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CN113354727B - 一组同时检测b/c/e组腺病毒的单克隆抗体和试纸条 - Google Patents

一组同时检测b/c/e组腺病毒的单克隆抗体和试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明提供一组同时检测B/C/E组腺病毒的单克隆抗体和试纸条，涉及腺病毒检测技术领域。本发明通过筛选获得了针对目前流行的呼吸道腺病毒HAdV‑B/C/E组特异的单克隆抗体，并利用其制备了一种检测B/C/E组腺病毒的胶体金检测试纸条，该试纸条具有很好的检测效果，其中对ADV1/2/5/6的最低检测限可达1.0×103VP/ml；对ADV3/4/7的检测限可达1.0×104VP/ml；并验证具有良好的特异性。本发明提供了一对单克隆抗体细胞株及一种同时检测B/C/E组腺病毒的快速检测方法，该检测方法对呼吸道腺病毒的检测效果好，操作简便，可以作为腺病毒感染的临床辅助诊断。

Description

一组同时检测B/C/E组腺病毒的单克隆抗体和试纸条
技术领域
本发明属于腺病毒检测技术领域，具体涉及一组同时检测B/C/E组腺病毒的单克隆抗体和试纸条。
背景技术
腺病毒（Adenovirus）是一种无包膜的二十面体双股DNA病毒，常侵犯呼吸系统、消化系统、泌尿系统、眼结膜等多器官。腺病毒在人群中常年流行，可发生于任何年龄组，全球多个国家和地区都曾发生过腺病毒感染的暴发，目前尚无特效的治疗方法。腺病毒作为一种机会性病原，大约50%的感染无症状，但仍具有传染性。
目前已发现的可感染人类的腺病毒约有69种血清型，可分为A-G的7个亚群。不同血清型腺病毒造成感染的组织嗜性有差异，其中B组、C组和E组常引起呼吸道感染，E组还可感染眼结膜，A组和F组主要感染胃肠道。腺病毒感染以呼吸道症状最为常见，其中B组的3/7型、C组的1/2/5/6型多引起儿童的急性呼吸道感染，E组的4型多与军事训练营地的急性呼吸道疾病疫情有关。腺病毒的抵抗力、感染性强，常引起聚集人群如家庭、幼儿园、小学等的暴发性流行，因此快速准确的诊断和处置，对控制和预防腺病毒感染及传播十分必要。
病毒培养目前作为实验室诊断的金标准，但受细胞培养周期的限制，难以在临床中应用。荧光定量PCR与细胞培养法相比，灵敏度较高，但耗费昂贵，需专业人员操作，且大量样本操作时易出现污染导致假阳性，因此现场应用受限。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一组产1H3和2A7单克隆抗体的杂交瘤细胞组、单克隆抗体及制备方法和应用，操作简便、耗时短，能快速地检测出呼吸道样本中的腺病毒感染，检测准确率高，非常适合呼吸道腺病毒感染的快速辅助诊断。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一组同时检测B/C/E组腺病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括1H3和2A7，所述1H3的重链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.3所示；所述1H3的轻链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.6所示；
所述2A7的重链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11~SEQ ID NO.13所示；所述2A7的轻链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14~SEQ ID NO.16所示。
优选的，所述1H3的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述1H3的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
优选的，编码所述1H3的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码所述1H3的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
优选的，所述2A7的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述2A7的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
优选的，编码所述2A7的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，编码所述2A7的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
本发明还提供了上述单克隆抗体在制备同时检测B/C/E组腺病毒的工具中的应用。
优选的，所述工具包括胶体金检测试纸条。
