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CN113365640A - 引导肌萎缩侧索硬化症的治疗性干预的神经丝蛋白 - Google Patents

引导肌萎缩侧索硬化症的治疗性干预的神经丝蛋白 Download PDF

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CN113365640A
CN113365640A CN201980080522.8A CN201980080522A CN113365640A CN 113365640 A CN113365640 A CN 113365640A CN 201980080522 A CN201980080522 A CN 201980080522A CN 113365640 A CN113365640 A CN 113365640A
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CN201980080522.8A
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T.A.弗古森
D.L.格雷厄姆
S.S-W.韩
A.R.V.麦坎贝尔
G.斯鲁贝克托马西
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Biogan Ma Co
Biogen Inc
Biogen MA Inc
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Biogan Ma Co
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Abstract

一方面，本发明提供了减轻肌萎缩侧索硬化症患者的症状的方法，所述方法包括施用对患者有效的有效治疗剂，所述有效治疗剂当向患者施用时导致患者的生物样品中的神经丝蛋白水平低于未施用所述治疗剂的肌萎缩侧索硬化症患者的神经丝蛋白水平。在一些实施方案中，患者当前正在被施用或以前曾被施用过无效治疗剂或不同于有效治疗剂的治疗剂。

Description

引导肌萎缩侧索硬化症的治疗性干预的神经丝蛋白
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年12月6日提交的美国临时申请第62/776,253号、2019年4月30日提交的美国临时申请第62/840,431号、2019年5月2日提交的美国临时申请第62/842,063号的优先权。每一个前述申请的内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
本发明涉及生物学和医学领域，具体而言涉及肌萎缩侧索硬化症(ALS)领域。ALS(也称为运动神经元疾病(MND)或Lou Gehrig氏病)是进行性神经变性疾病，其影响大脑和脊髓中的神经细胞。ALS中受影响的神经细胞主要是负责自主肌肉运动(诸如咀嚼、行走和说话)的神经细胞。肌萎缩侧索硬化症(ALS)是由运动途径中神经元的丧失和功能障碍引起的，并导致严重的无力、僵硬，并最终在3-5年内死亡。
ALS有两种不同的类型，散发性类型和家族性类型。散发性ALS是美国最常见的疾病形式，占所有病例的90％至95％。其可能会影响任何地方的任何人。在美国，家族性ALS(FALS)占所有病例的5％至10％。家族性ALS意味着该疾病是遗传性的。在这些家庭中，每个后代都有50％的机会遗传基因突变并可能患上该疾病。法国神经病学家Jean-MartinCharcot于1869年发现了该疾病。
尚无已知的治愈ALS的方法，但也有一些减轻ALS的症状的治疗剂，包括利鲁唑(以Rilutek销售的)、依达拉奉(以Radicava销售的)。其它疗法，诸如巴氯芬和地西泮，可用于控制由ALS引起的痉挛，而苯海索(trihexyphenidyl)和格隆溴铵可用于帮助吞咽唾液困难的ALS患者。
然而，并非所有治疗剂都能减轻所有ALS患者的症状，并且目前尚无已知的治愈ALS的方法。
因此，仍然需要鉴定减轻患者的ALS症状的新疗法。
发明内容
在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定治疗剂对该患者是否有效并且因此将减轻ALS的一种或多种症状并减慢该患者的失能进展的方法。在一些实施方案中，本发明提供了早期鉴定严重ALS疾病，从而尽快开始适当的治疗的方法。在一些实施方案中，本发明提供了针对特定使用背景的临床相关的割点(cutpoint)。在一些实施方案中，本发明提供了确定ALS患者是否对所施用的治疗剂有反应(即，该治疗剂对该患者是否有效)的方法，以及用会减轻该患者的症状的治疗剂治疗ALS患者的方法。
因此，在第一方面，本发明提供了用于减轻ALS患者的症状的方法，所述方法包括施用有效治疗剂，所述有效治疗剂对所述患者是有效的，当向所述患者施用时，导致所述患者的生物样品(例如，血液、血清、血浆或脑脊液(CSF))中的神经丝蛋白的水平低于(例如，低至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)未施用所述有效治疗剂的ALS患者的神经丝蛋白水平。在一些实施方案中，患者当前正在被施用或以前曾被施用过(a)无效治疗剂或(b)不同于有效治疗剂的治疗剂。
另一方面，本发明提供了用于确定向ALS患者施用的治疗剂是否对该患者有效的方法，所述方法包括从施用了所述治疗剂的所述患者获得或已经获得了生物样品(例如，血液、血清、血浆或脑脊液(CSF))；以及测量或已经测量了所述患者的生物样品(例如，血液、血清、血浆或脑脊液(CSF))中的神经丝蛋白水平以获得治疗后水平，其中治疗后水平低于(例如，低至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)未施用所述治疗剂的ALS患者的神经丝蛋白水平将所述治疗剂鉴定为是对所述患者有效的。在一些实施方案中，患者当前正在被施用或以前曾被施用过(a)无效治疗剂或(b)不同于有效治疗剂的治疗剂。
另一方面，本发明提供了用有效治疗剂治疗ALS患者的方法，所述方法包括：(i)通过以下步骤确定候选治疗剂是否可以减轻所述患者的ALS的症状：(a)在施用所述候选治疗剂之后从所述患者获得或已经获得了生物样品(例如，血液、血清、血浆或脑脊液(CSF))；以及(b)测量或已经测量了所述患者的生物样品(例如，血液、血清、血浆或脑脊液(CSF))中的神经丝蛋白水平以获得治疗后水平；以及如果所述治疗后水平低于(例如，低至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)未施用所述候选治疗剂的ALS患者的神经丝蛋白水平，则所述候选治疗剂是有效的治疗剂，以及(ii)向所述患者施用所述有效治疗剂，其中所述有效治疗剂将减轻ALS患者的ALS的症状。在一些实施方案中，患者当前正在被施用或以前曾被施用过(a)无效治疗剂或(b)不同于候选治疗剂的治疗剂。
另一方面，本发明提供了用于鉴定将减轻ALS患者的ALS症状的有效治疗剂的方法，所述方法包括向所述患者施用候选治疗剂，以及在向所述患者施用所述候选治疗剂至少5周(例如，至少5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周，或至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11周或12个月，或至少1年、2年、3年或更长时间)后测量被治疗的患者的生物样品(例如，血液、血清、血浆或脑脊液(CSF))中的神经丝蛋白的水平，以获得治疗后水平，其中所述治疗后水平低于(例如，低至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)未施用所述候选治疗剂的ALS患者的神经丝蛋白水平将所述候选治疗剂鉴定为可减轻所述患者的ALS症状的有效治疗剂。在一些实施方案中，患者当前正在被施用或以前曾被施用过过(a)无效治疗剂或(b)不同于所述候选治疗剂的治疗剂。
在各种实施方案中，有效治疗剂的施用减慢了患者的ALS疾病的进展。
