CN113355345A - 一种基因组整合外源序列的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基因组整合外源序列的方法。所述方法包括以下步骤：1)在罗氏真养菌的基因组上插入位点特异性重组酶Bxb1对应的attB位点以构建基因组上整合了attB序列的重组罗氏真氧菌；2)构建含有外源序列、位点特异性重组酶Bxb1基因、位点特异性重组酶Bxb1对应的attP序列的重组载体；3)将步骤2)中构建的所述重组载体转入步骤1)中构建的所述重组罗氏真氧菌中，利用所述位点特异性重组酶Bxb1介导attB和attP序列之间的重组，从而将所述重组载体整合到所述重组罗氏真氧菌的基因组上。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基因组整合外源序列的方法，具体而言，涉及一种适用于罗氏真氧菌的基于位点特异性重组酶的基因插入方法。
背景技术
罗氏真氧菌(Ralstonia eutropha，也叫Cupriavidus necator)是研究PHA(聚羟基脂肪酸酯，一种完全可降解的生物基材料)合成的重要模式细菌，有潜力作为PHA工业生产的菌株。
现有的罗氏真氧菌的基因编辑技术手段基于以自杀质粒为载体的同源重组。自杀质粒中含有无法在罗氏真氧菌中复制的R6Kγ复制子，抗性基因，以及用于同源重组的DNA序列(称为同源臂)，同源臂序列可根据需要编辑的基因位点自由设计。当自杀质粒转入罗氏真氧菌后，在抗生素的选择压力下，自杀质粒载体上的同源臂序列与基因组上的相同序列之间发生同源重组从而实现定点基因编辑。另外罗氏真氧菌中还开发出了基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法，其原理同样是同源重组，而选择压力改为用Cas9蛋白定点切割基因组(Xiong,B.,Li,Z.,Liu,L.,Zhao,D.,Zhang,X.,Bi,C.,2018.Genome editing ofRalstonia eutropha using an electroporation-based CRISPR-Cas9 technique.Biotechnol.Biofuels.11:172)。
同源重组是发生在非姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组依赖同源区域或者序列的存在，DNA链的断裂是随机的，暴露出一些能与一系列蛋白质(如原核生物细胞内的RecA，以及真核生物细胞内的Rad51等)相结合的序列，最终实现DNA分子之间或分子之内的交叉重组。但是依靠序列随机断裂和底盘微生物本身的重组系统，会限制整合外源序列的长度，此外还需要优化同源区域(例如同源序列的长度和位置)，以达到比较好的基因编辑效果。
同源重组虽然理论上能够实现基因敲除、插入和替换，但是在实际应用中，所插入片段越大，基因插入的效率就会越小，限制了在多基因线路、复杂代谢通路等大片段基因插入等场景的应用。
与之相比，位点特异性重组在重组过程中，不依赖于DNA顺序的同源性(虽然部分由很短的同源序列)，而依赖于能与某些酶相结合的短DNA序列的存在，在这些具有高效性和特异性的重组酶的作用下，发生DNA链的断裂和重新连接。因而具有位点特异性，保证了重组的高度专一性和高度保守性，位点特异性重组在效率上也优于依靠RecA等蛋白的同源重组方法。
位点特异性重组系统具有高效可控、准确快速、特异性强、元件正交性好等很多优点，具有很广泛的应用前景，可以运用在基因编辑和遗传工程操作中。该系统来源于噬菌体，噬菌体在侵染细菌时会将其DNA插入到宿主细菌的染色体上，并和宿主同步复制分裂，这一过程需要噬菌体体内的位点特异性重组酶识别专门的“识别位点”——“attP”和“attB”(attP和attB分别存在于噬菌体和宿主染色体中)。重组酶介导attP和attB两个序列之间的重组，这一过程会将噬菌体DNA插入到宿主细菌染色体上，原有的attP和attB序列会在染色体上形成两个新的序列“attL”和“attR”。作为工具，位点特异性重组系统由整合酶的识别位点/序列和识别DNA序列并介导DNA重组的整合酶组成。通过改变重组酶识别位点的位置和序列方向，位点特异性重组酶可以作为一种把特定序列插入到DNA链上或者从DNA链上删除或者翻转特定序列的工具酶，因此被广泛用于不同底盘微生物中，进行任何切口做切割和缝合操作(重组DNA片段)。
基于位点特异性重组系统已经被应用到了不同的微生物，甚至真核细胞，包括大肠杆菌，芽孢杆菌，酿酒酵母，T细胞甚至胚胎干细胞，被广泛适用于外源基因的整合，天然产物的生产和基因治疗等。例如利用整合酶作为基因编辑工具，可以实现大肠杆菌基因组34kb大小的代谢路径的整合用于藻酸盐降解和乙醇生产(Christine Nicole S.Santos.,Drew D.Regitsky.,and Yasuo Yoshikuni.,2013.Implementation of stable andcomplex biological systems through recombinase-assisted genomeengineering.Nature Communications.4:2503)。
综上，现有的罗氏真氧菌的基因编辑技术手段基于以自杀质粒为载体的同源重组及基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法。同源重组和CRISPR/Cas9的基因编辑方法在插入基因时会随着插入片段变长而效率变低。位点特异性重组酶能够实现高效的长片段插入，而目前尚没有在罗氏真氧菌中可用的位点特异性重组酶及其相关工具。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明人开发了适用于罗氏真氧菌的基于位点特异性重组酶的基因插入方法，加上已有的同源重组技术，完善了罗氏真氧菌基因编辑技术。
因此，一方面，本发明提供了一种适用于罗氏真氧菌的基于位点特异性重组酶的基因插入方法，包括以下步骤：
1)在罗氏真养菌的基因组上插入位点特异性重组酶Bxb1对应的attB位点以构建基因组上整合了attB序列的重组罗氏真氧菌；
2)构建含有外源序列、位点特异性重组酶Bxb1基因、位点特异性重组酶Bxb1对应的attP序列的重组载体；
3)将步骤2)中构建的所述重组载体转入步骤1)中构建的所述重组罗氏真氧菌中，利用所述位点特异性重组酶Bxb1介导attB和attP序列之间的重组，从而将所述重组载体整合到所述重组罗氏真氧菌的基因组上。
通过上述方法，可实现外源序列(DNA片段)与载体一同整合到重组菌的基因组上。在实际应用中，优选地，可以根据需要将除了欲整合的DNA片段之外的载体部分删除掉。
因此，本发明的适用于罗氏真氧菌的基于位点特异性重组酶的基因插入方法优选地包括以下步骤：
a)在罗氏真养菌的基因组上插入位点特异性重组酶Bxb1对应的attB位点以构建基因组上整合了attB序列的重组罗氏真氧菌；
b)构建含有VCre重组酶基因的重组载体；
c)构建含有外源序列、位点特异性重组酶Bxb1基因、位点特异性重组酶Bxb1对应的attP序列、2个能够被步骤b)中的VCre重组酶特异性识别的VloxP序列的重组载体，其中，所述外源序列和所述attP序列在所述2个VloxP序列之间，所述位点特异性重组酶Bxb1基因不在所述2个VloxP序列之间；
d)将步骤c)中构建的所述重组载体转入步骤a)中构建的所述重组罗氏真氧菌中，利用所述位点特异性重组酶Bxb1介导attB和attP序列之间的重组，从而将所述重组载体整合到所述重组罗氏真氧菌的基因组上；
e)将步骤b)中构建的所述重组载体转入步骤d)得到的基因组上整合了所述重组载体的重组菌中，从而将上述重组载体的骨架部分从基因组上删除。
本发明方法步骤1)或a)中，所述罗氏真氧菌也可以是Ralstonia属的其它菌。优选地，所述罗氏真氧菌可为Ralstonia eutropha H16。
本发明方法步骤2)或c)中，优选地，所述重组载体可为无法在罗氏真氧菌中复制的质粒载体，如自杀质粒。优选地，所述重组载体的骨架部分包含能在大肠杆菌(如S17-1)中复制而不能在罗氏真氧菌中复制的复制子，优选地，所述复制子为选自pMB1复制子、pUC复制子、p15a复制子和R6Kγ复制子中的一种或多种，更优选地，所述复制子为pMB1复制子。优选地，所述重组载体的骨架部分还包含筛选标记基因，例如抗生素抗性基因；更优选地，所述重组载体的骨架部分还包含抗生素抗性基因，特别地，所述抗生素抗性基因为选自卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因中的一种或多种，更特别地，所述抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因。更优选地，所述质粒载体可源自质粒pK18mobsacB。
本发明方法步骤b)中，优选地，所述重组载体可为能在罗氏真氧菌中复制的质粒载体。优选地，所述重组载体的骨架部分包含既能在大肠杆菌(如S17-1)中复制也能在罗氏真氧菌中复制的复制子，优选地，所述复制子为选自pBBR1复制子、SC101复制子和RK2复制子中的一种或多种，更优选地，所述复制子为pBBR1复制子。优选地，所述重组载体的骨架部分还包含筛选标记基因，例如抗生素抗性基因；更优选地，所述重组载体的骨架部分还包含抗生素抗性基因，优选地，所述抗生素抗性基因为选自卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因中的一种或多种，更优选地，所述抗生素抗性基因为卡那霉素和壮观霉素抗性基因。更优选地，所述质粒载体可源自质粒pBBR1MCS2。
本发明方法步骤1)或a)中，优选地，所述位点特异性重组酶Bxb1对应的attB位点的序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明方法步骤2)或c)中，对所述外源序列没有特别的要求和限制。例如，外源序列的长度可为1,000,000bp以下，优选100,000bp以下。
本发明方法步骤2)或c)中，优选地，所述位点特异性重组酶Bxb1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
本发明方法步骤2)或c)中，优选地，所述位点特异性重组酶Bxb1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。
本发明方法步骤2)或c)中，优选地，所述位点特异性重组酶Bxb1对应的attP序列如SEQ ID NO:22所示。
本发明方法步骤b)中，优选地，所述VCre重组酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示。
本发明方法步骤b)中，优选地，所述VCre重组酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示。
本发明方法步骤c)中，优选地，所述VloxP序列如SEQ ID NO:44所示。
本发明方法步骤3)中，优选地，将重组载体转入大肠杆菌(例如，S17-1)中，再通过接合转化方法转入重组罗氏真氧菌中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用筛选标记筛选出基因组上整合了所述重组载体的重组罗氏真氧菌。
进一步优选地，本发明方法步骤1)或a)可以采用本领域已知的方法来实现(Xiong,B.,Li,Z.,Liu,L.,Zhao,D.,Zhang,X.,Bi,C.,2018.Genome editing ofRalstonia eutropha using an electroporation-based CRISPR-Cas9technique.Biotechnol.Biofuels.11:172)。例如，构建其中attB位点位于两个同源片段之间的无法在罗氏真氧菌中复制的自杀质粒，将该自杀质粒转入罗氏真养菌，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，通过筛选得到整合了attB序列的重组罗氏真氧菌。具体地，本发明方法步骤1或a)包括以下步骤：使用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作为引物以Ralstonia eutropha H16基因组为模板进行PCR扩增得到同源片段H1和H2，使用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4作为引物以质粒pK18mobsacB为模板PCR扩增得到载体片段，使用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8作为引物以SEQ ID NO:9为模板扩增得到含有Bxb1对应的attB序列的片段，将H1、H2和attB序列通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，其中所述attB位点位于两个同源片段H1、H2之间，得到重组质粒pK18mobsacB-Bxb1；将重组质粒pK18mobsacB-Bxb1转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入Ralstonia eutropha H16中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有卡那霉素与安普霉素的LB平板筛选出阳性克隆，该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌；将第一次同源重组菌在含有蔗糖的LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并鉴别出Bxb1的attB序列整合到基因组的重组菌，得到的重组菌为Ralstonia eutropha Bxb1-attB。
进一步优选地，本发明方法步骤2)包括以下步骤：使用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6作为引物以质粒pK18mobsacB为模板PCR扩增得到载体片段，使用SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10作为引物以SEQ ID NO:19为模板扩增得到含有Bxb1重组酶基因及其对应的attP序列的片段，将片段通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pBxb1-attP。
进一步优选地，本发明方法步骤3)包括以下步骤：将重组质粒pBxb1-attP转入大肠杆菌(如S17-1)中，再通过接合转化方法转入Ralstonia eutropha Bxb1-attB中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，同时通过筛选标记筛选得到基因组上整合了所述重组载体的重组罗氏真氧菌。
进一步优选地，本发明方法步骤b)包括以下步骤：使用SEQ ID NO:36和SEQ IDNO:37作为引物以质粒pBBR1MCS2为模板PCR扩增得到复制子片段；使用SEQ ID NO:38和SEQID NO:39作为引物以SEQ ID NO:40为模板扩增得到DNA片段，该片段含有VCre重组酶基因，卡那霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因；将片段通过Gibson Assembly方法与复制子片段连接，得到重组质粒pVCre。
进一步优选地，本发明方法步骤c)包括以下步骤：使用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6作为引物以质粒pK18mobsacB为模板PCR扩增得到载体片段；得到含有Bxb1重组酶基因及其对应的attP序列、欲整合的外源基因，及2个能够被VCre重组酶特异性识别的VloxP序列的片段，并将片段通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒。具体地，以外源基因为GFP为例，本发明方法步骤c)包括以下步骤：使用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6作为引物以质粒pK18mobsacB为模板PCR扩增得到载体片段；使用SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18作为引物以SEQ ID NO:43为模板扩增得到DNA片段，该片段含有Bxb1重组酶基因及其对应的attP序列，欲整合的外源基因(GFP)，及2个能够被VCre重组酶特异性识别的VloxP序列；将片段通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pBxb1-attP-VCre。
进一步优选地，本发明方法步骤d)包括以下步骤：将步骤c)的重组质粒例如pBxb1-attP-VCre转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入Ralstonia eutrophaBxb1-attB中，通过筛选标记筛选得到基因组上整合了所述重组载体的重组罗氏真氧菌。
进一步优选地，本发明方法步骤e)包括以下步骤：将步骤b)中得到的重组质粒pVCre转入大肠杆菌S17-1中，通过接合转化方法转入步骤d)的重组菌，通过筛选标记筛选得到外源基因整合到基因组的重组菌(例如Ralstonia eutropha Bxb1-GFP)。
优选地，本发明方法步骤e)进一步包括：将所述外源基因整合到基因组的重组菌在无抗性平板上培养以使重组菌丢失所述含有VCre重组酶基因的重组载体的步骤。
本发明的适用于罗氏真氧菌的基于位点特异性重组酶的基因插入方法中，如图1所示：首先，在罗氏真养菌的基因组上插入位点特异性重组酶Bxb1对应的attB位点以构建基因组上整合了attB序列的重组罗氏真氧菌；构建含有VCre重组酶基因的重组载体；构建含有外源序列、位点特异性重组酶Bxb1基因、位点特异性重组酶Bxb1对应的attP序列、2个能够被上述VCre重组酶特异性识别的VloxP序列的重组载体，其中，所述外源序列和所述attP序列在所述2个VloxP序列之间，所述位点特异性重组酶Bxb1基因不在所述2个VloxP序列之间(如图2所示)，并将该重组载体转入上述构建的基因组上整合了attB序列的重组罗氏真氧菌中，利用所述位点特异性重组酶Bxb1介导attB和attP序列之间的重组，从而将所述重组载体整合到所述重组罗氏真氧菌的基因组上，其中，重组酶介导attP和attB两个序列之间的重组，这一过程会将噬菌体DNA插入到宿主细菌染色体上，原有的attP和attB序列会在染色体上形成两个新的序列“attL”和“attR”；接着，将上述构建的含有VCre重组酶基因的重组载体转入基因组上整合了所述重组载体的重组菌中，从而将上述重组载体的骨架部分从基因组上删除。
另一方面，本发明提供了一种重组载体(自杀质粒)，其包含外源序列、位点特异性重组酶Bxb1基因、位点特异性重组酶Bxb1对应的attP序列。优选地，所述重组载体进一步包含2个能够被VCre重组酶特异性识别的VloxP序列，其中，所述外源序列和所述attP序列在所述2个VloxP序列之间，所述位点特异性重组酶Bxb1基因不在所述2个VloxP序列之间。优选地，所述重组载体的骨架部分包含能在大肠杆菌(如S17-1)中复制而不能在罗氏真氧菌中复制的复制子，优选地，所述复制子为选自pMB1复制子、pUC复制子、p15a复制子和R6Kγ复制子中的一种或多种，更优选地，所述复制子为pMB1复制子。所述重组载体的骨架部分还包含抗生素抗性基因，优选地，包含卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因中的一种或多种，更优选地，所述抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因。优选地，所述位点特异性重组酶Bxb1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。更优选地，所述位点特异性重组酶Bxb1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。优选地，所述位点特异性重组酶Bxb1对应的attP序列如SEQ ID NO:22所示。优选地，所述VloxP序列如SEQ IDNO:44所示。
再一方面，本发明提供了一种重组载体，其包含VCre重组酶基因。优选地，所述重组载体的骨架部分包含既能在大肠杆菌(如S17-1)中复制也能在罗氏真氧菌中复制的复制子，优选地，所述复制子为选自pBBR1复制子，SC101复制子和RK2复制子中的一种或多种，更优选地，所述复制子为pBBR1复制子。所述重组载体的骨架部分还包含抗生素抗性基因，优选地，包含卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因中的一种或多种，更优选地，所述抗生素抗性基因为卡那霉素和壮观霉素抗性基因。优选地，所述VCre重组酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示。更优选地，所述VCre重组酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示。
本发明开发了Ralstonia eutropha中可用的位点特异性重组酶工具，可实现外源序列高效整合到基因组。
附图说明
图1为本发明的位点特异性重组酶介导的基因整合流程示意图。
图2为本发明中含有外源序列、重组酶和attP位点的载体结构示意图。
图3为显示本发明实施例3中验证重组酶Bxb1介导的载体整合到基因组上的PCR结果的图。
图4为显示本发明实施例4中验证载体骨架删除的PCR结果的图。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
所用酶试剂采购自ThermoFisher公司和New England Biolabs(NEB)公司，提取质粒所用的试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，回收DNA片段的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行，所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。
培养基配方：
LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042),10g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。
在实际培养过程中，可向上述培养基中加入一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如200μg/mL卡那霉素，100μg/ml安普霉素或500μg/mL壮观霉素。
实施例1：构建整合attB序列的重组罗氏真氧菌Ralstonia eutropha Bxb1-attB
以Ralstonia eutropha H16(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC1.7092)基因组为模板进行PCR扩增得到同源片段H1和H2，以质粒pK18mobsacB(Orita,I.,Iwazawa,R.,Nakamura,S.,Fukui,T.,2012.Identification of mutation points inCupriavidus necator NCIMB 11599and genetic reconstitution of glucose-utilization ability in wild strain H16 for polyhydroxyalkanoateproduction.J.Biosci.Bioeng.113,63-69)为模板PCR扩增得到载体片段，用引物以合成片段01为模板扩增得到含有Bxb1对应的attB序列的片段，按照商业试剂盒(Gibson
Master Mix，购买自New England Biolabs(NEB)公司)的说明，将H1、H2和attB序列通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pK18mobsacB-Bxb1。使用的引物如下表：
合成片段01的序列为：
GGCAGAGAGACAATCAAATCTCTAGGGCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCCAGGAAACAGCTATGACGGTTCGGCCGGCTTGTCGACGACGGCGGTCTCCGTCGTCAGGATCATCCGGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAGCCTGCCGGCCTGGTTCAAC(SEQ ID NO:9)
其中Bxb1对应的attB序列为：
TCGGCCGGCTTGTCGACGACGGCGGTCTCCGTCGTCAGGATCATCCGGGC(SEQ ID NO:10)
将重组质粒pK18mobsacB-Bxb1转入大肠杆菌S17-1(ATCC编号:47055，可购自美国菌种保藏中心American Type Culture Collection)中，再通过接合转化方法转入Ralstonia eutropha H16中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/ml卡那霉素与100μg/ml安普霉素的LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。
将第一次同源重组菌在含有100mg/ml蔗糖的LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并用引物primer 7和primer8进行PCR鉴别出Bxb1的attB序列整合到基因组的重组菌，得到的重组菌为Ralstonia eutropha Bxb1-attB。