本发明还提供了一种同时检测B/C/E组腺病毒的胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条以上述单克隆抗体中的1H3为捕获抗体，以上述单克隆抗体中的2A7为标记抗体。
优选的，所述胶体金检测试纸条包括依次连接在背板上的纤维素膜、金标垫、样品垫和吸水垫，所述纤维素膜上设检测线和质控线；所述检测线包被单克隆抗体1H3，质控线包括羊抗鼠IgG；
所述金标垫包被单克隆抗体2A7。
有益效果：本发明通过筛选获得了针对目前流行的呼吸道腺病毒HAdV-B/C/E组特异的单克隆抗体，并利用其制备了一种检测B/C/E组腺病毒的胶体金检测试纸条，该试纸条对腺病毒B组（3/7）、C组（1/2/5/6）、E组（4）具有很好的检测效果，其中对C组ADV1/2/5/6型的最低检测限可达1.0×103VP/ml；对ADV3/4/7的检测限可达1.0×104VP/ml；并验证具有良好的特异性，与常见的呼吸道A/B型流感病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒无交叉反应。本发明提供了一对单克隆抗体细胞株及一种同时检测B/C/E组腺病毒的快速检测方法，该检测方法对呼吸道腺病毒的检测效果好，操作简便，可以作为腺病毒感染的临床辅助诊断。
附图说明
图1为阳性克隆筛选结果图；
图2为单抗纯度的SDS-PAGE鉴定图；
图3为单抗的特异性鉴定结果图；
图4为胶体金检测试纸条组装示意图；
图5为试纸条特异性分析结果图；
图6为试纸条灵敏度分析结果图。
具体实施方式
本发明提供了一组同时检测B/C/E组腺病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括1H3和2A7，所述1H3的重链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.3所示；所述1H3的轻链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.6所示；
所述2A7的重链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11~SEQ ID NO.13所示；所述2A7的轻链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14~SEQ ID NO.16所示。
本发明所述1H3的重链可变区的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.7所示，编码所述重链可变区的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.9所示；所述1H3的轻链可变区的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.8所示，编码所述1H3的轻链可变区的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.10所示。
本发明所述2A7的重链可变区的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.17所示，编码所述2A7的重链可变区的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.19所示；所述2A7的轻链可变区的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.18所示，编码所述2A7的轻链可变区的核苷酸序列优选如SEQ IDNO.20所示。
本发明对所述单克隆抗体的制备方法并没有特殊限定，优选利用杂交瘤细胞和腹水制备的方法，其中杂交瘤细胞组的制备方法，包括以下步骤：（1）利用C组腺病毒首次免疫若干雌鼠，利用B组腺病毒对所述雌鼠进行二次加强免疫，利用E组腺病毒进行三次加强免疫，筛选血清中效价较高的小鼠进行C组腺病毒腹腔冲击，3天后，提取脾脏细胞；
（2）将所述脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，得所述杂交瘤细胞。
本发明利用C组腺病毒首次免疫若干雌鼠，利用B组腺病毒对所述雌鼠进行二次加强免疫，利用E组腺病毒进行三次加强免疫，筛选血清中效价较高的小鼠进行C组腺病毒腹腔冲击，3天后，提取脾脏细胞。
本发明所述首次免疫优选包括利用C组腺病毒和弗氏完全佐剂的混合乳化液免疫所述雌鼠；所述C组腺病毒和弗氏完全佐剂的体积比为1:1。本发明所述C组腺病毒优选为HAdV-C组（2），在进行首次免疫时，优选将所述C组腺病毒稀释至1×108VP/ml后，与等体积弗式完全佐剂按照200μL/只的总剂量免疫4~6周Balb/C雌鼠。
本发明所述二次加强免疫优选包括利用B组腺病毒和弗氏不完全佐剂的混合乳化液免疫经所述首次免疫后的雌鼠；所述B组腺病毒和弗氏不完全佐剂的体积比为1:1。本发明优选将所述B组腺病毒稀释至1×108VP/ml后，与等体积弗氏不完全佐剂按照200μL/只的总剂量免疫上述首次免疫后的雌鼠。本发明所述B组腺病毒优选为HAdV-B组（7）。