在另一方面，本发明提供了治疗有此需要的人受试者的肌萎缩侧索硬化症的方法，所述方法包括：测量从所述人受试者获得的第一生物样品中的神经丝蛋白水平；向所述人受试者施用一剂或多剂治疗剂；以及在施用所述一剂或多剂所述治疗剂后，测量从所述人受试者获得的第二生物样品中的神经丝蛋白水平，其中所述第二生物样品中的神经丝蛋白水平低于所述第一生物样品中的神经丝蛋白水平。
在一些实施方案中，所述方法需要在测量第二生物样品中的神经丝蛋白水平之后，向所述人受试者施用更多剂量的所述治疗剂，所述第二生物样品中的神经丝蛋白水平低于所述第一生物样品中的神经丝蛋白水平。
另一方面，本发明提供了治疗有此需要的人受试者的肌萎缩侧索硬化症的方法，所述方法包括：向所述人受试者施用初始剂量的治疗剂，其中所述初始剂量中的每一次剂量的量相同，并且在两次剂量之间以相同的给药间隔施用；在施用所述初始剂量之后，测量从所述人受试者获得的第一生物样品中的神经丝蛋白水平，其低于在施用所述初始剂量之前从所述人受试者获得的第二生物样品中所测量的神经丝蛋白水平；以及向所述人受试者施用更多剂量的治疗剂，其中与所述初始剂量相比，所述更多剂量中的每一次剂量的量相同或更少，并且给药间隔相同或延长。
另一方面，本发明提供了治疗有此需要的人受试者的肌萎缩侧索硬化症的方法，所述方法包括：向所述人受试者施用初始剂量的治疗剂，其中所述初始剂量中的每一次剂量的量相同，并且在两次剂量之间以相同的给药间隔施用；在施用所述初始剂量之后，测量从所述人受试者获得的第一生物样品中的神经丝蛋白水平，其等于或高于施用所述初始剂量之前从所述人受试者获得的第二生物样品中所测量的神经丝蛋白水平；以及向所述人受试者施用更多剂量的治疗剂，其中与所述初始剂量相比，所述更多剂量中的每一次剂量的量增加，并且/或者给药间隔缩短。
在任何前述方法的一些实施方案中，所述治疗剂是根据下式的反义化合物：
mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeoAes Geo mCes Te(SEQ ID NO:8的核碱基序列)，其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝经2'-O-甲氧基乙基核糖修饰的糖，
d＝在一些实施方案中，是2'-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，以及
o＝磷酸二酯核苷间键联；
或其药学上可接受的盐。
在任何前述方法的一些实施方案中，患者或人受试者在与肌萎缩侧索硬化相关的超氧化物歧化酶1(SOD1)基因中具有突变。在一些实施方案中，SOD1基因中的突变是A4V。在一些实施方案中，SOD1基因中的突变是A4V、H46R、G93S、A4T、G141X、D133A、V148G、N139K、G85R、G93A、V14G、C6S、I113T、D49K、G37R、A89V、E100G、D90A、T137A、E100K、G41A、G41D、G41S、G13R、G72S、L8V、F20C、Q22L、H48R、T54R、S591、V87A、T88deltaTAD、A89T、V97M、S105deltaSL、V118L、D124G、L114F、D90A、G12R或G147R。
在任何前述方法的一些实施方案中，神经丝蛋白是神经丝轻链。
在任何前述方法的一些实施方案中，神经丝蛋白是神经丝重链(例如，磷酸化的神经丝重链)。
在任何前述方法的一些实施方案中，所述第一生物样品和所述第二生物样品包含血液、血清、血浆或脑脊液。
附图说明
图1是显示血浆神经丝重链的纵向下降的线图，平均下降为每月1.8％。
图2是线图，其显示了处于神经丝重链水平的上三分位、中三分位和下三分位的患者中，按治疗组的血浆神经丝重链水平的纵向变化。对于每个三分位数，安慰剂治疗组为上线，右普拉克索治疗组为下线。
图3是比较用SOD1活性ASO或SOD1无活性ASO处理的SOD1G93A小鼠中神经肌肉接头损失(NMJ)的线图。
图4是比较用SOD1活性ASO或SOD1非活性ASO处理的SOD1G93A小鼠血清中磷酸化的神经丝重链水平的线图。
图5是显示在各种ASO1给药队列中CSF SOD1蛋白浓度相对于基线的倍数变化的图。
图6A是显示在用ASO1 100mg对比安慰剂治疗的为快速进展者的患者以及用ASO1100mg对比安慰剂治疗的具有总体SOD1突变(快速进展和其它SOD1突变)的患者的ALSFRS-R相对于基线的平均变化的图。
图6B是显示用ASO1 100mg对比安慰剂治疗的为快速进展者的患者以及用ASO1100mg对比安慰剂治疗的具有总体SOD1突变(快速进展和其它SOD1突变)的患者的SVC(预测％)相对于基线的平均变化的图。
图6C是显示用ASO1 100mg对比安慰剂治疗的为快速进展者的患者的第85天的CSFpNfH与基线的几何平均值比的图。
图7A是显示在用ASO1 100mg或安慰剂治疗期间血浆中的pNfH水平的图。
图7B是显示在用ASO1 100mg或安慰剂治疗期间血浆中的NfL水平的图。
图7C是显示在用ASO1 100mg或安慰剂治疗期间CSF中的pNfH水平的图。
图7D是显示在用ASO1 100mg或安慰剂治疗期间脑CSF中的NfL水平的图。
具体实施方式
在一些实施方案中，本发明提供了确定ALS患者是否对治疗剂有反应的方法，以及用会减轻该患者的症状的治疗剂治疗ALS患者的方法。在一些实施方案中，患者为人。
本文提及的出版物(包括专利出版物)、网站、公司名称和科学文献建立了本领域技术人员可以获取的知识，并据此通过引用以其全整体并入，其程度就如同每篇文献具体地和单独地指示以通过引用并入。本文所引用的任何参考文献与本说明书的具体教导之间的任何冲突均应予以解决，以后者为准。
除非另有说明，否则本文显示的所有氨基酸序列均在呈氨基(N)至羧基(C)方向。除非另有说明，否则本文所示的所有核苷酸序列均呈5'至3'方向。当含有或包含用于指指示的氨基酸序列时，意味着一个或多个氨基酸残基可以出现在指示的氨基酸序列的N’末端、指示的氨基酸序列的C’末端或两个末端上；但一个或多个氨基酸残基不会出现在所述的氨基酸序列中所述氨基酸残基之间。当含有或包含用于指指示的核苷酸序列时，意味着一个或多个核苷酸残基可以出现在指示的核苷酸序列的5’端、指示的核苷酸序列的3’端或两端上；但一个或多个核苷酸残基不会出现在指示的核苷酸序列中所述的核苷酸残基之间。
除非上下文另有要求，否则在说明书和权利要求书中定义或使用的术语应具有所指示的含义。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语的含义都与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。单词或短语的现有技术理解的定义与在本说明书中特别教导的该单词或短语的定义之间的任何矛盾都应该以有利于后者来解决。如本文中所用，以下术语具有所指示的含义。如本说明书中所用，除非内容清楚地另有规定，否则单数形式的“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”也特别地涵盖它们所指的术语的复数形式。本文使用的术语“约”大约意指大致或大约在范围内。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过延伸所示数值的上下边界修饰该范围。通常，术语“约”在本文中用于修饰偏差为20％的所述值的上下数值。
ALS是影响大脑和脊髓中的神经细胞的进行性神经变性疾病。在ALS中，上运动神经元(大脑中的运动神经元)和下运动神经元(脊髓中以及大脑的运动核中的运动神经元)均退化或死亡，并停止向肌肉发送信息。无法起作用，肌肉逐渐变弱，开始颤搐(twitch)(经历肌束震颤(fasciculations))，然后变衰弱(经历萎缩)。最终，大脑失去了发起和控制自主运动的能力。下降是不可避免的，诊断后平均2到5年通常会因呼吸衰竭而死亡。尽管大多数患者患有散发性ALS，但一小部分患者(大约2％)具有由超氧化物歧化酶1(SOD1)中的多种突变引起的遗传性或家族性ALS形式。自1993年其首次发现以来，据报道有180多种SOD1突变导致这种形式的ALS(称为SOD1 ALS)。肌萎缩侧索硬化症在线遗传学数据库(TheAmyotrophic Lateral Sclerosis Online Genetics Database)(ALSoD)。Institute ofPsychiatry,Psychology&Neuroscience.2015年出版；Rosen,Nature,364(6435):362(1993))。个别突变的疾病进展是可变的，最严重的突变存活期不到15个月。尽管尚不清楚突变引起SOD1 ALS的机制，但令人信服的数据表明，功能的毒性增加而非SOD1活性的丧失是引发一系列导致运动神经元死亡的事件的触发因素(Bruijn等人，Science,281(5384):1851-4(1998))。
