CN113355346A

CN113355346A - 删除稳定载体上冗余片段的方法，采用该方法得到的稳定载体及其应用

Info

Publication number: CN113355346A
Application number: CN202010850010.XA
Authority: CN
Inventors: 尹进; 胡潇婕; 李腾; 张浩千
Original assignee: Shenzhen Blue Crystal Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Blue Crystal Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2021-09-07

Abstract

本发明提供一种删除稳定载体上冗余片段的方法，采用该方法得到的稳定载体及其应用。所述方法包括以下步骤：1)将稳定载体导入罗氏真养菌中获得转化体，其中，所述稳定载体中的所述冗余片段的上游和下游各有1个重组酶特异性识别的核苷酸序列，并且所述稳定载体包含par区域中的启动子parP、质粒稳定化因子parA、parB、识别序列parS，复制蛋白repA，以及所述冗余片段；2)向所述转化体中导入表达所述重组酶的帮助质粒，经重组实现所述冗余片段的删除。本发明可以消除工业菌株中使用抗性基因所造成的抗性基因扩散到自然界的潜在隐患。

Description

删除稳定载体上冗余片段的方法，采用该方法得到的稳定载体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种删除稳定载体上冗余片段的稳定载体的方法及采用该方法得到的稳定载体。

背景技术

罗氏真养菌(Ralstonia eutropha，也被称作Cupriavidus necator)是研究PHA(聚羟基脂肪酸酯，一种完全可降解的生物基材料)合成的重要模式细菌，有潜力作为PHA工业生产的菌株。把一个目的基因通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞)，需要运载工具携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体(vector)，而质粒是最常用的一种载体。在Ralstonia eutropha的菌种研发和工业生产中，经常使用质粒载体引入外来基因达到优化菌种的目的。

在构建质粒载体和选择宿主菌时要考虑到大规模生产中高产率问题及发酵和后续纯化中可能遇到的相关问题。质粒稳定性是质粒生产中经常遇到的问题之一，质粒的不稳定性指的是重组菌在培养过程中发生突变或丢失，结果使重组菌失去了原有的表型特征。质粒的分离不稳定是细胞分裂后子代细胞分离时引起的不稳定。由于质粒在子代细胞中的不均匀分配而使部分细胞不含有质粒，这也是质粒丢失的重要原因。在一般实验中，通常可以利用抗生素施加选择抗性以维持质粒稳定，但是考虑到工业发酵的体量，在实际生产中添加抗生素会大大增加成本。

par系统是用于稳定保持质粒的系统，par系统启动后，质粒复制后就被均匀分配到子细胞中，所以即使不通过抗生素抗性施加选择选择抗性也能获得稳定保有质粒的菌株(Salje J,Gayathri P,

J.The ParMRC system:molecular mechanisms of plasmidsegregation by actin-like filaments[J].Nature Reviews Microbiology,2010,8(10):683-692.)。目前已经开发出一种利用par系统构建的，可以以Ralstonia eutropha为宿主、且不施加抗生素选择压力也能稳定保持的质粒载体。该载体使用耐金属贪铜菌CH34的巨大质粒pMOL28的par区域中的启动子parP、质粒稳定化因子parA28、parB28和识别序列parS。同时该载体上带有大肠杆菌复制子及卡那霉素抗性基因，以便于在大肠杆菌中进行载体改造相关的遗传操作(参见中国发明专利申请公开号CN101297036A)。

一般情况下，保持质粒的存在以及质粒的复制都需要依赖宿主细胞的代谢产生的能量，质粒拷贝数过高或质粒过大等会加重宿主细胞的代谢负担，严重的甚至影响宿主细胞生长(Karim A S,Curran K A,Alper H S.Characterization of plasmid burden andcopy number in Saccharomyces cerevisiae for optimization of metabolicengineering applications[J].Fems Yeast Research,2013；13(1):107-116.)。由于外源基因的大小通常不便于调节，在载体设计时就需要尽量精简，避免无效基因造成的复制负担。在质粒转化过程中，往往要依靠载体上的抗性基因对受体菌进行抗生素的压力筛选，以确保得到带有质粒的转化体。但对于稳定质粒载体而言，在质粒转入受体菌后，由于不再需要抗生素，载体上的抗性基因则失去利用价值，成为“无效”片段。

位点特异性重组系统由整合酶的识别位点/序列和识别DNA序列并介导DNA重组的整合酶组成。通过改变重组酶识别位点的位置和序列方向，位点特异性重组酶可以作为一种把特定序列插入到DNA链上或者从DNA链上删除或者翻转特定序列的工具酶。常用的位点特异性重组酶有TP901、PhiC31、P22和VCre等等。

现有技术中使用的载体含有在雷尔氏菌属、贪铜菌属和沃特氏菌属中发挥作用的DNA复制起始区域和稳定化重组载体的区域(par区域)，该载体使用耐金属贪铜菌CH34的巨大质粒pMOL28的par区域中的启动子parP、质粒稳定化因子parA28、parB28和识别序列parS。所述载体没有抗生素选择压力也能够利用par系统在细菌中保持稳定。同时该载体上带有大肠杆菌复制子及卡那霉素抗性基因，以便于在大肠杆菌中进行载体改造相关的遗传操作。

现有技术的稳定载体，虽然无需加入抗生素，但是卡那霉素抗性基因依然存在且表达，对DNA复制和蛋白表达而言是一种多余的能量和原料消耗；而且，带有卡那霉素抗性基因的稳定载体应用于工业生产菌，存在卡那霉素抗性基因扩散到自然界的隐患；另外，稳定载体上留有可在大肠杆菌中复制的复制子，该复制子在载体转入Ralstonia细菌后不再发挥功能，是冗余片段，对DNA复制是多余的能量和原料消耗。

基于以上现状，需要提供一种方法，其能够删除上述重组载体中冗余的的大肠杆菌复制子及卡那霉素抗性基因从而提供一种适用于Ralstonia eutropha的稳定载体。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种删除稳定载体上冗余片段的方法。

