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CN113336844B - 一种靶向新冠病毒n蛋白的鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向新冠病毒n蛋白的鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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CN113336844B CN202110589206.2A CN202110589206A CN113336844B CN 113336844 B CN113336844 B CN 113336844B CN 202110589206 A CN202110589206 A CN 202110589206A CN 113336844 B CN113336844 B CN 113336844B
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Abstract

本发明公开了靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用，属于生物技术领域；氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示；同时本发明还提供一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体的制备方法，通过分离免疫条纹斑竹鲨外周血淋巴细胞，提取总RNA，再反转录为cDNA；以cDNA为模板，扩增条纹斑竹鲨vNAR片段，与载体连接构建噬菌体文库；从噬菌体文库中淘选识别新冠病毒N蛋白的阳性克隆；构建表达载体，诱导表达新冠病毒N蛋白单域抗体，最终获得靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体。

Description

一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用。
背景技术
冠状病毒隶属于冠状病毒科、冠状病毒属，是一类单链正义RNA病毒；自1937年发现首个病毒至今，共鉴定多种冠状病毒，分属于α、β、γ和δ属，其中有7种冠状病毒能感染人，分别为α属的HCoV-229E、HCoV-NL63和β属的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV及2019年底鉴定的新型冠状病毒SARS-CoV-2。
SARS-CoV-2是可由飞沫携带的呼吸系统病毒，不同于以往任何一种已知的六种能够感染人类的冠状病毒，该病毒在不同的蛋白上至少有17个位点涉及氨基酸的改变，在密切接触的人群里极易人传人，引起爆发性的全面传播，因而亟需快速诊断检测来控制疾病的爆发和蔓延。
SARS-CoV-2基因组由大约30000个核苷酸组成，编码四种结构蛋白，包括S蛋白(Spike protein，棘突蛋白)，E蛋白(Envelope protein，包膜蛋白)，M蛋白(Membraneprotein，膜蛋白)和N蛋白(Nucleocapsid，核衣壳蛋白)，N蛋白，是冠状病毒中含量最丰富的蛋白，也是一种高度免疫原性的磷蛋白，在病毒感染过程中大量表达，每个病毒RNA基因组拷贝都存在近2000个N蛋白单体。在2003-2004年SARS-CoV期间，在病毒感染早期患者的血清样品中即可检测到N蛋白存在，因而N蛋白检测被视为检测SARS-CoV的可靠依据。在SARS-CoV-2大流行以来的研究数据表明，在新冠病毒感染者的鼻咽拭子样品中，检测到大量SARS-CoV-2病毒N蛋白。新冠病毒N蛋白的免疫原性高、在感染者体内的拷贝数高、且其自身蛋白稳定性好，是检测SARS-CoV-2病毒的重要检测靶标。
目前，新冠病毒的检测方法主要依靠核酸检测，即通过qRT-PCR(定量逆转录酶聚合酶链反应)来检测呼吸道样本中存在的病毒基因组RNA。核酸检测具有灵敏度高和并行检测量大等优点，但同时也面临着样品预处理难度大、逆转录试剂成本高以及检测需要先进的实时热循环仪等挑战。抗体的检测可以有效地弥补核酸检测漏检的风险，发挥其在新型冠状肺炎的及时诊治及防控中的作用。特异IgM和IgG是目前最为常用的新冠病毒检测抗体，但临床也有反映出现了较多的假阳性，困扰临床决策。
