的时间表在图7A和图7C中描述。B16F10细胞暴露于PBS、320μg/mL NaClNP 6小时，以及F/T方法用于诱导ICD。将垂死的2×10⁵B16F10细胞注射到5-6周龄雌性C57BL6小鼠(Charles River)(n＝5)的右侧。注射后6天，动物在对侧(左)侧接受2×10⁵个活B16F10细胞的皮下注射。与B16F10细胞类似，SCC VII细胞暴露于PBS和320μg/mL NaClNP 24小时以诱导IDC生物标志物释放。将垂死的2×10⁵SCC细胞两次注射到5-6周龄雌性C3H/HeN小鼠(Charles River)(n＝5)的右侧，间隔6天。注射后12天，动物在对侧(左)侧接受2×10⁵的活SCC细胞皮下注射。每2-3天用数显卡尺测量肿瘤大小。根据公式(长)×(宽)²/2计算肿瘤体积。对于B16F10肿瘤模型在第22天和对于SCC VII肿瘤模型在第24天处死动物。收集肿瘤用于流式细胞术分析。

SCC VII双侧肿瘤模型中的原位疫苗接种和癌症治疗

疫苗接种计划的时间表如图8A和图9A中所述。将细胞与Matrigel混合以进行肿瘤接种。SCC VII双侧肿瘤模型是通过向5-6周龄雌性C3H/HeN小鼠(Charles River)(n＝5)右侧皮下注射1×10⁶个SCC细胞作为原发肿瘤，在左侧皮下注射0.5×10⁶个SCC作为继发性肿瘤创建的。注射后12天，动物接受一次NaCl NP治疗。NP组中的每只小鼠注射在50μL盐水中的1.35mg NaCl NP。盐水处理组用作阴性对照。携带肿瘤的小鼠W/O治疗用作未治疗的对照。根据公式(长)×(宽)²/2计算肿瘤体积。在第12天，在对动物实施安乐死后收集原发性和继发性肿瘤、脾脏、PBMC和TDLN，以进行流式细胞术研究。

流式细胞术分析

将用于单细胞分析的肿瘤块用剪刀切成小块，并在含有0.5mg/mL I型胶原酶(Worthington Biochemical Corporation)的DMEM中在37℃下消化1小时。消化的组织通过70μM细胞筛轻轻过筛两次。根据制造商的说明，通过Ack裂解缓冲液(Gibco)裂解红细胞。将单细胞悬液洗涤两次并重悬于染色缓冲液中。在细胞计数和等分之后，将悬浮液与FcBlock(TruStain fcXTM抗小鼠CD16/32，克隆93，BioLegend)孵育20分钟以避免非特异性结合。然后通过使用荧光团偶联抗体的各种组合在4℃下染色40分钟。以下抗小鼠抗体购自BDBiosciences：CD45-APC-Cy7(#557659,1/100),CD45-V450(#560501),CD4-BV605(#563151,1/100),CD8α-PE(#561095,1/100),CD8α-FITC(#563030,1/100),CD11c-V450(#560521,1/100),CD86-BV605(#563055,1/100),CD80-PerCP-Cy5.5(#560526,1/100),CD11b-PE(#553311,1/100)。Foxp3-PE(#60-5773,1/100),活/死细胞测定Ghost Red 710(#13-0871,1/100)购自TONBO biosciences。IFN-γ-APC(#505810，1/100)、CD25-PerCP-Cy5.5(#102030，1/100)和CD3-APC-Cy7(#100222，1/100)购自BioLegend。多参数染色用于鉴定以下感兴趣的群体：(a)CD8+ T细胞(CD45+CD3+CD8+CD25+),(b)Tregs(CD45+CD3+CD4+Foxp3+),(c)DCs(CD45+CD11c+),(d)CD86+DCs(CD45+CD11c+CD86+),(e)CD80+CD86+DCs,(f)CCR7+DCs(CD45+CD11c+CD80+CD86+CCR7+),(f)CD8+DCs(CD45+CD11c+CD8+CD11b-)。对于细胞内Foxp3和IFN-γ染色，使用Foxp3/转录因子染色缓冲液套装(eBioscience)进一步固定和透化细胞。洗涤后，将细胞用于流式细胞术分析(CytoFLEX，Backman Coulter)。数据由FlowJo 10.0处理。基于前向和侧向散射排除双峰。基于Ghost Red 710染色的阴性信号排除死细胞。