本发明的另一目的是提供一种通过上述方法获得的删除了冗余片段的稳定载体。

本发明的又一目的是提供一种上述稳定载体的用途。

本发明的再一目的是提供一种罗氏真养菌重组菌，其包含通过上述方法删除了冗余片段的稳定载体。

本发明的又一目的是提供所述罗氏真养菌重组菌用于PHA生产的用途。

一方面，本发明提供一种删除稳定载体上冗余片段的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将稳定载体导入罗氏真养菌中获得转化体，其中，所述稳定载体中的冗余片段的上游和下游各有1个重组酶特异性识别的核苷酸序列，并且所述稳定载体包含par区域中的启动子parP、质粒稳定化因子parA、parB、识别序列parS，复制蛋白repA，以及所述冗余片段；

2)向所述转化体中导入表达所述重组酶的帮助质粒，经重组实现所述冗余片段的删除。

本发明方法中，优选地，所述重组酶可以选自VCre重组酶、Bxb1重组酶、phiC31重组酶、TP901重组酶、HK022重组酶、Phi80重组酶、P21重组酶、Int3重组酶、Int4重组酶、Int5重组酶、Int9重组酶、Int11重组酶、Int12重组酶、Int13重组酶、P22重组酶、lamda重组酶、Cre重组酶、Dre重组酶、Vika重组酶、Flp重组酶、FimE重组酶、HbiF重组酶、A118重组酶中。

在具体实施方式中，所述重组酶为VCre重组酶，所述重组酶特异性识别的核苷酸序列为VloxP序列(SEQ ID No.：20)。

在具体实施方式中，所述VCre重组酶的氨基酸序列如SEQ ID No.：22所示。

在具体实施方式中，所述VCre重组酶的核苷酸序列如SEQ ID No.：21所示。

在具体实施方式中，所述par区域的核苷酸序列包含如SEQ ID No.：25所示的序列。

在具体实施方式中，所述复制蛋白repA为复制蛋白repA28，其包含如SEQ ID No.：26所示的序列。

本发明方法中，优选地，可选的par序列还可包括RP4、RK2的载体稳定化区域。

本发明中，所述罗氏真养菌的实例没有特别的限制，其可以是本领域中的用于PHA生产的任何罗氏真养菌。在具体实施方式中，所述罗氏真养菌是Ralstonia eutropha H16。

本发明中的所述的“冗余片段”是指稳定载体在导入罗氏真氧菌之后其序列中不再发挥功能的和/或没有应用意义的基因片段和/或核苷酸序列。

在具体实施方式中，所述冗余片段包括抗性基因。优选地，所述抗性基因是抗生素抗性基因。

在具体实施方式中，所述抗性基因是卡那霉素抗性基因。

在具体实施方式中，所述冗余片段还包括大肠杆菌复制子。

在具体实施方式中，所述Ptet诱导型也可以用表达VCre的其他启动子代替，包括但不限于诱导型启动子Ptac、pBAD、pRha、pTrp、T7启动子、热诱导启动子等，以及组成型启动子J23119和其他J231xx系列、原核细胞中Sigma70因子介导转录的组成型启动子等。

另一方面，本发明提供一种通过上述方法得到的适用于罗氏真养菌的稳定载体。

再一方面，本发明提供了上述稳定载体在基因工程中的应用。

再一方面，本发明提供了上述稳定载体用于罗氏真养菌中的应用。

再一方面，本发明提供了一种罗氏真养菌重组菌，其包含通过上述方法删除了冗余片段的稳定载体。

再一方面，本发明提供了上述罗氏真养菌重组菌用于聚羟基脂肪酸酯(PHA)生产的用途。

有益效果

本发明的有益技术效果在于，一方面，避免了稳定载体在罗氏真养菌中使用时冗余的大肠杆菌复制子和抗性基因的DNA复制和蛋白表达，从而节约能量并且减少了原料消耗；另一方面，避免了工业菌株中使用抗性基因所造成的抗性基因扩散到自然界的潜在隐患。

附图说明

图1为根据本发明的稳定载体通过含有重组酶VCre基因的载体删除大肠杆菌复制子和抗生素抗性基因的示意图。

图2显示实施例2中Ralstonia eutropha H16(pSP-kana-GFP)在添加或未添加卡那霉素两种情形下的质粒保留率。

图3显示比较例2中的Ralstonia eutropha H16(pBBR1-GFP)在添加或未添加卡那霉素两种情形下的质粒保留率。

图4显示使用帮助质粒pVCre删除大肠杆菌p15A复制子和卡那霉素抗性基因前(第1-3泳道)/后(第5-7泳道)的PCR结果。

图5显示未删除p15A复制子和卡那霉素抗性基因的Ralstonia eutropha H16(pSP-kana-GFP)和删除了p15A复制子和卡那霉素抗性基因的Ralstonia eutropha H16(pSP-GFP)的质粒保留率。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所用酶试剂采购自ThermoFisher公司和New England Biolabs(NEB)公司，提取质粒所用的试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，回收DNA片段的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行，所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。

培养基配方：

LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042),10g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。

实施例1：用质粒载体pSP制备整合绿色荧光蛋白(GFP)的质粒pSP-kana-GFP

用引物1(SEQ ID No.：1)和引物2(SEQ ID No.：2)以合成片段01(SEQ ID No.：15)为模板扩增得到含有p15A复制子和卡那霉素抗性基因的片段，用引物3(SEQ ID No.：3)和引物4(SEQ ID No.：4)以合成片段02(SEQ ID No.：16)为模板扩增得到含有par区域的片段，用引物7(SEQ ID No.：5)和引物8(SEQ ID No.：6)以合成片段03(SEQ ID No.：17)为模板扩增得到含有复制起始蛋白Rep及限制性内切酶BsaI位点的片段，将获得的三个片段按照商业试剂盒(

Master Mix，购买自New England Biolabs(NEB)公司)的说明通过Gibson Assembly方法连接，得到带有卡那霉素抗性的pSP载体，p15A复制子的上游和卡那霉素抗性基因的下游各有1个VCre重组酶(氨基酸序列SEQ ID No.：22，基因序列SEQ ID No.：21)特异性识别的VloxP序列(SEQ ID No.：20)。使用的引物如下表1：

表1

使用BsaI处理合成片段04(SEQ ID No.：18)，其中包括GFP绿色荧光蛋白基因，酶切片段通过Golden Gate(Werner S,Engler C,Weber E,et al.Fast track assembly ofmultigene constructs using Golden Gate cloning and the MoClo system[J].Bioengineered bugs,2012,3(1):38-43.)导入pSP载体的限制性内切酶BsaI位点，得到使用pSP载体构建的pSP-kana-GFP质粒。