重链抗体作为天然缺失轻链的抗体分子，在基因工程改造中相对于传统IgG抗体分子具有更大的优势。由重链抗体改造而来的单域抗体(single domain antibody)在天然状态下具有与抗原结合的能力，与人源或鼠源的单域抗体相比，其亲和力保留得更好，单域抗体具有多方面的优势。近年来单域抗体吸引了人们巨大的研究热情，在探索抗原受体起源，研发疫苗、治疗药物、诊断试剂和生物技术研究工具等方面取得了长足的进展。目前在单域抗体方面研究开发最好的是骆驼单域抗体，继骆驼发现单域抗体后，Greenberg等又相继从护士鲨等软骨鱼体内发现了一种天然缺失轻链，仅由重链同源二聚体组成的抗体IgNAR(Ig New antigen Receptor)，每条链由1个可变区(vNAR)和5个恒定区(cNAR)构成。将IgNAR的可变区vNAR重组表达，即可获得具有完整功能的抗体分子片段，被称为鲨鱼单域抗体。公开号为CN106831981A的中国专利公开了一种单域抗体蛋白骨架及其制备方法，具体公开了来源于条纹斑竹鲨的单域抗体，其单域抗体蛋白骨架序列组成依次为FR1，CDR1，FR2，CDR3和FR3区，其中FR1、FR2、FR3区为固定氨基酸序列，CDR1和CDR3区为抗体互补决定区，其氨基酸序列可变，CDR1和CDR3区决定与不同的抗原结合，证明了鲨鱼单域抗体具有抗原结合区，能够实现抗原抗体结合，用于诊断和治疗；此外，公开号为WO2010033913A1的专利公开了一种抗体，模拟物及其用途，具体公开了鲨鱼和骆驼科动物重链抗体及其类似物可用于诊断，治疗以及同时诊断和治疗。
因此，利用鲨鱼单域抗体检测新冠病毒抗原蛋白并制成抗体检测试剂盒是完全可行且具有较高临床应用价值。
发明内容
为解决现有技术中需要进一步提高高灵敏度检测新冠抗原以及开发运用抗体的问题，本发明创造性地提出一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用，通过本发明制备得到的鲨鱼单域抗体的能够特异性地识别内源性产生的新冠病毒N蛋白，并在应用于新冠病毒检测时具有很好的灵敏度和准确性，在开发新冠病毒检测试剂盒上具有良好的应用前景。
本发明的技术方案如下：
一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示。
一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4所示。
一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)分离免疫条纹斑竹鲨外周血淋巴细胞，提取总RNA，再反转录为cDNA；
(2)以cDNA为模板，扩增条纹斑竹鲨vNAR片段，与载体连接构建噬菌体文库：采用巢式PCR，经过两轮PCR扩增，得到条纹斑竹鲨单域抗体vNAR基因；将vNAR基因片段与载体进行酶接后构建噬菌体文库；
(3)从噬菌体文库中淘选识别新冠病毒N蛋白的阳性克隆：通过对噬菌体文库进行扩大培养、富集、淘筛和鉴定，将所有OD450值大于1的阳性克隆进行测序分析，排除重复后，最终获得2株单域抗体，命名为鲨鱼单域抗体的N05抗体和N38抗体；通过测序，获得N05抗体和N38抗体的vNAR基因序列；
(4)构建表达载体，诱导表达新冠病毒N蛋白单域抗体：将N05抗体和N38抗体的vNAR基因序列克隆到PET30a上，获得N05抗体和N38抗体的表达载体，将表达载体转化至E.coli BL21菌株，扩大培养后，加入IPTG诱导表达，破菌收集纯化重组抗体蛋白。
进一步地，所述步骤(1)中免疫条纹斑竹鲨是在条纹斑竹鲨皮下注射重组新冠病毒N蛋白，剂量为5nM/kg，间隔周期为14天，完成6次免疫的14天后获得重组新冠病毒N蛋白免疫的条纹斑竹鲨。
进一步地，所述步骤(2)中酶接过程首先用Sfi I分别对PCR得到的条纹斑竹鲨vNAR基因和pComb3XSS载体进行酶切，酶切回收后T4连接酶进行连接；将连接产物转化XL1-Blue感受态细胞，培养至OD660达到0.6时，加入辅助噬菌体VCSM13，培养过夜后，收集培养基上清，获得初级噬菌体文库。
一种编码如上所述的鲨鱼单域抗体的核酸分子。