本发明所述三次加强免疫优选包括利用E组腺病毒和弗氏不完全佐剂的混合乳化液免疫经所述二次加强免疫后的雌鼠；所述E组腺病毒和弗氏不完全佐剂的体积比为1:1。本发明优选将所述E组腺病毒稀释至1×108VP/ml后，与等体积弗氏不完全佐剂按照200μL/只的总剂量免疫上述次加强免疫后的雌鼠。本发明所述E组腺病毒优选为HAdV-E组（4）。在本发明中，所述首次免疫、二次加强免疫和三次加强免疫的时间间隔优选均为2周。
本发明在所述三次加强免疫后优选还包括采集血清测定效价，挑选效价较高的小鼠用HAdV-C组（2）（1×108VP/ml）200μL/只腹腔冲击，三天后取脾脏细胞进行融合。本发明对所述脾脏细胞的提取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。
得脾脏细胞后，本发明将所述脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，得所述杂交瘤细胞。本发明优选将所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0通过PEG1450融合，制备杂交瘤细胞。
本发明在得到所述杂交瘤细胞后，优选还包括将所述杂交瘤细胞稀释至单克隆状态，测定细胞培养上清效价，筛选只与C组腺病毒、B组腺病毒和E组腺病毒发生特异性反应的单克隆抗体。本发明优选利用ELISA的方法筛选特异性单克隆抗体，且在进行所述筛选时，以HAdv2/3/4/6/7各型病毒包被板检测，并用Hep-2细胞破碎液（反复冻融）200倍稀释及RSV病毒、A型（A/PR8）/B型流感病毒（B/Yamagata）、冠状病毒HCoV（OC43、NL63） 换算成与腺病毒一致的蛋白量进行包被，间接ELISA方法进行检测，筛选出1H3、2A7、6D8三株只与HAdv2/3/4/6/7特异反应的单克隆抗体，经有限稀释至单克隆状态后进行扩大培养和冻存，可用于制备特异性单克隆抗体。
本发明优选利用上述杂交瘤细胞组腹腔免疫小鼠，制备腹水，更优选的将筛选到的杂交瘤细胞株进行扩大培养后，于腹腔注射0.2mL (约2×106个细胞)至雌性Balb/C小鼠，约10~15日后，待小鼠腹部明显肿大时，使用无菌注射器针头采集腹水。本发明优选将收集到腹水以12000 r/min离心10min，去除上层油脂和下层沉淀，收集上清；将腹水上清液用结合缓冲液按照1:10进行稀释，用滤膜过滤，然后结合至Protein G柱(先用结合缓冲液平衡)；再用结合缓冲液冲洗大约5个柱体积，用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH 2.7)洗脱，收集洗脱峰；然后迅速使用1M Tris-HC1 (pH 9.0)溶液中和，使处干中性范围；将纯化抗体多次换液后透析至1×PBS中，得所述单克隆抗体。在本发明中，利用单抗亚型鉴定试剂盒（Proteintech）鉴定三株抗体（1H3、2A7、6D8）亚型，按说明书进行操作，结果表明1H3为IgG2a，2A7和6D8为IgG1 亚型，同时利用ELISA方法筛选配对抗体，结果显示1H3包被和2A7标记作为配对单抗检测的OD450nm值最高，可以很好的区分阴阳性，确定最佳配对单抗为1H3和2A7，用作本发明腺病毒检测试纸条的捕获抗体和标记抗体。
本发明还提供了上述单克隆抗体在制备同时检测B/C/E组腺病毒的工具中的应用。
本发明所述工具优选包括胶体金检测试纸条。本发明对所述胶体金检测试纸条的结构和制备方法并没有特殊限定。
本发明还提供了一种同时检测B/C/E组腺病毒的胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条以上述单克隆抗体中的1H3为捕获抗体，以上述单克隆抗体中的2A7为标记抗体。
本发明所述胶体金检测试纸条包括依次连接在背板上的纤维素膜、金标垫、样品垫和吸水垫，所述纤维素膜上设检测线和质控线；所述检测线包被单克隆抗体1H3，质控线包括羊抗鼠IgG；所述金标垫包被单克隆抗体2A7。
本发明所述检测线和质控线的制备优选包括将纯化的抗体单克隆抗体1H3用pH为7.4的PBS稀释至1mg/ml，以1μL/cm的量包被于纤维素膜上作为检测线，即为T线；间隔6mm将羊抗鼠IgG用pH7.4 PBS，稀释至1mg/mL，然后以1μL/cm的量包被于纤维素膜上，作为质控线，即为C线。
本发明所述金标垫优选包被金标抗体2A7，所述金标抗体2A7金标的制备方法，优选包括采用柠檬酸还原法制备得到1.0%的金颗粒溶液；按照1ml金溶液加入5μL 0.2M K2CO3水溶液调节pH值至7.6，混匀后加入纯化抗体2A7（5μg/ml）和20μL 10%BSA，混匀后静至10min，再加入10μL 10%PEG，静止5min后12000rpm离心5min，弃掉上清加入复溶液（0.01MPB+1%BSA+2%蔗糖）重悬，得金标抗体2A7。本发明优选将所述金标抗体2A7用稀释液稀释，以1200μL/条的量喷涂在玻璃纤维上作为金标垫，40℃烘干备用。
本发明优选按照图4所示，将上述包被好的纤维素膜、金标垫、样品垫、吸水垫按要求次序粘贴在背板上，经切条机斩切，并用塑料卡壳包裹，使样品垫暴露于塑料卡壳的加样孔位置，质控线、检测线暴露于结果观察孔的位置，组装成完整的检测卡。