将质粒pSP-kana-GFP转入大肠杆菌S17-1(ATCC编号:47055，可购自美国菌种保藏中心American Type Culture Collection)中，再通过接合转化方法转入Ralstoniaeutropha H16(中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC 1.7092)中，用同时含有250μg/ml卡那霉素与50μg/ml安普霉素的LB平板筛选带有绿色荧光的阳性克隆，即得到用pSP载体构建的转化体Ralstonia eutropha H16(pSP-kana-GFP)。

比较例1：用载体pBBR1MCS2制备整合绿色荧光蛋白(GFP)的质粒pBBR1-GFP

用引物9(SEQ ID No.：7)和引物10(SEQ ID No.：8)以质粒pBBR1MCS-2(KovachME,Elzer PH,Hill DS,Robertson GT,Farris MA,Roop RM,Peterson KM.,1995.Four newderivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carryingdifferent antibiotic-resistance cassettes.Gene.166,175-176)为模板PCR扩增得到载体片段，片段上带有复制子及卡那霉素抗性基因；用引物11(SEQ ID No.：9)和引物12(SEQ ID No.：10)以合成片段04(SEQ ID No.：18)为模板扩增得到含有GFP基因的DNA片段；通过Gibson Assembly方法将两片段相连接，得到用质粒载体pBBR1MCS2制备整合绿色荧光蛋白(GFP)的质粒pBBR1-GFP。使用的引物如下表2。

表2

使用与实施例1同样的方法将pBBR1-GFP质粒转入Ralstonia eutropha H16，即得到转入pBBR1-GFP质粒的Ralstonia eutropha H16(pBBR1-GFP)。

实施例2：Ralstonia eutropha H16(pSP-kana-GFP)的质粒保留率(plasmidretention rate)

使用流式细胞仪鉴定了Ralstonia eutropha H16(pSP-kana-GFP)的质粒保留率。测定如下进行：分别用含有250μg/ml卡那霉素和未添加抗生素的LB液体培养基对转化体进行摇床培养(30℃，220rpm/min)，每24小时传代一次，测定连续传代2、4、6、8天后的转化体质粒保留率。

首先将转接菌液用10×PBS(购自北京Solarbio公司，产品货号P1022)溶液调菌液OD值为0.012，吸取200μl稀释后的菌液加入96孔板(购自美国Corning公司，产品目录号351172)，使用流式细胞仪(贝克曼CytoFLEX)对每个样品中带绿色荧光的细胞数进行统计，只有保留了pSP-kana-GFP的转化体才能发出绿色荧光，其占所有细胞总数的百分比即为质粒保留率。具体实验操作按照仪器说明书执行。结果如图2。

从图2中可以看出，Ralstonia eutropha H16(pSP-kana-GFP)在不添加卡那霉素抗性条件下连续转接后，质粒没有明显丢失现象，质粒保留率在转接8天后依然保持在90％以上，与添加卡那霉素条件下进行转接没有显著差异。根据以上结果可以认为pSP载体在不施加抗生素条件下能够稳定保持。

比较例2：Ralstonia eutropha H16(pBBR1-GFP)的质粒保留率

用Ralstonia eutropha H16(pBBR1-GFP)代替实施例1中的Ralstonia eutrophaH16(pSP-kana-GFP)，以实施例2中相同的方法测定质粒保留率。结果如图3。

从图3可以看出，Ralstonia eutropha H16(pBBR1-GFP)在不添加卡那霉素抗性条件下连续转接后，质粒明显丢失，转接8天后仅有不到10％的转化体保留了pBBR1-GFP质粒，与添加卡那霉素条件下进行转接有显著差异。根据以上结果可以认为pBBR1MCS2载体不施加抗生素选择压力不能稳定保持。

实施例3：用帮助质粒删除pSP-kana-GFP质粒上的卡那霉素抗性基因

用引物13(SEQ ID No.：11)和引物14(SEQ ID No.：12)以质粒pBBR1MCS2为模板PCR扩增得到载体片段，片段上带有复制子及卡那霉素抗性基因；用引物15(SEQ ID No.：13)和引物16(SEQ ID No.：14)以合成片段05(SEQ ID No.：19)为模板扩增得到含有Ptet诱导型启动子、VCre基因(SEQ ID No.：21)及壮观霉素抗性基因的DNA片段；通过GibsonAssembly方法将两片段相连接，得到帮助质粒pVCre。使用的引物如下表3。

表3

将帮助质粒pVCre转入大肠杆菌S17-1中，通过接合转化方法转入实施例1中得到的转化体，用同时含有500μg/ml壮观霉素与50μg/ml安普霉素的LB平板，随机挑取3个带有绿色荧光的克隆，用引物17(SEQ ID No.：23)和引物18(SEQ ID No.：24)进行PCR验证，得到预期的1104bp的条带，使用同样引物对转化体Ralstonia eutropha H16(pSP-kana-GFP)进行扩增作为对照，得到预期的3074bp条带(图4)，证明导入的含有VCre重组酶的基因的帮助质粒pVCre删除了片段长度为1970bp的p15A复制子和卡那霉素抗性基因。最后，将阳性克隆在无抗性平板上培养丢失pVCre质粒，即得到无p15A复制子和卡那霉素抗性基因的pSP载体转化体Ralstonia eutropha H16(pSP-GFP)。

实施例4：Ralstonia eutropha H16(pSP-GFP)的质粒保留率

以实施例2中相同的方法，用Ralstonia eutropha H16(pSP-GFP)在无抗条件下测定质粒保留率，同时用Ralstonia eutropha H16(pSP-kana-GFP)作为对照。结果如图5所示。

从图5中可以看出，Ralstonia eutropha H16(pSP-GFP)在不添加卡那霉素抗性条件下连续转接后，质粒没有明显丢失现象，与Ralstonia eutropha H16(pSP-kana-GFP)没有显著差异。根据以上结果可以认为pSP-kana-GFP在删除卡那霉素抗性基因及p15A复制子后依然能够稳定保持。

总结上述内容，本申请构建的删除了p15A复制子和卡那霉素抗性基因的载体相对于未删除上述基因的载体的稳定保持率没有显著差异，另外，本申请构建的稳定载体消除了卡那霉素抗性基因扩散到自然界的隐患。