对比例1：构建整合attB序列的重组罗氏真氧菌Ralstonia eutropha PhiC31-attB
以Ralstonia eutropha H16基因组为模板进行PCR扩增得到同源片段H1和H2，以质粒pK18mobsacB为模板PCR扩增得到载体片段，用引物以合成片段02为模板扩增得到含有PhiC31对应的attB序列的片段，按照商业试剂盒(Gibson 
Master Mix，购买自New England Biolabs(NEB)公司)的说明，将H1、H2和attB序列通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pK18mobsacB-PhiC31。使用的引物如下表：
合成片段02的序列为：
GGCAGAGAGACAATCAAATCTCTAGGGCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCCAGGAAACAGCTATGACGGTCGCGCCCGGGGAGCCCAAGGGCACGCCCTGGCACACTGGCCGTCGTTTTACAACCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAGCCTGCCGGCCTGGTTCAAC(SEQ ID NO:11)
其中PhiC31对应的attB序列为：
CGCGCCCGGGGAGCCCAAGGGCACGCCCTGGCAC(SEQ ID NO:12)
将重组质粒pK18mobsacB-PhiC31转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入Ralstonia eutropha H16中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/ml卡那霉素与100μg/ml安普霉素的LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。
将第一次同源重组菌在含有100mg/ml蔗糖的LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并用引物primer 7和primer8进行PCR鉴别出PhiC31的attB序列整合到基因组的重组菌，得到的重组菌为Ralstonia eutropha PhiC31-attB。
对比例2：构建整合attB序列的重组罗氏真氧菌Ralstonia eutropha TP901-attB
以Ralstonia eutropha H16基因组为模板进行PCR扩增得到同源片段H1和H2，以质粒pK18mobsacB为模板PCR扩增得到载体片段，用引物以合成片段03为模板扩增得到含有TP901对应的attB序列的片段，按照商业试剂盒(Gibson 
Master Mix，购买自New England Biolabs(NEB)公司)的说明，将H1、H2和attB序列通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pK18mobsacB-TP901。使用的引物如下表：
合成片段03的序列为：
GGCAGAGAGACAATCAAATCTCTAGGGCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCCAGGAAACAGCTATGACGGTTATGCCAACACAATTAACATCTCAATCAAGGTAAATGCTTTTTGCTTTTTTTGACTGGCCGTCGTTTTACAACCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAGCCTGCCGGCCTGGTTCAAC(SEQ ID NO:13)
其中TP901对应的attB序列为：
TATGCCAACACAATTAACATCTCAATCAAGGTAAATGCTTTTTGCTTTTTTTG(SEQ ID NO:14)
将重组质粒pK18mobsacB-TP901转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入Ralstonia eutropha H16中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/ml卡那霉素与100μg/ml安普霉素的LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。
将第一次同源重组菌在含有100mg/ml蔗糖的LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并用引物primer 7和primer8进行PCR鉴别出TP901的attB序列整合到基因组的重组菌，得到的重组菌为Ralstonia eutropha TP901-attB。
对比例3：构建整合attB序列的重组罗氏真氧菌Ralstonia eutropha P22-attB
以Ralstonia eutropha H16基因组为模板进行PCR扩增得到同源片段H1和H2，以质粒pK18mobsacB为模板PCR扩增得到载体片段，用引物以合成片段04为模板扩增得到含有P22对应的attB序列的片段，按照商业试剂盒(Gibson 
Master Mix，购买自New England Biolabs(NEB)公司)的说明，将H1、H2和attB序列通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pK18mobsacB-P22。使用的引物如下表：
合成片段04的序列为：
GGCAGAGAGACAATCAAATCTCTAGGGCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCCAGGAAACAGCTATGACGGTACGACCTTCGCATTACGAATGCGCTGCACTGGCCGTCGTTTTACAACCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAGCCTGCCGGCCTGGTTCAAC(SEQ ID NO:15)
其中P22对应的attB序列为：
ACGACCTTCGCATTACGAATGCGCTGC(SEQ ID NO:16)
将重组质粒pK18mobsacB-P22转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入Ralstonia eutropha H16中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/ml卡那霉素与100μg/ml安普霉素的LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。
将第一次同源重组菌在含有100mg/ml蔗糖的LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并用引物primer 7和primer8进行PCR鉴别出P22的attB序列整合到基因组的重组菌，得到的重组菌为Ralstonia eutropha P22-attB。
实施例2：构建含有重组酶和对应attP序列的重组质粒pBxb1-attP
以质粒pK18mobsacB为模板PCR扩增得到载体片段，用引物以合成片段05为模板扩增得到含有Bxb1重组酶基因及其对应的attP序列的片段，按照商业试剂盒(Gibson
Master Mix，购买自New England Biolabs(NEB)公司)的说明，将片段通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pBxb1-attP。使用的引物如下表：
合成片段05的序列为：
CACACAGGAAACAGCTATGACCTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCTACGACATCCCGGTGTGTAGCCGTTCGACCACGCTGCCGAGCCTGAGATGCTGCTCGTACTCTTGCAGATCCCCGAAGTCGATCGTGCGAGTCAGCCCGCCGCGGACGTCGAACGTCAGCCGAACGTTCATCGACCGAAGCCAGGTGTTCTTTGCCGCGGTGTCCTGCTCCCGCCACCAGTCCCCGAACCGCTGCCCGGTCTCGCGCCACTCCCAGCCAGACGGGCGAGCCTCTAGGCCCTCCAGCTCCTCTTGCCGCGCGGCCAGCGCCGCAATACGGGCATCCAGTGCTTCTCGCTGCGGAGAGCCGGCCCGGTAGGCCGGGGAGCCGATCAGCGACGTCAGGTCCACCAGCTCCGCGTTCACCTCCGCGAGTTCGACCGCGGAGTCCGAGCCGGCTACCCAGACTTTCTCCAGACGCTCCGCGTCCCCGAGCAGATCCAGCACCTGCTCCTCGCAGAACGCGTCCCACTCGGCCATCGCCACCGTGCCGTTCCCGCAGTGCTTCGGGAACCCCATCGAGCGGCAGCGGTAGCGCGGGTGCTTACGTCCTCCCCCGGCGAACTTGTACGCGGGCTCCCCGCACACCGCGCAGAACAACACCCGCAGCAGCAGCGACGGGGTAGACACCGCGGGCTTCGCCCGGGAGGTCTTCACGAGCTCGGCGCGCAGCGCCTCCAGCTGCTCACGGGTCAGGATCGGCTCAGCCCGCACCAGCGGGGCTCCGTCGTCGTCTCGGACGGTCTTACCGTTCAGAGTCGCGTACCCGAGCATCGCCTCGGAGATCATCGATCGCTTCAGCGCGGTAGCCGACCACTCCCGGCCCTGCGGCTCGCGGCCTTGCAGCTGCGCGAAGTAGTCCTTCGGCGACAGGACACCACGCCGGTTCAGGTCGTGGGCCACCAGGTGCAGCGGCTCGTGGTTGTCGACGACGCGGTGATACACCTCGAGGATGCGCTCTCGCTGCACAGGGTCCGGCACCAGCCGCCACTCCCCGTCCACGCGCGTAGGCAGGTATCCCCACGGCGGCAGGGATCCTCGGTATTTCCCGGCGCGGATATTGAAATGCGCAGCCGAACGGTTCCGCTCTTTGATCGCTTCTAATTCCATCTGCGCCACCGTTCCCATAAGCGCGATGACGACCGCCGCAAACGGCGTCGTCGTATCGAAGTGCGCTTCGGTCGCGGAGACGACCAGCTTCTTGTGGTCCTCGGCCCAGTGGACCAGCTGTTGCAGATGCCGGATCGATCGGGTCAACCGGTCTACCCGGTACGCCACGATCACGTCGAACGGTTGCTCCTCGAACGCTAGCCACCGGGCCAGGTTCGGTCTGCGCTTCCGGTCGAACGGATCGACCGCCCCGGAGACGTCCAGATCCTCCGCTACCCCGACGACGTCCCAGCCGCGCTGGGCGCAGAGCTGCTGGCAAGACTCCAGCTGACGCTCCGGTGAAGTCGTAGCATCGGTGACGCGGGACAGGCGGATGACTACCAGGGCTCTCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAACAAAATTATTTGTAGAGGCTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGACCGGAAAGCACATCCGGTGACAGCTTGCTCGCAGGTCAAAGGGTATACTGGGATTCCAGTGAACGCAAGGGTTTGTACCGTACACCACTGAGACCGCGGTGGTTGACCAGACAAACCACGAACTGGCCGTCGTTTTACAAC(SEQ ID NO:19)
其中Bxb1重组酶的基因序列为：
ATGAGAGCCCTGGTAGTCATCCGCCTGTCCCGCGTCACCGATGCTACGACTTCACCGGAGCGTCAGCTGGAGTCTTGCCAGCAGCTCTGCGCCCAGCGCGGCTGGGACGTCGTCGGGGTAGCGGAGGATCTGGACGTCTCCGGGGCGGTCGATCCGTTCGACCGGAAGCGCAGACCGAACCTGGCCCGGTGGCTAGCGTTCGAGGAGCAACCGTTCGACGTGATCGTGGCGTACCGGGTAGACCGGTTGACCCGATCGATCCGGCATCTGCAACAGCTGGTCCACTGGGCCGAGGACCACAAGAAGCTGGTCGTCTCCGCGACCGAAGCGCACTTCGATACGACGACGCCGTTTGCGGCGGTCGTCATCGCGCTTATGGGAACGGTGGCGCAGATGGAATTAGAAGCGATCAAAGAGCGGAACCGTTCGGCTGCGCATTTCAATATCCGCGCCGGGAAATACCGAGGATCCCTGCCGCCGTGGGGATACCTGCCTACGCGCGTGGACGGGGAGTGGCGGCTGGTGCCGGACCCTGTGCAGCGAGAGCGCATCCTCGAGGTGTATCACCGCGTCGTCGACAACCACGAGCCGCTGCACCTGGTGGCCCACGACCTGAACCGGCGTGGTGTCCTGTCGCCGAAGGACTACTTCGCGCAGCTGCAAGGCCGCGAGCCGCAGGGCCGGGAGTGGTCGGCTACCGCGCTGAAGCGATCGATGATCTCCGAGGCGATGCTCGGGTACGCGACTCTGAACGGTAAGACCGTCCGAGACGACGACGGAGCCCCGCTGGTGCGGGCTGAGCCGATCCTGACCCGTGAGCAGCTGGAGGCGCTGCGCGCCGAGCTCGTGAAGACCTCCCGGGCGAAGCCCGCGGTGTCTACCCCGTCGCTGCTGCTGCGGGTGTTGTTCTGCGCGGTGTGCGGGGAGCCCGCGTACAAGTTCGCCGGGGGAGGACGTAAGCACCCGCGCTACCGCTGCCGCTCGATGGGGTTCCCGAAGCACTGCGGGAACGGCACGGTGGCGATGGCCGAGTGGGACGCGTTCTGCGAGGAGCAGGTGCTGGATCTGCTCGGGGACGCGGAGCGTCTGGAGAAAGTCTGGGTAGCCGGCTCGGACTCCGCGGTCGAACTCGCGGAGGTGAACGCGGAGCTGGTGGACCTGACGTCGCTGATCGGCTCCCCGGCCTACCGGGCCGGCTCTCCGCAGCGAGAAGCACTGGATGCCCGTATTGCGGCGCTGGCCGCGCGGCAAGAGGAGCTGGAGGGCCTAGAGGCTCGCCCGTCTGGCTGGGAGTGGCGCGAGACCGGGCAGCGGTTCGGGGACTGGTGGCGGGAGCAGGACACCGCGGCAAAGAACACCTGGCTTCGGTCGATGAACGTTCGGCTGACGTTCGACGTCCGCGGCGGGCTGACTCGCACGATCGACTTCGGGGATCTGCAAGAGTACGAGCAGCATCTCAGGCTCGGCAGCGTGGTCGAACGGCTACACACCGGGATGTCGTAG(SEQ IDNO:20)
Bxb1重组酶的氨基酸序列为：
MRALVVIRLSRVTDATTSPERQLESCQQLCAQRGWDVVGVAEDLDVSGAVDPFDRKRRPNLARWLAFEEQPFDVIVAYRVDRLTRSIRHLQQLVHWAEDHKKLVVSATEAHFDTTTPFAAVVIALMGTVAQMELEAIKERNRSAAHFNIRAGKYRGSLPPWGYLPTRVDGEWRLVPDPVQRERILEVYHRVVDNHEPLHLVAHDLNRRGVLSPKDYFAQLQGREPQGREWSATALKRSMISEAMLGYATLNGKTVRDDDGAPLVRAEPILTREQLEALRAELVKTSRAKPAVSTPSLLLRVLFCAVCGEPAYKFAGGGRKHPRYRCRSMGFPKHCGNGTVAMAEWDAFCEEQVLDLLGDAERLEKVWVAGSDSAVELAEVNAELVDLTSLIGSPAYRAGSPQREALDARIAALAARQEELEGLEARPSGWEWRETGQRFGDWWREQDTAAKNTWLRSMNVRLTFDVRGGLTRTIDFGDLQEYEQHLRLGSVVERLHTGMS(SEQ ID NO:21)
Bxb1对应的attP序列为：
TCGTGGTTTGTCTGGTCAACCACCGCGGTCTCAGTGGTGTACGGTACAAACCC(SEQ ID NO:22)对比例4：构建含有重组酶和对应attP序列的重组质粒pPhiC31-attP
以质粒pK18mobsacB为模板PCR扩增得到载体片段，用引物以合成片段06为模板扩增得到含有PhiC31重组酶基因及其对应的attP序列的片段，按照商业试剂盒(Gibson
Master Mix，购买自New England Biolabs(NEB)公司)的说明，将片段通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pPhiC31-attP。使用的引物如下表：
合成片段06的序列为：
CACACAGGAAACAGCTATGACCTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCTACGCCGCTACGTCTTCCGTGCCGTCCTGGGCGTCGTCTTCGTCGTCGTCGGTCGGCGGCTTCGCCCACGTGATCGAAGCGCGCTTCTCGATGGGCGTTCCCTGCCCCCTGCCCGTAGTCGACTTCGTGACAACGATCTTGTCTACGAAGAGCCCGACGAACACGCGCTTGTCGTCTACTGACGCGCGCCCCCACCACGACTTAGGGCCGGTCGGGTCAGCGTCGGCGTCTTCGGGGAACCATTGGTCAAGGGGAAGCTTCGGGGCTTCGGCGGCTTCAAGTTCGGCAAGCCGCTCTTCCGCCCCTTGCTGCCGGAGCGTCAGCGCTGCCTGTTGCTTCCGGAAGTGCTTCCTGCCAACGGGTCCGTCGTACGCGCCTGCCGCGCGGTCTTCGTACAGCTCTTCAAGGGCGTTCAGGGCGTCGGCGCGCTCCGCAACAAGGTTCGCCCGTTCGCCGCTCTTCTCAGGCGCCTCAGTGAGCTTGCCGAAGCGTCGGGCGGCTTCCCACAGAAGCGCCAACGTCTCTTCGTCGCCTTCGGCGTGCCTGATCTTGTTGAAGATGCGTTCCGCAACGAACTTGTCGAGTGCCGCCATGCTGACGTTGCACGTGCCTTCGTGCTGCCCAGGTGCGGACGGGTCGACCACCTTCCGGCGACGGCAGCGGTAAGAGTCCTTGATCGATTCTTCCCCGCGCTTCGAAGTCATGACGGCGCCACACTCGCAGTACAGCTTGTCCATGGCGGACAGAATGGCTTGCCCCCGGGAAAGCCCCTTGCCGCGCCCCCTGCCGTCCAACCACGCCTGAAGCTCATACCACTCAGCGGGCTCGATGATCGGTCCGCAATCAAGCTCGACCGGCCGGAGCGTGATCGGGTCGCGCTGAATGCGGTAACCCTCAATCTTCGTGGTCGGCGTGCCGTCCGGCTTCTTCTTGTAGATCACCTCAGCGGCGAAGCCCGCAATACGCGGGTCCCGAAGGATTCGCATAACGGTTGCCGGGTCCCAGGCGCTTGAAGCGGTCTTCTTCCCAATCGTCTCGCCCCGGGTCGGCACGGCGTCAGCGTCCATGCGCTTACAAAGCCCCGTGATGCTGCCCGGGTGAATGGCGGCTTGACTGCCCGGCTTGAAGGGAAGGTGTTTGTGCGTCTTGATCTCACGCCACCACCACCGGATTACGTCGGGCTCGAACTCGAAGGGTCCGGTAAGGGGAGTGGTCGAGTGCGCAAGCTTGTTGATGACGACATTGACCATTCGGCCGTTGCGCGTGATCTCCTTCGTCTCCGAAACAAGCTCGAAGCCGTAAGGCGCCTTCCCGCCGACGTACCCGCCCAATTCGCGCTGAAGGTTCTTCGTGTCGAGAATCTTCGCCGACTTCAGCGAAGATTCTTTGTGCGACGCGTCGAGCCGCATAATCAGGTGAATCAGGTCCATGACGTTTCCCTGCCGGAAGACGCCTTCCTGAGTGGAAACAATCGTCACGCCCAGGGCGAGCAATTCCGAGACAATCGGAATCGCGTCCATGACCTTCAGGCGCGAGAAGCGCGACACGTCATAGACAATGATCATGTTGAGCCGCCCGGCGCGGCATTCGTTCAGGATGCGTTCGAACTCCGGGCGCTCCGCCGTCCCGAACGCCGACGTGCCCGGCGCTTCGCTGAAATGCCCGACGAACCTGAACCGGCCCCCGTCGCGCTCGACTTCGCGCTGAAGGTCGGCCGCCTTGTCTTCGTTGGCGCTACGCTGTGTCGCTGGGCTTGCTGCGCTCGAATTCTCGCGCTCGCGCGACTGACGGTCGTAAGCACCCGCGTACGTGTCCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAACAAAATTATTTGTAGAGGCTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGACCGGAAAGCACATCCGGTGACAGCTTGCTCGCAGGTCAAAGGGTATACTGGGATTCCAGTGAACGCAACCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTCTCAGTTGGGGGACTGGCCGTCGTTTTACAAC(SEQ ID NO:23)
其中PhiC31重组酶的基因序列为：
ATGGACACGTACGCGGGTGCTTACGACCGTCAGTCGCGCGAGCGCGAGAATTCGAGCGCAGCAAGCCCAGCGACACAGCGTAGCGCCAACGAAGACAAGGCGGCCGACCTTCAGCGCGAAGTCGAGCGCGACGGGGGCCGGTTCAGGTTCGTCGGGCATTTCAGCGAAGCGCCGGGCACGTCGGCGTTCGGGACGGCGGAGCGCCCGGAGTTCGAACGCATCCTGAACGAATGCCGCGCCGGGCGGCTCAACATGATCATTGTCTATGACGTGTCGCGCTTCTCGCGCCTGAAGGTCATGGACGCGATTCCGATTGTCTCGGAATTGCTCGCCCTGGGCGTGACGATTGTTTCCACTCAGGAAGGCGTCTTCCGGCAGGGAAACGTCATGGACCTGATTCACCTGATTATGCGGCTCGACGCGTCGCACAAAGAATCTTCGCTGAAGTCGGCGAAGATTCTCGACACGAAGAACCTTCAGCGCGAATTGGGCGGGTACGTCGGCGGGAAGGCGCCTTACGGCTTCGAGCTTGTTTCGGAGACGAAGGAGATCACGCGCAACGGCCGAATGGTCAATGTCGTCATCAACAAGCTTGCGCACTCGACCACTCCCCTTACCGGACCCTTCGAGTTCGAGCCCGACGTAATCCGGTGGTGGTGGCGTGAGATCAAGACGCACAAACACCTTCCCTTCAAGCCGGGCAGTCAAGCCGCCATTCACCCGGGCAGCATCACGGGGCTTTGTAAGCGCATGGACGCTGACGCCGTGCCGACCCGGGGCGAGACGATTGGGAAGAAGACCGCTTCAAGCGCCTGGGACCCGGCAACCGTTATGCGAATCCTTCGGGACCCGCGTATTGCGGGCTTCGCCGCTGAGGTGATCTACAAGAAGAAGCCGGACGGCACGCCGACCACGAAGATTGAGGGTTACCGCATTCAGCGCGACCCGATCACGCTCCGGCCGGTCGAGCTTGATTGCGGACCGATCATCGAGCCCGCTGAGTGGTATGAGCTTCAGGCGTGGTTGGACGGCAGGGGGCGCGGCAAGGGGCTTTCCCGGGGGCAAGCCATTCTGTCCGCCATGGACAAGCTGTACTGCGAGTGTGGCGCCGTCATGACTTCGAAGCGCGGGGAAGAATCGATCAAGGACTCTTACCGCTGCCGTCGCCGGAAGGTGGTCGACCCGTCCGCACCTGGGCAGCACGAAGGCACGTGCAACGTCAGCATGGCGGCACTCGACAAGTTCGTTGCGGAACGCATCTTCAACAAGATCAGGCACGCCGAAGGCGACGAAGAGACGTTGGCGCTTCTGTGGGAAGCCGCCCGACGCTTCGGCAAGCTCACTGAGGCGCCTGAGAAGAGCGGCGAACGGGCGAACCTTGTTGCGGAGCGCGCCGACGCCCTGAACGCCCTTGAAGAGCTGTACGAAGACCGCGCGGCAGGCGCGTACGACGGACCCGTTGGCAGGAAGCACTTCCGGAAGCAACAGGCAGCGCTGACGCTCCGGCAGCAAGGGGCGGAAGAGCGGCTTGCCGAACTTGAAGCCGCCGAAGCCCCGAAGCTTCCCCTTGACCAATGGTTCCCCGAAGACGCCGACGCTGACCCGACCGGCCCTAAGTCGTGGTGGGGGCGCGCGTCAGTAGACGACAAGCGCGTGTTCGTCGGGCTCTTCGTAGACAAGATCGTTGTCACGAAGTCGACTACGGGCAGGGGGCAGGGAACGCCCATCGAGAAGCGCGCTTCGATCACGTGGGCGAAGCCGCCGACCGACGACGACGAAGACGACGCCCAGGACGGCACGGAAGACGTAGCGGCGTAG(SEQ ID NO:24)