一种载体，其包含编码如上所述的鲨鱼单域抗体的核酸分子。
一种非诊断目的检测新冠病毒N蛋白的方法，包括以下步骤：
S1、新冠病毒N蛋白假病毒感染HEK293T细胞；
S2、提取细胞总蛋白并将蛋白经过电泳、分离转运至PVDE膜上；
S3、在将经过亲和纯化的如权利要求1或2所述的鲨鱼单域抗体与PVDE膜接触，进行Western Blot检测。
一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体在制备新冠抗体检测产品或药用组合物中的应用。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的新冠病毒N蛋白鲨鱼单域抗体，能够特异性地识别内源性产生的新冠病毒N蛋白，可以用作新冠抗体检测试剂盒的质控抗体，填补了新冠病毒血清学检测市场中ELISA检测试剂盒中没有鲨鱼单域抗体的空白；本发明提供的鲨鱼单域抗体，用ELISA方法测得N05抗体、N38抗体与新冠病毒N蛋白结合的亲和力较高，它们的IC50分别为1.415nM和1.749nM。
2、本发明提供的鲨鱼单域抗体相较于传统单克隆抗体和骆驼单域抗体，在新冠病毒N蛋白检测上具有其独特的优势，首先，鲨鱼单域抗体的互补决定区CDR3(Complementarity-Determing Region 3)结构域呈凸环状，可识别隐藏的新冠病毒N蛋白的抗原表位，因而在与抗原的结合方面要优于传统单克隆抗体；其次，在生产方面，传统抗体发挥识别与结合功能，通常需要糖基化修饰，需要通过哺乳动物细胞进行表达，造价昂贵，而本发明提供的鲨鱼单域抗体不需糖基化修饰即可发挥其功能，通过原核细胞或酵母表达系统即可大量表达，生产成本大大降低。
3、本发明提供的鲨鱼单域抗体的N05抗体和N38抗体也可以继续改造，提供抗体的亲和力，直接用于开发高灵敏度的新冠抗原检测试剂盒，也可用于新冠抗体检测试剂盒调试。
附图说明
图1为根据本发明实施例1噬菌体展示筛选结果；其中，图1A为三轮淘筛后噬菌体的富集度变化；图1B为Phage-ELISA检测噬菌体多克隆上清液；
图2为根据本发明实施例2所鲨鱼制备单域抗体的SDS-PAGE凝胶电泳结果示意图；
图3为根据本发明实施例3利用ELISA检测制备的鲨鱼单域抗体与新冠病毒N蛋白的结合示意图；
图4为根据本发明实施例3利用Western Blot检测制备的鲨鱼单域抗体对内源性新冠病毒N蛋白的识别示意图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式和附图对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体，命名为N05抗体，其氨基酸序列为SEQID NO:1所示，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。
一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体，命名为N38抗体，其氨基酸序列为SEQID NO:2，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
实施例2
一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)分离免疫条纹斑竹鲨外周血淋巴细胞，提取总RNA，再反转录为cDNA；
对条纹斑竹鲨进行重组新冠病毒N蛋白的免疫：以纯化后的原核表达的重组新冠病毒N蛋白对条纹斑竹鲨进行免疫，具体方法如下：按照5nM/kg的剂量，用弗氏佐剂乳化抗原后，对条纹斑竹鲨进行多点皮下注射进行免疫，每次免疫间隔为14天，在完成第6次免疫的14天后，由条纹斑竹鲨尾静脉采血5mL至肝素钠抗凝管中，完成对条纹斑竹鲨的免疫；
条纹斑竹鲨外周血淋巴细胞的获得：将经过静脉采血获得的5mL血液等量分装于5支15mL离心管，分别加入血液样本10倍体积的生理盐水稀释，缓慢混匀；吸取稀释后血液样本于分离液的液面上，300g/min，离心30min；离心后，淋巴细胞呈灰白色的带状，位于淡黄色的血浆层和透明的分离液层之间，用吸管小心吸取淋巴细胞到另一支15mL离心管中，加入10mL PBS缓冲液进行重悬、洗涤，350g/min，离心10min，重复3次，收集得到免疫条纹斑竹鲨的外周血淋巴细胞；