可溶性SOD1酶(也称为Cu/Zn超氧化物歧化酶)是可通过催化将超氧化物歧化为过氧化氢(H2O2)来防御生物分子的氧化损伤的超氧化物歧化酶之一(Fridovich,Annu.Rev.Biochem.,64:97-112(1995))。超氧阴离子(O2-)是潜在有害的细胞副产物，主要由线粒体中的氧化磷酸化的错误产生(Turrens,J.Physiol.,552:335-344(2003))。SOD1基因的突变与ALS的显性遗传形式相关联，该病症的特征在于上、下运动神经元的选择性变性(Rowland,N.Engl.J.Med.,2001,344:1688-1700(2001))。家族性ALS与SOD1基因中的错义突变之间存在紧密遗传连锁(Rosen,Nature,362:59-62(1993))。突变型SOD1的毒性被认为是由于最初的错误折叠(功能获得)导致活性酶对核的保护作用减弱(核中功能丧失)引起的，该过程可能与ALS发病机理相关(Sau,Hum.Mol.Genet.,16:1604-1618(2007))。ALS中运动神经元的进行性变性最终导致其死亡。当运动神经元死亡时，大脑启动和控制肌肉运动的能力就会丧失。随着自主肌肉动作逐渐受到影响，处于疾病晚期的患者可能会完全瘫痪。
ALS的早期症状通常包括肌肉无力或僵硬。逐渐地，在自主控制下的所有肌肉都会受到影响，并且个体会失去其力量以及说话、进食、移动甚至呼吸的能力。大多数ALS患者通常在症状首次出现后的3-5年内死于呼吸衰竭。然而，约10％的ALS患者可以生存10年或更长时间。
没有治愈ALS的方法，尽管有批准用于向ALS患者施用的治疗剂，但并不是每位ALS患者都会对每种治疗剂产生反应。因此，ALS的治疗是具有挑战性的，因为并非所有ALS患者对相同的治疗剂反应相同，并且为特定患者选择正确治疗剂是很困难的。当前，取决于健康保健提供者来选择用于特定患者的特定治疗剂。健康保健提供者(例如，医师)当前基于减轻特定患者的ALS症状来选择用于治疗该特定患者的特定治疗剂，但不能确定所选的特定治疗剂实际上是否会减轻该特定患者的ALS症状。
为了确定治疗剂是否能减轻特定患者的ALS症状，可通过其与未施用所述治疗剂的患者(例如，未经治疗的患者或治疗前的患者)相比，减慢实用了所述治疗剂的患者的ALS疾病进展并且/或者减少ALS的症状的能力来判断治疗剂。
当前，ALS中的症状通过诸如肌肉力量等功能测试来测量。一种常用的量表是ALS功能评定量表(ALSFRS或ALFRS-R)。评级通常基于语音、流涎、吞咽、手写、切割食物、穿着和卫生、在床上翻身、行走、爬楼梯、呼吸困难、端坐呼吸(orthopnea)、呼吸功能不全等类别。在某些情况下，考虑自ALS诊断以来的时间。患者按0至4的等级对12个类别中的每个类别进行排序，其中0为最差(例如，语音类别中的语音丢失)，而4为最佳(例如，语音类别中的正常语音)。根据这些因素，可以计算出ALSFRS-R等级，其中0为最差(即，患病最多)，而40为最佳(即，症状最少)。
徒手肌力测试(MMT)也可以用在单个肌肉上，测试诸如运动、收缩、运动范围和顶住压力保持姿势等的能力。分级范围是如下的0-5：
0级：无收缩或肌肉运动。
1级：收缩的痕迹，但关节没有运动。
2级：重力消除时关节处的运动。
3级：抵抗重力但不抵抗附加阻力的运动。
4级：强度低于平常的抵抗外部阻力的运动。
5级：正常强度。
在一些实施方案中，如果在施用治疗剂至少三个月后，患者的ALSFRS-R评分与开始施用所述治疗剂之前所述患者的ALSFRS-R评分相比，保持相同、增加或减小1.0或更少，则认为所述治疗剂减轻特定患者的ALS症状(即，在该患者中是有效的)。例如，如果在施用之前，患者的初始ALSFRS-R评分为20，并且在用所述治疗剂治疗三个月后，所述患者的ALSFRS-R评分仍然为20或者增加(例如，增加到25或30)或者减小至19，则认为所述治疗剂减轻ALS的症状。在一些实施方案中，如果在施用治疗剂至少6个月后，与开始施用所述治疗剂之前的患者的ALSFRS-R评分相比，所述患者的ALSFRS-R评分保持不变、增加或减少1.0或更少，则认为所述治疗剂减轻了ALS的症状。在一些实施方案中，如果在施用治疗剂至少12个月后，与开始施用所述治疗剂之前的患者的ALSFRS-R评分相比，所述患者的ALSFRS-R评分保持不变、增加或减少1.0或更少，则认为所述治疗剂减轻了ALS的症状。
可用于评估ALS症状及其严重程度的另一项功能测试是慢肺活量(SVC)测试。SVC是显示在没有强迫或快速努力的最大吸气后的低完全呼气时测量的气体体积的肺活量测定测试。
可用于评估ALS症状及其严重程度的其它功能测试是手持测功仪(HHD)测试。
尽管功能测试(诸如ALSFRS-R测试)是非侵入性的，它们管理起来很费时，通常几个月后才会显示变化，有时甚至几年后才会显示变化。此外，一旦功能下降，可能就很难使其恢复。因此，ALS的疾病进展还可通过跟踪身体变化(优选在出现功能下降之前)来检测。
因此，需要找到鉴定在特定患者中有效的治疗剂的方式，所述方式不是基于在实施功能测试之前已经发生的功能丧失。
神经丝(NF)是在神经元细胞质中发现的蛋白质。它们是直径约10nm，长度为许多微米的蛋白质聚合物。它们与微管和微丝一起形成神经元细胞骨架。神经丝由不同的蛋白质组成，所述蛋白质包括神经丝蛋白L(低分子量，NFL，也称为神经丝轻链)、神经丝蛋白M(中等分子量；NFM，也称为神经丝中链)和神经丝蛋白H(高分子量；NFH，也称为神经丝重链)。哺乳动物神经系统中的神经丝也含有蛋白质互联蛋白，并且周围神经系统中的神经丝也可含有蛋白质外周蛋白。
因此，如本文中所用，“神经丝蛋白”是指神经丝蛋白L(低分子量，NFL，也称为神经丝轻链)、神经丝蛋白M(中分子量；NFM，又称神经丝中链)、神经丝蛋白H(高分子量；NFH，也称为神经丝重链)、互联蛋白和外周蛋白。人神经丝轻链的氨基酸序列在SEQ ID NO:1和Julien等人，Biochimica et Biophysica Acta 909:10-20,1987中提供(也参见NCBI参考序列:NP_006149.2和NCBI参考序列:NG_008492.1)。人神经丝重链的氨基酸序列在SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3以及Lees等人的EMBO J.7(7):1947-1955,1988中提供(也请参见NCBI参考序列：NG_008404.1和NCBI参考序列：NP_066554.2)。人神经丝中链的氨基酸序列在SEQID NO:4和SEQ ID NO:5以及Myers等人，EMBO J.6(6):1617-1626,1987中提供。SEQ ID NO:6提供人互联蛋白的序列。SEQ ID NO:7提供了人外周蛋白的序列。
由于神经丝在神经元中的特定结构作用，神经丝可用于评估神经元完整性。当神经元受损时，神经丝会逸出受损的神经元，并且可以在脑脊液(CSF)甚至血液中(例如，血液的血清或血浆成分中)被发现。神经变性疾病患者的脑脊液和血浆中的神经丝水平升高(参见Yuan A等人Cold Spring Harb Perspect Biol.2017；9(4).2.Weydt P，等人Ann Neurol2016；79(1):152-158)。这可代表变性神经元轴突内容物的细胞外释放。确实，在肌萎缩侧索硬化症(ALS)患者的观察数据(主要是横断面数据)中，已证明了神经丝水平与疾病严重程度之间存在相关性，如通过修订后的肌萎缩侧索硬化症功能评定量表(ALSFRS-R)中的存活率和下降所指示的(参见McCombe PA等人J Neurol Sci.2015；353(1-2):122-129；Boylan KB等人Neurol Neurosurg Psychiatry.2013；84(4):467-472)。