序列表

<110> 深圳蓝晶生物科技有限公司

<120> 删除稳定载体上冗余片段的方法，采用该方法得到的稳定载体及其应用

<130> DI20-1223-XC03

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 1

<400> 1

cgtctcattt tcgccagata tcggtagcgg agtgtatact ggcttac 47

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 2

<400> 2

tcagaagaac tcgtcaagaa ggc 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 3

<400> 3

gccttcttga cgagttcttc tga 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 4

<400> 4

gcataaggtt cgcgtagaac g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 7

<400> 5

cgttctacgc gaaccttatg c 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 8

<400> 6

cgatatctgg cgaaaatgag acg 23

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 9

<400> 7

cgatttaaat tggcgaaaat gagacgtatc gaattcctgc agcccgggg 49

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 10

<400> 8

aagcacatcc ggtgacagct atcaagctta tcgataccgt 40

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 11

<400> 9

agctgtcacc ggatgtgctt 20

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 12

<400> 10

acgtctcatt ttcgccaatt taaatcg 27

<210> 11

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 13

<400> 11

cgatttaaat tggcgaaaat gagacgtatc gaattcctgc agcccgggg 49

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 14

<400> 12

cgatatctgg cgaaaatgag acgatatcaa gcttatcgat accgt 45

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 15

<400> 13

cgtctcattt tcgccagata tcg 23

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 16

<400> 14

acgtctcatt ttcgccaatt taaatcg 27

<210> 15

<211> 1912

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成片段 01

<400> 15

gtagcggagt gtatactggc ttactatgtt ggcactgatg agggtgtcag tgaagtgctt 60

catgtggcag gagaaaaaag gctgcaccgg tgcgtcagca gaatatgtga tacaggatat 120

attccgcttc ctcgctcact gactcgctac gctcggtcgt tcgactgcgg cgagcggaaa 180

tggcttacga acggggcgga gatttcctgg aagatgccag gaagatactt aacagggaag 240

tgagagggcc gcggcaaagc cgtttttcca taggctccgc ccccctgaca agcatcacga 300

aatctgacgc tcaaatcagt ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 360

tcccctggcg gctccctcgt gcgctctcct gttcctgcct ttcggtttac cggtgtcatt 420

ccgctgttat ggccgcgttt gtctcattcc acgcctgaca ctcagttccg ggtaggcagt 480

tcgctccaag ctggactgta tgcacgaacc ccccgttcag tccgaccgct gcgccttatc 540

cggtaactat cgtcttgagt ccaacccgga aagacatgca aaagcaccac tggcagcagc 600

cactggtaat tgatttagag gagttagtct tgaagtcatg cgccggttaa ggctaaactg 660

aaaggacaag ttttggtgac tgcgctcctc caagccagtt acctcggttc aaagagttgg 720

tagctcagag aaccttcgaa aaaccgccct gcaaggcggt tttttcgttt tcagagcaag 780

agattacgcg cagaccaaaa cgatctcaag aagatcatct tattaaaggg tccccaataa 840

ttacgattta aattggatga atgtcagcta ctgggctatc tggacaaggg aaaacgcaag 900

cgcaaagaga aagcaggtag cttgcagtgg gcttacatgg cgatagctag actgggcggt 960

tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg ccctctggta aggttgggaa 1020

gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctt gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc 1080

aagatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca 1140

cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac 1200

aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt 1260

tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc 1320

gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg 1380

aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc 1440

tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc 1500

ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat 1560

ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc 1620

cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca 1680

tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga 1740

ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat 1800

tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc 1860

tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct ga 1912

<210> 16

<211> 2503

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成片段 02

<400> 16

gccttcttga cgagttcttc tgatcaattt ccgagaatga cagttctcag aaattgattt 60

gacttttgtc cttttccgct gcataaccct gcttcggggt cattatagcg attttttcgg 120

tatatccatc ctttttcgca cgatatacag gattttgcca aagggttcgt gtagactttc 180

cttggtgtat ccaacggcgt cagccgggca ggataggtga agtaggccca cccgcgagcg 240

ggtgttcctt cttcactgtc ccttattcgc acctggcggt gctcaacggg aatcctgctc 300

tgcgaggctg gccgtaggcc ggccgcgatg caggtggctg ctgaaccccc agccggaact 360

gaccccacaa ggccctgtac acgcctcaaa aggacgggag tgggacagcg tagccatagt 420

ccgagccgaa gagacaatcg ttcccgacag cgaaagccca gaaagcgaag aaaggcgcct 480

cttctacgtc gccgtcacgc gcgccaggga ttgcctgttt atctcaacgg cgaagaagaa 540

cccgacctcg cgcttcgtcc ttgaggctgg cctaagcctt acttcctgag gcgcgcattc 600

tttgtgcgtt atatggcact ttcgtagaat tcctcgcctt ttactttaac aacgacccgt 660

aagtaccggg ggaacagctc gatctctcgg gtacaacagg cacaaagtta acttgcgtat 720

acgtctaagg gccgctaacc ttcacggcaa cgcaaccgcg gacgtcattt ttgccgaaaa 780

cggttgcacg atccaccggc ggttccggtg aacagcttaa aggtttttga accgaatgga 840

tatcaagcta gcccacccca gcaagacgac gcctgaggat ttgaagcagt tggcaaatct 900

ctccgcggtg atgctgcaga aaattcggga tgagatgctg gagccatttc ctcggaagga 960

agccccgctg atcccgtctg gccgcctaca agaattgtgt ggcatcgaca aaacgcggat 1020

gaaccggtcc ctcaaaaagg gggatctccc tcagggccag caatcgcgac ccggtgcagt 1080

gcgctatttc agcctcagcg aggcaatgca atggatccga gcggaactta agcctgtccc 1140

gcgaagggga ccaggtaaag tcattgcagt tgcgaacttc aagggcggtg tcacgaagac 1200

cactatgtcc accctcctct gccagggctt gagtctgcgg cgaggtcgga aggtgtgcca 1260

cgttgatctg gatccgcagg gaagcgcaac cacgctgtat ggcatcaatc cacatgccga 1320

ggtgtcgtcc gaaaacacca ttatgccgct catcgaggcg tatttggcgg gcgagtcctt 1380

cgatatgcga gggcttcctc aggagactta ctggcctaac ctggatttga ttccttcgtc 1440

tactgagctt ttcaacgcgg agtttatgct tccggctcgg gcgacggcag aggaaggcca 1500

tattccgttc gagcgcgtgt taagtaacgg cctcgattcg ttgaaagacg aatatgacta 1560

catcatcctc gacacggctc ctaccctcag ctacctgacc atcaacgcga ttttcgctgc 1620

cgatggcgtc atcgtaccgg tggtcccgga caccttggct ttcgcgtcta tggtccagtt 1680

ctggcaactc ttctcggacc tagtaacagg catggaagag cagagcgagg gatctaaaaa 1740

ggagttcgac tttctcgatg ttctcatgac acgcatggag aaaaagaacg ctcctcgcct 1800

ggtggcagac tggattcgcg gcgtctatgg gtcgcgcgtg ctgccgattg agatccctga 1860

gacggacctc gcccgtaaca gcagcattca atttcgcacg gtctatgacc tctcctctag 1920

cgaggcgaac accgagacga tgcgacgcat tcgccaaccc tgcgatgagt ttgtcgacta 1980

tgtggacgac aaggtcagcg cgctttggca aggaattgaa gaatgagttt gagagaaaag 2040

cttgccgcaa aggctgggaa catcaaggtc acggcggaag acttggagaa agccgctgcg 2100

cgcggtccgc aagcgccgcg aactgcgccc ggtcagttaa tgcatatgca agggaaggtt 2160

gagcgacagg ctaacgagat cgcgcaacta agagcagaac ttgagtcggc ccgcgtcagc 2220

ggcggcgcag tggatgtgcc tatcgaccaa ctgcatgagg tcccaggccg cagacgcttc 2280

atgcctcccg agaagtatgt cgaattgagg gaaaacctca ggcacaacaa gctcgttcat 2340

cctgtgattg tatgccctcg gcctgcggga ggcttcgaga ttgtctccgg gcatcaccgg 2400

acagacgcgt accgcgagct tgggcgcgat cacatacgct gcgtgctcgg cgaacttagt 2460

tcagacgagg ctgacacggg cgcgttctac gcgaacctta tgc 2503

<210> 17

<211> 2381

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成片段 03

<400> 17

cgttctacgc gaaccttatg cagtcagatt taacggattt cgagaagttt cggaagttcg 60

acgaactgct gcttcgcagc ccagacaaga ctcaagccgc aatagctgaa caggctggtg 120

tacctgtctc gactctctca gagattttgt cgttccggaa cttgcctccc gaggtcctaa 180

gccttctcga tagccgccca gacctgctcg ggtcgaatgc tggcgccgag ttggcaaggg 240

cgaccaaaga cggtcgcggg gatcgggtcg tcgaagcggt taagttgttg gccgagaaga 300

agatcgatca acagcaggcc gtacggatga ctaaggccga gcaggttaag accaggcctg 360

ccgcatctac cggcttcaaa atcaaggcgg gaaaggcgac ttggtgcgat gttcgtatcg 420

caaagaaagt catgcgcatt gagttccgca gcgaggaaga agcggaagcg gcccaatcgg 480

ccattcgcga acatctggaa gggttagcta aagctgcgtc ggaagacgca aaaagctaag 540

tgcttgtttt ttaaggactt cgtactacga atcgaggttt taagccatgt ctagactgta 600

atcctacaaa aacaaaagcc cacggcggca accgtgggct tttgagaact tcaagctgac 660

cagtttcccg gccgctacac accgaagcca ctcgacatgg attcgttagt cggagtgtag 720

cggaacgcga acctgagtca agcgacttca accatttttt acgaatggga aggtcatatg 780

actttcgcgc aacgctccgt tgctggcgag gatgttgctc gcccacaaaa acaccttaac 840

cagacagacg ctctgattgc tccggcgccc aagcgcctca aacgcaagac tatcgaagca 900

gtcgagcgcg caactcgaat cgtcgggatc gggcgtagcg cccgatcagc tcttgccgcc 960

ctcgcccgca cggcgaataa cgatgacccc accggtaaga tctttaagca ccgggaaacg 1020

ctttgtgccg aaaccggaat gtcgccggct acttggtacc gtgctcaacg agaactgctc 1080

gacttgggcc taattaccgt cgacgttcaa gttcggaagc gatttggccg attcgcagga 1140

gcctacattt acctgacgga aaaagcgacg gagatgctcg gcttaagctc gcgaaaagaa 1200

gaagaaacca cgggtacggg cgaggacgac acagcgcagc tcggcgagcc ggccgttcca 1260

ccaccctctt ctatggcgca accgtctctc aaaacgagag tcctgtttac agaagatcgt 1320

gtcccatact cctttcaaaa aagacagcag gatcggctcc cccaggacct gacacgtctg 1380

cgcggcctgg gtcttgatgt aaatttaatt ttttggttga tgcgaaaggc taaagagcaa 1440

ggccactttc tctcagatgt cgtaagcgcg acatgggaga gtcttgcgaa agcacgcgtg 1500

ccaaaagcgt atctgcttgc cctactcacc gcccgcaccg atttcagtgc tgtctgcaaa 1560

gcaaaggcac tcaaagaaga caaagcccga atccaagtgc aggaccgcga tttcgtgcgt 1620

tcgatactcg caggggcagc gcggcagtgt ttcgtggacg aaaaaggcaa ccatttcgaa 1680

gtcgaaagcg acggaagctc agtgcttgtc accgaggtcc aaagtgcggt cacttcccgc 1740

ttggtaggaa cttccctcgc cgaatttgca aggcgactac acgctggtgc gtaccagaaa 1800

gctgaggtct acgctgctcc ccagagagca agcggccggc tcgagaaacg gggaaaggag 1860

gcggcttcga cgttatcggc gttgcgagcg atgctgcgcg accgcaggtc agccaacgcg 1920

gcaaacacga cgaacaatgc tcatgccatg gcctagggtg tgttttgcgc tgaaagtcta 1980

gggcggcgga tttgtcctac tcaggagagc gttcaccgac aaacaacaga taaaacgaaa 2040

ggcccagtct ttcgactgag cctttcgttt tatttgatgc ctttaattaa agcggataac 2100

aatttcacac aggagagtga agagcttttg ctcttcatcc aagcgagacc aaaaggtctc 2160

gccgcgaccc attaccgcct ttgagtgagc gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgactagt 2220