RNA提取：在装有淋巴细胞样品的离心管内加入1mL Tripure Reagent，超声破碎30s，加入1/5体积氯仿，室温放置5min，12000rpm、42℃、离心15min；将上清液小心转至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静止20min，12000rpm、42℃、离心5min；缓慢吸取上清，加入75％乙醇洗涤，12000rpm、42℃、离心5min；小心倒掉上清液，空干RNA沉淀，加入DEPC水溶解后，核酸测定量仪测定RNA浓度，同时取适量RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳以鉴定RNA的质量；
反转录获得cDNA：
首先，在冰上往0.2mL PCR管中加入以下混合物：
Oligoc(dT)(10μM) 1μL
总RNA 5μg
其次，将上述混合物于65℃下加热10min，然后立即置于冰上；
接着，在冰浴条件下，再往上述PCR管中加入以下反应物：
5×M-Mμlv Reaction Buffer 8μL
dNTP Mixture(10mM) 5μL
M-Mμlv Reverse Transcriptase 1μL
DEPC water 20μL
Total 40μL
最后，将上述混合物稍微离心后，立即置于37℃条件下温育90min合成第一链cDNA，在65℃加热5min，终止反应；
(2)以cDNA为模板，扩增条纹斑竹鲨vNAR片段，与载体连接构建噬菌体文库；
条纹斑竹鲨单域抗体vNAR基因的扩增：采用巢式PCR，经过两轮PCR扩增，得到条纹斑竹鲨单域抗体vNAR基因；其中，第一轮PCR所用引物为，上游引物(F1)：ATGAATATTTTCTTGTTTTCGGGCC，
下游引物(R1)：ATAGTATCCGCTAATTAGACAAA；
第一轮PCR扩增体系为：
5×Premix Taq 25μL
F1(10mM) 0.5μL
R1(10mM) 0.5μL
cDNA 2μL
ddH2O to50μL
第一轮PCR扩增程序为：
利用第一轮PCR产物进行第二轮巢式PCR，第二轮PCR所用引物为，上游引物(F1’)：CGTGGCCCAGGCGGCCGGGCCCCCTGGTTACCAAATGT；下游引物(R1’)：
CGTGGCCCAGGCGGCCGGGCCCTTTGCCAGGTTTCACAGTCAG；
第二轮PCR扩增体系为：
5×Premix Taq 25μL
F1’(10mM) 0.5μL
R1’(10mM) 0.5μL
第一轮PCR扩增产物 2μL
ddH2O to50μL
第二轮PCR扩增程序为：
将第二轮PCR产物使用2％琼脂糖凝胶电泳后，切胶纯化vNAR片段(约500bp)，使用gel-extraction纯化试剂盒进行纯化；纯化后琼脂糖凝胶电泳检测，条带唯一(约500bp)且清晰，即得到vNAR基因片段；
vNAR基因与载体连接：将vNAR基因片段与载体pComb3xss用内切酶Sfi I分别进行双酶切，酶切反应体系为：
Sfi I 120U
CutSmart 5μL
DNA 5μg
ddH2O to 50μL
酶切反应条件为：55℃反应6h；酶切反应完成后使用DNA纯化回收试剂盒回收vNAR基因片段和pComb3xss载体，回收后通过T4连接酶进行连接，连接体系为：
pComb3xss载体 1μg
vNAR片段 300μg
10X T4 buffer 4μL
T4 Ligase 2μL
ddH2O to 50μL
在16℃条件下连接3h后，对连接产物进行纯化回收，ddH2O溶解；
噬菌体文库的构建：将电击杯置于冰上预冷，取XL1-Blue电转感受态于冰上融解，待溶解后，加入5μL上述连接产物，轻轻混匀，置于冰上5min；转移到预冷的电转杯中，电转仪程序：1800kV，5ms，电击转化；电转后立即加入1mL SOCG培养基，37℃，180rpm，培养60min；取培养后的菌液100uL，按1:10、1:100和1:1000的比例梯度稀释后涂布含氨苄青霉素抗性的SOC平板，37℃培养过夜，计算平板上的菌落数，推算库容量(库容量至少应达到107pfu/ml)；剩余的转化后培养的菌液，涂布含氨苄青霉素抗性的SOC平板，37℃培养过夜，刮板后加入终浓度为15％的甘油，-70℃，保存菌液。