在一些实施方案中，所述神经丝蛋白是神经丝轻链。在一些实施方案中，所述神经丝轻链被磷酸化。已经描述了用于测量血清中的神经丝轻链的测定(参见例如，Gaiottino等人，PLoS ONE 8:e75091,2013；Kuhle等人，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 86(3):273-279,2014。例如，来自患者的血清在室温下以1000g离心10分钟，并在采集后2小时内储存于-80℃下。神经丝轻链(NfL)(例如，血清NfL)浓度可使即用型酶联免疫吸附测定(ELISA)稀释剂(Mabtech AB,Nacka Strand,Sweden)或Gaiottino等人，PLoS ONE 8:e75091,2013中描述的电化学发光(ECL)免疫测定法或Disanto等人，Ann.Neurol.81(6):857-870,2017中描述的单分子阵列(SIMOA)法进行测量(例如，以一式两份)。已在Kuhl等人，Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 54(10):1655-1661,2016中比较了所述三种测定法。SIMOA测定(特别称为Simoa NF-light Advantage试剂盒)可从QuanterixCorp.(Lexington,MA,USA)商购获得。
根据本发明的一些实施方案，也可以测量神经丝蛋白的中链和/或重链。
例如，SimplePlex平台可用于测量磷酸化Nf重链(pNf-H)的水平。SimplePlex可从Protein Simple(San Jose,CA,USA)商购获得(参见Dysinger M,等人J ImmunolMethods.451:1-10,2017)。在一些实施方案中，所述神经丝重链被磷酸化。
尽管如本文所述，CSF和血清中升高的神经丝轻链水平已被描述为与用MRI观察到的身体损伤相关，但本发明人已发现血清和/或CSF中升高的(或增加的)神经丝蛋白水平可预测ALS患者未来的身体损伤或功能丧失。因此，通过跟踪特定治疗的患者血清(或CSF)中的神经丝蛋白水平，健康保健提供者可以在患者表现出功能丧失和/或身体损伤之前预测所述患者是否对治疗剂有反应(即，所述治疗剂是否减轻了该患者的症状)。
一方面，本发明提供了用于减轻ALS患者的ALS症状的方法，其包括施用治疗剂，所述治疗剂，与(a)未施用所述治疗剂的患者或(b)施用所述治疗剂之前的患者的生物样品(例如，血液、血清、血浆或脑脊液(CSF))中的神经丝蛋白水平相比，维持或降低了患者的生物样品(例如，血液、血清、血浆或脑脊液(CSF))中的神经丝蛋白水平。
另一个方面，本发明提供了方法，所述方法通过确定候选治疗剂，与用该候选治疗剂治疗前的患者的神经丝蛋白(例如，血清或CSF神经丝蛋白)水平相比，是否能够降低患者的神经丝蛋白水平，来确定所述候选治疗剂对特定患者是否有效，从而是否有助于减轻该患者的ALS症状。如果与用候选治疗剂治疗前的患者的神经丝蛋白(例如，血清或CSF神经丝)水平相比，候选治疗剂能够降低患者的所述神经丝蛋白水平，则该候选治疗剂被鉴定为在该患者中是有效的。
另一方面，本发明提供了用于减轻ALS患者的症状的方法，所述方法包括施用对所述患者有效的有效治疗剂，所述有效治疗剂，当向患者施用时，导致所述患者血清中的神经丝蛋白水平低于相当于未施用所述治疗剂的肌萎缩侧索硬化症患者的每ml血清16pg血清神经丝轻链的量，或低于所述患者的神经丝蛋白的水平。在一些实施方案中，患者当前正在被施用或以前曾被施用过无效治疗剂或不同于有效治疗剂的治疗剂。
在一些实施方案中，所述神经丝蛋白是神经丝轻链(NfL)。在一些实施方案中，所述神经丝蛋白是神经丝中等链(NfM)。在一些实施方案中，所述神经丝蛋白是神经丝重链(NfH)(例如，磷酸化的神经丝重链(pNfH))。在一些实施方案中，所述神经丝蛋白是人蛋白。在一些实施方案中，测量生物样品(例如，血液、血清、血浆或脑脊液(CSF))中的神经丝蛋白水平(即，量或数量)。
应当理解，当神经丝蛋白(例如，本文所述的神经丝蛋白，例如NfL或NfH，例如pNfH)的水平被描述为增加(即，升高)时，该水平与使用相同测定方法从相同类型的流体中获得的水平相比，相同(或相等)或降低(即，下降)。例如，将使用Simoa分析从患者血清中获得的血清神经丝轻链(sNfL)的治疗后水平与使用Simoa分析从患者中获得的sNfL的基线水平(即治疗开始之前)进行比较，或者将其与未经治疗的患者血清中通过Simoa分析测得的sNfL水平进行比较。还应当理解，神经丝蛋白的“水平”可以以用任何物质来描述，例如，以神经丝蛋白(例如，神经丝轻链)的皮克数每mL的生物样品(例如，血液、血清、血浆或脑脊液(CSF))来描述。
“治疗剂”仅是指可用于治疗肌萎缩侧索硬化症的药物或剂。治疗实际上不需要治愈疾病，目前还没有已知的治愈肌萎缩侧索硬化症的方法。因此，正在被施用治疗剂“治疗的”患者仅仅意味着他/她正在被施用可能对他或她的疾病有效的治疗剂。所述治疗剂可能并非在所有ALS患者中均有效。相反，ALS的治疗剂有时被称为疾病缓解疗法或疾病缓解药物(DMT或DMD)，因为它们的施用减少了一些患者的ALS症状，从而使对所述治疗剂有反应的那些ALS患者的生活质量和/或神经肌肉功能得到改善。当前的疗法(如果有效的话)会减慢ALS疾病的进展并且/或者减轻响应患者的症状。
因此，“有效的”意指治疗剂将减轻ALS患者的症状。
在美国，有两种经美国食品药品管理局批准用于治疗ALS的治疗剂。
第一，利鲁唑(riluzole)(如以Rilutek销售的；Condordia)以口服丸剂的形式施用，并且在一些患有ALS的人中表现出减缓疾病的进展。尽管其确切机制尚不清楚，但其可降低大脑中谷氨酸盐的水平，因为谷氨酸盐通常在患有ALS的人中以较高的水平存在。然而，使用利鲁唑可能会引起诸如头晕、胃肠道疾患和肝功能改变等副作用。
第二FDA批准的治疗剂，依达拉奉(以Radicava销售的；Mitsubishi)，在临床试验的证据表明在六个月的时期内服用本品可减少与ALS相关的日常功能下降后，被批准。依达拉奉的(静脉内注射其)副作用包括瘀伤、步态不稳、荨麻疹、肿胀和呼吸急促。
仍在开发中并且/或者在美国以外被批准的用于治疗ALS并且/或者减轻ALS症状的其它新型治疗剂包括，但不限于Neuronata-R(Corestem)、KPT-350(Biogen/KaryopharmTherapeutics)、CNS10-NPC-GDNF(Svedsen Lab)、Cu(II)ATSM(ProCypra Therapeutics)、BIIB067靶向水平的SOD1蛋白(Biogen/Ionis)、GM604(Genervon Biopharmaceuticals)、本文所述的ASO(例如，ASO1、ASO2或ASO3)和US 2017/0037410A1(通过引用以其整体并入本文)中所述的ASO。
在一些实施方案中，治疗剂，例如候选和/或有效的ALS治疗剂，包括小分子、抗体或其片段、核酸分子(例如，反义寡核苷酸、microRNA、适体、短发夹RNA或小干扰RNA)、间充质干细胞、胶质限制性祖细胞和/或病毒载体(例如，腺病毒或腺相关病毒)。在一些实施方案中，病毒载体包含或编码以下的一种或多种：抗体或其片段，和/或核酸分子(例如，反义寡核苷酸、microRNA、适体、短发夹RNA或小干扰RNA)。
在一些实施方案中，治疗剂靶向一种或多种与ALS相关的基因突变。在一些实施方案中，治疗剂，例如候选和/或有效的ALS治疗剂，包含靶向(例如，结合、降解和/或降低......水平)SOD1基因(例如，突变的SOD1基因)、SOD1 RNA(例如，突变的SOD1 RNA)和/或SOD1多肽(例如，突变的SOD1多肽)的分子。在实施方案中，突变的SOD1基因、RNA或多肽与ALS相关。在实施方案中，治疗剂包括针对SOD1的microRNA，例如VY-SOD101(VoyagerTherapeutics)。在一些实施方案中，治疗剂，例如候选和/或有效的ALS治疗剂，包括如US2018282732A1(通过引用以其整体并入本文)所述的靶向SOD1的核酸。在一些实施方案中，治疗剂包括靶向SOD1基因(例如，突变的SOD1基因)的反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，治疗剂，例如候选和/或有效的ALS治疗剂，包括靶向(例如，结合、降解和/或降低......水平)9号染色体开放阅读框72(C9orf72)六核苷酸扩展多核苷酸(expansion polynucleotide)(例如，DNA或RNA)和/或C9ORF72二肽重复(DPR)多肽的分子。在一些实施方案中，治疗剂包括靶向C9orf72的microRNA，例如，如Martier等人Mol.Therapy Nuc.Acids 14(2019):P593-608中所描述的。