cttggactcc tgttgataga tccagtaatg acctcagaac tccatctgga tttgttcaga 2280

acgctcggtt gccgccgggc gttttttatt ggtgagaatc cagtcaattt ccgagaatga 2340

cagttctcag aaattgaacg tctcattttc gccagatatc g 2381

<210> 18

<211> 1549

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成片段 04

<400> 18

agctgtcacc ggatgtgctt tccggtctga tgagtccgtg aggacgaaac agcctctaca 60

aataattttg tttaagagcg gcgagacctt tcacacagga atgcctccac accgctcgtc 120

acatcctgtt gcgttcactg gaatcccagt atagactttg acctgcgagc aagctgtcac 180

cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa cagcctctac aaataatttt 240

gtttaagagt tactagagaa agaggagaaa tactagatgc gtaaaggcga agagctgttc 300

actggtgtcg tccctattct ggtggaactg gatggtgatg tcaacggtca taagttttcc 360

gtgcgtggcg agggtgaagg tgacgcaact aatggtaaac tgacgctgaa gttcatctgt 420

actactggta aactgccggt accttggccg actctggtaa cgacgctgac ttatggtgtt 480

cagtgctttg ctcgttatcc ggaccatatg aagcagcatg acttcttcaa gtccgccatg 540

ccggaaggct atgtgcagga acgcacgatt tcctttaagg atgacggcac gtacaaaacg 600

cgtgcggaag tgaaatttga aggcgatacc ctggtaaacc gcattgagct gaaaggcatt 660

gactttaaag aagacggcaa tatcctgggc cataagctgg aatacaattt taacagccac 720

aatgtttaca tcaccgccga taaacaaaaa aatggcatta aagcgaattt taaaattcgc 780

cacaacgtgg aggatggcag cgtgcagctg gctgatcact accagcaaaa cactccaatc 840

ggtgatggtc ctgttctgct gccagacaat cactatctga gcacgcaaag cgttctgtct 900

aaagatccga acgagaaacg cgatcatatg gttctgctgg agttcgtaac cgcagcgggc 960

atcacgcatg gtatggatga actgtacaaa taatcgtcac tccaccggtg cttaataacc 1020

aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt 1080

ttgtcggtga acgctctcta ctagagtcac actggctcac cttcgggtgg gcctttctgc 1140

gtttatatac tagagctgct aacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg 1200

ctgagcaata actagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc 1260

tgaaaggagg aactatatcc ggattactag aggtcatgct tgccatctgt tttcttgcaa 1320

gatgctcact caaaggcggt aatgggtcga tgaagagcaa aagctcttca ctcgtcgtga 1380

ctgggaaaac cctggcggtc tcgcttggac tcctgttgat agatccagta atgacctcag 1440

aactccatct ggatttgttc agaacgctcg gttgccgccg ggcgtttttt attggtgaga 1500

atccaggggt ccccaataat tacgatttaa attggcgaaa atgagacgt 1549

<210> 19

<211> 2185

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成片段 05

<400> 19

cgtctcattt tcgccagata tcgacgtctt aagacccact ttcacattta agttgttttt 60

ctaatccgca tatgatcaat tcaaggccga ataagaaggc tggctctgca ccttggtgat 120

caaataattc gatagcttgt cgtaataatg gcggcatact atcagtagta ggtgtttccc 180

tttcttcttt agcgacttga tgctcttgat cttccaatac gcaacctaaa gtaaaatgcc 240

ccacagcgct gagtgcatat aatgcattct ctagtgaaaa accttgttgg cataaaaagg 300

ctaattgatt ttcgagagtt tcatactgtt tttctgtagg ccgtgtacct aaatgtactt 360

ttgctccatc gcgatgactt agtaaagcac atctaaaact tttagcgtta ttacgtaaaa 420

aatcttgcca gctttcccct tctaaagggc aaaagtgagt atggtgccta tctaacatct 480

caatggctaa ggcgtcgagc aaagcccgct tattttttac atgccaatac aatgtaggct 540

gctctacacc tagcttctgg gcgagtttac gggttgttaa accttcgatt ccgacctcat 600

taagcagctc taatgcgctg ttaatcactt tacttttatc taatctagac atcattaatt 660

cctaattttt gttgacactc tatcgttgat agagttattt taccactccc tatcagtgat 720

agagaaaaga attcaagctg tcaccggatg tgctttccgg tctgatgagt ccgtgaggac 780

gaaacagcct ctacaaataa ttttgtttaa tactagagaa agaggagaaa tactagatga 840

tcgagaacca gctgagcctg ctgggtgatt tcagcggcgt gcgtccggac gatgttaaga 900

ccgcgatcca ggcggcgcaa aagaaaggta ttaacgttgc ggagaacgaa caattcaaag 960

cggcgtttga gcacctgctg aacgagttca agaaacgtga ggaacgttac agcccgaaca 1020

ccctgcgtcg tctggaaagc gcgtggacct gctttgtgga ttggtgcctg gcgaaccatc 1080

gtcacagcct gccggcgacc ccggacaccg ttgaggcgtt ctttatcgaa cgtgcggagg 1140

aactgcaccg taacaccctg agcgtgtacc gttgggcgat tagccgtgtt catcgtgttg 1200

cgggttgccc ggacccgtgc ctggatatct atgtggagga tcgtctgaag gcgattgcgc 1260

gtaagaaagt gcgtgagggc gaagcggtta aacaggcgag cccgtttaac gaacaacacc 1320

tgctgaagct gaccagcctg tggtaccgta gcgacaaact gctgctgcgt cgtaacctgg 1380

cgctgctggc ggtggcgtat gagagcatgc tgcgtgcgag cgaactggcg aacatccgtg 1440

ttagcgacat ggagctggcg ggtgatggca ccgcgattct gaccatcccg attaccaaga 1500

ccaaccacag cggcgagccg gacacctgca ttctgagcca ggatgtggtt agcctgctga 1560

tggactacac cgaagcgggc aagctggaca tgagcagcga tggtttcctg tttgtgggcg 1620

ttagcaaaca caacacctgc atcaagccga agaaagataa acagaccggt gaagttctgc 1680

acaagccgat taccaccaaa accgtggagg gcgttttcta tagcgcgtgg gaaaccctgg 1740

atctgggtcg tcaaggcgtg aagccgttta ccgcgcacag cgcgcgtgtt ggtgcggcgc 1800

aggacctgct gaagaaaggc tacaacaccc tgcaaatcca gcaaagcggt cgttggagca 1860

gcggcgcgat ggttgcgcgt tatggtcgtg cgatcctggc gcgtgacggc gcgatggcgc 1920

acagccgtgt gaaaacccgt agcgcgccga tgcaatgggg caaggacgag aaagattaat 1980

gataagtagc ggagtgtata ctggcttacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgactagtc 2040