PhiC31重组酶的氨基酸序列为：
MDTYAGAYDRQSRERENSSAASPATQRSANEDKAADLQREVERDGGRFRFVGHFSEAPGTSAFGTAERPEFERILNECRAGRLNMIIVYDVSRFSRLKVMDAIPIVSELLALGVTIVSTQEGVFRQGNVMDLIHLIMRLDASHKESSLKSAKILDTKNLQRELGGYVGGKAPYGFELVSETKEITRNGRMVNVVINKLAHSTTPLTGPFEFEPDVIRWWWREIKTHKHLPFKPGSQAAIHPGSITGLCKRMDADAVPTRGETIGKKTASSAWDPATVMRILRDPRIAGFAAEVIYKKKPDGTPTTKIEGYRIQRDPITLRPVELDCGPIIEPAEWYELQAWLDGRGRGKGLSRGQAILSAMDKLYCECGAVMTSKRGEESIKDSYRCRRRKVVDPSAPGQHEGTCNVSMAALDKFVAERIFNKIRHAEGDEETLALLWEAARRFGKLTEAPEKSGERANLVAERADALNALEELYEDRAAGAYDGPVGRKHFRKQQAALTLRQQGAEERLAELEAAEAPKLPLDQWFPEDADADPTGPKSWWGRASVDDKRVFVGLFVDKIVVTKSTTGRGQGTPIEKRASITWAKPPTDDDEDDAQDGTEDVAA(SEQ ID NO:25)
PhiC31对应的attP序列为：
CCCCCAACTGAGAGAACTCAAAGGTTACCCCAGTTGGGG(SEQ ID NO:26)
对比例5：构建含有重组酶和对应attP序列的重组质粒pTP901-attP
以质粒pK18mobsacB为模板PCR扩增得到载体片段，用引物以合成片段07为模板扩增得到含有TP901重组酶基因及其对应的attP序列的片段，按照商业试剂盒(Gibson
Master Mix，购买自New England Biolabs(NEB)公司)的说明，将片段通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pTP901-attP。使用的引物如下表：
合成片段07的序列为：
CACACAGGAAACAGCTATGACCTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGTTAAGCAGCCAGAGCGTAGTTTTCGTCCTTAGCAGCACCGGTAGCGAGTTGGAATTTAAATATGATATCTACATTATCAGCAGTAACATCAACCTTTGATACAAGGTTGTTGACGATTTTCTTTTTATTATCATATGATAGTTCATTAATCGGAATTGAGCCCAACTGAGTTTTAACTAACTCAAAAACATCAGTAGAGTCATTAAATTTATTTTCGCTAATCTTAGCTTTAAGCAGCTTTTTCTCAGCCTGAAGGGAATCAGTACGATCTTTCAACTCATCCATAGTGATAAAATCATTTAGGTACAAATCAGAGTTCTTTTGTATTTTTTTATCGATCTGTGAAATTTGCTTTTTAAATGACGAAGTATCAAGAATAGGTTGGTTGTTGCCATTGATAATTTTCAATAAGGAGTCATTATTTTCTTGAAATCCAATCAGGTTGTCAATAACAGTATTTTCTAAATTACTTAAATCATAAGTTCCTGAATCACACTTTTTATTGTCATTATATACTGTAATTCCTTTTGTTTTTCGAGGAAATCTATTTGCACAGTGATATTTCATAGTGCGGCTTCCATCTTTTCTTTTGTGGCCAAGAACAATTTTTAAAGGTGCTCCACAGTAACCGCACCTTGCCATCCCTGACAGCATATATTTAGCTTGGAAAGGTCTAGGGTTGTTATTTCTTTCATAAGTCTGCTGTTGTCTTTCTTCTAGCTCTTTTTGAACTTTTAAATAAGTCTCATAAGGGATAATTGGTTTGTGCATACCTTCAAATAGGCTGTCCTTAAATTTGATATAACCACAGTAAACTGGATTATCAAGTGTTTGTCTTAGGGTACGATAAGACCACGGTATATCTTTACCGATGTGTCCAGATTCATTGAGTTTATCTCTTAATTTTGTAAGTGATATTCCTGATAAATAATCAGTGAATATTTGTTCAACTATTGTAGCTTGTAAAGGAACAATTTCTAATATACCTGTCTTTCTGTTGTGGTAATACCCAAAAGCTGTCTTAGTCCACATCATAGACTTACCAGATTTCGCTCGCCCTAGTTTACCCATAGTCATGCGTTCTTTTATATTCTCTCTTTCAAACTCATTAATTGCAGAAAGAATAGTGAGAAACAAGCTACCCATAGCAGAAGAAGTATCAATACTTTCATTAAGCGAGATAAAGTCTATTTTATTTTTTGTGAACACATCCTTAACAAGATAAAGAGTATCTCTTACACTACGTGAAAGGCGGTCTAGCTTATATACAAGAACTGTATCAAAAGCTTTATTCTCGATATCGTTGATTAATCTTTGCATTGCTGGGCGTTCAAGTTTGGCCCCTGAAAAACCAGCATCAGTATAAGTATCAGATACTTGCCACCCCATTGCTTCAGCATATTTTGTTAAACGGTCAATTTGCTCATCAATTGAGAAGCCTTCCTCTGCTTGGTTAGTAGTGGATACTCGTGTATAGATTGCTACTTTCTTAGTGCCGGCCTGGTGGTGATGGTGATGATGTTTCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAACAAAATTATTTGTAGAGGCTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGACCGGAAAGCACATCCGGTGACAGCTTGCTCGCAGGTCAAAGGGTATACTGGGATTCCAGTGAACGCAAAAAAGGAGTTTTTTAGTTACCTTAATTGAAATAAACGAAATAAAAACTCGACTGGCCGTCGTTTTACAAC(SEQ ID NO:27)
其中TP901重组酶的基因序列为：
ATGAAACATCATCACCATCACCACCAGGCCGGCACTAAGAAAGTAGCAATCTATACACGAGTATCCACTACTAACCAAGCAGAGGAAGGCTTCTCAATTGATGAGCAAATTGACCGTTTAACAAAATATGCTGAAGCAATGGGGTGGCAAGTATCTGATACTTATACTGATGCTGGTTTTTCAGGGGCCAAACTTGAACGCCCAGCAATGCAAAGATTAATCAACGATATCGAGAATAAAGCTTTTGATACAGTTCTTGTATATAAGCTAGACCGCCTTTCACGTAGTGTAAGAGATACTCTTTATCTTGTTAAGGATGTGTTCACAAAAAATAAAATAGACTTTATCTCGCTTAATGAAAGTATTGATACTTCTTCTGCTATGGGTAGCTTGTTTCTCACTATTCTTTCTGCAATTAATGAGTTTGAAAGAGAGAATATAAAAGAACGCATGACTATGGGTAAACTAGGGCGAGCGAAATCTGGTAAGTCTATGATGTGGACTAAGACAGCTTTTGGGTATTACCACAACAGAAAGACAGGTATATTAGAAATTGTTCCTTTACAAGCTACAATAGTTGAACAAATATTCACTGATTATTTATCAGGAATATCACTTACAAAATTAAGAGATAAACTCAATGAATCTGGACACATCGGTAAAGATATACCGTGGTCTTATCGTACCCTAAGACAAACACTTGATAATCCAGTTTACTGTGGTTATATCAAATTTAAGGACAGCCTATTTGAAGGTATGCACAAACCAATTATCCCTTATGAGACTTATTTAAAAGTTCAAAAAGAGCTAGAAGAAAGACAACAGCAGACTTATGAAAGAAATAACAACCCTAGACCTTTCCAAGCTAAATATATGCTGTCAGGGATGGCAAGGTGCGGTTACTGTGGAGCACCTTTAAAAATTGTTCTTGGCCACAAAAGAAAAGATGGAAGCCGCACTATGAAATATCACTGTGCAAATAGATTTCCTCGAAAAACAAAAGGAATTACAGTATATAATGACAATAAAAAGTGTGATTCAGGAACTTATGATTTAAGTAATTTAGAAAATACTGTTATTGACAACCTGATTGGATTTCAAGAAAATAATGACTCCTTATTGAAAATTATCAATGGCAACAACCAACCTATTCTTGATACTTCGTCATTTAAAAAGCAAATTTCACAGATCGATAAAAAAATACAAAAGAACTCTGATTTGTACCTAAATGATTTTATCACTATGGATGAGTTGAAAGATCGTACTGATTCCCTTCAGGCTGAGAAAAAGCTGCTTAAAGCTAAGATTAGCGAAAATAAATTTAATGACTCTACTGATGTTTTTGAGTTAGTTAAAACTCAGTTGGGCTCAATTCCGATTAATGAACTATCATATGATAATAAAAAGAAAATCGTCAACAACCTTGTATCAAAGGTTGATGTTACTGCTGATAATGTAGATATCATATTTAAATTCCAACTCGCTACCGGTGCTGCTAAGGACGAAAACTACGCTCTGGCTGCTTAA(SEQ ID NO:28)
TP901重组酶的氨基酸序列为：
MKHHHHHHQAGTKKVAIYTRVSTTNQAEEGFSIDEQIDRLTKYAEAMGWQVSDTYTDAGFSGAKLERPAMQRLINDIENKAFDTVLVYKLDRLSRSVRDTLYLVKDVFTKNKIDFISLNESIDTSSAMGSLFLTILSAINEFERENIKERMTMGKLGRAKSGKSMMWTKTAFGYYHNRKTGILEIVPLQATIVEQIFTDYLSGISLTKLRDKLNESGHIGKDIPWSYRTLRQTLDNPVYCGYIKFKDSLFEGMHKPIIPYETYLKVQKELEERQQQTYERNNNPRPFQAKYMLSGMARCGYCGAPLKIVLGHKRKDGSRTMKYHCANRFPRKTKGITVYNDNKKCDSGTYDLSNLENTVIDNLIGFQENNDSLLKIINGNNQPILDTSSFKKQISQIDKKIQKNSDLYLNDFITMDELKDRTDSLQAEKKLLKAKISENKFNDSTDVFELVKTQLGSIPINELSYDNKKKIVNNLVSKVDVTADNVDIIFKFQLATGAAKDENYALAA(SEQ ID NO:29)
TP901对应的attP序列为：
CGAGTTTTTATTTCGTTTATTTCAATTAAGGTAACTAAAAAACTCCTTTT(SEQ ID NO:30)对比例6：构建含有重组酶和对应attP序列的重组质粒pP22-attP
类似地，以质粒pK18mobsacB为模板PCR扩增得到载体片段，用引物以合成片段08为模板扩增得到含有P22重组酶基因及其对应的attP序列的片段，按照商业试剂盒(Gibson
Master Mix，购买自New England Biolabs(NEB)公司)的说明，将片段通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pP22-attP。使用的引物如下表：
合成片段08的序列为：
CACACAGGAAACAGCTATGACCTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCTACGTATTATTCGTGCCTTCCTTATTTTTACTGTGGGACATATTTGGGACAGAAGTACCAAAAATCGAGTCAATTTGTCGAGCATGTTCAGTCAGGTGATTTGGTGCCAGATGAGCATATCGGCGAACCATTTCGATAGACTCCCAGCCACCCATTTCCTGCAATACCGAAATCGGAACGCCAGCCTGAACTAACCAACTTGCCCACGTGTGCCTCAGGTCATGAAAACGGAAGTCTTCAATGCCCGCTCGTTTTAATGCTGCCCTCCATGCAGTATTAGCGTCATAGCGCATCTTCCTCACTACAGGTGATTTAGTTCCGTCTGGTTTGGTGCTGCTTTCCTTGTAGACGAACACCCATTTGTGATGATTGCCGATTTGCTTTTTCAGCACCCGGCAAGCGGTATCATTCAGCGCCACTCCAATGGCATGATTAGACTTGCTTTGTTCCGGGTGTATCCATGCCACCTTTCGTTGCATGTCTATCTGCTGCCACTCCAGATTGATAATGTTAGACCGCCTTAAGCCAGTAGAAAGCGCAAACTCTACGACTGACTTTAGCGGTTCCTGGCATTCATCAATCAACCTTTTTGCCTCGTGAGGCTCAAGCCAGCGGATACGCTTATTTTTCGGCTGAGGAACTTTGATGATCGGAGCCTTATCCAGCATCTTCCATTCGCGTTCAGCAGCCCGGAGGAGTGCCTTAATGAATGAAAGGTGAGTTGCTTTTGTAGCTACTGCTGCCGGCTTAGGCTTGAATACCGGAGGCTGCTTCCCATTCTTCCTGCATGCTTCATCCATTAACTTCCAGTTTTCCTCATGCCGCCGATTAGTTATCTTCTGGATGGCGGAGTAAATCTTCGTCTCGGTAATATCCTTCAACTGCATTCCTGCAAAATGCTGGAGCCAGAATCCTATCCGACTCTTGTCATCATCCAGCGACTTCTTATGCGCCTTCTCCTCTAACCACCTGACACAGGCCCCCTCAAAAGTCATGTCAGGCGTCTCTCCTAATTTACTTACCCTCCATGCTTCTGCCTTCAGCTTGTCATGAAGCTCTGTGGCCTGCCTTTTGTCCTTTGTCCCAAGAGACTGCTTAAATCTTTTGCCGTTCGGCAATGTGAAACTGGCGTACCAGGTTTCACCTCTGCGGAATAGTGACATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAACAAAATTATTTGTAGAGGCTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGACCGGAAAGCACATCCGGTGACAGCTTGCTCGCAGGTCAAAGGGTATACTGGGATTCCAGTGAACGCAACTAAGTGGTTTGGGACAAAAATGGGACATACAAATCTTTGCATCGGTTTGCAAGGCTTTGCATGTCTTTCGAAGATGGGACGTGTGAGCGCAGGTATGACGTGGTATGTTGTTGACTTAAAAGGTAGTTCTTATAATTCGTAATGCGAAGGTCGTAGGTTCGACTCCTATTATCGGCACCAGTTAAATCAAATACTTACGTATTATTCGTGCCTTCCTTATTTTTACTGTGGGACATATTTGGGACAGAAGTACCAAAAAACTGGCCGTCGTTTTACAAC(SEQ ID NO:31)
其中P22重组酶的基因序列为：
ATGTCACTATTCCGCAGAGGTGAAACCTGGTACGCCAGTTTCACATTGCCGAACGGCAAAAGATTTAAGCAGTCTCTTGGGACAAAGGACAAAAGGCAGGCCACAGAGCTTCATGACAAGCTGAAGGCAGAAGCATGGAGGGTAAGTAAATTAGGAGAGACGCCTGACATGACTTTTGAGGGGGCCTGTGTCAGGTGGTTAGAGGAGAAGGCGCATAAGAAGTCGCTGGATGATGACAAGAGTCGGATAGGATTCTGGCTCCAGCATTTTGCAGGAATGCAGTTGAAGGATATTACCGAGACGAAGATTTACTCCGCCATCCAGAAGATAACTAATCGGCGGCATGAGGAAAACTGGAAGTTAATGGATGAAGCATGCAGGAAGAATGGGAAGCAGCCTCCGGTATTCAAGCCTAAGCCGGCAGCAGTAGCTACAAAAGCAACTCACCTTTCATTCATTAAGGCACTCCTCCGGGCTGCTGAACGCGAATGGAAGATGCTGGATAAGGCTCCGATCATCAAAGTTCCTCAGCCGAAAAATAAGCGTATCCGCTGGCTTGAGCCTCACGAGGCAAAAAGGTTGATTGATGAATGCCAGGAACCGCTAAAGTCAGTCGTAGAGTTTGCGCTTTCTACTGGCTTAAGGCGGTCTAACATTATCAATCTGGAGTGGCAGCAGATAGACATGCAACGAAAGGTGGCATGGATACACCCGGAACAAAGCAAGTCTAATCATGCCATTGGAGTGGCGCTGAATGATACCGCTTGCCGGGTGCTGAAAAAGCAAATCGGCAATCATCACAAATGGGTGTTCGTCTACAAGGAAAGCAGCACCAAACCAGACGGAACTAAATCACCTGTAGTGAGGAAGATGCGCTATGACGCTAATACTGCATGGAGGGCAGCATTAAAACGAGCGGGCATTGAAGACTTCCGTTTTCATGACCTGAGGCACACGTGGGCAAGTTGGTTAGTTCAGGCTGGCGTTCCGATTTCGGTATTGCAGGAAATGGGTGGCTGGGAGTCTATCGAAATGGTTCGCCGATATGCTCATCTGGCACCAAATCACCTGACTGAACATGCTCGACAAATTGACTCGATTTTTGGTACTTCTGTCCCAAATATGTCCCACAGTAAAAATAAGGAAGGCACGAATAATACGTAG(SEQ ID NO:32)
P22重组酶的氨基酸序列为：
MSLFRRGETWYASFTLPNGKRFKQSLGTKDKRQATELHDKLKAEAWRVSKLGETPDMTFEGACVRWLEEKAHKKSLDDDKSRIGFWLQHFAGMQLKDITETKIYSAIQKITNRRHEENWKLMDEACRKNGKQPPVFKPKPAAVATKATHLSFIKALLRAAEREWKMLDKAPIIKVPQPKNKRIRWLEPHEAKRLIDECQEPLKSVVEFALSTGLRRSNIINLEWQQIDMQRKVAWIHPEQSKSNHAIGVALNDTACRVLKKQIGNHHKWVFVYKESSTKPDGTKSPVVRKMRYDANTAWRAALKRAGIEDFRFHDLRHTWASWLVQAGVPISVLQEMGGWESIEMVRRYAHLAPNHLTEHARQIDSIFGTSVPNMSHSKNKEGTNNT(SEQ ID NO:33)
P22对应的attP序列为：
TTTTTGGTACTTCTGTCCCAAATATGTCCCACAGTAAAAATAAGGAAGGCACGAATAATACGTAAGTATTTGATTTAACTGGTGCCGATAATAGGAGTCGAACCTACGACCTTCGCATTACGAATTATAAGAACTACCTTTTAAGTCAACAACATACCACGTCATACCTGCGCTCACACGTCCCATCTTCGAAAGACATGCAAAGCCTTGCAAACCGATGCAAAGATTTGTATGTCCCATTTTTGTCCCAAACCACTTAG(SEQ ID NO:34)
实施例3：重组酶介导的attB-attP重组
将重组质粒pBxb1-attP转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入Ralstonia eutropha Bxb1-attB中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/ml卡那霉素与100μg/ml安普霉素的LB平板筛。如果重组酶Bxb1有功能，则将介导attB和attP序列之间的重组，从而将质粒pBxb1-attP整合到基因组上。
对比例7：重组酶介导的attB-attP重组
将重组质粒pPhiC31-attP转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入Ralstonia eutropha PhiC31-attB中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/ml卡那霉素与100μg/ml安普霉素的LB平板筛。如果重组酶PhiC31有功能，则将介导attB和attP序列之间的重组，从而将质粒pPhiC1-attP整合到基因组上。
对比例8：重组酶介导的attB-attP重组
将重组质粒pTP901-attP转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入Ralstonia eutropha TP901-attB中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/ml卡那霉素与100μg/ml安普霉素的LB平板筛。如果重组酶TP901有功能，则将介导attB和attP序列之间的重组，从而将质粒pTP901-attP整合到基因组上。
对比例9：重组酶介导的attB-attP重组
将重组质粒pP22-attP转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入Ralstonia eutropha P22-attB中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/ml卡那霉素与100μg/ml安普霉素的LB平板筛。如果重组酶P22有功能，则将介导attB和attP序列之间的重组，从而将质粒pP22-attP整合到基因组上。
实验例1：验证载体整合到基因组
4种重组酶的质粒分别转入对应的Ralstonia eutropha后，随机挑取8个长出的克隆，用引物gcgcatggcgtctccatg(SEQ ID NO:35)和gtggaccagctgttgcag(SEQ ID NO:36)对进行PCR验证，结果如下表所示：
上表结果表明，仅采用重组酶Bxb1介导的attB和attP重组全部得到预期的862bp的条带，证明质粒pBxb1-attP整合到了基因组上(图3)，而采用重组酶PhiC31、TP901和P22介导的attB和attP重组都没有成功。
由此可见在某些宿主微生物中已经证明可用的重组酶在另一种微生物中是否发挥功能并没有必然性或可预见性。本发明测试的4种重组酶中只有Bxb1在Ralstoniaeutropha中发挥出了功能，可以应用于外源序列的整合；而其他3个重组酶都没有功能，不适合应用于Ralstonia eutropha菌株中。
实施例4：用帮助质粒删除载体骨架
上述实施例证明重组酶Bxb1在Ralstonia eutropha有功能，将欲整合的DNA片段放在含有Bxb1基因和对应的attP序列的载体上就可实现DNA片段与载体一同整合到重组菌Ralstonia eutropha Bxb1-attB的基因组上。而在实际应用中，更优选地，除了欲整合的DNA片段之外的载体部分需要删除掉。本实施例使用另一套重组酶实现该目的。
以质粒pBBR1MCS2(Kovach ME,Elzer PH,Hill DS,Robertson GT,Farris MA,Roop RM,Peterson KM.,1995.Four new derivatives of the broad-host-rangecloning vector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistancecassettes.Gene.166,175-176)为模板PCR扩增得到复制子片段；用引物以合成片段09为模板扩增得到DNA片段，该片段含有VCre重组酶基因，卡那霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因；按照商业试剂盒(Gibson 