(3)从噬菌体文库中淘选识别新冠病毒N蛋白的阳性克隆；
噬菌体文库的扩增：取1ml上述培养后的菌液(含约108个转化细胞)，加入到100mL2xYT培养基中，37℃、250rpm，培养至OD600达到0.6；按MOI＝1:20加入辅助噬菌体VCSM13，37℃、220rpm条件下培养1h，加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素和0.1mM的IPTG，37℃过夜培养，将过夜培养的菌液在4℃、10000rpm，离心15min，收集上清液；在上清中加入1/4体积的PEG/Nacl，冰上沉降30分钟，4℃，10000rpm，离心10min，弃去上清，加入2mL PBS重悬沉淀，4℃保存；
抗新冠病毒N蛋白单域抗体的亲和筛选：将新冠病毒N蛋白用稀释至25μL/mL，包被免疫管(2mL/管，共10μL)，4℃孵育过夜；次日，PBS洗涤3次，用封闭液(2％脱脂乳PBS，MPBS)封闭免疫管，37℃孵育2h；PBS洗涤3次后，每孔加入1x1011pfu以上的噬菌体(溶于200μLMPBS)，37℃孵育2h；PBST(PBS+0.5％Tween-20)和PBS各洗涤3次后，加入2ml Glycine-HCl(pH＝2.5)洗脱缓冲液，柔和转动洗脱10min后，加入等体积Tris-HCl(pH＝7.4)中和pH至7.0；将洗脱获得的噬菌体，按10-1至10-8梯度稀释，加入新鲜XL1-blue菌液，37℃轻摇孵育30min；取100uL各梯度感染后的菌液，涂布含氨苄抗性SOC平板，计算噬菌体输出滴度；剩余的噬菌体洗脱液中，加入等体积XL1-blue(OD600＝0.5)菌液，37℃，150rpm培养1h后，4000rpm离心5min，重悬沉淀后，涂布含氨苄抗性的SOC平板；次日刮取平板上的菌体，甘油保存用于下一轮筛选；亲和筛选共进行3轮，抗原的包被量逐轮递减，第二轮包被量为25μg，第三轮为12.5μg；参见图1，在三轮亲和淘筛中，特异性针对新冠病毒N蛋白的噬菌体的富集量及回收率逐轮提升；
Phage Elisa筛选抗新冠病毒N蛋白单域抗体的阳性单克隆：取72孔培养板，加入400μL 2×YT-Gamp+kan+培养基，挑取亲和筛选后输出平板上的单克隆接种到孔中，标记为Master Plate，37℃，200rpm，培养过夜；另取72孔培养板，取400μL含有1x1010pfu VCSM13辅助噬菌体的2×YT-Gamp+kan+至每孔，标记为P1 Plate；从Master Plate上每孔取40ul培养液加入到P1 Plate对应孔中，37℃，150rpm，振荡培养2h；4000rpm离心20min，弃上清液，每孔加入400μL2×YTamp+kan+培养液，37℃，250rpm，振荡培养过夜；4000rpm离心20min，取320μl上清液与80μL MPBS混匀，4℃保存备用，至此完成噬菌体重组抗体制备；
Phage Elisa检测：将新冠病毒N蛋白稀释至0.5μg/mL，200μL/well包被96孔酶标板，37℃孵育1h；PBS洗涤3次，加入1％BSA，37℃封闭1.5h；对应加入上述制备好的噬菌体重组抗体，37℃孵育2h；PBST、PBS各洗涤3次，加入酶标二抗Anti-M13-HRP(用MPBS按1:4000的比例稀释)，37℃孵育1小时，PBST、PBS各洗涤3次后，每孔加入150μL TBM显色底物，避光放置10min后，每孔加入150μL 2M的H2SO4终止显色，使用酶标仪在OD450nm处读值，结果如图1B所示，将所有OD450值大于1的阳性克隆进行测序分析，排除重复后，最终得到2个阳性克隆，分别命名为N05抗体和N38抗体；
N05抗体的氨基酸序列为：
MNIFLFSFLLAWLPNVFTQWVEQTPTTTTKEAGESLTINCVLKGSSYGLCNTNWYFTKKSVTKKESLSNGGRYAETVNKASKSFSLRISDLRVEDSGTYHCKPSMGWDETGYCLGLGEGGGTILTVKPGK(SEQ ID NO:1)；
N05抗体的核苷酸序列为：