ttggactcct gttgatagat ccagtaatga cctcagaact ccatctggat ttgttcagaa 2100

cgctcggttg ccgccgggcg ttttttattg gtgagaatcc aggggtcccc aataattacg 2160

atttaaattg gcgaaaatga gacgt 2185

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VloxP序列

<400> 20

tcaatttccg agaatgacag ttctcagaaa ttga 34

<210> 21

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VCre重组酶的基因序列

<400> 21

atgatcgaga accagctgag cctgctgggt gatttcagcg gcgtgcgtcc ggacgatgtt 60

aagaccgcga tccaggcggc gcaaaagaaa ggtattaacg ttgcggagaa cgaacaattc 120

aaagcggcgt ttgagcacct gctgaacgag ttcaagaaac gtgaggaacg ttacagcccg 180

aacaccctgc gtcgtctgga aagcgcgtgg acctgctttg tggattggtg cctggcgaac 240

catcgtcaca gcctgccggc gaccccggac accgttgagg cgttctttat cgaacgtgcg 300

gaggaactgc accgtaacac cctgagcgtg taccgttggg cgattagccg tgttcatcgt 360

gttgcgggtt gcccggaccc gtgcctggat atctatgtgg aggatcgtct gaaggcgatt 420

gcgcgtaaga aagtgcgtga gggcgaagcg gttaaacagg cgagcccgtt taacgaacaa 480

cacctgctga agctgaccag cctgtggtac cgtagcgaca aactgctgct gcgtcgtaac 540

ctggcgctgc tggcggtggc gtatgagagc atgctgcgtg cgagcgaact ggcgaacatc 600

cgtgttagcg acatggagct ggcgggtgat ggcaccgcga ttctgaccat cccgattacc 660

aagaccaacc acagcggcga gccggacacc tgcattctga gccaggatgt ggttagcctg 720

ctgatggact acaccgaagc gggcaagctg gacatgagca gcgatggttt cctgtttgtg 780

ggcgttagca aacacaacac ctgcatcaag ccgaagaaag ataaacagac cggtgaagtt 840

ctgcacaagc cgattaccac caaaaccgtg gagggcgttt tctatagcgc gtgggaaacc 900

ctggatctgg gtcgtcaagg cgtgaagccg tttaccgcgc acagcgcgcg tgttggtgcg 960

gcgcaggacc tgctgaagaa aggctacaac accctgcaaa tccagcaaag cggtcgttgg 1020

agcagcggcg cgatggttgc gcgttatggt cgtgcgatcc tggcgcgtga cggcgcgatg 1080

gcgcacagcc gtgtgaaaac ccgtagcgcg ccgatgcaat ggggcaagga cgagaaagat 1140

taa 1143

<210> 22

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VCre重组酶的氨基酸序列

<400> 22

Met Ile Glu Asn Gln Leu Ser Leu Leu Gly Asp Phe Ser Gly Val Arg

1 5 10 15

Pro Asp Asp Val Lys Thr Ala Ile Gln Ala Ala Gln Lys Lys Gly Ile

20 25 30

Asn Val Ala Glu Asn Glu Gln Phe Lys Ala Ala Phe Glu His Leu Leu

35 40 45

Asn Glu Phe Lys Lys Arg Glu Glu Arg Tyr Ser Pro Asn Thr Leu Arg

50 55 60

Arg Leu Glu Ser Ala Trp Thr Cys Phe Val Asp Trp Cys Leu Ala Asn

65 70 75 80

His Arg His Ser Leu Pro Ala Thr Pro Asp Thr Val Glu Ala Phe Phe

85 90 95

Ile Glu Arg Ala Glu Glu Leu His Arg Asn Thr Leu Ser Val Tyr Arg

100 105 110

Trp Ala Ile Ser Arg Val His Arg Val Ala Gly Cys Pro Asp Pro Cys

115 120 125

Leu Asp Ile Tyr Val Glu Asp Arg Leu Lys Ala Ile Ala Arg Lys Lys

130 135 140

Val Arg Glu Gly Glu Ala Val Lys Gln Ala Ser Pro Phe Asn Glu Gln

145 150 155 160

His Leu Leu Lys Leu Thr Ser Leu Trp Tyr Arg Ser Asp Lys Leu Leu

165 170 175

Leu Arg Arg Asn Leu Ala Leu Leu Ala Val Ala Tyr Glu Ser Met Leu

180 185 190

Arg Ala Ser Glu Leu Ala Asn Ile Arg Val Ser Asp Met Glu Leu Ala

195 200 205

Gly Asp Gly Thr Ala Ile Leu Thr Ile Pro Ile Thr Lys Thr Asn His

210 215 220

Ser Gly Glu Pro Asp Thr Cys Ile Leu Ser Gln Asp Val Val Ser Leu

225 230 235 240

Leu Met Asp Tyr Thr Glu Ala Gly Lys Leu Asp Met Ser Ser Asp Gly

245 250 255

Phe Leu Phe Val Gly Val Ser Lys His Asn Thr Cys Ile Lys Pro Lys

260 265 270

Lys Asp Lys Gln Thr Gly Glu Val Leu His Lys Pro Ile Thr Thr Lys

275 280 285

Thr Val Glu Gly Val Phe Tyr Ser Ala Trp Glu Thr Leu Asp Leu Gly

290 295 300

Arg Gln Gly Val Lys Pro Phe Thr Ala His Ser Ala Arg Val Gly Ala

305 310 315 320

Ala Gln Asp Leu Leu Lys Lys Gly Tyr Asn Thr Leu Gln Ile Gln Gln

325 330 335

Ser Gly Arg Trp Ser Ser Gly Ala Met Val Ala Arg Tyr Gly Arg Ala

340 345 350

Ile Leu Ala Arg Asp Gly Ala Met Ala His Ser Arg Val Lys Thr Arg

355 360 365

Ser Ala Pro Met Gln Trp Gly Lys Asp Glu Lys Asp

370 375 380

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 17

<400> 23

aaggcgagga attctacgaa agtgccatat aacgcac 37

<210> 24

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物 18

<400> 24

gcgtcagttt accattagtt gcgtcacctt cacc 34

<210> 25

<211> 2298