Master Mix，购买自New England Biolabs(NEB)公司)的说明，将片段通过Gibson Assembly方法与复制子片段连接，得到重组质粒pVCre。使用的引物如下表：
合成片段09的序列为：
GAGCCAGCCGGTGGCCGCCTACATGGCTCTGCTGTAGTTCACCCTTGGCGTCCAACCAGCGGCACCAGCGGCGCCTGAGAGGGGCGCGCCCAGCTGTCTAGGGCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTTTAATTAAAGCGGATAACAATTTCACACAGGACAACTGAGACCGGAATTGGTCTCAACGTACGTCTCATTTTCGCCAGATATCGACGTCTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGCATATGATCAATTCAAGGCCGAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCAAATAATTCGATAGCTTGTCGTAATAATGGCGGCATACTATCAGTAGTAGGTGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGATGCTCTTGATCTTCCAATACGCAACCTAAAGTAAAATGCCCCACAGCGCTGAGTGCATATAATGCATTCTCTAGTGAAAAACCTTGTTGGCATAAAAAGGCTAATTGATTTTCGAGAGTTTCATACTGTTTTTCTGTAGGCCGTGTACCTAAATGTACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAGTAAAGCACATCTAAAACTTTTAGCGTTATTACGTAAAAAATCTTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTATGGTGCCTATCTAACATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAAAGCCCGCTTATTTTTTACATGCCAATACAATGTAGGCTGCTCTACACCTAGCTTCTGGGCGAGTTTACGGGTTGTTAAACCTTCGATTCCGACCTCATTAAGCAGCTCTAATGCGCTGTTAATCACTTTACTTTTATCTAATCTAGACATCATTAATTCCTAATTTTTGTTGACACTCTATCGTTGATAGAGTTATTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGAATTCAAGCTGTCACCGGATGTGCTTTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAGCCTCTACAAATAATTTTGTTTAATACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGATCGAGAACCAGCTGAGCCTGCTGGGTGATTTCAGCGGCGTGCGTCCGGACGATGTTAAGACCGCGATCCAGGCGGCGCAAAAGAAAGGTATTAACGTTGCGGAGAACGAACAATTCAAAGCGGCGTTTGAGCACCTGCTGAACGAGTTCAAGAAACGTGAGGAACGTTACAGCCCGAACACCCTGCGTCGTCTGGAAAGCGCGTGGACCTGCTTTGTGGATTGGTGCCTGGCGAACCATCGTCACAGCCTGCCGGCGACCCCGGACACCGTTGAGGCGTTCTTTATCGAACGTGCGGAGGAACTGCACCGTAACACCCTGAGCGTGTACCGTTGGGCGATTAGCCGTGTTCATCGTGTTGCGGGTTGCCCGGACCCGTGCCTGGATATCTATGTGGAGGATCGTCTGAAGGCGATTGCGCGTAAGAAAGTGCGTGAGGGCGAAGCGGTTAAACAGGCGAGCCCGTTTAACGAACAACACCTGCTGAAGCTGACCAGCCTGTGGTACCGTAGCGACAAACTGCTGCTGCGTCGTAACCTGGCGCTGCTGGCGGTGGCGTATGAGAGCATGCTGCGTGCGAGCGAACTGGCGAACATCCGTGTTAGCGACATGGAGCTGGCGGGTGATGGCACCGCGATTCTGACCATCCCGATTACCAAGACCAACCACAGCGGCGAGCCGGACACCTGCATTCTGAGCCAGGATGTGGTTAGCCTGCTGATGGACTACACCGAAGCGGGCAAGCTGGACATGAGCAGCGATGGTTTCCTGTTTGTGGGCGTTAGCAAACACAACACCTGCATCAAGCCGAAGAAAGATAAACAGACCGGTGAAGTTCTGCACAAGCCGATTACCACCAAAACCGTGGAGGGCGTTTTCTATAGCGCGTGGGAAACCCTGGATCTGGGTCGTCAAGGCGTGAAGCCGTTTACCGCGCACAGCGCGCGTGTTGGTGCGGCGCAGGACCTGCTGAAGAAAGGCTACAACACCCTGCAAATCCAGCAAAGCGGTCGTTGGAGCAGCGGCGCGATGGTTGCGCGTTATGGTCGTGCGATCCTGGCGCGTGACGGCGCGATGGCGCACAGCCGTGTGAAAACCCGTAGCGCGCCGATGCAATGGGGCAAGGACGAGAAAGATTAATGATAAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATATACTAGAGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTACTAGAGGTCATGCTTGCCATCTGTTTTCTTGCAAGATTACTAGTAGCGGCCGCTGCAGGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGACTAGTCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAGACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGATCAGATCACGCATCTTCCCGACAACGCAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAAAAGTTCAAAATCACCAACTGGTCCACCTACAACAAAGCTCTCATCAACCGTGGCTCCCTCACTTTCTGGCTGGATGATGGGGCGATTCAGGCCTGGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGCTATTCTGACCTTGCCATCACGACTGTGCTGGTCATTAAACGCGTATTCAGGCTGACCCTGCGCGCTGCGCAGGGCTTTATTGATTCCATTTTTACACTGATGAATGTTCCGTTGCGCTGCCCGGATTACAGCCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGCGCTCACGCAACTGGTCCAGAACCTTGACCGAACGCAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGGGGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAAAACAAAGTTAAACATCATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACATTTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGCCTCGCGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATAAACTAGTAAATAATAAAAAAGCCGGATTAATAATCTGGCTTTTTATATTCTCTGCATAACCCTGCTTCGGGGTCATTATAGCGATTTTTTCGGTATATCCATCCTTTTTCGCACGATATACAGGATTTTGCCAAAGGGTTCGTGTAGACTTTCCTTGGTGTATCCAACGGCGTCAGCCGGGCAGGATAGGTGAAGTAGGCCCACCCGCGAGCGGGTGTTCCTTCTTCACTGTCCCTTATTCGCACCTGGCGGTGCTCAACGGGAATCCTGCTCTGCGAGGCTGGCCGTAGGCCGGCCGCGATGCAGGTGGCTGCTGAACCCCCAGCCGGAACTGACCCCACAAGGCCCTACCGGCGCGGCAGCG(SEQ ID NO:41)
其中VCre重组酶的基因序列为：
ATGATCGAGAACCAGCTGAGCCTGCTGGGTGATTTCAGCGGCGTGCGTCCGGACGATGTTAAGACCGCGATCCAGGCGGCGCAAAAGAAAGGTATTAACGTTGCGGAGAACGAACAATTCAAAGCGGCGTTTGAGCACCTGCTGAACGAGTTCAAGAAACGTGAGGAACGTTACAGCCCGAACACCCTGCGTCGTCTGGAAAGCGCGTGGACCTGCTTTGTGGATTGGTGCCTGGCGAACCATCGTCACAGCCTGCCGGCGACCCCGGACACCGTTGAGGCGTTCTTTATCGAACGTGCGGAGGAACTGCACCGTAACACCCTGAGCGTGTACCGTTGGGCGATTAGCCGTGTTCATCGTGTTGCGGGTTGCCCGGACCCGTGCCTGGATATCTATGTGGAGGATCGTCTGAAGGCGATTGCGCGTAAGAAAGTGCGTGAGGGCGAAGCGGTTAAACAGGCGAGCCCGTTTAACGAACAACACCTGCTGAAGCTGACCAGCCTGTGGTACCGTAGCGACAAACTGCTGCTGCGTCGTAACCTGGCGCTGCTGGCGGTGGCGTATGAGAGCATGCTGCGTGCGAGCGAACTGGCGAACATCCGTGTTAGCGACATGGAGCTGGCGGGTGATGGCACCGCGATTCTGACCATCCCGATTACCAAGACCAACCACAGCGGCGAGCCGGACACCTGCATTCTGAGCCAGGATGTGGTTAGCCTGCTGATGGACTACACCGAAGCGGGCAAGCTGGACATGAGCAGCGATGGTTTCCTGTTTGTGGGCGTTAGCAAACACAACACCTGCATCAAGCCGAAGAAAGATAAACAGACCGGTGAAGTTCTGCACAAGCCGATTACCACCAAAACCGTGGAGGGCGTTTTCTATAGCGCGTGGGAAACCCTGGATCTGGGTCGTCAAGGCGTGAAGCCGTTTACCGCGCACAGCGCGCGTGTTGGTGCGGCGCAGGACCTGCTGAAGAAAGGCTACAACACCCTGCAAATCCAGCAAAGCGGTCGTTGGAGCAGCGGCGCGATGGTTGCGCGTTATGGTCGTGCGATCCTGGCGCGTGACGGCGCGATGGCGCACAGCCGTGTGAAAACCCGTAGCGCGCCGATGCAATGGGGCAAGGACGAGAAAGATTAA(SEQ ID NO:42)
VCre重组酶的氨基酸序列为：
MIENQLSLLGDFSGVRPDDVKTAIQAAQKKGINVAENEQFKAAFEHLLNEFKKREERYSPNTLRRLESAWTCFVDWCLANHRHSLPATPDTVEAFFIERAEELHRNTLSVYRWAISRVHRVAGCPDPCLDIYVEDRLKAIARKKVREGEAVKQASPFNEQHLLKLTSLWYRSDKLLLRRNLALLAVAYESMLRASELANIRVSDMELAGDGTAILTIPITKTNHSGEPDTCILSQDVVSLLMDYTEAGKLDMSSDGFLFVGVSKHNTCIKPKKDKQTGEVLHKPITTKTVEGVFYSAWETLDLGRQGVKPFTAHSARVGAAQDLLKKGYNTLQIQQSGRWSSGAMVARYGRAILARDGAMAHSRVKTRSAPMQWGKDEKD(SEQ ID NO:43)
以质粒pK18mobsacB为模板PCR扩增得到载体片段；用引物以合成片段10为模板扩增得到DNA片段，该片段含有Bxb1重组酶基因及其对应的attP序列，欲整合的外源基因(本实施例中为绿色荧光蛋白基因GFP)，及2个VCre重组酶特异性识别的VloxP序列；按照商业试剂盒(Gibson 
Master Mix，购买自New England Biolabs(NEB)公司)的说明，将片段通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pBxb1-attP-VCre。使用的引物如下表：
合成片段10的序列为：
CACACAGGAAACAGCTATGACCTGGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAACAAATCCAGATGGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCTATCAACAGGAGTCCAAGCTACGACATCCCGGTGTGTAGCCGTTCGACCACGCTGCCGAGCCTGAGATGCTGCTCGTACTCTTGCAGATCCCCGAAGTCGATCGTGCGAGTCAGCCCGCCGCGGACGTCGAACGTCAGCCGAACGTTCATCGACCGAAGCCAGGTGTTCTTTGCCGCGGTGTCCTGCTCCCGCCACCAGTCCCCGAACCGCTGCCCGGTCTCGCGCCACTCCCAGCCAGACGGGCGAGCCTCTAGGCCCTCCAGCTCCTCTTGCCGCGCGGCCAGCGCCGCAATACGGGCATCCAGTGCTTCTCGCTGCGGAGAGCCGGCCCGGTAGGCCGGGGAGCCGATCAGCGACGTCAGGTCCACCAGCTCCGCGTTCACCTCCGCGAGTTCGACCGCGGAGTCCGAGCCGGCTACCCAGACTTTCTCCAGACGCTCCGCGTCCCCGAGCAGATCCAGCACCTGCTCCTCGCAGAACGCGTCCCACTCGGCCATCGCCACCGTGCCGTTCCCGCAGTGCTTCGGGAACCCCATCGAGCGGCAGCGGTAGCGCGGGTGCTTACGTCCTCCCCCGGCGAACTTGTACGCGGGCTCCCCGCACACCGCGCAGAACAACACCCGCAGCAGCAGCGACGGGGTAGACACCGCGGGCTTCGCCCGGGAGGTCTTCACGAGCTCGGCGCGCAGCGCCTCCAGCTGCTCACGGGTCAGGATCGGCTCAGCCCGCACCAGCGGGGCTCCGTCGTCGTCTCGGACGGTCTTACCGTTCAGAGTCGCGTACCCGAGCATCGCCTCGGAGATCATCGATCGCTTCAGCGCGGTAGCCGACCACTCCCGGCCCTGCGGCTCGCGGCCTTGCAGCTGCGCGAAGTAGTCCTTCGGCGACAGGACACCACGCCGGTTCAGGTCGTGGGCCACCAGGTGCAGCGGCTCGTGGTTGTCGACGACGCGGTGATACACCTCGAGGATGCGCTCTCGCTGCACAGGGTCCGGCACCAGCCGCCACTCCCCGTCCACGCGCGTAGGCAGGTATCCCCACGGCGGCAGGGATCCTCGGTATTTCCCGGCGCGGATATTGAAATGCGCAGCCGAACGGTTCCGCTCTTTGATCGCTTCTAATTCCATCTGCGCCACCGTTCCCATAAGCGCGATGACGACCGCCGCAAACGGCGTCGTCGTATCGAAGTGCGCTTCGGTCGCGGAGACGACCAGCTTCTTGTGGTCCTCGGCCCAGTGGACCAGCTGTTGCAGATGCCGGATCGATCGGGTCAACCGGTCTACCCGGTACGCCACGATCACGTCGAACGGTTGCTCCTCGAACGCTAGCCACCGGGCCAGGTTCGGTCTGCGCTTCCGGTCGAACGGATCGACCGCCCCGGAGACGTCCAGATCCTCCGCTACCCCGACGACGTCCCAGCCGCGCTGGGCGCAGAGCTGCTGGCAAGACTCCAGCTGACGCTCCGGTGAAGTCGTAGCATCGGTGACGCGGGACAGGCGGATGACTACCAGGGCTCTCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTATTAAACAAAATTATTTGTAGAGGCTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGACCGGAAAGCACATCCGGTGACAGCTTGCTCGCAGGTCAAAGGGTATACTGGGATTCCAGTGAACGCAATCAATTTCTGAGAACTGTCATTCTCGGAAATTGAGGGTTTGTACCGTACACCACTGAGACCGCGGTGGTTGACCAGACAAACCACGAGGGAGACCAGAAACAAAAAAAGGCCCCCCGTTAGGGAGGCCTTCAATAATTGGTTATCATTTGTACAGTTCATCCATACCATGCGTGATGCCCGCTGCGGTTACGAACTCCAGCAGAACCATATGATCGCGTTTCTCGTTCGGATCTTTAGACAGAACGCTTTGCGTGCTCAGATAGTGATTGTCTGGCAGCAGAACAGGACCATCACCGATTGGAGTGTTTTGCTGGTAGTGATCAGCCAGCTGCACGCTGCCATCCTCCACGTTGTGGCGAATTTTAAAATTCGCTTTAATGCCATTTTTTTGTTTATCGGCGGTGATGTAAACATTGTGGCTGTTAAAATTGTATTCCAGCTTATGGCCCAGGATATTGCCGTCTTCTTTAAAGTCAATGCCTTTCAGCTCAATGCGGTTTACCAGGGTATCGCCTTCAAATTTCACTTCCGCACGCGTTTTGTACGTGCCGTCATCCTTAAAGGAAATCGTGCGTTCCTGCACATAGCCTTCCGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCATGCTGCTTCATATGGTCCGGATAACGAGCAAAGCACTGAACACCATAAGTCAGCGTCGTTACCAGAGTCGGCCAAGGTACCGGCAGTTTACCAGTAGTACAGATGAACTTCAGCGTCAGTTTACCATTAGTTGCGTCACCTTCACCCTCGCCACGCACGGAAAACTTATGACCGTTGACATCACCATCCAGTTCCACCAGAATAGGGACGACACCAGTGAACAGCTCTTCGCCTTTACGCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTAACTCTTAAACAAAATTATTTGTAGAGGCTGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGACCGGAAAGCACATCCGGTGACAGCTTGCTCGCAGGTCAAAATATATACTGGGATTCCAGTGAACGCAACAGGATGTGACGAGCGGTGTGGTCAATTTCTGAGAACTGTCATTCTCGGAAATTGAACTGGCCGTCGTTTTACAAC(SEQ ID NO:44)
其中VloxP的序列为：
TCAATTTCCGAGAATGACAGTTCTCAGAAATTGA(SEQ ID NO:45)
将重组质粒pBxb1-attP-VCre转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入Ralstonia eutropha Bxb1-attB中，用同时含有200μg/ml卡那霉素与100μg/ml安普霉素的LB平板筛选阳性克隆，即得到质粒整合到基因组上的重组菌。再将重组质粒pVCre转入大肠杆菌S17-1中，通过接合转化方法转入所述重组菌，用同时含有250μg/ml壮观霉素与100μg/ml安普霉素的LB平板，随机挑取8个长出的克隆，用引物tcggcggcggccgggcgtg(SEQ ID NO:46)和caccgattggagtgttttgc(SEQ ID NO:47)进行PCR验证，全部得到预期的1547bp的条带，证明VCre删除了载体骨架(图4)。最后，将阳性克隆在无抗性平板上培养丢失pVCre质粒，即得到外源基因GFP整合到基因组的重组菌Ralstonia eutropha Bxb1-GFP。
序列表
<110> 深圳蓝晶生物科技有限公司
<120> 一种基因组整合外源序列的方法
<130> DI20-0220-XC37
<160> 47
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H1-primer 1
<400> 1
acacaggaaa cagctatgac tggtacccgg ccaagtctgc 40
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H1-primer 2
<400> 2
gatttgattg tctctctgcc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H2-primer 3
<400> 3
cctgccggcc tggttcaac 19
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H2-primer 4
<400> 4
gttgtaaaac gacggccagt aaagcctcta ccgctcgc 38
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Primer 5
<400> 5
gtcatagctg tttcctgtgt g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Primer 6
<400> 6
actggccgtc gttttacaac 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Primer 7
<400> 7
ggcagagaga caatcaaatc 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Primer 8
<400> 8
gttgaaccag gccggcagg 19
<210> 9
<211> 337
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成片段01
<400> 9
ggcagagaga caatcaaatc tctagggcgg cggatttgtc ctactcagga gagcgttcac 60
cgacaaacaa cagataaaac gaaaggccca gtctttcgac tgagcctttc gttttatttg 120
atgcccagga aacagctatg acggttcggc cggcttgtcg acgacggcgg tctccgtcgt 180
caggatcatc cgggcactgg ccgtcgtttt acaaccttgg actcctgttg atagatccag 240
taatgacctc agaactccat ctggatttgt tcagaacgct cggttgccgc cgggcgtttt 300
ttattggtga gaatccagcc tgccggcctg gttcaac 347
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Bxb1对应的attB序列
<400> 10
tcggccggct tgtcgacgac ggcggtctcc gtcgtcagga tcatccgggc 50
<210> 11
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成片段02
<400> 11
ggcagagaga caatcaaatc tctagggcgg cggatttgtc ctactcagga gagcgttcac 60
cgacaaacaa cagataaaac gaaaggccca gtctttcgac tgagcctttc gttttatttg 120
atgcccagga aacagctatg acggtcgcgc ccggggagcc caagggcacg ccctggcaca 180
ctggccgtcg ttttacaacc ttggactcct gttgatagat ccagtaatga cctcagaact 240
ccatctggat ttgttcagaa cgctcggttg ccgccgggcg ttttttattg gtgagaatcc 300
agcctgccgg cctggttcaa c 331