结果

B16F10细胞通过PSCNP或冻融(F/Z)处理(疫苗制备中的常用方法)杀死，并将死细胞皮下接种到健康的C57BL/6小鼠。在第7天，将活的B16F10细胞注射到动物的对侧侧面。PSCNP治疗与盐水治疗的小鼠相比，并且常规F/T方法如图7B所示。类似地，PSCNP治疗在抗SCC肿瘤疫苗接种中比未接种疫苗的小鼠显示出超过96％的肿瘤生长抑制，并增强了T细胞应答，包括CD8+T细胞增加1.07倍，Treg减少0.68倍，CD8+ T细胞/Treg比值增加1.57倍，DC增加1.34倍，活化的CD86+DC增加1.11倍，以及抗原呈递CD8+DC增加1.29倍(图7D，表3)。

表3：在图7C-7D中的研究后，对动物实施安乐死并收集肿瘤用于流式细胞术分析。检查了CD8+ T细胞、Treg(CD4+Foxp3+ T细胞)、DC、CD86+DC和CD8+DC的相对频率，以及CD8+/Treg比值。

表3中的结果表明在NaCl NP疫苗接种后强烈的T细胞应答。使用流式细胞术收集数据以在FlowJo 10.0中确定CD8+ T细胞、Treg(CD4+Foxp3+ T细胞)、CD8/Treg比值、CD86+DC和CD8+DC，并基于对照组归一化，对于每个子集被视为1。接种了PSCNP杀死的癌细胞的小鼠对随后的活癌细胞攻击表现出更大的抵抗力，所有动物都保持无肿瘤超过2周(图7B)。在C3H小鼠中用SCC VII细胞中观察到类似的结果(图7D)。

在SCC双侧肿瘤模型中的另一项研究表明，与盐水组相比，PSCNP治疗减缓了48％的继发性肿瘤生长(图8B)。PSCNP通过上调CD8+ T细胞、减少Treg、增加CD8+/Treg比值和激活DC来刺激免疫应答。具体而言，PSCNP原位接种对于所有收集的组织使CD8+T细胞增加超过1.13倍，活化的CD8+IFN-γT细胞增加超过1.02倍，并将肿瘤和脾脏内的Treg减少超过0.65倍，导致CD8+/Treg比值在继发性肿瘤中增加16.92倍。对于DC，PSCNP在癌细胞中的杀伤作用诱导原发肿瘤和TDLN中DC增加超过1.6倍，增强了几乎所有收集组织的DC共刺激(CD86+DC和CD80+CD86+DC)并刺激DC归巢至TDLN在肿瘤和脾脏中的变化超过1.3倍。总的来说，NaCl NP对原发性肿瘤的治疗可以作为一种原位疫苗来杀死癌细胞并释放DMAP以招募DC。DC摄取垂死的肿瘤细胞，归巢至TDLN，通过交叉呈递将表面上的新抗原呈递到T细胞。因此结果表明活化的CD8+T细胞可以进一步浸润到肿瘤部位并杀死继发性肿瘤中的癌细胞。

表4显示了在治疗后第12天，与盐水治疗组相比，不同组织中T淋巴细胞和DC亚群的倍数变化。对动物实施安乐死后收集原发性和继发性肿瘤、脾脏、PBMC和TDL，以进行流式细胞术研究。数据通过FlowJo10.0分析并基于盐水治疗组归一化，每个子集被视为1。