下面结合实施例对本发明提供的一组产1H3和2A7单克隆抗体的杂交瘤细胞组、单克隆抗体及制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明所用材料如非特殊说明，均为常规市售产品。
1、病毒
人腺病毒血清型HAdV-B组（3/7）、HAdV-C组（1/2/5/6）、HAdV-E组（4）由核酸阳性的临床咽拭子分离鉴定并在Hep2细胞繁殖扩增，人冠状病毒HCoV（OC43、NL63），A型流感病毒（PR8），B型流感病毒（Yamagata），呼吸道合胞病毒（RSV-long）由中国疾病预防控制中心病毒病所分离鉴定保存，Balb/C小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司（SCXK（京）2019-0008）。
2、试剂
氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、Tris、表面活性剂等常规化学试剂为国产分析纯，弗氏佐剂、氯金酸为Sigma产品，羊抗鼠IgG-HRP购自北京索莱宝，TMB显色液为北京梅科万德生产。
实施例1
1、杂交瘤细胞的制备
1.1小鼠免疫
先用HAdV-C组（2）稀释至1×108VP/ml，免疫4~6周Balb/C雌鼠；二次加强免疫用HAdV-B组（7）（1×108VP/ml）、三次加强免疫用HAdV-E组（4）（1×108VP/ml）；
每次免疫时毒液的用量均为100μL/只，且首次免疫时与等体积的弗氏完全佐剂混合成乳液进行免疫；二次加强免疫和三次加强免疫时均为100μl/次/只的毒液与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，每次免疫间隔2周。
第三次免疫后采集血清测定效价，挑选效价较高的小鼠用HAdV-C组（2）（1×108VP/ml）200μl/只腹腔冲击（不加佐剂），三天后取脾脏细胞进行融合。
1.2细胞融合及阳性克隆筛选
将腹腔加强免疫后的小鼠眼眶取血后处死，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0通过PEG1450融合，制备杂交瘤细胞，以HAdV-B组（3/7）、HAdV-C组（1/2/5/6）和HAdV-E组（4）各型病毒包被板检测，并用Hep-2细胞破碎液（反复冻融）200倍稀释及RSV病毒、A型（A/PR8）/B型流感病毒（B/Yamagata）、冠状病毒HCoV（OC43、NL63、），按100倍稀释，间接ELISA方法进行检测，筛选出1H3、2A7、6D8三株只与HAdV-B组（3/7）、HAdV-C组（1/2/5/6）和HAdV-E组（4）特异反应的单克隆抗体，经有限稀释至单克隆状态后进行扩大培养和冻存。结果如图1所示，将获得的单克隆细胞株腹腔免疫小鼠，制备腹水。
ELISA检测方法：用碳酸盐缓冲液（pH9.6）将抗原按上述要求分别用包被缓冲液（碳酸盐缓冲液：碳酸钠1.59g和碳酸氢钠2.93g定容至1L纯水中）稀释，50μl/孔加入至酶标板中，4℃包被过夜，以2%马血清+1%蔗糖37℃封闭2h，甩干备用。将细胞上清50μl/孔加入至包被板中，37℃孵育35min，甩干液体，用0.5%的PBST洗液清洗四次，拍干后加入HRP标记的羊抗小鼠IgG (Solarbio）5000倍稀释，50μl/孔，37℃孵育35min，重复洗板步骤，加入TMB显色液（北京梅科万德生物科技有限公司）50μl/孔，37℃孵育10min，加入0.5M硫酸终止反应，波长OD450读数。测定结果如图所示。
1.3腹水制备与纯化
将筛选到的杂交瘤细胞株进行扩大培养后，于腹腔注射0.2mL (约2×106个细胞)至雌性Balb/C小鼠，约10~15日后待小鼠腹部明显肿大时，使用无菌注射器针头采集腹水。将收集到腹水以12000 r/min离心10min，去除上层油脂和下层沉淀，收集上清。将腹水上清液用结合缓冲液按照1:10进行稀释，用滤膜过滤，然后结合至Protein G柱(先用结合缓冲液平衡)。再用结合缓冲液冲洗大约5个柱体积，用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH 2.7)洗脱，收集洗脱峰。然后迅速使用1M Tris-HC1 (pH 9.0)溶液中和，使处干中性范围。将纯化抗体多次换液后透析至1×PBS中，测定浓度并分装1mL/管，-20℃以下保存。
2、纯化的单克隆抗体鉴定
2.1抗体纯度鉴定
SDS-PAGE电泳胶的配制：垂直电泳玻璃板洗净晾干，垂直放于制胶架上，按照要求配好分离胶体系，加入玻璃板间隙，至胶面达到所要求的高度后，加入无水乙醇密封；室温凝固后，弃去胶上层密封液体，并用吸水纸吸干，按比例配制浓缩胶，并插入适合的梳子，室温凝固。
SDS-PAGE电泳：抗体样品加同等体积的2×SDS loading buffer，置于沸水浴中煮10min，12000rpm离心3min，取上清加至加样孔。将5×甘氨酸缓冲液稀释至工作浓度，加入电泳槽至合适液面高度，将梳子从凝固凝胶中轻轻拔出。在加样孔内加入蛋白marker和10μl处理过的蛋白样品。接通电源，调整电压80V恒压电泳至分离胶，再改为120V直至溴酚蓝至凝胶底部。