AATATTTTCTTGTTTTCGGTCCTTTTAGCCTGGTTACCAAATGTCTTTACTCAATGGGTTGAACAAACACCGACAACGACAACAAAGGAGGCAGGCGAATCACTGACCATCAATTGCGTCCTAAAAGGTTCCAGCTATGGATTGTGTAACACGAACTGGTATTTCACAAAAAAGAGCGTTACAAAGAAGGAGAGCTTATCAAATGGCGGACGATACGCGGAAACAGTGAACAAGGCATCAAAGTCCTTTTCTTTGCGAATTAGCGACCTAAGAGTTGAAGACAGTGGTACATATCACTGTAAACCGTCTATGGGCTGGGATGAGACCGGTTACTGTCTGGGATTGGGGGAAGGAGGCGGCACCATTCTGACTGTGAAACCTGGCAAA(SEQ ID NO:3)
N38抗体的氨基酸序列为：
MNIFLFSFLLAWLPNVFTQWVEQTPRTTTKEAGESLTINCVLKGSSYVLCNTYWYFTKKGATKKETLSNGGRYAETVNKASKSFSLRISDLRVEDSGTYYCKAYSRYSWDGCSVILLATGSDYYEGGGTILTVKPGK(SEQ IDNO:2)；
N38抗体的核苷酸序列为：
AATATTTTCTTGTTTTCGTTCCTTTTAGCCTGGTTACCAAATGTCTTTACTCAATGGGTTGAACAAACACCGAGAACGACAACAAAGGAGGCAGGCGAATCACTGACCATCAATTGCGTCCTAAAAGGTTCCAGTTATGTATTGTGTAATACGTACTGGTATTTCACAAAAAAGGGCGCTACAAAGAAGGAGACCTTATCAAATGGCGGACGATACGCGGAAACAGTGAACAAGGCATCAAAGTCCTTTTCTTTGCGAATCAGTGACCTGCGAGTTGAAGACAGTGGTACATATTACTGTAAAGCGTATAGTCGGTACAGCTGGGATGGGTGTAGTGTTATACTGTTAGCGACAGGTTCCGACTATTATGAAGGAGGCGGCACCATTCTGACTGTGAAACCTGGCAAA(SEQ ID NO:4)。
(4)构建表达载体，诱导表达新冠病毒N蛋白单域抗体；
单域抗体原核表达菌株的构建：根据上述测序结果，设计引物扩增vNAR基因；其中引物F：CCATGGTCCAATGGGTTGAACAAACACCGA，引物R：CTCGAGTTTGCCAGGTTTCACAGTCAG；将PCR产物使用纯化试剂盒行纯化；纯化后琼脂糖凝胶电泳检测，条带唯一(约400bp)且清晰，使用NotI和xHoI对vNAR片段和表达载体Pet30a进行双酶切，酶切反应体系如下：
DNA 5μL
10x H Buffer 5μL
Nde I 2μL
xHoI 2μL
ddH2O to 50μL
酶切反应在37℃，进行1h，使用2％琼脂糖凝胶电泳，分别切取凝胶，回收相应的vNAR基因和载体；将回收的vNAR基因和载体使用T4连接酶进行连接后，转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布含卡那霉素抗性的LB平板，37℃培养过夜；次日，通过PCR初步筛选出阳性克隆后，进行测序分析，确定阳性菌株；
抗新冠病毒N蛋白单域抗体的原核表达与纯化：挑取获得的阳性菌株，接种于含有卡纳霉素的LB液体培养基中，37℃，摇床200rpm培养过夜，抽提质粒；将获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21，37℃，200rpm振荡培养至OD600＝0.6-1.0之间时，添加终浓度为0.5mM的IPTG溶液，25℃、200rpm振荡诱导表达12-18h；诱导表达结束后，离心收集菌体，超声波将菌体破碎，离心收集上清，采用常规His-tag亲和层析方法纯化抗体蛋白，获得的纯化重组抗体蛋白的纯度>95％，SDS-PAGE电泳检测结果如图2所示。
实施例3
核酸、载体、组合物或复合物
本发明涉及编码本发明的鲨鱼单域抗体的核酸分子，本发明的核酸可为RNA、DNA或cDNA。