在一些实施方案中，治疗剂，例如候选和/或有效的ALS治疗剂，包括以下的一种或多种：利鲁唑、依达拉奉、铜-ATSM、马赛替尼、替拉西替韦(tirasemtiv)、NP001、乙胺嘧啶(pyrimethamine)、甲钴胺、异丁司特、美西律、GDC-0134、美金刚胺、EPI-589、托珠单抗、RNS-60、匹莫齐特、ODM-109、埃佐加滨(ezogabine)、amylyx或低剂量IL-2。在一些实施方案中，治疗剂，例如候选和/或有效的ALS治疗剂，包括反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含以下的一种或多种：抗C9orf72反义寡核苷酸(例如，如Sareen等人Sci.Transl.Med.2013；5(208):208ra149中所述的)、BIIB067(例如，如临床试验标识号NCT02623699中所述的)、AS0816(例如，如Sareen等人Sci.Transl Med.2013；5(208):208ra149中所述的)、ISISSMNRx、ISIS 333611(例如，如Miller等人Lancet Neurol.2013；12(5):435-42中所述的)或ASO061(例如，如Sareen等人Sci.Transl.Med.2013；5(208):208ra149中所述的)。
在一些实施方案中，治疗剂，例如候选和/或有效的ALS治疗药，包括以下的一种或多种：倍他米松(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT03707795中所述的)；MCI-186(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT01492686中所述的)；ONO-2506PO(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT00694941中所述的)；TRO19622NCT01285583；E0302(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT00444613中所述的)；AP-101(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT03981536中所述的)；雷沙吉兰(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT01232738中所述的)；TCH346(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT00230074中所述的)；NP001(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT01281631中所述的)；Triumeq(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT02868580中所述的)；马赛替尼(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT02588677中所述的)；粒细胞集落刺激因子(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT01825551中所述的)；CK-2127107(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT03160898中所述的)；替拉西替韦(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT02936635中所述的)；Gilenya(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT01786174中所述的)；阿立莫唑(Arimoclomol)(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT00706147中所述的)；匹莫齐特(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT03272503中所述的)；Nuedexta(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT01806857中所述的)；KNS-760704(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT00931944中所述的)；MN-166(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT04057898中所述的)；SB-509(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT00748501中所述的)；KNS-760704(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT00647296中所述的)；奥索来肟(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT00868166中所述的)；左西孟旦(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT03505021中所述的)；美金刚胺(例如，如在ClinicalTrials.gov标识符：NCT00353665中所述的)；BIIB067(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT02623699中所述的)；BIIB078(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT03626012中所述的)；或BIIB100(例如，如ClinicalTrials.gov标识符：NCT03945279中所述的)。
在一些实施方案中，治疗剂，例如候选和/或有效的ALS治疗剂，包括反义寡核苷酸，例如，如WO2019032607A1、WO 2015/153800、WO 2003/000707、WO 2014/062691、WO2015/054676、WO2016/168592、WO 2014/062686、WO 2014/062736、WO 2017/079291、WO2017/180835、WO 2015/057727、WO 2015/057738、WO2016/112132、WO 2016/167780、WO2015/143246、WO 2015/143245、WO 2017/117496(其中的每一个均通过引用以其整体并入本文)中所述的。
在一些实施方案中，治疗剂，例如候选和/或有效的ALS治疗剂，包括小分子，例如如WO 2013/170068(通过引用以其整体并入本文)中所述的。
在一些实施方案中，治疗剂，例如候选和/或有效的ALS治疗剂，包括多肽，例如抗体或其片段，例如，如WO 2016/050822和WO2019/210054(其中两者通过引用以其整体并入本文)中所述的。在一些实施方案中，治疗剂，例如候选和/或有效的ALS治疗剂，包括抗体或其片段，所述抗体或其片段包含可变重链氨基酸序列、可变轻链氨基酸序列和/或下列抗体之一的互补决定区(CDR)：NI-308.18F7、NI-308.15O7、NI-308.28G1、NI-308.45C2、NI.308.24E11、NI-308.5G2、NI-308.46E9、NI308-6B11、NI-308.46F8、NI-308.4M1、NI-308.12A3或NI-308.16C10，如WO 2016/050822(通过引用并入本文)中所述的。在一些实施方案中，治疗剂，例如候选和/或有效的ALS治疗剂，包括抗体或其片段，所述抗体或其片段包含可变重链氨基酸序列、可变轻链氨基酸序列和/或互补决定区(CDR)，所述互补决定区选自如WO2019/210054中所述的SEQ ID No:40、44、45、46、47、48、49和/或50，和/或WO2019/210054(通过引用并入本文)的表14中的序列。