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PhiC31对应的attB序列
<400> 12
cgcgcccggg gagcccaagg gcacgccctg gcac 34
<210> 13
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成片段03
<400> 13
ggcagagaga caatcaaatc tctagggcgg cggatttgtc ctactcagga gagcgttcac 60
cgacaaacaa cagataaaac gaaaggccca gtctttcgac tgagcctttc gttttatttg 120
atgcccagga aacagctatg acggttatgc caacacaatt aacatctcaa tcaaggtaaa 180
tgctttttgc tttttttgac tggccgtcgt tttacaacct tggactcctg ttgatagatc 240
cagtaatgac ctcagaactc catctggatt tgttcagaac gctcggttgc cgccgggcgt 300
tttttattgg tgagaatcca gcctgccggc ctggttcaac 350
<210> 14
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TP901对应的attB序列
<400> 14
tatgccaaca caattaacat ctcaatcaag gtaaatgctt tttgcttttt ttg 53
<210> 15
<211> 314
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成片段04
<400> 15
ggcagagaga caatcaaatc tctagggcgg cggatttgtc ctactcagga gagcgttcac 60
cgacaaacaa cagataaaac gaaaggccca gtctttcgac tgagcctttc gttttatttg 120
atgcccagga aacagctatg acggtacgac cttcgcatta cgaatgcgct gcactggccg 180
tcgttttaca accttggact cctgttgata gatccagtaa tgacctcaga actccatctg 240
gatttgttca gaacgctcgg ttgccgccgg gcgtttttta ttggtgagaa tccagcctgc 300
cggcctggtt caac 324
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P22对应的attB序列
<400> 16
acgaccttcg cattacgaat gcgctgc 27
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Primer 9
<400> 17
cacacaggaa acagctatga c 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Primer 10
<400> 18
gttgtaaaac gacggccagt 20
<210> 19
<211> 1844
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成片段05
<400> 19
cacacaggaa acagctatga cctggattct caccaataaa aaacgcccgg cggcaaccga 60
gcgttctgaa caaatccaga tggagttctg aggtcattac tggatctatc aacaggagtc 120
caagctacga catcccggtg tgtagccgtt cgaccacgct gccgagcctg agatgctgct 180
cgtactcttg cagatccccg aagtcgatcg tgcgagtcag cccgccgcgg acgtcgaacg 240
tcagccgaac gttcatcgac cgaagccagg tgttctttgc cgcggtgtcc tgctcccgcc 300
accagtcccc gaaccgctgc ccggtctcgc gccactccca gccagacggg cgagcctcta 360
ggccctccag ctcctcttgc cgcgcggcca gcgccgcaat acgggcatcc agtgcttctc 420
gctgcggaga gccggcccgg taggccgggg agccgatcag cgacgtcagg tccaccagct 480
ccgcgttcac ctccgcgagt tcgaccgcgg agtccgagcc ggctacccag actttctcca 540
gacgctccgc gtccccgagc agatccagca cctgctcctc gcagaacgcg tcccactcgg 600
ccatcgccac cgtgccgttc ccgcagtgct tcgggaaccc catcgagcgg cagcggtagc 660
gcgggtgctt acgtcctccc ccggcgaact tgtacgcggg ctccccgcac accgcgcaga 720
acaacacccg cagcagcagc gacggggtag acaccgcggg cttcgcccgg gaggtcttca 780
cgagctcggc gcgcagcgcc tccagctgct cacgggtcag gatcggctca gcccgcacca 840
gcggggctcc gtcgtcgtct cggacggtct taccgttcag agtcgcgtac ccgagcatcg 900
cctcggagat catcgatcgc ttcagcgcgg tagccgacca ctcccggccc tgcggctcgc 960
ggccttgcag ctgcgcgaag tagtccttcg gcgacaggac accacgccgg ttcaggtcgt 1020
gggccaccag gtgcagcggc tcgtggttgt cgacgacgcg gtgatacacc tcgaggatgc 1080
gctctcgctg cacagggtcc ggcaccagcc gccactcccc gtccacgcgc gtaggcaggt 1140
atccccacgg cggcagggat cctcggtatt tcccggcgcg gatattgaaa tgcgcagccg 1200
aacggttccg ctctttgatc gcttctaatt ccatctgcgc caccgttccc ataagcgcga 1260
tgacgaccgc cgcaaacggc gtcgtcgtat cgaagtgcgc ttcggtcgcg gagacgacca 1320
gcttcttgtg gtcctcggcc cagtggacca gctgttgcag atgccggatc gatcgggtca 1380
accggtctac ccggtacgcc acgatcacgt cgaacggttg ctcctcgaac gctagccacc 1440
gggccaggtt cggtctgcgc ttccggtcga acggatcgac cgccccggag acgtccagat 1500
cctccgctac cccgacgacg tcccagccgc gctgggcgca gagctgctgg caagactcca 1560
gctgacgctc cggtgaagtc gtagcatcgg tgacgcggga caggcggatg actaccaggg 1620
ctctcatcta gtatttctcc tctttctcta gtattaaaca aaattatttg tagaggctgt 1680
ttcgtcctca cggactcatc agaccggaaa gcacatccgg tgacagcttg ctcgcaggtc 1740
aaagggtata ctgggattcc agtgaacgca agggtttgta ccgtacacca ctgagaccgc 1800
ggtggttgac cagacaaacc acgaactggc cgtcgtttta caac 1904
<210> 20
<211> 1503
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Bxb1重组酶的基因序列
<400> 20
atgagagccc tggtagtcat ccgcctgtcc cgcgtcaccg atgctacgac ttcaccggag 60
cgtcagctgg agtcttgcca gcagctctgc gcccagcgcg gctgggacgt cgtcggggta 120
gcggaggatc tggacgtctc cggggcggtc gatccgttcg accggaagcg cagaccgaac 180
ctggcccggt ggctagcgtt cgaggagcaa ccgttcgacg tgatcgtggc gtaccgggta 240
gaccggttga cccgatcgat ccggcatctg caacagctgg tccactgggc cgaggaccac 300
aagaagctgg tcgtctccgc gaccgaagcg cacttcgata cgacgacgcc gtttgcggcg 360
gtcgtcatcg cgcttatggg aacggtggcg cagatggaat tagaagcgat caaagagcgg 420
aaccgttcgg ctgcgcattt caatatccgc gccgggaaat accgaggatc cctgccgccg 480
tggggatacc tgcctacgcg cgtggacggg gagtggcggc tggtgccgga ccctgtgcag 540
cgagagcgca tcctcgaggt gtatcaccgc gtcgtcgaca accacgagcc gctgcacctg 600
gtggcccacg acctgaaccg gcgtggtgtc ctgtcgccga aggactactt cgcgcagctg 660
caaggccgcg agccgcaggg ccgggagtgg tcggctaccg cgctgaagcg atcgatgatc 720
tccgaggcga tgctcgggta cgcgactctg aacggtaaga ccgtccgaga cgacgacgga 780
gccccgctgg tgcgggctga gccgatcctg acccgtgagc agctggaggc gctgcgcgcc 840
gagctcgtga agacctcccg ggcgaagccc gcggtgtcta ccccgtcgct gctgctgcgg 900
gtgttgttct gcgcggtgtg cggggagccc gcgtacaagt tcgccggggg aggacgtaag 960
cacccgcgct accgctgccg ctcgatgggg ttcccgaagc actgcgggaa cggcacggtg 1020
gcgatggccg agtgggacgc gttctgcgag gagcaggtgc tggatctgct cggggacgcg 1080
gagcgtctgg agaaagtctg ggtagccggc tcggactccg cggtcgaact cgcggaggtg 1140
aacgcggagc tggtggacct gacgtcgctg atcggctccc cggcctaccg ggccggctct 1200
ccgcagcgag aagcactgga tgcccgtatt gcggcgctgg ccgcgcggca agaggagctg 1260
gagggcctag aggctcgccc gtctggctgg gagtggcgcg agaccgggca gcggttcggg 1320
gactggtggc gggagcagga caccgcggca aagaacacct ggcttcggtc gatgaacgtt 1380
cggctgacgt tcgacgtccg cggcgggctg actcgcacga tcgacttcgg ggatctgcaa 1440
gagtacgagc agcatctcag gctcggcagc gtggtcgaac ggctacacac cgggatgtcg 1500
tag 1553
<210> 21
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Bxb1重组酶
<400> 21
Met Arg Ala Leu Val Val Ile Arg Leu Ser Arg Val Thr Asp Ala Thr
1 5 10 15
Thr Ser Pro Glu Arg Gln Leu Glu Ser Cys Gln Gln Leu Cys Ala Gln
20 25 30
Arg Gly Trp Asp Val Val Gly Val Ala Glu Asp Leu Asp Val Ser Gly
35 40 45
Ala Val Asp Pro Phe Asp Arg Lys Arg Arg Pro Asn Leu Ala Arg Trp
50 55 60
Leu Ala Phe Glu Glu Gln Pro Phe Asp Val Ile Val Ala Tyr Arg Val
65 70 75 80
Asp Arg Leu Thr Arg Ser Ile Arg His Leu Gln Gln Leu Val His Trp
85 90 95
Ala Glu Asp His Lys Lys Leu Val Val Ser Ala Thr Glu Ala His Phe
100 105 110
Asp Thr Thr Thr Pro Phe Ala Ala Val Val Ile Ala Leu Met Gly Thr
115 120 125
Val Ala Gln Met Glu Leu Glu Ala Ile Lys Glu Arg Asn Arg Ser Ala
130 135 140
Ala His Phe Asn Ile Arg Ala Gly Lys Tyr Arg Gly Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Trp Gly Tyr Leu Pro Thr Arg Val Asp Gly Glu Trp Arg Leu Val Pro
165 170 175
Asp Pro Val Gln Arg Glu Arg Ile Leu Glu Val Tyr His Arg Val Val
180 185 190
Asp Asn His Glu Pro Leu His Leu Val Ala His Asp Leu Asn Arg Arg
195 200 205
Gly Val Leu Ser Pro Lys Asp Tyr Phe Ala Gln Leu Gln Gly Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Gly Arg Glu Trp Ser Ala Thr Ala Leu Lys Arg Ser Met Ile
225 230 235 240
Ser Glu Ala Met Leu Gly Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Lys Thr Val Arg
245 250 255
Asp Asp Asp Gly Ala Pro Leu Val Arg Ala Glu Pro Ile Leu Thr Arg
260 265 270
Glu Gln Leu Glu Ala Leu Arg Ala Glu Leu Val Lys Thr Ser Arg Ala
275 280 285
Lys Pro Ala Val Ser Thr Pro Ser Leu Leu Leu Arg Val Leu Phe Cys
290 295 300
Ala Val Cys Gly Glu Pro Ala Tyr Lys Phe Ala Gly Gly Gly Arg Lys
305 310 315 320
His Pro Arg Tyr Arg Cys Arg Ser Met Gly Phe Pro Lys His Cys Gly
325 330 335
Asn Gly Thr Val Ala Met Ala Glu Trp Asp Ala Phe Cys Glu Glu Gln
340 345 350
Val Leu Asp Leu Leu Gly Asp Ala Glu Arg Leu Glu Lys Val Trp Val
355 360 365
Ala Gly Ser Asp Ser Ala Val Glu Leu Ala Glu Val Asn Ala Glu Leu
370 375 380
Val Asp Leu Thr Ser Leu Ile Gly Ser Pro Ala Tyr Arg Ala Gly Ser
385 390 395 400
Pro Gln Arg Glu Ala Leu Asp Ala Arg Ile Ala Ala Leu Ala Ala Arg
405 410 415
Gln Glu Glu Leu Glu Gly Leu Glu Ala Arg Pro Ser Gly Trp Glu Trp
420 425 430
Arg Glu Thr Gly Gln Arg Phe Gly Asp Trp Trp Arg Glu Gln Asp Thr
435 440 445
Ala Ala Lys Asn Thr Trp Leu Arg Ser Met Asn Val Arg Leu Thr Phe
450 455 460
Asp Val Arg Gly Gly Leu Thr Arg Thr Ile Asp Phe Gly Asp Leu Gln
465 470 475 480
Glu Tyr Glu Gln His Leu Arg Leu Gly Ser Val Val Glu Arg Leu His
485 490 495
Thr Gly Met Ser
500
<210> 22
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Bxb1对应的attP序列
<400> 22
tcgtggtttg tctggtcaac caccgcggtc tcagtggtgt acggtacaaa ccc 53
<210> 23
<211> 2145
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成片段06
<400> 23
cacacaggaa acagctatga cctggattct caccaataaa aaacgcccgg cggcaaccga 60
gcgttctgaa caaatccaga tggagttctg aggtcattac tggatctatc aacaggagtc 120
caagctacgc cgctacgtct tccgtgccgt cctgggcgtc gtcttcgtcg tcgtcggtcg 180
gcggcttcgc ccacgtgatc gaagcgcgct tctcgatggg cgttccctgc cccctgcccg 240
tagtcgactt cgtgacaacg atcttgtcta cgaagagccc gacgaacacg cgcttgtcgt 300
ctactgacgc gcgcccccac cacgacttag ggccggtcgg gtcagcgtcg gcgtcttcgg 360
ggaaccattg gtcaagggga agcttcgggg cttcggcggc ttcaagttcg gcaagccgct 420
cttccgcccc ttgctgccgg agcgtcagcg ctgcctgttg cttccggaag tgcttcctgc 480
caacgggtcc gtcgtacgcg cctgccgcgc ggtcttcgta cagctcttca agggcgttca 540
gggcgtcggc gcgctccgca acaaggttcg cccgttcgcc gctcttctca ggcgcctcag 600
tgagcttgcc gaagcgtcgg gcggcttccc acagaagcgc caacgtctct tcgtcgcctt 660
cggcgtgcct gatcttgttg aagatgcgtt ccgcaacgaa cttgtcgagt gccgccatgc 720
tgacgttgca cgtgccttcg tgctgcccag gtgcggacgg gtcgaccacc ttccggcgac 780
ggcagcggta agagtccttg atcgattctt ccccgcgctt cgaagtcatg acggcgccac 840
actcgcagta cagcttgtcc atggcggaca gaatggcttg cccccgggaa agccccttgc 900
cgcgccccct gccgtccaac cacgcctgaa gctcatacca ctcagcgggc tcgatgatcg 960
gtccgcaatc aagctcgacc ggccggagcg tgatcgggtc gcgctgaatg cggtaaccct 1020
caatcttcgt ggtcggcgtg ccgtccggct tcttcttgta gatcacctca gcggcgaagc 1080
ccgcaatacg cgggtcccga aggattcgca taacggttgc cgggtcccag gcgcttgaag 1140
cggtcttctt cccaatcgtc tcgccccggg tcggcacggc gtcagcgtcc atgcgcttac 1200
aaagccccgt gatgctgccc gggtgaatgg cggcttgact gcccggcttg aagggaaggt 1260
gtttgtgcgt cttgatctca cgccaccacc accggattac gtcgggctcg aactcgaagg 1320
gtccggtaag gggagtggtc gagtgcgcaa gcttgttgat gacgacattg accattcggc 1380
cgttgcgcgt gatctccttc gtctccgaaa caagctcgaa gccgtaaggc gccttcccgc 1440
cgacgtaccc gcccaattcg cgctgaaggt tcttcgtgtc gagaatcttc gccgacttca 1500
gcgaagattc tttgtgcgac gcgtcgagcc gcataatcag gtgaatcagg tccatgacgt 1560
ttccctgccg gaagacgcct tcctgagtgg aaacaatcgt cacgcccagg gcgagcaatt 1620
ccgagacaat cggaatcgcg tccatgacct tcaggcgcga gaagcgcgac acgtcataga 1680
caatgatcat gttgagccgc ccggcgcggc attcgttcag gatgcgttcg aactccgggc 1740
gctccgccgt cccgaacgcc gacgtgcccg gcgcttcgct gaaatgcccg acgaacctga 1800
accggccccc gtcgcgctcg acttcgcgct gaaggtcggc cgccttgtct tcgttggcgc 1860
tacgctgtgt cgctgggctt gctgcgctcg aattctcgcg ctcgcgcgac tgacggtcgt 1920
aagcacccgc gtacgtgtcc atctagtatt tctcctcttt ctctagtatt aaacaaaatt 1980
atttgtagag gctgtttcgt cctcacggac tcatcagacc ggaaagcaca tccggtgaca 2040
gcttgctcgc aggtcaaagg gtatactggg attccagtga acgcaacccc aactggggta 2100
acctttgagt tctctcagtt gggggactgg ccgtcgtttt acaac 2215
<210> 24
<211> 1818
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PhiC31重组酶的基因序列
<400> 24
atggacacgt acgcgggtgc ttacgaccgt cagtcgcgcg agcgcgagaa ttcgagcgca 60
gcaagcccag cgacacagcg tagcgccaac gaagacaagg cggccgacct tcagcgcgaa 120
gtcgagcgcg acgggggccg gttcaggttc gtcgggcatt tcagcgaagc gccgggcacg 180
tcggcgttcg ggacggcgga gcgcccggag ttcgaacgca tcctgaacga atgccgcgcc 240
gggcggctca acatgatcat tgtctatgac gtgtcgcgct tctcgcgcct gaaggtcatg 300
gacgcgattc cgattgtctc ggaattgctc gccctgggcg tgacgattgt ttccactcag 360