本发明的核酸也可呈载体形式，可存在于载体中和/或可为载体的一部分，该载体例如质粒、粘端质粒或YAC。载体可尤其为表达载体，即可提供鲨鱼单域抗体在体外和/或体内(即在适合宿主细胞、宿主有机体和/或表达系统中)表达的载体。该表达载体通常包含至少一种本发明的核酸分子，其可操作地连接至一个或多个适合的表达调控元件(例如启动子、增强子、终止子等)。对所述调控元件及其序列进行选择以便在特定宿主中表达是本领域技术人员熟知的。
实施例4
1、根据本发明制得的鲨鱼单域抗体与新冠病毒N蛋白结合的检测
根据正交实验得到的最佳抗原包被浓度，将重组新冠病毒N蛋白用PBS稀释至4μg/mL，每孔加100μL包被酶标板，1％BSA常规封闭；将纯化后的重组抗体按1:2的比例梯度稀释，依次加入至对应孔中，37℃孵育1.5h；洗涤后，加入HRP偶联的鼠抗条纹斑竹鲨vNAR的抗体，37℃孵育1h，洗涤后，每孔加入150μL TBM显色底物，避光放置10min后，每孔加入150μL2M H2SO4终止显色，使用酶标仪在OD450nm处读值，检测结合情况；参见图3，实验结果表明，N05抗体和N38抗体与新冠病毒N蛋白结合的亲和力较高，它们的IC50分别为1.826±0.03nM和2.107±0.045nM。
2、根据本发明制得的鲨鱼单域抗体对内源性新冠病毒N蛋白的检测
2.1、新冠病毒N蛋白假病毒感染HEK293T细胞：在6孔板中接种HEK293T细胞，培养基为DMEM+10％FBS，37℃、5％CO2下培养48小时；用DMEM+1％FBS将新冠病毒N基因假病毒(Lenti-EF1α-SARS-COV-2-Nucleocapsid-Flag/CMV-Puro)稀释至105pfu/mL，取500uL加入6孔板中，同时设置不感染假病毒的对照组，轻摇混匀后，37℃、5％CO2下孵育6h；吸去孵育液，PBS洗3次，每孔加入1mL DMEM(含10％FBS+0.5％甲基纤维素)，37℃、5％CO2下培养48h；
2.2、细胞总蛋白的提取：吸去培养液，PBS洗涤2次后，加入0.05％胰酶消化液处理10min后，将感染组和对照组的HEK293T细胞吸出转移至1.5ml离心管，4000rpm离心5min收集细胞，PBS洗涤3次，去除残存胰酶；在离心管中加入200uL细胞裂解液，超声破碎30s，获得细胞总蛋白粗提液，BCA法测定蛋白浓度；
2.3、Western Blot检测：将感染组和对照组细胞的蛋白样品用PBS稀释至100μg/mL，蛋白上样量为1μg；SDS-PAGE电泳：分离胶80V，20min；浓缩胶120V，80min；半干转移法转膜：将蛋白转运至PVDF膜，PVDF膜用前在甲醇中浸泡超过15S，再浸入transfer buffer15min；转膜条件：23V，30min；5％脱脂奶粉封闭，37℃孵育2h；加入亲和纯化后的N05和N38抗体(抗体用TBST稀释至0.5μg/mL)，37℃孵育1h；TBST洗涤5次后，加入HRP偶联的鼠抗条纹斑竹鲨vNAR的抗体，37℃孵育1h；TBST洗涤5次，将ECL化学发光液A液和B液等体积混合后淋于膜上，利用化学发光凝胶成像仪(BIORAD ChemiDoc XRS)进行曝光显色；实验结果如图4所示：所制备的抗新冠病毒N蛋白单域抗体N05和N38均可特异识别假病毒感染细胞中所产生的内源性新冠病毒N蛋白。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1. 一种靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体，其特征在于：所述鲨鱼单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
2.一种编码如权利要求1所述的鲨鱼单域抗体的核酸分子。
3.一种载体，其包含编码如权利要求2所述的鲨鱼单域抗体的核酸分子。
4.一种非诊断目的检测新冠病毒N蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、新冠病毒N蛋白假病毒感染HEK293T细胞；
S2、提取细胞总蛋白并将蛋白经过电泳、分离转运至PVDE膜上；
S3、在将经过亲和纯化的如权利要求1所述的鲨鱼单域抗体与PVDE膜接触，进行Western Blot检测。
5.一种如权利要求1所述的靶向新冠病毒N蛋白的鲨鱼单域抗体在制备新冠抗体检测产品或药用组合物中的应用。
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