PSCNP或盐水被瘤内注射到原发肿瘤中，但对侧肿瘤(继发肿瘤)未治疗(图9A)。结果显示，PSCNP组中继发性肿瘤的生长速度远低于盐水对照组，第12天的肿瘤抑制率为53％(图9B-9D)。同时，在整个研究过程中体重没有下降(图9E-9F)。在另一项研究中，在注射颗粒/盐水后第3、7和12天对动物实施安乐死，收集肿瘤、脾脏、血液和肿瘤引流淋巴结(TDLN)，并通过流式细胞术分析白细胞曲线。相对于盐水对照，PSCNP注射导致CD8+T细胞频率增加，这在所有三个时间点的脾脏样品中最为显著(图10A-10E)。特别是，第7天原发肿瘤和血液中的效应T细胞(CD8+IFN-γ+)群体增加(图10F-10J)。在第7天和第12天，原发性肿瘤、脾脏、TDLN和血液中的CD8+/Treg(CD4+Foxp3+)比值也增加(图10P-10T)。在第7天和第12天，血液B细胞(B220+CD19+)频率相对于盐水对照也升高，表明体液免疫增强的可能性(图10W)。增强的适应性免疫应答背后的一个因素是ICD促进的DC浸润和成熟(Gardner和Ruffell，Trends Immunol.,37,855(2016))。在第7天和第12天，在原发性肿瘤中观察到活化DC(CD80+CD86+)和TDLN归巢DC(CD80+CD86+CCR7+)数量增加(图10U-10V)。总的来说，结果表明PSCNP杀死癌细胞并将垂死的癌细胞转化为原位疫苗。值得注意的是，该治疗并未导致继发性肿瘤中CD8/Treg比值的显著增加。

实施例9：NaCl纳米颗粒与αPD-1结合用于抑制肿瘤。

材料和方法

BBN双侧肿瘤模型是通过向5-6周龄雌性C57BL6小鼠右侧皮下注射2×10⁶BBN963细胞作为原发性肿瘤，在左侧皮下注射0.7×10⁶SCC作为继发性肿瘤创建的。注射后21天，动物每3天接受3次NaCl NP治疗。NP组的每只小鼠注射在50μL盐水中的3.25mg NaCl NP。盐水治疗组(50μL)用作阴性对照。PSCNP(瘤内)和抗PD-1抗体共同施用用于联合治疗。根据公式(长)×(宽)²/2计算肿瘤体积。

结果

联合疗法显示出比单独的PSCNP或αPD-1更有效的肿瘤抑制(图11A-11B)。图11A是肿瘤生长曲线，显示PSCNP+αPD-1诱导最有效的肿瘤生长抑制，77.8％的动物在第65天保持无肿瘤。图11B是体重变化图。在整个实验过程中没有观察到体重下降或全身毒性迹象。

总的来说，实施例7和8中的结果表明NaCl NP在体外和体内诱导B16F10和SCC VII头颈癌细胞系中的免疫原性细胞死亡(ICD)(图6A-6D、7A-7D，表3)。与NaCl盐和PBS对照的影响可忽略不计相比，NaCl NP治疗会在B16F10和SCC VII细胞系中诱导ICD生物标志物(例如ATP和HMGB-1)的释放。通过注射NaCl NP治疗的垂死B16F10细胞的抗B16F10疫苗接种方法比传统的冻融(F/T)方法引起更强的ICD反应。抗SCC VII研究中的类似方法也显示了由NaCl NP治疗的垂死SCC VII细胞诱导的ICD效应。与未接种组相比，NaCl NP接种刺激了强烈的T细胞应答，包括Treg细胞(CD4+Foxp3+ T细胞)减少、CD8+T细胞和CD8+/Treg比值增加。与未接种组相比，NaCl NP疫苗接种还促进DC活化，例如增加CD86+DC子集中的CD86共刺激物表达和增强抗原呈递子集CD8+DC。