染色及脱色：将胶从玻璃板上切下，置于考马斯亮蓝染液，摇床上染色过夜。脱色时取出凝胶，清水冲洗，置于脱色液中，摇床上反复脱色至条带清晰。结果见图2，3株单抗纯度可达90%以上。
2.2抗体结合力和特异性鉴定
用上述ELISA检测方法，分别包被腺病毒抗原和对照抗原，对纯化后的抗体进行ELISA鉴定，抗体稀释至1μg/ml，结果见图3，1H3、2A7和6D8能特异性识别HAdv2/3/4/6/7各型病毒。
2.3 抗体亚型鉴定
采用商品化的小鼠单抗亚型鉴定试剂盒（Proteintech）鉴定三株抗体亚型，按说明书进行操作，结果表明1H3为IgG2a，2A7和6D8为IgG1 亚型，结果见表1。
表1 单抗亚型鉴定结果（OD450）
Figure DEST_PATH_IMAGE002
3、腺病毒快速检测方法的建立
3.1 ELISA方法筛选配对抗体
分别将三株抗体进行HRP标记，标记完成用甘油1:1混合-20℃保存。用pH7.4 PBS将单克隆抗体稀释至0.5µg/ml，4℃包被过夜，用 PBST洗板1次，然后使用含有2%马血清+1%蔗糖的封闭液37℃封闭2h。在包被板内加入200倍稀释的HAdV-B组（3/7）、HAdV-C组（1/2/5/6）和HAdV-E组（4）病毒、Hep2细胞裂解液200稀释和RSV病毒、A型/B型流感病毒、冠状病毒，50μl/孔，37℃反应35min，洗板4次；加入HRP标记的酶标鼠单抗（1:3000倍稀释），37℃反应35min，洗板4次；加入TMB显色液37℃显色10min，加入终止液，读取OD450值，结果如表2所示，用不同梯度稀释的腺病毒各型混合物进行灵敏度检测，发现1H3包被和2A7标记作为配对单抗检测的OD450nm值最高，可以很好的区分阴阳性，确定最佳配对单抗为1H3和2A7，用作本发明腺病毒检测试纸条的捕获抗体和标记抗体。
表2 配对单抗的确定（OD450）
Figure DEST_PATH_IMAGE004
3.2胶体金检测试纸制备
划膜：将纯化的抗体1H3用pH为7 .4的PBS稀释至1mg/ml，以1μl /cm的量包被于纤维素膜上作为检测线，即为T线；间隔6mm将羊抗鼠二抗用pH7.4 PBS，稀释至1mg/mL，然后以1μl/cm的量包被于纤维素膜上，作为质控线，即为C线。
金标抗体制备：采用柠檬酸还原法制备得到1.0%的金颗粒溶液；按照1ml金溶液加入5μl 0.2M K2CO3调节PH值至7.6，混匀后加入纯化后抗体2A7（5μg/ml）和20μl 10%BSA混匀后静至10min，再加入10μl 10%PEG，静止5min后12000rpm离心5min，弃掉上清加入复溶液（0.01M PB+1%BSA+2%蔗糖）重悬。
金标垫制备：将金标2A7单抗用稀释液（0.01M PB+1%BSA+0.1% 吐温-20）稀释，以1200μL/条的量喷涂在玻璃纤维上作为金标垫，40℃烘干备用。
检测试纸组装：将包被好的纤维素膜、金标垫、样品垫、吸水垫按要求次序粘贴在背板上，经切条机斩切，并用塑料卡壳包裹，使样品垫暴露于塑料卡壳的加样孔位置，质控线、检测线暴露于结果观察孔的位置，组装成完整的检测卡（图4）。
4、试纸条的性能检测
4.1特异性检测
将组装好的试纸卡平放，将HAdV-B组（3/7）、HAdV-C组（1/2/5/6）、HAdV-E组（4）、人冠状病毒HCoV（OC43、NL63），A型流感病毒（FluA-PR8），B型流感病毒（FluB-Yamagata），呼吸道合胞病毒（RSV-long）、Hep2细胞裂解液样本用稀释液（0.01M PB+0.1%吐温-20+0.2%蔗糖）梯度稀释稀释10倍（10μl加入90μl样本稀释液，另加一条直接加入样本稀释液做为阴性对照，各取100μl滴入试纸卡的加样孔中，15min迅速判定结果，20min后显示的结果无效。结果如图5所示，该试纸条可以很好地检出ADV1/2/3/4/5/6/7型，而与其他样本无交叉反应，具有良好的特异性。
4.2灵敏度鉴定
选取HAdV-B组（3/7）、HAdV-C组（1/2/5/6）、HAdV-E组（4）纯化的病毒培养物，分别稀释至病毒颗粒浓度为：1.0×107VP/ml，以此为起始浓度再用病毒样本稀释液（0.01M PB+0.1%吐温-20+0.2%蔗糖）进行103、104倍稀释，充分混匀。将组装好的试纸卡平放，各取100μl样本滴入试纸卡的加样孔中，15min迅速判定结果，20min后显示的结果无效。结果如图6所示，用ADV1/2/3/4/5/6/7纯化的病毒培养物稀释后进行检测发现，对C组ADV1/2/5/6型的最低检测限可达1.0×103VP/ml；对ADV3/4/7的检测限可达1.0×104VP/ml。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京溯本源和生物科技有限公司
<120> 一组同时检测B/C/E组腺病毒的单克隆抗体和试纸条
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr
1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
Ser Arg Ala Leu Ser Thr Met Ile Thr Thr Arg Gly Met Asp Cys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Leu Ser Phe
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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Ala Ala Ser
1
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Ala Leu Ser Thr Met Ile Thr Thr Arg Gly Met Asp Cys Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Gln Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 367
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
gaggtgcagc tgcaggagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60
tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt agctattgga tagagtgggt aaagcagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtag tactaactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata tatcctccaa cacagcctat 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccatct attactgttc aagagcccta 300
tctactatga ttacgacgag aggtatggac tgctggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctcag 367
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
aacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctcaagggca gagggccacc 60
atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattatggcc ttagttttat gaactggttc 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240
cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaac 334
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr
1 5
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
Ala Arg Arg Met Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ala Lys Ser Trp Gly Leu
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Asp Tyr
<210> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
Gln Ser Leu Asp Tyr Asp Gly Asp Arg Tyr
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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Ala Ala Ser
1
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
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Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Met Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ala Lys Ser Trp Gly Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Arg Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
gacgtgaagc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt acctatggca tgtcctgggt tcgccagact 120
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ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa taccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagacggatg 300
atctactatg attacgacgc aaagtcctgg gggttggatt actggggcca aggcaccact 360
ctcacagtct cctcag 376
<210> 20
<211> 334
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtcttgat tatgatggtg atcgttatat gaactggtac 120
caacagaaag cgggacagcc acccaaactc ctcatctctg ctgcatccaa tctagaatct 180
gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatccat 240
cctgtggaga aggaggatac tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggttccgctc 300
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaac 334

Claims (9)

1.一组同时检测B/C/E组腺病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括1H3和2A7，所述1H3的重链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.3所示；所述1H3的轻链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4~SEQ ID NO.6所示；
所述2A7的重链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQID NO.11~SEQ ID NO.13所示；所述2A7的轻链可变区包括三个互补决定区，所述互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14~SEQ ID NO.16所示。
2.根据权利要求1所述单克隆抗体，其特征在于，所述1H3的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述1H3的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求1或2所述单克隆抗体，其特征在于，编码所述1H3的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码所述1H3的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
4.根据权利要求1所述单克隆抗体，其特征在于，所述2A7的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述2A7的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
5.根据权利要求1或4所述单克隆抗体，其特征在于，编码所述2A7的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，编码所述2A7的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
6.权利要求1~5任一项所述单克隆抗体在制备同时检测B/C/E组腺病毒的工具中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述工具包括胶体金检测试纸条。
8.一种同时检测B/C/E组腺病毒的胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条以权利要求1~5任一项所述单克隆抗体中的1H3为捕获抗体，以权利要求1~5任一项所述单克隆抗体中的2A7为标记抗体。
9.根据权利要求8所述胶体金检测试纸条，其特征在于，所述胶体金检测试纸条包括依次连接在背板上的纤维素膜、金标垫、样品垫和吸水垫，所述纤维素膜上设检测线和质控线；所述检测线包被单克隆抗体1H3，质控线包括羊抗鼠IgG；
所述金标垫包被单克隆抗体2A7。
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