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> par 区域

<400> 25

atggatatca agctagccca ccccagcaag acgacgcctg aggatttgaa gcagttggca 60

aatctctccg cggtgatgct gcagaaaatt cgggatgaga tgctggagcc atttcctcgg 120

aaggaagccc cgctgatccc gtctggccgc ctacaagaat tgtgtggcat cgacaaaacg 180

cggatgaacc ggtccctcaa aaagggggat ctccctcagg gccagcaatc gcgacccggt 240

gcagtgcgct atttcagcct cagcgaggca atgcaatgga tccgagcgga acttaagcct 300

gtcccgcgaa ggggaccagg taaagtcatt gcagttgcga acttcaaggg cggtgtcacg 360

aagaccacta tgtccaccct cctctgccag ggcttgagtc tgcggcgagg tcggaaggtg 420

tgccacgttg atctggatcc gcagggaagc gcaaccacgc tgtatggcat caatccacat 480

gccgaggtgt cgtccgaaaa caccattatg ccgctcatcg aggcgtattt ggcgggcgag 540

tccttcgata tgcgagggct tcctcaggag acttactggc ctaacctgga tttgattcct 600

tcgtctactg agcttttcaa cgcggagttt atgcttccgg ctcgggcgac ggcagaggaa 660

ggccatattc cgttcgagcg cgtgttaagt aacggcctcg attcgttgaa agacgaatat 720

gactacatca tcctcgacac ggctcctacc ctcagctacc tgaccatcaa cgcgattttc 780

gctgccgatg gcgtcatcgt accggtggtc ccggacacct tggctttcgc gtctatggtc 840

cagttctggc aactcttctc ggacctagta acaggcatgg aagagcagag cgagggatct 900

aaaaaggagt tcgactttct cgatgttctc atgacacgca tggagaaaaa gaacgctcct 960

cgcctggtgg cagactggat tcgcggcgtc tatgggtcgc gcgtgctgcc gattgagatc 1020

cctgagacgg acctcgcccg taacagcagc attcaatttc gcacggtcta tgacctctcc 1080

tctagcgagg cgaacaccga gacgatgcga cgcattcgcc aaccctgcga tgagtttgtc 1140

gactatgtgg acgacaaggt cagcgcgctt tggcaaggaa ttgaagaatg agtttgagag 1200

aaaagcttgc cgcaaaggct gggaacatca aggtcacggc ggaagacttg gagaaagccg 1260

ctgcgcgcgg tccgcaagcg ccgcgaactg cgcccggtca gttaatgcat atgcaaggga 1320

aggttgagcg acaggctaac gagatcgcgc aactaagagc agaacttgag tcggcccgcg 1380

tcagcggcgg cgcagtggat gtgcctatcg accaactgca tgaggtccca ggccgcagac 1440

gcttcatgcc tcccgagaag tatgtcgaat tgagggaaaa cctcaggcac aacaagctcg 1500

ttcatcctgt gattgtatgc cctcggcctg cgggaggctt cgagattgtc tccgggcatc 1560

accggacaga cgcgtaccgc gagcttgggc gcgatcacat acgctgcgtg ctcggcgaac 1620

ttagttcaga cgaggctgac acgggcgcgt tctacgcgaa ccttatgcag tcagatttaa 1680

cggatttcga gaagtttcgg aagttcgacg aactgctgct tcgcagccca gacaagactc 1740

aagccgcaat agctgaacag gctggtgtac ctgtctcgac tctctcagag attttgtcgt 1800

tccggaactt gcctcccgag gtcctaagcc ttctcgatag ccgcccagac ctgctcgggt 1860

cgaatgctgg cgccgagttg gcaagggcga ccaaagacgg tcgcggggat cgggtcgtcg 1920

aagcggttaa gttgttggcc gagaagaaga tcgatcaaca gcaggccgta cggatgacta 1980

aggccgagca ggttaagacc aggcctgccg catctaccgg cttcaaaatc aaggcgggaa 2040

aggcgacttg gtgcgatgtt cgtatcgcaa agaaagtcat gcgcattgag ttccgcagcg 2100

aggaagaagc ggaagcggcc caatcggcca ttcgcgaaca tctggaaggg ttagctaaag 2160

ctgcgtcgga agacgcaaaa agctaagtgc ttgtttttta aggacttcgt actacgaatc 2220

gaggttttaa gccatgtcta gactgtaatc ctacaaaaac aaaagcccac ggcggcaacc 2280

gtgggctttt gagaactt 2298

<210> 26

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 复制蛋白 repA28

<400> 26

ggtcttgatg taaatttaat tttttggttg atgcgaaagg ctaaagagca aggccacttt 60

ctctcagatg tcgtaagcgc gacatgggag ag 92

Claims

1.一种删除稳定载体上冗余片段的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将稳定载体导入罗氏真养菌中获得转化体，其中，所述稳定载体中的所述冗余片段的上游和下游各有1个重组酶特异性识别的核苷酸序列，并且所述稳定载体包含par区域中的启动子parP、质粒稳定化因子parA、parB、识别序列parS，复制蛋白repA，以及所述冗余片段，优选地，所述par区域的核苷酸序列包含如SEQ ID No.：25所示的序列；

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述重组酶选自VCre重组酶、Bxb1重组酶、phiC31重组酶、TP901重组酶、HK022重组酶、Phi80重组酶、P21重组酶、Int3重组酶、Int4重组酶、Int5重组酶、Int9重组酶、Int11重组酶、Int12重组酶、Int13重组酶、P22重组酶、lamda重组酶、Cre重组酶、Dre重组酶、Vika重组酶、Flp重组酶、FimE重组酶、HbiF重组酶、A118重组酶中。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述重组酶特异性识别的核苷酸序列为VloxP序列，所述重组酶为VCre重组酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述罗氏真养菌是Ralstonia eutropha H16。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述冗余片段包括抗性基因，优选地，所述抗性基因是抗生素抗性基因，更优选地，所述抗性基因是卡那霉素抗性基因。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述冗余片段还包括大肠杆菌复制子。

7.一种通过如权利要求1至6中任一项所述的方法得到的稳定载体。

8.如权利要求7所述的稳定载体在基因工程中的应用。

9.如权利要求7所述的稳定载体用于罗氏真养菌中的应用。

10.一种罗氏真养菌重组菌，其包含如权利要求7所述的稳定载体。