在SCC VII双侧肿瘤模型(图8A-8B，表4)中NaCl NP的另一项原位疫苗接种和抗肿瘤治疗研究显示了在未治疗的继发性肿瘤中的强烈免疫应答以便清除癌细胞。NaCl NP治疗原发肿瘤可作为原位疫苗杀死SCC癌细胞并释放损伤相关分子模式(DMAP)，例如ATP和HMGB-1，以募集抗原呈递细胞(APC)，通常为DC。APC摄取垂死的肿瘤细胞，归巢至肿瘤引流淋巴结(TDLN)，通过交叉呈递将表面上的新抗原呈递到T细胞上。活化的CD8+ T细胞进一步浸润到肿瘤部位并杀死继发性肿瘤中的癌细胞。与盐水组和未治疗组相比，SCC VII双侧肿瘤模型中的NaCl NP治疗显示出对继发性肿瘤生长的显著抑制。NaCl NP处理诱导强烈的DC和T细胞应答，包括Treg细胞(CD4+Foxp3+ T细胞)减少、CD8+T细胞增加、CD8+/Treg比值和活化的DC增加。

实施例9显示组合疗法比单独PSCNP或αPD-1更有效地抑制肿瘤(图11A-11B)。

总的来说，本文呈现的结果证明了基于纳米颗粒的方法来改变癌细胞的细胞内渗透压并杀死它们。这种机制可能适用于其他基于电解质的纳米颗粒，如KCl和CaCl₂。与一次穿梭一个离子的分子离子载体不同(Busschaert等，Nature Chemistry 9,667-675(2017))，PSCNP将数百万个钠离子和氯离子转移到细胞中。这压倒了细胞保护机制，不仅诱导细胞凋亡，还诱导高免疫原性坏死，从而增强抗癌免疫力。Menger等筛选了1040种不同的FDA批准的药物，发现强心苷是特别有效的ICD诱导剂(Menger等，Sci.Transl.Med.,4,143ra99(2012))。强心苷类似于PSCNP，通过抑制细胞钠钾ATP酶泵和增加[Na⁺]_int起作用(Schoner等，Am.J.Physiol.：Cell Physiol.,293,C509(2007))。

ICD特性增加了PSCNP作为癌症治疗剂的潜力。虽然无机纳米颗粒作为成像探针(Kim等，ACS Cent.Sci.,4,324(2018))、递送载体(Tonga等，Curr.Opin.ColloidInterface Sci.,19,49(2014)或辐射换能器(Mi,et al.,Cancer Nanotechnol.,7,11(2016))已被广泛研究，但很少有人将其用于临床。主要关注的是它们的毒性、缓慢清除率以及对宿主的不可预测的长期影响(Chen,et al.,Nat.Rev.Mater.,2,17024(2017),Smolkova,et al.,Food Chem.Toxicol.,109,780(2017),De Matteis,et al.,Toxics,5,29(2017))。

尽管对无机纳米颗粒进行了广泛的研究，但对由电解质制成的纳米颗粒的关注有限。本文公开的PSCNP由良性材料制成，它们的毒性完全取决于纳米颗粒的形式。假设是电解质制成的纳米颗粒会迅速溶解在水溶液中，并且其行为与其组成盐类(constituentsalt)没有区别。这些研究表明并非如此。这一发现引入了一种细胞杀伤机制，并为基于纳米颗粒的疗法开辟了新的视角。

考虑到在水溶液中的半衰期相对较短，PSCNP局部消融而不是全身治疗可能是优选的。该治疗将导致立即的、免疫原性癌细胞死亡。治疗后，纳米颗粒被还原为盐，与体液系统融合，不会造成全身性或累积性毒性。事实上，没有观察到高剂量瘤内注射的PSCNP的全身性毒性的迹象(如上文更详细的讨论)。

由于毒性是癌细胞选择性和暂时性的，因此PSCNP在临床转化中作为安全的焦点治疗方式具有巨大的潜力。例如，它们可用于术前辅助治疗或作为无法手术的肿瘤患者的微创消融方法。特定靶标癌症包括膀胱癌、前列腺癌、头颈癌和肝癌。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文引用的出版物和引用的材料通过引用具体纳入。