“施用(administration)”或“施用(administering)”意指向患者递送治疗剂。施用途径可以是任何方式，包括但不限于口服、直肠、静脉内、鞘内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内、局部、肠胃外和舌下。治疗剂的剂量量和给药方案可根据监管机构(例如，美国美国食品药品管理局或欧洲药品管理局)的标签确定。被施用治疗剂的患者可被称为正在被施用该治疗剂，而不管患者是否实际上对所施用的治疗剂有反应。如果患者对所施用的治疗剂没有反应，则该治疗剂在该患者中是无效的。
“ALS的症状”是指ALS患者可能经历的任何症状。ALS的症状包括但不限于肌肉无力、协调问题、肌肉僵硬、肌肉丧失、肌肉痉挛、反射过度、说话困难、声带痉挛、吞咽困难、垂涎、缺乏约束、轻度认知障碍、严重便秘、严重无意体重减轻、呼吸急促、抬脚困难以及肌萎缩侧索硬化患者经历的其他症状。为避免疑问，生物样品(例如，血液、血清、血浆或脑脊液(CSF))中的神经丝蛋白(例如，神经丝轻链或神经丝重链)不是ALS的症状。因此，简单地减少生物样品(例如，血液、血清、血浆或脑脊液(CSF))中的神经丝蛋白而不减少ALS患者的任何ALS症状的治疗剂对该患者是无效的。
如本文中所用，“减轻ALS的症状”意指治疗剂将减轻患者的ALS疾病症状和/或减缓ALS疾病的进展。通过施用治疗剂来减轻其ALS症状的患者被认为对所指示的治疗剂有反应或将对其作出反应。例如，减轻患者的ALS症状的治疗剂，在施用治疗剂后，导致ALS功能评定量表(ALSFRS或ALFRS-R)的评级等于或高于未接受治疗剂治疗的ALS患者或用所述治疗剂治疗前的ALS患者，或者低于所述ALS患者少于1.0。如果治疗剂在向该患者施用所述治疗剂后能够减轻ALS的症状，则该治疗剂被称为在该患者中是有效的。
应当注意的是，“未被施用治疗剂”的患者仅指未用指示的治疗剂治疗的患者(例如，ALS患者)。因此，该患者可以是在未来某个时间点施用所指示的治疗剂的同一患者，或者该患者可以是没有被施用所指示的治疗剂的完全不同的患者。请注意，未被施用治疗剂的患者目前可能正在被施用另一种治疗剂，或者可能在过去被施用过所指示的治疗剂，但目前未被施用所指示的治疗剂。
在一些实施方案中，在观察到ALS症状减轻之前至少两个月、2.5个月、3个月、4个月、5个月或至少6个月，或至少一年(如通过本文所述的评估之一确定的)，将通过治疗剂减轻(如与未治疗的患者的水平相比)他或她的ALS症状的患者的生物样品(例如，血液、血清、血浆或脑脊液(CSF))中的神经丝蛋白(例如，神经丝轻链)水平的维持或降低是可检测的。
序列公开
SEQ ID NO:1(人神经丝轻链氨基酸序列)
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RSAYGGLQTSSYLMSTRSFPSYYTSHVQEEQIEVEETIEAAKAEEAKDEPPSEGEAEEEEKDKEEAEEEE
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SEQ ID NO:2(人神经丝重链氨基酸序列)
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SEQ ID NO:3
Figure BDA0003101154590000231
Figure BDA0003101154590000241
Figure BDA0003101154590000251
SEQ ID NO:4(人神经丝中链氨基酸序列)
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SEQ ID NO:5
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SEQ ID NO:7
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SEQ ID NO:8
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SEQ ID NO:9
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SEQ ID NO:10
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SEQ ID NO:11
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SEQ ID NO:12
CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC
SEQ ID NO:13
CCTATAGGACTATCCAGGAA
提供下面的实例意在举例说明而不是限制本文所述的本发明。
实施例1：对ALS无效的治疗剂
进行了临床试验，以研究候选治疗剂右普拉克索是否具有减轻ALS症状的能力。
结果表明，施用去普拉克索(depramipexole)并不减轻ALS症状。
回顾性观察用右普拉克索治疗的患者血清中的神经丝蛋白(即神经丝重链)水平。在右普拉克索、EMPOWER的临床试验中测定基线和纵向血浆神经丝重链(NFH)浓度，并评估它们与临床结果(包括存活率和肌肉力量下降率(通过手持测功仪[HHD]评估的)、慢肺活量(SVC)和ALSFRS-R)的关系。
神经丝(由轻链、中链和重链的杂聚物组成)是成熟轴突的主要结构组分。神经变性疾病患者表现出神经丝的CSF和血浆水平升高，推测代表变性神经元轴突内容物的细胞外释放。在ALS患者的观察性数据(主要是横断面数据)中，证实了NF水平与疾病严重程度(如通过存活率和ALSFRS-R下降所指示的)之间的相关性。
EMPOWER是在81个学术医疗中心进行的共有943名成人参加的针对右普拉克索治疗ALS的安全性和有效性的3期全球随机临床试验(RCT)(见Cudkowicz ME等人，LancetNeurol.2013Nov；12(11):1059-67)。
EMPOWER研究中包括的受试者必须诊断为可能、很可能的或明确的ALS，有ALS症状少于24个月，SVC值至少为预测值的65％，并且没有显著的共病。
在这项研究中，以1:1的比例分配受试者接受右普拉克索或安慰剂治疗12个月，
在Ella上使用NFH测定进行测量血浆神经丝重链(NFH)，Ella是一种来自ProteinSimple的基于自动化微流控盒的免疫测定平台。
结果示于表1。
表1：血浆NFH是在EMPOWER的大的代表性亚组中测量的。
Figure BDA0003101154590000301
Figure BDA0003101154590000311
在调整了多个协变量之后，基线血浆NFH(log10转换的)的相关性如下：
--研究期间的存活率(HR＝2.41,p<0.001)
--HHD的下降率(b＝-0.026,p<0.001,adj.r2＝0.14)，
--SVC的下降率(b＝-1.77,p<0.001,adj.r2＝0.20)，
--ALSFRS-R的下降率(b＝-0.61,p<0.001,adj.r2＝0.20)；
平均血浆神经丝重链水平每月下降1.8％(见图1)。然而，研究结果表明，在分配给安慰剂对比右旋氨苄索(在该EMPOWER研究中没有临床疗效的一种疗法)的受试者之间在纵向血浆NFH过程上没有差异(参见图2)。
实施例2：预期在ALS患者中有效的治疗剂的施用导致血清神经丝水平下降
超氧化物歧化酶1(SOD1)中的突变占家族性ALS的20％。鉴于在这种显性遗传性疾病中获得了毒性功能，降低SOD1 mRNA和蛋白质可提供治疗益处。
靶向SOD1的反义寡核苷酸(ASO)一直被认为减少了SOD1mRNA和蛋白，并在SOD1G93A大鼠中使存活期延长超过50天，在SOD1G93A小鼠中使存活期延长几乎40天。