gaaggcgtct tccggcaggg aaacgtcatg gacctgattc acctgattat gcggctcgac 420
gcgtcgcaca aagaatcttc gctgaagtcg gcgaagattc tcgacacgaa gaaccttcag 480
cgcgaattgg gcgggtacgt cggcgggaag gcgccttacg gcttcgagct tgtttcggag 540
acgaaggaga tcacgcgcaa cggccgaatg gtcaatgtcg tcatcaacaa gcttgcgcac 600
tcgaccactc cccttaccgg acccttcgag ttcgagcccg acgtaatccg gtggtggtgg 660
cgtgagatca agacgcacaa acaccttccc ttcaagccgg gcagtcaagc cgccattcac 720
ccgggcagca tcacggggct ttgtaagcgc atggacgctg acgccgtgcc gacccggggc 780
gagacgattg ggaagaagac cgcttcaagc gcctgggacc cggcaaccgt tatgcgaatc 840
cttcgggacc cgcgtattgc gggcttcgcc gctgaggtga tctacaagaa gaagccggac 900
ggcacgccga ccacgaagat tgagggttac cgcattcagc gcgacccgat cacgctccgg 960
ccggtcgagc ttgattgcgg accgatcatc gagcccgctg agtggtatga gcttcaggcg 1020
tggttggacg gcagggggcg cggcaagggg ctttcccggg ggcaagccat tctgtccgcc 1080
atggacaagc tgtactgcga gtgtggcgcc gtcatgactt cgaagcgcgg ggaagaatcg 1140
atcaaggact cttaccgctg ccgtcgccgg aaggtggtcg acccgtccgc acctgggcag 1200
cacgaaggca cgtgcaacgt cagcatggcg gcactcgaca agttcgttgc ggaacgcatc 1260
ttcaacaaga tcaggcacgc cgaaggcgac gaagagacgt tggcgcttct gtgggaagcc 1320
gcccgacgct tcggcaagct cactgaggcg cctgagaaga gcggcgaacg ggcgaacctt 1380
gttgcggagc gcgccgacgc cctgaacgcc cttgaagagc tgtacgaaga ccgcgcggca 1440
ggcgcgtacg acggacccgt tggcaggaag cacttccgga agcaacaggc agcgctgacg 1500
ctccggcagc aaggggcgga agagcggctt gccgaacttg aagccgccga agccccgaag 1560
cttccccttg accaatggtt ccccgaagac gccgacgctg acccgaccgg ccctaagtcg 1620
tggtgggggc gcgcgtcagt agacgacaag cgcgtgttcg tcgggctctt cgtagacaag 1680
atcgttgtca cgaagtcgac tacgggcagg gggcagggaa cgcccatcga gaagcgcgct 1740
tcgatcacgt gggcgaagcc gccgaccgac gacgacgaag acgacgccca ggacggcacg 1800
gaagacgtag cggcgtag 1878
<210> 25
<211> 605
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PhiC31重组酶
<400> 25
Met Asp Thr Tyr Ala Gly Ala Tyr Asp Arg Gln Ser Arg Glu Arg Glu
1 5 10 15
Asn Ser Ser Ala Ala Ser Pro Ala Thr Gln Arg Ser Ala Asn Glu Asp
20 25 30
Lys Ala Ala Asp Leu Gln Arg Glu Val Glu Arg Asp Gly Gly Arg Phe
35 40 45
Arg Phe Val Gly His Phe Ser Glu Ala Pro Gly Thr Ser Ala Phe Gly
50 55 60
Thr Ala Glu Arg Pro Glu Phe Glu Arg Ile Leu Asn Glu Cys Arg Ala
65 70 75 80
Gly Arg Leu Asn Met Ile Ile Val Tyr Asp Val Ser Arg Phe Ser Arg
85 90 95
Leu Lys Val Met Asp Ala Ile Pro Ile Val Ser Glu Leu Leu Ala Leu
100 105 110
Gly Val Thr Ile Val Ser Thr Gln Glu Gly Val Phe Arg Gln Gly Asn
115 120 125
Val Met Asp Leu Ile His Leu Ile Met Arg Leu Asp Ala Ser His Lys
130 135 140
Glu Ser Ser Leu Lys Ser Ala Lys Ile Leu Asp Thr Lys Asn Leu Gln
145 150 155 160
Arg Glu Leu Gly Gly Tyr Val Gly Gly Lys Ala Pro Tyr Gly Phe Glu
165 170 175
Leu Val Ser Glu Thr Lys Glu Ile Thr Arg Asn Gly Arg Met Val Asn
180 185 190
Val Val Ile Asn Lys Leu Ala His Ser Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro
195 200 205
Phe Glu Phe Glu Pro Asp Val Ile Arg Trp Trp Trp Arg Glu Ile Lys
210 215 220
Thr His Lys His Leu Pro Phe Lys Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ile His
225 230 235 240
Pro Gly Ser Ile Thr Gly Leu Cys Lys Arg Met Asp Ala Asp Ala Val
245 250 255
Pro Thr Arg Gly Glu Thr Ile Gly Lys Lys Thr Ala Ser Ser Ala Trp
260 265 270
Asp Pro Ala Thr Val Met Arg Ile Leu Arg Asp Pro Arg Ile Ala Gly
275 280 285
Phe Ala Ala Glu Val Ile Tyr Lys Lys Lys Pro Asp Gly Thr Pro Thr
290 295 300
Thr Lys Ile Glu Gly Tyr Arg Ile Gln Arg Asp Pro Ile Thr Leu Arg
305 310 315 320
Pro Val Glu Leu Asp Cys Gly Pro Ile Ile Glu Pro Ala Glu Trp Tyr
325 330 335
Glu Leu Gln Ala Trp Leu Asp Gly Arg Gly Arg Gly Lys Gly Leu Ser
340 345 350
Arg Gly Gln Ala Ile Leu Ser Ala Met Asp Lys Leu Tyr Cys Glu Cys
355 360 365
Gly Ala Val Met Thr Ser Lys Arg Gly Glu Glu Ser Ile Lys Asp Ser
370 375 380
Tyr Arg Cys Arg Arg Arg Lys Val Val Asp Pro Ser Ala Pro Gly Gln
385 390 395 400
His Glu Gly Thr Cys Asn Val Ser Met Ala Ala Leu Asp Lys Phe Val
405 410 415
Ala Glu Arg Ile Phe Asn Lys Ile Arg His Ala Glu Gly Asp Glu Glu
420 425 430
Thr Leu Ala Leu Leu Trp Glu Ala Ala Arg Arg Phe Gly Lys Leu Thr
435 440 445
Glu Ala Pro Glu Lys Ser Gly Glu Arg Ala Asn Leu Val Ala Glu Arg
450 455 460
Ala Asp Ala Leu Asn Ala Leu Glu Glu Leu Tyr Glu Asp Arg Ala Ala
465 470 475 480
Gly Ala Tyr Asp Gly Pro Val Gly Arg Lys His Phe Arg Lys Gln Gln
485 490 495
Ala Ala Leu Thr Leu Arg Gln Gln Gly Ala Glu Glu Arg Leu Ala Glu
500 505 510
Leu Glu Ala Ala Glu Ala Pro Lys Leu Pro Leu Asp Gln Trp Phe Pro
515 520 525
Glu Asp Ala Asp Ala Asp Pro Thr Gly Pro Lys Ser Trp Trp Gly Arg
530 535 540
Ala Ser Val Asp Asp Lys Arg Val Phe Val Gly Leu Phe Val Asp Lys
545 550 555 560
Ile Val Val Thr Lys Ser Thr Thr Gly Arg Gly Gln Gly Thr Pro Ile
565 570 575
Glu Lys Arg Ala Ser Ile Thr Trp Ala Lys Pro Pro Thr Asp Asp Asp
580 585 590
Glu Asp Asp Ala Gln Asp Gly Thr Glu Asp Val Ala Ala
595 600 605
<210> 26
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PhiC31对应的attP序列
<400> 26
cccccaactg agagaactca aaggttaccc cagttgggg 39
<210> 27
<211> 1865
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成片段07
<400> 27
cacacaggaa acagctatga cctggattct caccaataaa aaacgcccgg cggcaaccga 60
gcgttctgaa caaatccaga tggagttctg aggtcattac tggatctatc aacaggagtc 120
caagttaagc agccagagcg tagttttcgt ccttagcagc accggtagcg agttggaatt 180
taaatatgat atctacatta tcagcagtaa catcaacctt tgatacaagg ttgttgacga 240
ttttcttttt attatcatat gatagttcat taatcggaat tgagcccaac tgagttttaa 300
ctaactcaaa aacatcagta gagtcattaa atttattttc gctaatctta gctttaagca 360
gctttttctc agcctgaagg gaatcagtac gatctttcaa ctcatccata gtgataaaat 420
catttaggta caaatcagag ttcttttgta tttttttatc gatctgtgaa atttgctttt 480
taaatgacga agtatcaaga ataggttggt tgttgccatt gataattttc aataaggagt 540
cattattttc ttgaaatcca atcaggttgt caataacagt attttctaaa ttacttaaat 600
cataagttcc tgaatcacac tttttattgt cattatatac tgtaattcct tttgtttttc 660
gaggaaatct atttgcacag tgatatttca tagtgcggct tccatctttt cttttgtggc 720
caagaacaat ttttaaaggt gctccacagt aaccgcacct tgccatccct gacagcatat 780
atttagcttg gaaaggtcta gggttgttat ttctttcata agtctgctgt tgtctttctt 840
ctagctcttt ttgaactttt aaataagtct cataagggat aattggtttg tgcatacctt 900
caaataggct gtccttaaat ttgatataac cacagtaaac tggattatca agtgtttgtc 960
ttagggtacg ataagaccac ggtatatctt taccgatgtg tccagattca ttgagtttat 1020
ctcttaattt tgtaagtgat attcctgata aataatcagt gaatatttgt tcaactattg 1080
tagcttgtaa aggaacaatt tctaatatac ctgtctttct gttgtggtaa tacccaaaag 1140
ctgtcttagt ccacatcata gacttaccag atttcgctcg ccctagttta cccatagtca 1200
tgcgttcttt tatattctct ctttcaaact cattaattgc agaaagaata gtgagaaaca 1260
agctacccat agcagaagaa gtatcaatac tttcattaag cgagataaag tctattttat 1320
tttttgtgaa cacatcctta acaagataaa gagtatctct tacactacgt gaaaggcggt 1380
ctagcttata tacaagaact gtatcaaaag ctttattctc gatatcgttg attaatcttt 1440
gcattgctgg gcgttcaagt ttggcccctg aaaaaccagc atcagtataa gtatcagata 1500
cttgccaccc cattgcttca gcatattttg ttaaacggtc aatttgctca tcaattgaga 1560
agccttcctc tgcttggtta gtagtggata ctcgtgtata gattgctact ttcttagtgc 1620
cggcctggtg gtgatggtga tgatgtttca tctagtattt ctcctctttc tctagtatta 1680
aacaaaatta tttgtagagg ctgtttcgtc ctcacggact catcagaccg gaaagcacat 1740
ccggtgacag cttgctcgca ggtcaaaggg tatactggga ttccagtgaa cgcaaaaaag 1800
gagtttttta gttaccttaa ttgaaataaa cgaaataaaa actcgactgg ccgtcgtttt 1860
acaac 1927
<210> 28
<211> 1527
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TP901重组酶的基因序列
<400> 28
atgaaacatc atcaccatca ccaccaggcc ggcactaaga aagtagcaat ctatacacga 60
gtatccacta ctaaccaagc agaggaaggc ttctcaattg atgagcaaat tgaccgttta 120
acaaaatatg ctgaagcaat ggggtggcaa gtatctgata cttatactga tgctggtttt 180
tcaggggcca aacttgaacg cccagcaatg caaagattaa tcaacgatat cgagaataaa 240
gcttttgata cagttcttgt atataagcta gaccgccttt cacgtagtgt aagagatact 300
ctttatcttg ttaaggatgt gttcacaaaa aataaaatag actttatctc gcttaatgaa 360
agtattgata cttcttctgc tatgggtagc ttgtttctca ctattctttc tgcaattaat 420
gagtttgaaa gagagaatat aaaagaacgc atgactatgg gtaaactagg gcgagcgaaa 480
tctggtaagt ctatgatgtg gactaagaca gcttttgggt attaccacaa cagaaagaca 540
ggtatattag aaattgttcc tttacaagct acaatagttg aacaaatatt cactgattat 600
ttatcaggaa tatcacttac aaaattaaga gataaactca atgaatctgg acacatcggt 660
aaagatatac cgtggtctta tcgtacccta agacaaacac ttgataatcc agtttactgt 720
ggttatatca aatttaagga cagcctattt gaaggtatgc acaaaccaat tatcccttat 780
gagacttatt taaaagttca aaaagagcta gaagaaagac aacagcagac ttatgaaaga 840
aataacaacc ctagaccttt ccaagctaaa tatatgctgt cagggatggc aaggtgcggt 900
tactgtggag cacctttaaa aattgttctt ggccacaaaa gaaaagatgg aagccgcact 960
atgaaatatc actgtgcaaa tagatttcct cgaaaaacaa aaggaattac agtatataat 1020
gacaataaaa agtgtgattc aggaacttat gatttaagta atttagaaaa tactgttatt 1080
gacaacctga ttggatttca agaaaataat gactccttat tgaaaattat caatggcaac 1140
aaccaaccta ttcttgatac ttcgtcattt aaaaagcaaa tttcacagat cgataaaaaa 1200
atacaaaaga actctgattt gtacctaaat gattttatca ctatggatga gttgaaagat 1260
cgtactgatt cccttcaggc tgagaaaaag ctgcttaaag ctaagattag cgaaaataaa 1320
tttaatgact ctactgatgt ttttgagtta gttaaaactc agttgggctc aattccgatt 1380
aatgaactat catatgataa taaaaagaaa atcgtcaaca accttgtatc aaaggttgat 1440
gttactgctg ataatgtaga tatcatattt aaattccaac tcgctaccgg tgctgctaag 1500
gacgaaaact acgctctggc tgcttaa 1577
<210> 29
<211> 508
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TP901重组酶
<400> 29
Met Lys His His His His His His Gln Ala Gly Thr Lys Lys Val Ala
1 5 10 15
Ile Tyr Thr Arg Val Ser Thr Thr Asn Gln Ala Glu Glu Gly Phe Ser
20 25 30
Ile Asp Glu Gln Ile Asp Arg Leu Thr Lys Tyr Ala Glu Ala Met Gly
35 40 45
Trp Gln Val Ser Asp Thr Tyr Thr Asp Ala Gly Phe Ser Gly Ala Lys
50 55 60
Leu Glu Arg Pro Ala Met Gln Arg Leu Ile Asn Asp Ile Glu Asn Lys
65 70 75 80
Ala Phe Asp Thr Val Leu Val Tyr Lys Leu Asp Arg Leu Ser Arg Ser
85 90 95
Val Arg Asp Thr Leu Tyr Leu Val Lys Asp Val Phe Thr Lys Asn Lys
100 105 110
Ile Asp Phe Ile Ser Leu Asn Glu Ser Ile Asp Thr Ser Ser Ala Met
115 120 125
Gly Ser Leu Phe Leu Thr Ile Leu Ser Ala Ile Asn Glu Phe Glu Arg
130 135 140
Glu Asn Ile Lys Glu Arg Met Thr Met Gly Lys Leu Gly Arg Ala Lys
145 150 155 160
Ser Gly Lys Ser Met Met Trp Thr Lys Thr Ala Phe Gly Tyr Tyr His
165 170 175
Asn Arg Lys Thr Gly Ile Leu Glu Ile Val Pro Leu Gln Ala Thr Ile
180 185 190
Val Glu Gln Ile Phe Thr Asp Tyr Leu Ser Gly Ile Ser Leu Thr Lys
195 200 205
Leu Arg Asp Lys Leu Asn Glu Ser Gly His Ile Gly Lys Asp Ile Pro
210 215 220
Trp Ser Tyr Arg Thr Leu Arg Gln Thr Leu Asp Asn Pro Val Tyr Cys
225 230 235 240
Gly Tyr Ile Lys Phe Lys Asp Ser Leu Phe Glu Gly Met His Lys Pro
245 250 255
Ile Ile Pro Tyr Glu Thr Tyr Leu Lys Val Gln Lys Glu Leu Glu Glu
260 265 270
Arg Gln Gln Gln Thr Tyr Glu Arg Asn Asn Asn Pro Arg Pro Phe Gln
275 280 285
Ala Lys Tyr Met Leu Ser Gly Met Ala Arg Cys Gly Tyr Cys Gly Ala
290 295 300
Pro Leu Lys Ile Val Leu Gly His Lys Arg Lys Asp Gly Ser Arg Thr
305 310 315 320
Met Lys Tyr His Cys Ala Asn Arg Phe Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ile
325 330 335
Thr Val Tyr Asn Asp Asn Lys Lys Cys Asp Ser Gly Thr Tyr Asp Leu
340 345 350
Ser Asn Leu Glu Asn Thr Val Ile Asp Asn Leu Ile Gly Phe Gln Glu
355 360 365
Asn Asn Asp Ser Leu Leu Lys Ile Ile Asn Gly Asn Asn Gln Pro Ile
370 375 380
Leu Asp Thr Ser Ser Phe Lys Lys Gln Ile Ser Gln Ile Asp Lys Lys
385 390 395 400
Ile Gln Lys Asn Ser Asp Leu Tyr Leu Asn Asp Phe Ile Thr Met Asp
405 410 415
Glu Leu Lys Asp Arg Thr Asp Ser Leu Gln Ala Glu Lys Lys Leu Leu
420 425 430
Lys Ala Lys Ile Ser Glu Asn Lys Phe Asn Asp Ser Thr Asp Val Phe
435 440 445
Glu Leu Val Lys Thr Gln Leu Gly Ser Ile Pro Ile Asn Glu Leu Ser
450 455 460