本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的特定实施例的许多等同物。此类等同物旨在包含在以下权利要求中。

Claims (60)

1.纳米颗粒，其由碱金属或碱土金属和卤化物形成。

2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述碱金属是锂、钠、钾、铷或铯，并且所述卤化物是氟化物、氯化物、溴化物或碘化物。

3.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述碱土金属是镁或钙，并且所述卤化物是氟化物、氯化物、溴化物或碘化物。

4.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其包括氯化钠、氟化钠、溴化钠、碘化钠、氯化钾或氯化钙。

5.根据权利要求4所述的纳米颗粒，其包括氯化钠。

6.根据权利要求4所述的纳米颗粒，其包括氯化钾或氯化钙。

7.根据权利要求5所述的纳米颗粒，其中钠和氯化物的摩尔比为约1:1。

8.根据权利要求7所述的纳米颗粒，其中所述颗粒是立方体的。

9.根据权利要求5所述的纳米颗粒，其还包括亲水性涂层或外层。

10.根据权利要求9所述的纳米颗粒，其中所述层或涂层包括两亲嵌段共聚物、肽、蛋白质、脂质或其组合。

11.根据权利要求10所述的纳米颗粒，其中所述层或涂层包括脂质，例如磷脂。

12.根据权利要求11所述的纳米颗粒，其中所述磷脂是磷酸乙醇胺。

13.根据权利要求9所述的纳米颗粒，其中所述层或涂层包括PEG，例如PEG胺。

14.根据权利要求13所述的纳米颗粒，其中所述层或涂层包括脂质-PEG缀合物，例如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)PEG(2000)胺，或由其组成。

15.药物组合物，其包含多个根据权利要求1-14中任一项所述的纳米颗粒。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒的平均流体动力学尺寸在约10nm和约500nm之间，或在约25nm和约300nm之间，或在约50nm和150nm之间，在约75nm和约125nm之间，±5％、10％，15％，20％或25％。

17.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒是单分散的。

18.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒通过微乳液反应形成。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述微乳液反应包括将氯化钼(V)添加到包含溶剂、表面活性剂和油酸钠且任选地不含水的溶剂溶液中。

20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述溶剂是己烷和乙醇的混合物。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述表面活性剂是油胺或油酸。

22.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒包含亲水性涂层或外层，所述亲水性涂层或外层任选地通过将所述纳米颗粒和脂质-PEG缀合物一起在溶剂中混合并去除溶剂而形成。

23.根据权利要求15所述的药物组合物，其包含药学上可接受的载体。

24.根据权利要求15所述的药物组合物，其包含治疗有效量的纳米颗粒。

25.根据权利要求15所述的药物组合物，其包含有效量的纳米颗粒，以在肿瘤细胞和/或癌细胞中降低线粒体耗氧率(OCR)、降低线粒体呼吸速率(MSR)、降低细胞内ATP水平、增加ROS水平、增加JNK、ERK和/或p38磷酸化水平、增加脂质过氧化、增加DNA损伤、释放细胞色素c、增加胱天蛋白酶-3活性，增加胱天蛋白酶-1活性，增加细胞溶胀和/或气泡形成、诱导细胞破裂和/或完全渗透溶解，增加NLRP3炎症体诱导，增加GSDMD N末端片段释放，增加IL-1β分泌，增加细胞内K⁺水平，或其组合。

26.根据权利要求15所述的药物组合物，其包含有效量的纳米颗粒以增加肿瘤和/或癌细胞的细胞凋亡、坏死和/或细胞焦亡。

27.根据权利要求15所述的药物组合物，其中相对于非肿瘤和/或非癌细胞，在肿瘤细胞和/或癌细胞中线粒体耗氧率(OCR)，降低线粒体呼吸速率(MSR)，降低细胞内ATP水平，增加ROS水平，增加JNK、ERK和/或p38磷酸化水平，增加脂质过氧化，增加DNA损伤，释放细胞色素c，增加胱天蛋白酶-3活性，增加胱天蛋白酶-1活性，增加细胞溶胀和/或气泡形成，诱导细胞破裂和/或完全渗透溶解，增加NLRP3炎症体诱导，增加GSDMD N-末端片段释放，增加IL-1β分泌，增加细胞内K⁺水平，增加细胞凋亡，增加坏死，增加细胞焦亡或其任何组合被更大程度地改变或影响。