如下所示，在单剂量的SOD1 ASO后，SOD1G93A小鼠中复合肌肉动作电位的最初丧失得以逆转。此外，SOD1 ASO疗法可停止血清磷酸化神经丝重链水平的升高。
所用的反义寡核苷酸如下表2所示。
表2
Figure BDA0003101154590000321
表2中所示的6个反义寡核苷酸在5'和3'翼上包含硫代磷酸酯骨架修饰(其中“o”表示未经修饰的磷酸二酯键联)、2'-O-甲氧基乙基核糖(MOE；粗体)和(S)-2',4'-约束的2'-O-乙基(cEt；斜体)。ASO被靶向SOD1 mRNA(ASO1、ASO2和ASO3)的3’UTR、SOD1 mRNA的外显子1(333611)，或者在啮齿动物基因组中无靶标(无活性的ASO)。提供了评估的序列和化学修饰的位置。不同的对照(无活性的)ASO用于体外和体内研究。所有胞嘧啶残基均为5'甲基胞嘧啶。
在人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)中，这些ASO(ASO1和ASO2)以剂量依赖的方式强效降低了SOD1 mRNA。
降低SOD1的ASO的治疗显著延迟了疾病的发作，并延长了SOD1G93A小鼠和大鼠的存活期。已知突变型SOD1在SOD1G93A啮齿动物模型中的表达会导致四肢和躯干严重萎缩，从而导致运动功能丧失，以及最终死亡。
为了研究降低SOD1的ASO策略是否可以延迟疾病参数，在50和94天龄时用300μgASO1的团注剂量对SOD1G93A小鼠(B6.CgTg(SOD1*G93A)Gur/J)进行脑室内(i.c.v.)输注。每周测试体重和在转杆上的表现。接受ASO1的小鼠比注射相似浓度的对照无活性ASO(无活性ASO)的小鼠体重维持时间长26天，并且在转杆上表现更好(数据未显示)。ASO1处理的小鼠的中位存活期比无活性ASO延长了37天，表明小鼠模型的存活期延长了22％。
SOD1G93A大鼠(Taconic Biosciences，模型2148)通过放置在腰脊髓的L3与L5椎骨之间的聚乙烯导管接受30-μl鞘内团注注射。给予65日龄大鼠1000μg ASO1、ASO2、ASO3、ASO333611、无活性ASO或人工脑脊液(aCSF)媒介物对照。将所有ASO稀释在aCSF中。所有处理组都是性表型和同窝生幼崽匹配的，以控制拷贝数或性表型漂移-诱导的差异。
结果表明，经ASO1或ASO2处理的大鼠维持体重比经aCSF处理的大鼠分别长70天(P<0.0001)和67天(P<0.001)。333611适度延迟了体重减轻的开始(中位数为139天，相比之下aCSF的中位数为121天)。
80天活性ASO处理和110天活性ASO处理之间的发病或存活期没有显著差异。
为了测试ASO对SOD1的降低是否会影响疾病标志物，在5周龄时向SOD1G93A小鼠脑室内注射一次100μg ASO1，并评估复合肌肉动作电位(CMAP)、神经肌肉接头神经支配和血清磷酸神经丝重链(pNfH)水平的变化。在SOD1G93A小鼠中，CMAP随着时间的推移而下降，先于运动神经元的丧失。在第5周用ASO1处理的SOD1G93A小鼠在接下来的12周内保持CMAP，而对照处理的动物的CMAP在同一时期减少了一半以上(数据未显示)。与保持的肌肉功能的CMAP电生理学证明一致，ASO1处理的小鼠(在5周龄时注射一次300μgASO1的单剂量)保持后肢胫骨前肌的神经支配，而对照处理的动物显示超过75％的肌肉终板去神经的证据(图3，每组n＝12；平均值±SEM)。
在ALS啮齿动物模型、人ALS患者和其它神经变性疾病的CSF和血清中pNfH增加。为了观察血清中磷酸化的神经丝重链水平，在i.c.v.注射前的基线(5周)采集血液，然后在8周龄和10周龄时再次从5周龄时用300μg ASO1的单次剂量注射一次的SOD1G93A突变型小鼠采集血液。根据制造商的说明，通过ELLA微流控ELISA平台(Protein Simple)测量pNfH血清水平。简言之，在指定的时间点通过面部静脉穿刺采集最多100μl的血液。血清样品通过离心BD Vacutainer SST管(BD Diagnostics)制备，并在-80℃下储存直至使用。如图4所示，用活性ASO1处理的SOD1小鼠与用对照ASO(即，SOD1无活性ASO)处理的SOD1小鼠相比显示出较低水平的pNfH((每组n＝12；图4中的平均值±SEM))。
基于本实施例2在大鼠和鼠模型中的结果，以及SOD1活性ASO能够降低磷酸化神经丝重链的血清水平的事实，预计SOD1活性ASO将是对于减轻ALS患者的ALS症状有效的治疗剂。
实施例3:在ALS患者中改换治疗剂
在这个预言性实例中，一个最近被诊断为ALS并且ALSFRS-R评分为31的患者接受了利鲁唑治疗。测量患者的血清神经丝蛋白水平，并确定其处于称为初始水平的水平。患者的医生会要求患者每六个月进行一次ALSFRS-R评估。但是在3个月后(即，在进行ALSFRS-R测试之前)，医生测量患者的血清神经丝蛋白水平，发现患者的血清神经丝蛋白水平高于初始水平。然后，医生将建议患者在进行其为期六个月的ALSFRS-R测试之前，改换另一种治疗剂(例如，对该患者有效的依达拉奉)。据预测，如果患者改换治疗剂，他的下一次ALSFRS-R测试(即，改换后3个月)将高于患者继续使用利鲁唑(如果新的治疗剂(例如，依达拉奉)对患者有效的话)的情况。
实施例4：ALS治疗药剂的施用导致神经丝水平下降
在SOD1 ALS患者中进行了双盲、随机、安慰剂对照的临床试验。该试验包括单次和多次递增剂量(SAD/MAD)研究。在MAD部分，参与者在大约3个月内接受了5剂研究药物。50名具有SOD1突变的成年受试者按3:1(ASO:安慰剂)每队列随机分组，接受20mg、40mg、60mg或100mg安慰剂或降低SOD-1的ASO-ASO1(SEQ ID NO:8)。每个队列中有1至4名接受ASO1治疗的参与者有SOD1突变记录，所述突变被先验地判定为快速进展(主要是A4V)。
SOD1水平的降低
在40mg、60mg和100mg队列中观察到CSF SOD1浓度相对于基线的降低，所述降低随着剂量量的增加而增加，并且随着时间的推移，在第85天，100mg处理组的降低最大。参见图5。基于临床前数据的建模表明，100mg的ASO1可有效降低脊髓中SOD1水平>99％，降低皮质中SOD1水平约25-30％。
临床观察
与安慰剂相比，使用ASO1的治疗表现出功能下降(ALSFRS-R)减慢以及呼吸功能下降减慢(如通过SVC测量的)。参见图6A和图6B。在具有快速进展SOD1突变的参与者中，与其它突变相比，在这些测量中观察到ASO1 100mg组与安慰剂组之间的差异更大。
CSF酸化神经丝重链(pNfH)水平
与安慰剂相比，在ASO1 100mg队列中观察到CSF pNfH的降低，在具有快速进展SOD1突变的参与者中，观察到ASO1 100mg组与安慰剂组之间的差异更大。与安慰剂相比，在具有快速进展SOD1突变的患者中，用ASO1进行治疗导致CSF pNfH水平降低和临床下降减慢。图6C显示在具有快速进展SOD1突变的患者中观察到的ASO1100mg组与安慰剂组之间在第85天的pNfH水平的差异。
血浆和CSF pNfH以及神经丝轻链(NfL)的水平
基线pNfH和NfL水平在快速进展患者中最高，并且与疾病活动性(如通过ALSFRS-R随机前斜度测量的)相关。在血浆和CSF中，对于ASO1 100mg处理随时间推移均可观察到pNfH和NfL水平均降低，而相比之下安慰剂组则明显稳定或升高。参见图7A-图7D。在图7A-图7D，总体安慰剂(n＝12)是整个研究过程中处于、接近或高于1.0基线测量值的实线；总体ASO1 100mg治疗(n＝10)是在整个研究过程中下降到1.0基线测量值以下的实线；快速进展安慰剂(n＝4)是在整个研究过程中处于、接近或高于1.0基线测量值的虚线；快速进展ASO1100mg治疗(n＝4)是在整个研究过程中下降到1.0的基线测量值以下的点线。使用ProteinSimpleTMSimple Plex Ella免疫测定法评估pNfH水平。使用Quanterix Simoa NfLAdvantage测定评估NfL水平。
因此，在不希望受任何特定理论约束的情况下，随同提供的结果支持使用神经丝蛋白水平(例如，血清和/或CSF神经丝蛋白水平)作为标志物(例如，药效学标志物)来确定用来治疗ALS患者的治疗剂是否实际上对该患者有效。例如，如果患者以前接受过无效治疗剂，但仍有渐进性ALS症状，在不可逆的功能下降发生之前，测量血清神经丝蛋白水平可能会提前通知患者该治疗剂无效，应改用可对该患者有效的新治疗剂。