Tyr Asp Asn Lys Lys Lys Ile Val Asn Asn Leu Val Ser Lys Val Asp
465 470 475 480
Val Thr Ala Asp Asn Val Asp Ile Ile Phe Lys Phe Gln Leu Ala Thr
485 490 495
Gly Ala Ala Lys Asp Glu Asn Tyr Ala Leu Ala Ala
500 505
<210> 30
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TP901对应的attP序列
<400> 30
cgagttttta tttcgtttat ttcaattaag gtaactaaaa aactcctttt 50
<210> 31
<211> 1712
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成片段08
<400> 31
cacacaggaa acagctatga cctggattct caccaataaa aaacgcccgg cggcaaccga 60
gcgttctgaa caaatccaga tggagttctg aggtcattac tggatctatc aacaggagtc 120
caagctacgt attattcgtg ccttccttat ttttactgtg ggacatattt gggacagaag 180
taccaaaaat cgagtcaatt tgtcgagcat gttcagtcag gtgatttggt gccagatgag 240
catatcggcg aaccatttcg atagactccc agccacccat ttcctgcaat accgaaatcg 300
gaacgccagc ctgaactaac caacttgccc acgtgtgcct caggtcatga aaacggaagt 360
cttcaatgcc cgctcgtttt aatgctgccc tccatgcagt attagcgtca tagcgcatct 420
tcctcactac aggtgattta gttccgtctg gtttggtgct gctttccttg tagacgaaca 480
cccatttgtg atgattgccg atttgctttt tcagcacccg gcaagcggta tcattcagcg 540
ccactccaat ggcatgatta gacttgcttt gttccgggtg tatccatgcc acctttcgtt 600
gcatgtctat ctgctgccac tccagattga taatgttaga ccgccttaag ccagtagaaa 660
gcgcaaactc tacgactgac tttagcggtt cctggcattc atcaatcaac ctttttgcct 720
cgtgaggctc aagccagcgg atacgcttat ttttcggctg aggaactttg atgatcggag 780
ccttatccag catcttccat tcgcgttcag cagcccggag gagtgcctta atgaatgaaa 840
ggtgagttgc ttttgtagct actgctgccg gcttaggctt gaataccgga ggctgcttcc 900
cattcttcct gcatgcttca tccattaact tccagttttc ctcatgccgc cgattagtta 960
tcttctggat ggcggagtaa atcttcgtct cggtaatatc cttcaactgc attcctgcaa 1020
aatgctggag ccagaatcct atccgactct tgtcatcatc cagcgacttc ttatgcgcct 1080
tctcctctaa ccacctgaca caggccccct caaaagtcat gtcaggcgtc tctcctaatt 1140
tacttaccct ccatgcttct gccttcagct tgtcatgaag ctctgtggcc tgccttttgt 1200
cctttgtccc aagagactgc ttaaatcttt tgccgttcgg caatgtgaaa ctggcgtacc 1260
aggtttcacc tctgcggaat agtgacatct agtatttctc ctctttctct agtattaaac 1320
aaaattattt gtagaggctg tttcgtcctc acggactcat cagaccggaa agcacatccg 1380
gtgacagctt gctcgcaggt caaagggtat actgggattc cagtgaacgc aactaagtgg 1440
tttgggacaa aaatgggaca tacaaatctt tgcatcggtt tgcaaggctt tgcatgtctt 1500
tcgaagatgg gacgtgtgag cgcaggtatg acgtggtatg ttgttgactt aaaaggtagt 1560
tcttataatt cgtaatgcga aggtcgtagg ttcgactcct attatcggca ccagttaaat 1620
caaatactta cgtattattc gtgccttcct tatttttact gtgggacata tttgggacag 1680
aagtaccaaa aaactggccg tcgttttaca ac 1768
<210> 32
<211> 1164
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P22重组酶的基因序列
<400> 32
atgtcactat tccgcagagg tgaaacctgg tacgccagtt tcacattgcc gaacggcaaa 60
agatttaagc agtctcttgg gacaaaggac aaaaggcagg ccacagagct tcatgacaag 120
ctgaaggcag aagcatggag ggtaagtaaa ttaggagaga cgcctgacat gacttttgag 180
ggggcctgtg tcaggtggtt agaggagaag gcgcataaga agtcgctgga tgatgacaag 240
agtcggatag gattctggct ccagcatttt gcaggaatgc agttgaagga tattaccgag 300
acgaagattt actccgccat ccagaagata actaatcggc ggcatgagga aaactggaag 360
ttaatggatg aagcatgcag gaagaatggg aagcagcctc cggtattcaa gcctaagccg 420
gcagcagtag ctacaaaagc aactcacctt tcattcatta aggcactcct ccgggctgct 480
gaacgcgaat ggaagatgct ggataaggct ccgatcatca aagttcctca gccgaaaaat 540
aagcgtatcc gctggcttga gcctcacgag gcaaaaaggt tgattgatga atgccaggaa 600
ccgctaaagt cagtcgtaga gtttgcgctt tctactggct taaggcggtc taacattatc 660
aatctggagt ggcagcagat agacatgcaa cgaaaggtgg catggataca cccggaacaa 720
agcaagtcta atcatgccat tggagtggcg ctgaatgata ccgcttgccg ggtgctgaaa 780
aagcaaatcg gcaatcatca caaatgggtg ttcgtctaca aggaaagcag caccaaacca 840
gacggaacta aatcacctgt agtgaggaag atgcgctatg acgctaatac tgcatggagg 900
gcagcattaa aacgagcggg cattgaagac ttccgttttc atgacctgag gcacacgtgg 960
gcaagttggt tagttcaggc tggcgttccg atttcggtat tgcaggaaat gggtggctgg 1020
gagtctatcg aaatggttcg ccgatatgct catctggcac caaatcacct gactgaacat 1080
gctcgacaaa ttgactcgat ttttggtact tctgtcccaa atatgtccca cagtaaaaat 1140
aaggaaggca cgaataatac gtag 1202
<210> 33
<211> 387
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P22重组酶
<400> 33
Met Ser Leu Phe Arg Arg Gly Glu Thr Trp Tyr Ala Ser Phe Thr Leu
1 5 10 15
Pro Asn Gly Lys Arg Phe Lys Gln Ser Leu Gly Thr Lys Asp Lys Arg
20 25 30
Gln Ala Thr Glu Leu His Asp Lys Leu Lys Ala Glu Ala Trp Arg Val
35 40 45
Ser Lys Leu Gly Glu Thr Pro Asp Met Thr Phe Glu Gly Ala Cys Val
50 55 60
Arg Trp Leu Glu Glu Lys Ala His Lys Lys Ser Leu Asp Asp Asp Lys
65 70 75 80
Ser Arg Ile Gly Phe Trp Leu Gln His Phe Ala Gly Met Gln Leu Lys
85 90 95
Asp Ile Thr Glu Thr Lys Ile Tyr Ser Ala Ile Gln Lys Ile Thr Asn
100 105 110
Arg Arg His Glu Glu Asn Trp Lys Leu Met Asp Glu Ala Cys Arg Lys
115 120 125
Asn Gly Lys Gln Pro Pro Val Phe Lys Pro Lys Pro Ala Ala Val Ala
130 135 140
Thr Lys Ala Thr His Leu Ser Phe Ile Lys Ala Leu Leu Arg Ala Ala
145 150 155 160
Glu Arg Glu Trp Lys Met Leu Asp Lys Ala Pro Ile Ile Lys Val Pro
165 170 175
Gln Pro Lys Asn Lys Arg Ile Arg Trp Leu Glu Pro His Glu Ala Lys
180 185 190
Arg Leu Ile Asp Glu Cys Gln Glu Pro Leu Lys Ser Val Val Glu Phe
195 200 205
Ala Leu Ser Thr Gly Leu Arg Arg Ser Asn Ile Ile Asn Leu Glu Trp
210 215 220
Gln Gln Ile Asp Met Gln Arg Lys Val Ala Trp Ile His Pro Glu Gln
225 230 235 240
Ser Lys Ser Asn His Ala Ile Gly Val Ala Leu Asn Asp Thr Ala Cys
245 250 255
Arg Val Leu Lys Lys Gln Ile Gly Asn His His Lys Trp Val Phe Val
260 265 270
Tyr Lys Glu Ser Ser Thr Lys Pro Asp Gly Thr Lys Ser Pro Val Val
275 280 285
Arg Lys Met Arg Tyr Asp Ala Asn Thr Ala Trp Arg Ala Ala Leu Lys
290 295 300
Arg Ala Gly Ile Glu Asp Phe Arg Phe His Asp Leu Arg His Thr Trp
305 310 315 320
Ala Ser Trp Leu Val Gln Ala Gly Val Pro Ile Ser Val Leu Gln Glu
325 330 335
Met Gly Gly Trp Glu Ser Ile Glu Met Val Arg Arg Tyr Ala His Leu
340 345 350
Ala Pro Asn His Leu Thr Glu His Ala Arg Gln Ile Asp Ser Ile Phe
355 360 365
Gly Thr Ser Val Pro Asn Met Ser His Ser Lys Asn Lys Glu Gly Thr
370 375 380
Asn Asn Thr
385
<210> 34
<211> 260
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P22对应的attP序列
<400> 34
tttttggtac ttctgtccca aatatgtccc acagtaaaaa taaggaaggc acgaataata 60
cgtaagtatt tgatttaact ggtgccgata ataggagtcg aacctacgac cttcgcatta 120
cgaattataa gaactacctt ttaagtcaac aacataccac gtcatacctg cgctcacacg 180
tcccatcttc gaaagacatg caaagccttg caaaccgatg caaagatttg tatgtcccat 240
ttttgtccca aaccacttag 268
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 35
gcgcatggcg tctccatg 18
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 36
gtggaccagc tgttgcag 18
<210> 37
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Primer 11
<400> 37
ctaccggcgc ggcagcg 17
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Primer 12
<400> 38
gcggccaccg gctggctc 18
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Primer 13
<400> 39
cgctgccgcg ccggtag 17
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Primer 14
<400> 40
gagccagccg gtggccgc 18
<210> 41
<211> 5555
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成片段09
<400> 41
gagccagccg gtggccgcct acatggctct gctgtagttc acccttggcg tccaaccagc 60
ggcaccagcg gcgcctgaga ggggcgcgcc cagctgtcta gggcggcgga tttgtcctac 120
tcaggagagc gttcaccgac aaacaacaga taaaacgaaa ggcccagtct ttcgactgag 180
cctttcgttt tatttgatgc ctttaattaa agcggataac aatttcacac aggacaactg 240
agaccggaat tggtctcaac gtacgtctca ttttcgccag atatcgacgt cttaagaccc 300
actttcacat ttaagttgtt tttctaatcc gcatatgatc aattcaaggc cgaataagaa 360
ggctggctct gcaccttggt gatcaaataa ttcgatagct tgtcgtaata atggcggcat 420
actatcagta gtaggtgttt ccctttcttc tttagcgact tgatgctctt gatcttccaa 480
tacgcaacct aaagtaaaat gccccacagc gctgagtgca tataatgcat tctctagtga 540
aaaaccttgt tggcataaaa aggctaattg attttcgaga gtttcatact gtttttctgt 600
aggccgtgta cctaaatgta cttttgctcc atcgcgatga cttagtaaag cacatctaaa 660
acttttagcg ttattacgta aaaaatcttg ccagctttcc ccttctaaag ggcaaaagtg 720
agtatggtgc ctatctaaca tctcaatggc taaggcgtcg agcaaagccc gcttattttt 780
tacatgccaa tacaatgtag gctgctctac acctagcttc tgggcgagtt tacgggttgt 840
taaaccttcg attccgacct cattaagcag ctctaatgcg ctgttaatca ctttactttt 900
atctaatcta gacatcatta attcctaatt tttgttgaca ctctatcgtt gatagagtta 960
ttttaccact ccctatcagt gatagagaaa agaattcaag ctgtcaccgg atgtgctttc 1020
cggtctgatg agtccgtgag gacgaaacag cctctacaaa taattttgtt taatactaga 1080
gaaagaggag aaatactaga tgatcgagaa ccagctgagc ctgctgggtg atttcagcgg 1140
cgtgcgtccg gacgatgtta agaccgcgat ccaggcggcg caaaagaaag gtattaacgt 1200
tgcggagaac gaacaattca aagcggcgtt tgagcacctg ctgaacgagt tcaagaaacg 1260
tgaggaacgt tacagcccga acaccctgcg tcgtctggaa agcgcgtgga cctgctttgt 1320
ggattggtgc ctggcgaacc atcgtcacag cctgccggcg accccggaca ccgttgaggc 1380
gttctttatc gaacgtgcgg aggaactgca ccgtaacacc ctgagcgtgt accgttgggc 1440
gattagccgt gttcatcgtg ttgcgggttg cccggacccg tgcctggata tctatgtgga 1500
ggatcgtctg aaggcgattg cgcgtaagaa agtgcgtgag ggcgaagcgg ttaaacaggc 1560
gagcccgttt aacgaacaac acctgctgaa gctgaccagc ctgtggtacc gtagcgacaa 1620
actgctgctg cgtcgtaacc tggcgctgct ggcggtggcg tatgagagca tgctgcgtgc 1680
gagcgaactg gcgaacatcc gtgttagcga catggagctg gcgggtgatg gcaccgcgat 1740
tctgaccatc ccgattacca agaccaacca cagcggcgag ccggacacct gcattctgag 1800
ccaggatgtg gttagcctgc tgatggacta caccgaagcg ggcaagctgg acatgagcag 1860
cgatggtttc ctgtttgtgg gcgttagcaa acacaacacc tgcatcaagc cgaagaaaga 1920
taaacagacc ggtgaagttc tgcacaagcc gattaccacc aaaaccgtgg agggcgtttt 1980
ctatagcgcg tgggaaaccc tggatctggg tcgtcaaggc gtgaagccgt ttaccgcgca 2040
cagcgcgcgt gttggtgcgg cgcaggacct gctgaagaaa ggctacaaca ccctgcaaat 2100
ccagcaaagc ggtcgttgga gcagcggcgc gatggttgcg cgttatggtc gtgcgatcct 2160
ggcgcgtgac ggcgcgatgg cgcacagccg tgtgaaaacc cgtagcgcgc cgatgcaatg 2220
gggcaaggac gagaaagatt aatgataagc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc 2280
gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctct actagagtca 2340
cactggctca ccttcgggtg ggcctttctg cgtttatata ctagagctgc taacaaagcc 2400
cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg 2460
gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc cggattacta 2520
gaggtcatgc ttgccatctg ttttcttgca agattactag tagcggccgc tgcaggtcgt 2580
gactgggaaa accctggcga ctagtcttgg actcctgttg atagatccag taatgacctc 2640
agaactccat ctggatttgt tcagaacgct cggttgccgc cgggcgtttt ttattggtga 2700
gaatccagac gttgtgtctc aaaatctctg atgttacatt gcacaagata aaaatatatc 2760
atcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg ttatgagcca 2820
tattcaacgg gaaacgtctt gctcgaggcc gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt 2880
atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgatt 2940
gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta gcgttgccaa 3000
tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac 3060
catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg cgatccccgg 3120
gaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata ttgttgatgc 3180
gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacag 3240
cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc 3300
gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca 3360
taagcttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa 3420
ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc 3480
agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt 3540
acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt 3600
tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc agaattggtt aattggttgt aacactggca 3660
gagcattacg ctgacttgac gggacggcgg ctttgttgaa taaatcgaac ttttgctgag 3720
ttgaaggatc agatcacgca tcttcccgac aacgcagacc gttccgtggc aaagcaaaag 3780
ttcaaaatca ccaactggtc cacctacaac aaagctctca tcaaccgtgg ctccctcact 3840