28.根据权利要求15所述的药物组合物，其剂型适合于施用约0.1mg/kg至约1,000mg/kg，或约1mg/kg至约100mg/kg，或约5mg/kg至约50mg/kg至有需要的受试者。

29.根据权利要求28所述的药物组合物，其包含一种或多种另外的活性剂。

30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述一种或多种另外的活性剂包括免疫检查点抑制剂、化学治疗剂或其组合。

31.根据权利要求30所述的药物组合物，其包含选自PD-1拮抗剂、CTLA4拮抗剂及其组合的免疫检查点抑制剂。

32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述PD-1拮抗剂和/或CTLA拮抗剂是抗体或其抗原结合片段。

33.制备抗原的方法，其包括使癌细胞与有效量的根据权利要求15所述的药物组合物接触以诱导细胞死亡。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述纳米颗粒有效增加一种或多种损伤相关分子模式(DAMP)分子的表达或分泌。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述DAMP分子包括钙网蛋白(CRT)、三磷酸腺苷(ATP)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)及其组合。

36.根据权利要求33所述的方法，其中所述接触发生在体外或离体。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述癌细胞是从需要癌症治疗或预防的受试者中分离的。

38.抗原，其包括根据权利要求36所述的方法形成的垂死或死细胞，或其溶解产物、提取物、馏分、分离物或分泌因子的集合。

39.为受试者接种疫苗的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求33所述的抗原以增加或诱导针对抗原的免疫应答，其中接触发生在体内，在向受试者施用药物组合物之后。

40.为受试者接种疫苗的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求38所述的抗原以增加或诱导对抗原的免疫应答。

41.根据权利要求40所述的方法，其进一步包括向受试者施用佐剂。

42.根据权利要求所述41所述的方法，其中所述抗原和佐剂一起施用。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述抗原和佐剂是相同或不同混合物的一部分。

44.根据权利要求41所述的方法，其中所述所述抗原和佐剂分开施用。

45.根据权利要求40所述的方法，其中所述受试者患有癌症。

46.治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用根据权利要求15所述的药物组合物。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述药物组合物在所述受试者中诱导针对癌症的免疫应答。

48.根据权利要求46所述的方法，其中所述受试者具有骨骼、膀胱、脑、乳房、宫颈、结肠直肠、019-食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮肤、胃或子宫癌症。

49.根据权利要求46所述的方法，其中施用是注射或输注。

50.根据权利要求46所述的方法，其中施用是局部施用至需要治疗的部位。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述部位是肿瘤。

52.根据权利要求46所述的方法，其中所述施用是全身性的。

53.根据权利要求46所述的方法，进一步包括施用一种或多种另外的活性剂。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述一种或多种另外的活性剂包括免疫检查点抑制剂、化学治疗剂或其组合。

55.根据权利要求54所述的方法，其包括选自PD-1拮抗剂、CTLA4拮抗剂及其组合的免疫检查点抑制剂。

56.根据权利要求55所述的方法，其中PD-1拮抗剂和/或CTLA拮抗剂是抗体或其抗原结合片段。

57.根据权利要求54所述的方法，其中在不同时间向受试者施用所述颗粒和所述另外的活性剂。

58.根据权利要求54所述的方法，其中同时向受试者施用所述颗粒和所述另外的活性剂。

59.根据权利要求54所述的方法，其中所述颗粒和所述另外的活性剂形成相同药物组合物的一部分。

60.根据权利要求46所述的方法，其中通过膀胱灌注向受试者施用所述颗粒，任选地其中所述受试者患有膀胱癌。

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