上述本发明的实施方案旨在仅仅是示例性的；许多变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。所有这些变化和修改都旨在落入如在任何所附权利要求中限定的本发明的范围内。

Claims (23)

1.一种用于减轻肌萎缩侧索硬化症患者的症状的方法，所述方法包括施用对所述患者有效的有效治疗剂，所述有效治疗剂当向所述患者施用时导致所述患者的生物样品中的神经丝蛋白的水平低于未施用所述有效治疗剂的肌萎缩侧索硬化症患者的神经丝蛋白水平。
2.一种用于确定向肌萎缩侧索硬化症患者施用的治疗剂是否是对所述患者有效的有效治疗剂的方法，所述方法包括：从施用了所述治疗剂的所述患者获得或已经获得了生物样品；以及测量或已经测量了所述患者的生物样品中的神经丝蛋白水平以获得治疗后水平，其中治疗后水平低于未施用所述治疗剂的肌萎缩侧索硬化症患者的神经丝蛋白水平将所述治疗剂鉴定为是对所述患者有效的。
3.一种用于通过施用有效的治疗剂来减轻肌萎缩侧索硬化症患者的症状的方法，所述方法包括：
(a)通过以下步骤确定候选治疗剂是否可以减轻所述患者的肌萎缩侧索硬化症的症状：
(i)在施用所述候选治疗剂之后从所述患者获得或已经获得了生物样品；以及
(ii)测量或已经测量了所述生物样品中的神经丝蛋白水平以获得治疗后水平；以及如果所述治疗后水平低于未施用所述候选治疗剂的肌萎缩侧索硬化症患者的神经丝蛋白水平，则所述候选治疗剂是有效的治疗剂，以及
(b)向所述患者施用所述有效治疗剂，其中所述有效治疗剂的施用将减轻所述患者的肌萎缩侧索硬化症的症状。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述患者当前正在被施用或以前曾被施用过(a)无效治疗剂或(b)不同于所述候选治疗剂的治疗剂。
5.一种用于通过施用有效治疗剂减轻肌萎缩侧索硬化症患者的症状的方法，所述方法包括测量所述患者的生物样品中的神经丝蛋白水平，所述患者当前正在被施用第一治疗剂，所述第一治疗剂是(a)无效治疗剂或(b)与所述有效治疗剂不同，并且如果所述水平高于或等于未施用所述有效治疗剂的肌萎缩侧索硬化症患者的神经丝蛋白水平，则停止向所述患者施用所述第一治疗剂，并开始向所述患者施用所述有效的治疗剂。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中施用了所述有效治疗剂的所述患者的所述生物样品中所述神经丝蛋白的治疗后水平比未施用所述有效治疗剂的患者的所述生物样品中所述神经丝蛋白的水平低至少10％。
7.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中施用了所述有效治疗剂至少3个月的所述患者的所述生物样品中所述神经丝蛋白的治疗后水平比未施用所述有效治疗剂的患者的所述生物样品中所述神经丝蛋白的水平低至少10％。
8.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中施用了所述有效治疗剂至少6个月的所述患者的所述生物样品中所述神经丝蛋白的水平比未施用所述有效治疗剂的患者的所述生物样品中所述神经丝蛋白的水平低至少10％。
9.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中施用了所述有效治疗剂至少12个月的所述患者的所述生物样品中所述神经丝蛋白的水平比未施用所述有效治疗剂的患者的所述生物样品中所述神经丝蛋白的水平低至少10％。
10.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述有效治疗剂的所述施用减慢了所述患者的肌萎缩侧索硬化症的进展。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含血液、血清、血浆或脑脊液。
12.一种治疗有此需要的人受试者的肌萎缩侧索硬化症的方法，所述方法包括：
测量从所述人受试者获得的第一生物样品中的神经丝蛋白水平；
向所述人受试者施用一剂或多剂治疗剂；以及
在施用所述一剂或多剂所述治疗剂之后，测量从所述人受试者获得的第二生物样品中的神经丝蛋白水平，其中所述第二生物样品中所述神经丝蛋白水平低于所述第一生物样品中所述神经丝蛋白水平。
13.如权利要求12所述的方法，所述方法还包括在测量所述第二生物样品中的神经丝蛋白水平之后，向所述人受试者施用更多剂量的所述治疗剂，所述第二生物样品中所述神经丝蛋白水平低于所述第一生物样品中所述神经丝蛋白水平。
14.一种治疗有此需要的人受试者的肌萎缩侧索硬化症的方法，所述方法包括：
向所述人受试者施用初始剂量的治疗剂，其中所述初始剂量中的每一次剂量的量相同，并且在两次剂量之间以相同的给药间隔施用；
在施用所述初始剂量之后，测量从所述人受试者获得的第一生物样品中的神经丝蛋白水平，其低于在施用所述初始剂量之前从所述人受试者获得的第二生物样品中所测量的神经丝蛋白水平；以及
向所述人受试者施用更多剂量的治疗剂，其中与所述初始剂量相比，所述更多剂量中的每一次剂量的量相同或更少，并且给药间隔相同或延长。
15.一种治疗有此需要的人受试者的肌萎缩侧索硬化症的方法，所述方法包括：
向所述人受试者施用初始剂量的治疗剂，其中所述初始剂量中的每一次剂量的量相同，并且在两次剂量之间以相同的给药间隔施用；
在施用所述初始剂量之后，测量从所述人受试者获得的第一生物样品中的神经丝蛋白水平，其等于或高于施用所述初始剂量之前从所述人受试者获得的第二生物样品中所测量的神经丝蛋白水平；以及
向所述人受试者施用更多剂量的所述治疗剂，其中与所述初始剂量相比，所述更多剂量中的每一次剂量的量增加，并且/或者给药间隔缩短。
16.如如权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是根据下式的反义化合物：
mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo AesGeo mCes Te(SEQ ID NO:8的核碱基序列)，其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝经2'-O-甲氧基乙基核糖修饰的糖，
d＝2'-脱氧核糖，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，以及
o＝磷酸二酯核苷间键联；
或其药学上可接受的盐。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者或所述人受试者在与肌萎缩侧索硬化症相关的超氧化物歧化酶1(SOD1)基因中具有突变。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述SOD1基因中所述突变是A4V。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述SOD1基因中的突变是A4V、H46R、G93S、A4T、G141X、D133A、V148G、N139K、G85R、G93A、V14G、C6S、I113T、D49K、G37R、A89V、E100G、D90A、T137A、E100K、G41A、G41D、G41S、G13R、G72S、L8V、F20C、Q22L、H48R、T54R、S591、V87A、T88deltaTAD、A89T、V97M、S105deltaSL、V118L、D124G、L114F、D90A、G12R或G147R。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经丝蛋白是神经丝轻链。
21.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述神经丝蛋白是神经丝重链。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述神经丝重链是磷酸化的神经丝重链。
23.如权利要求12至22中任一项所述的方法，其中所述第一生物样品和所述第二生物样品包含血液、血清、血浆或脑脊液。
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