ttctggctgg atgatggggc gattcaggcc tggtatgagt cagcaacacc ttcttcacga 3900
ggcagacctc agcgctattc tgaccttgcc atcacgactg tgctggtcat taaacgcgta 3960
ttcaggctga ccctgcgcgc tgcgcagggc tttattgatt ccatttttac actgatgaat 4020
gttccgttgc gctgcccgga ttacagccgg atcctctaga gtcgacctgc aggcatgctg 4080
atcggcacgt aagaggttcc aactttcacc ataatgaaat aagatcacta ccgggcgtat 4140
tttttgagtt atcgagattt tcaggagcta aggaagctaa aatgcgctca cgcaactggt 4200
ccagaacctt gaccgaacgc agcggtggta acggcgcagt ggcggttttc atggcttgtt 4260
atgactgttt ttttggggta cagtctatgc ctcgggcatc caagcagcaa gcgcgttacg 4320
ccgtgggtcg atgtttgatg ttatggagca gcaacgatgt tacgcagcag ggcagtcgcc 4380
ctaaaacaaa gttaaacatc atgagggaag cggtgatcgc cgaagtatcg actcaactat 4440
cagaggtagt tggcgtcatc gagcgccatc tcgaaccgac gttgctggcc gtacatttgt 4500
acggctccgc agtggatggc ggcctgaagc cacacagtga tattgatttg ctggttacgg 4560
tgaccgtaag gcttgatgaa acaacgcggc gagctttgat caacgacctt ttggaaactt 4620
cggcttcccc tggagagagc gagattctcc gcgctgtaga agtcaccatt gttgtgcacg 4680
acgacatcat tccgtggcgt tatccagcta agcgcgaact gcaatttgga gaatggcagc 4740
gcaatgacat tcttgcaggt atcttcgagc cagccacgat cgacattgat ctggctatct 4800
tgctgacaaa agcaagagaa catagcgttg ccttggtagg tccagcggcg gaggaactct 4860
ttgatccggt tcctgaacag gatctatttg aggcgctaaa tgaaacctta acgctatgga 4920
actcgccgcc cgactgggct ggcgatgagc gaaatgtagt gcttacgttg tcccgcattt 4980
ggtacagcgc agtaaccggc aaaatcgcgc cgaaggatgt cgctgccgac tgggcaatgg 5040
agcgcctgcc ggcccagtat cagcccgtca tacttgaagc tagacaggct tatcttggac 5100
aagaagaaga tcgcttggcc tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtc cactacgtga 5160
aaggcgagat caccaaggta gtcggcaaat aaactagtaa ataataaaaa agccggatta 5220
ataatctggc tttttatatt ctctgcataa ccctgcttcg gggtcattat agcgattttt 5280
tcggtatatc catccttttt cgcacgatat acaggatttt gccaaagggt tcgtgtagac 5340
tttccttggt gtatccaacg gcgtcagccg ggcaggatag gtgaagtagg cccacccgcg 5400
agcgggtgtt ccttcttcac tgtcccttat tcgcacctgg cggtgctcaa cgggaatcct 5460
gctctgcgag gctggccgta ggccggccgc gatgcaggtg gctgctgaac ccccagccgg 5520
aactgacccc acaaggccct accggcgcgg cagcg 5739
<210> 42
<211> 1143
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VCre重组酶的基因序列
<400> 42
atgatcgaga accagctgag cctgctgggt gatttcagcg gcgtgcgtcc ggacgatgtt 60
aagaccgcga tccaggcggc gcaaaagaaa ggtattaacg ttgcggagaa cgaacaattc 120
aaagcggcgt ttgagcacct gctgaacgag ttcaagaaac gtgaggaacg ttacagcccg 180
aacaccctgc gtcgtctgga aagcgcgtgg acctgctttg tggattggtg cctggcgaac 240
catcgtcaca gcctgccggc gaccccggac accgttgagg cgttctttat cgaacgtgcg 300
gaggaactgc accgtaacac cctgagcgtg taccgttggg cgattagccg tgttcatcgt 360
gttgcgggtt gcccggaccc gtgcctggat atctatgtgg aggatcgtct gaaggcgatt 420
gcgcgtaaga aagtgcgtga gggcgaagcg gttaaacagg cgagcccgtt taacgaacaa 480
cacctgctga agctgaccag cctgtggtac cgtagcgaca aactgctgct gcgtcgtaac 540
ctggcgctgc tggcggtggc gtatgagagc atgctgcgtg cgagcgaact ggcgaacatc 600
cgtgttagcg acatggagct ggcgggtgat ggcaccgcga ttctgaccat cccgattacc 660
aagaccaacc acagcggcga gccggacacc tgcattctga gccaggatgt ggttagcctg 720
ctgatggact acaccgaagc gggcaagctg gacatgagca gcgatggttt cctgtttgtg 780
ggcgttagca aacacaacac ctgcatcaag ccgaagaaag ataaacagac cggtgaagtt 840
ctgcacaagc cgattaccac caaaaccgtg gagggcgttt tctatagcgc gtgggaaacc 900
ctggatctgg gtcgtcaagg cgtgaagccg tttaccgcgc acagcgcgcg tgttggtgcg 960
gcgcaggacc tgctgaagaa aggctacaac accctgcaaa tccagcaaag cggtcgttgg 1020
agcagcggcg cgatggttgc gcgttatggt cgtgcgatcc tggcgcgtga cggcgcgatg 1080
gcgcacagcc gtgtgaaaac ccgtagcgcg ccgatgcaat ggggcaagga cgagaaagat 1140
taa 1181
<210> 43
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VCre重组酶
<400> 43
Met Ile Glu Asn Gln Leu Ser Leu Leu Gly Asp Phe Ser Gly Val Arg
1 5 10 15
Pro Asp Asp Val Lys Thr Ala Ile Gln Ala Ala Gln Lys Lys Gly Ile
20 25 30
Asn Val Ala Glu Asn Glu Gln Phe Lys Ala Ala Phe Glu His Leu Leu
35 40 45
Asn Glu Phe Lys Lys Arg Glu Glu Arg Tyr Ser Pro Asn Thr Leu Arg
50 55 60
Arg Leu Glu Ser Ala Trp Thr Cys Phe Val Asp Trp Cys Leu Ala Asn
65 70 75 80
His Arg His Ser Leu Pro Ala Thr Pro Asp Thr Val Glu Ala Phe Phe
85 90 95
Ile Glu Arg Ala Glu Glu Leu His Arg Asn Thr Leu Ser Val Tyr Arg
100 105 110
Trp Ala Ile Ser Arg Val His Arg Val Ala Gly Cys Pro Asp Pro Cys
115 120 125
Leu Asp Ile Tyr Val Glu Asp Arg Leu Lys Ala Ile Ala Arg Lys Lys
130 135 140
Val Arg Glu Gly Glu Ala Val Lys Gln Ala Ser Pro Phe Asn Glu Gln
145 150 155 160
His Leu Leu Lys Leu Thr Ser Leu Trp Tyr Arg Ser Asp Lys Leu Leu
165 170 175
Leu Arg Arg Asn Leu Ala Leu Leu Ala Val Ala Tyr Glu Ser Met Leu
180 185 190
Arg Ala Ser Glu Leu Ala Asn Ile Arg Val Ser Asp Met Glu Leu Ala
195 200 205
Gly Asp Gly Thr Ala Ile Leu Thr Ile Pro Ile Thr Lys Thr Asn His
210 215 220
Ser Gly Glu Pro Asp Thr Cys Ile Leu Ser Gln Asp Val Val Ser Leu
225 230 235 240
Leu Met Asp Tyr Thr Glu Ala Gly Lys Leu Asp Met Ser Ser Asp Gly
245 250 255
Phe Leu Phe Val Gly Val Ser Lys His Asn Thr Cys Ile Lys Pro Lys
260 265 270
Lys Asp Lys Gln Thr Gly Glu Val Leu His Lys Pro Ile Thr Thr Lys
275 280 285
Thr Val Glu Gly Val Phe Tyr Ser Ala Trp Glu Thr Leu Asp Leu Gly
290 295 300
Arg Gln Gly Val Lys Pro Phe Thr Ala His Ser Ala Arg Val Gly Ala
305 310 315 320
Ala Gln Asp Leu Leu Lys Lys Gly Tyr Asn Thr Leu Gln Ile Gln Gln
325 330 335
Ser Gly Arg Trp Ser Ser Gly Ala Met Val Ala Arg Tyr Gly Arg Ala
340 345 350
Ile Leu Ala Arg Asp Gly Ala Met Ala His Ser Arg Val Lys Thr Arg
355 360 365
Ser Ala Pro Met Gln Trp Gly Lys Asp Glu Lys Asp
370 375 380
<210> 44
<211> 2855
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成片段10
<400> 44
cacacaggaa acagctatga cctggattct caccaataaa aaacgcccgg cggcaaccga 60
gcgttctgaa caaatccaga tggagttctg aggtcattac tggatctatc aacaggagtc 120
caagctacga catcccggtg tgtagccgtt cgaccacgct gccgagcctg agatgctgct 180
cgtactcttg cagatccccg aagtcgatcg tgcgagtcag cccgccgcgg acgtcgaacg 240
tcagccgaac gttcatcgac cgaagccagg tgttctttgc cgcggtgtcc tgctcccgcc 300
accagtcccc gaaccgctgc ccggtctcgc gccactccca gccagacggg cgagcctcta 360
ggccctccag ctcctcttgc cgcgcggcca gcgccgcaat acgggcatcc agtgcttctc 420
gctgcggaga gccggcccgg taggccgggg agccgatcag cgacgtcagg tccaccagct 480
ccgcgttcac ctccgcgagt tcgaccgcgg agtccgagcc ggctacccag actttctcca 540
gacgctccgc gtccccgagc agatccagca cctgctcctc gcagaacgcg tcccactcgg 600
ccatcgccac cgtgccgttc ccgcagtgct tcgggaaccc catcgagcgg cagcggtagc 660
gcgggtgctt acgtcctccc ccggcgaact tgtacgcggg ctccccgcac accgcgcaga 720
acaacacccg cagcagcagc gacggggtag acaccgcggg cttcgcccgg gaggtcttca 780
cgagctcggc gcgcagcgcc tccagctgct cacgggtcag gatcggctca gcccgcacca 840
gcggggctcc gtcgtcgtct cggacggtct taccgttcag agtcgcgtac ccgagcatcg 900
cctcggagat catcgatcgc ttcagcgcgg tagccgacca ctcccggccc tgcggctcgc 960
ggccttgcag ctgcgcgaag tagtccttcg gcgacaggac accacgccgg ttcaggtcgt 1020
gggccaccag gtgcagcggc tcgtggttgt cgacgacgcg gtgatacacc tcgaggatgc 1080
gctctcgctg cacagggtcc ggcaccagcc gccactcccc gtccacgcgc gtaggcaggt 1140
atccccacgg cggcagggat cctcggtatt tcccggcgcg gatattgaaa tgcgcagccg 1200
aacggttccg ctctttgatc gcttctaatt ccatctgcgc caccgttccc ataagcgcga 1260
tgacgaccgc cgcaaacggc gtcgtcgtat cgaagtgcgc ttcggtcgcg gagacgacca 1320
gcttcttgtg gtcctcggcc cagtggacca gctgttgcag atgccggatc gatcgggtca 1380
accggtctac ccggtacgcc acgatcacgt cgaacggttg ctcctcgaac gctagccacc 1440
gggccaggtt cggtctgcgc ttccggtcga acggatcgac cgccccggag acgtccagat 1500
cctccgctac cccgacgacg tcccagccgc gctgggcgca gagctgctgg caagactcca 1560
gctgacgctc cggtgaagtc gtagcatcgg tgacgcggga caggcggatg actaccaggg 1620
ctctcatcta gtatttctcc tctttctcta gtattaaaca aaattatttg tagaggctgt 1680
ttcgtcctca cggactcatc agaccggaaa gcacatccgg tgacagcttg ctcgcaggtc 1740
aaagggtata ctgggattcc agtgaacgca atcaatttct gagaactgtc attctcggaa 1800
attgagggtt tgtaccgtac accactgaga ccgcggtggt tgaccagaca aaccacgagg 1860
gagaccagaa acaaaaaaag gccccccgtt agggaggcct tcaataattg gttatcattt 1920
gtacagttca tccataccat gcgtgatgcc cgctgcggtt acgaactcca gcagaaccat 1980
atgatcgcgt ttctcgttcg gatctttaga cagaacgctt tgcgtgctca gatagtgatt 2040
gtctggcagc agaacaggac catcaccgat tggagtgttt tgctggtagt gatcagccag 2100
ctgcacgctg ccatcctcca cgttgtggcg aattttaaaa ttcgctttaa tgccattttt 2160
ttgtttatcg gcggtgatgt aaacattgtg gctgttaaaa ttgtattcca gcttatggcc 2220
caggatattg ccgtcttctt taaagtcaat gcctttcagc tcaatgcggt ttaccagggt 2280
atcgccttca aatttcactt ccgcacgcgt tttgtacgtg ccgtcatcct taaaggaaat 2340
cgtgcgttcc tgcacatagc cttccggcat ggcggacttg aagaagtcat gctgcttcat 2400
atggtccgga taacgagcaa agcactgaac accataagtc agcgtcgtta ccagagtcgg 2460
ccaaggtacc ggcagtttac cagtagtaca gatgaacttc agcgtcagtt taccattagt 2520
tgcgtcacct tcaccctcgc cacgcacgga aaacttatga ccgttgacat caccatccag 2580
ttccaccaga atagggacga caccagtgaa cagctcttcg cctttacgca tctagtattt 2640
ctcctctttc tctagtaact cttaaacaaa attatttgta gaggctgttt cgtcctcacg 2700
gactcatcag accggaaagc acatccggtg acagcttgct cgcaggtcaa aatatatact 2760
gggattccag tgaacgcaac aggatgtgac gagcggtgtg gtcaatttct gagaactgtc 2820
attctcggaa attgaactgg ccgtcgtttt acaac 2949
<210> 45
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VloxP的序列
<400> 45
tcaatttccg agaatgacag ttctcagaaa ttga 34
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 46
tcggcggcgg ccgggcgtg 19
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 47
caccgattgg agtgttttgc 20
Claims (10)
1.一种适用于罗氏真氧菌的基于位点特异性重组酶的基因插入方法，包括以下步骤：
1)在罗氏真养菌的基因组上插入位点特异性重组酶Bxb1对应的attB位点以构建基因组上整合了attB序列的重组罗氏真氧菌；
2)构建含有外源序列、位点特异性重组酶Bxb1基因、位点特异性重组酶Bxb1对应的attP序列的重组载体；
3)将步骤2)中构建的所述重组载体转入步骤1)中构建的所述重组罗氏真氧菌中，利用所述位点特异性重组酶Bxb1介导attB和attP序列之间的重组，从而将所述重组载体整合到所述重组罗氏真氧菌的基因组上。
2.根据权利要求1的适用于罗氏真氧菌的基于位点特异性重组酶的基因插入方法，包括以下步骤：
a)在罗氏真养菌的基因组上插入位点特异性重组酶Bxb1对应的attB位点以构建基因组上整合了attB序列的重组罗氏真氧菌；
b)构建含有VCre重组酶基因的重组载体；
c)构建含有外源序列、位点特异性重组酶Bxb1基因、位点特异性重组酶Bxb1对应的attP序列、2个能够被步骤b)中的VCre重组酶特异性识别的VloxP序列的重组载体，其中，所述外源序列和所述attP序列在所述2个VloxP序列之间，所述位点特异性重组酶Bxb1基因不在所述2个VloxP序列之间；
d)将步骤c)中构建的所述重组载体转入步骤a)中构建的所述重组罗氏真氧菌中，利用所述位点特异性重组酶Bxb1介导attB和attP序列之间的重组，从而将所述重组载体整合到所述重组罗氏真氧菌的基因组上；
e)将步骤b)中构建的所述重组载体转入步骤d)得到基因组上整合了所述重组载体的重组菌中，从而将上述重组载体的骨架部分从基因组上删除。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述罗氏真氧菌为Ralstonia eutropha H16。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤2)或c)中，所述重组载体为无法在罗氏真氧菌中复制的质粒载体；优选地，所述重组载体的骨架部分包含能在大肠杆菌(如S17-1)中复制而不能在罗氏真氧菌中复制的复制子，优选地，所述复制子选自pMB1复制子、pUC复制子、p15a复制子和R6Kγ复制子，更优选地，所述复制子为pMB1复制子；优选地，所述重组载体的骨架部分还包含筛选标记基因；更优选地，所述筛选标记基因为抗生素抗性基因，特别地，所述抗生素抗性基因选自卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因，更特别地，所述抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤b)中，优选地，所述重组载体可为能在罗氏真氧菌中复制的质粒载体；优选地，所述重组载体的骨架部分包含既能在大肠杆菌中复制也能在罗氏真氧菌中复制的复制子，优选地，所述复制子选自pBBR1复制子、SC101复制子和RK2复制子，更优选地，所述复制子为pBBR1复制子；优选地，所述重组载体的骨架部分还包含筛选标记基因；更优选地，所述筛选标记基因是抗生素抗性基因，优选地，所述抗生素抗性基因选自卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因和壮观霉素抗性基因，更优选地，所述抗生素抗性基因是卡那霉素和壮观霉素抗性基因。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
步骤1)或a)中，所述位点特异性重组酶Bxb1对应的attB位点的序列如SEQ ID NO:10所示；和/或
步骤2)或c)中，所述位点特异性重组酶Bxb1基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；和/或
步骤2)或c)中，所述位点特异性重组酶Bxb1对应的attP序列如SEQ ID NO:22所示；和/或
步骤b)中，所述VCre重组酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示；和/或
步骤c)中，优选地，所述VloxP序列如SEQ ID NO:44所示。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤2)或c)中，所述位点特异性重组酶Bxb1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；和或，步骤b)中，所述VCre重组酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示。
8.一种重组载体，其包含外源序列、位点特异性重组酶Bxb1基因、位点特异性重组酶Bxb1对应的attP序列。
9.根据权利要求8所述的重组载体，其中，所述重组载体进一步包含2个能够被VCre重组酶特异性识别的VloxP序列，其中，所述外源序列和所述attP序列在所述2个VloxP序列之间，所述位点特异性重组酶Bxb1基因不在所述2个VloxP序列之间。
10.一种重组载体，其包含VCre重组酶基因。
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