CN113316634A - 成熟的库普弗细胞的产生 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产生iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)的方法。该方法可以包括提供源自诱导多能干细胞(iPSC)的巨噬细胞前体

巨噬细胞前体

可以在存在肝脏信号的情况下进行培养，例如原代人肝细胞条件培养基和高级DMEM的结合物，从而获得iPSC衍生的库普弗细胞。iPSC衍生的库普弗细胞可以显示出原代库普弗细胞例如原代成人KC(pKC)的生物学特性。所述生物学活性包括表达巨噬细胞标记物，例如CD11、CD14、CD68、CD163、CD32、CLEC‑4F、ID1和ID3。

Description

成熟的库普弗细胞的产生

技术领域

本发明涉及医学、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。本发明涉及医学领域。

背景技术

库普弗(Kupffer)细胞(KC)是肝脏中的固有免疫细胞；并且专门执行清道夫和吞噬功能[1]。它们在正常的肝脏生理稳态中发挥关键作用，并参与不同的肝脏疾病(如肝纤维化、病毒性肝炎、胆汁淤积、脂肪性肝炎、酒精性/非酒精性肝脏疾病和药物性肝损伤(DILI))的发病机制[1,2]。

KC通过与肝细胞的直接细胞-细胞接触以及在激活后释放多种炎性细胞因子、生长因子和活性氧来发挥这种作用[3]。

这些相互作用，特别是在炎性条件下，不会在仅使用原代人肝细胞(pHep)的单培养中重现，这是体外肝模型的金标准。缺乏非实质细胞，包括pHep单培养中的KC，可能是导致肝脏疾病建模[4]和检测肝毒性[5,6]的体外模型的性能欠佳的一个原因。到目前为止，涉及KC的模型已经部署了来自动物来源的细胞[7-9]。为了避免种间变异，重要的是研究来自人类来源的KC的影响。

人KC的应用受到供体可用性、低产量和/或纯度以及原代成人KC(pKC)的繁琐分离程序的阻碍[10,11]。一旦分离/纯化，pKC不能长时间保持其功能，也不能在培养中扩展以产生更多细胞。pKC的成本仍然是一个挑战：目前由少数商业公司提供的每百万pKC的成本为1075美元至3900美元。

为了取代pKC，替代细胞应该是可再生的、肝脏特异性的和成熟的。人诱导多能干细胞(iPSC)衍生的细胞源可能是一种有价值的替代物；然而，iPSC衍生的细胞通常表现出类似胎儿的特性，而不是成熟的特性[12-16]。此外，到目前为止，还没有从iPSC(iKC)生成KC的成功方案，这可能是由于一直认为KC源自骨髓来源的血液循环单核细胞(BMDM)[17,18]。

自2012年以来的对比研究表明，KC是在胚胎发育过程中建立的，独立于BMDM[19-21]。早期红细胞-骨髓祖细胞在卵黄囊中产生的原始巨噬细胞

增殖并分化为肝脏特异性巨噬细胞，即在肝脏中以MYB独立的方式接收肝脏信号后的KC[21,22]。最近的研究表明，iPSC衍生的

与MYB独立的组织驻留

共享个体发生[23]。

发明内容

根据本发明的第一方面，本发明人提供了一种产生iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)的方法。该方法可以包括提供巨噬细胞前体

巨噬细胞前体可源自诱导多能干细胞(iPSC)。

所述方法可包括在肝脏信号存在下培养巨噬细胞前体

所述方法可以包括从中获得iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)。

iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)可以显示出原代库普弗细胞的生物学特性。所述原代库普弗细胞可以包括原代成人KC(pKC)。

所述肝脏信号可包括暴露于原代人肝细胞条件培养基(PHCM)。巨噬细胞前体可以在原代人肝细胞条件培养基(PHCM)中培养。所述培养可以在高级DMEM中进行。

所述生物学特性可以包括巨噬细胞标记物的表达。所述生物学特性可以包括吞噬作用。所述生物学特性可以包括在激活后释放炎性细胞因子。所述生物学特性可以包括在激活后释放生长因子。所述生物学特性可以包括在激活后释放氧物质。所述生物学特性可以包括在刺激后分泌IL-6和TNFα。所述刺激可以包括暴露于LPS。

所述生物学活性可以包括巨噬细胞标记物的表达。

所述巨噬细胞标记物可以包括CD11(GenBank登录号NM_000632.3)。所述巨噬细胞标记物可以包括CD14(GenBank登录号NM_001174105.1)。所述巨噬细胞标记物可以包括CD68(GenBank登录号NM_001251.2)。所述巨噬细胞标记物可以包括CD163(GenBank登录号NM_203416.3)。所述巨噬细胞标记物可以包括CD32(GenBank登录号NM_001136219.1)。所述巨噬细胞标记物可以包括CLEC-4F(GenBank登录号NM_173535.2)。所述巨噬细胞标记物可以包括ID1(GenBank登录号NM_181353.2)。所述巨噬细胞标记物可以包括ID3(GenBank登录号NM_002167.4)。

所述巨噬细胞前体

可以通过培养诱导多能干细胞(iPSC)以产生胚状体(EB)来衍生自所述诱导多能干细胞(iPSC)。可以培养所述胚状体(EB)以产生巨噬细胞前体

细胞。

步骤(a)可以包括暴露于骨形态发生蛋白-4(BMP-4，GenBank登录号Q53XC5)。所述BMP-4可以以50ng/mL存在。它可以包括暴露于血管内皮生长因子(VEGF，GenBank登录号NP_001165097)。所述VEGF可以以50ng/mL存在。它可以包括暴露于干细胞因子(SCF，GenBank登录号P21583.1)。所述SCF可以以20ng/mL存在。它可以包括暴露于ROCK抑制剂。所述ROCK抑制剂可以以10μM存在。

步骤(a)可以包括以上述的浓度暴露于含有这些中的每一种的培养基。步骤(a)可以包括在这种培养基中的培养。

步骤(b)可以包括暴露于巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，GenBank登录号P09603)。所述M-CSF可以以100ng/mL存在。它可能包括暴露于白介素-3(IL-3，GenBank登录号AAC08706)。所述IL-3可以以25ng/mL存在。它可以包括暴露于glutamax。所述glutamax可以以2mM存在。它可以包括暴露于β-巯基乙醇。所述β-巯基乙醇可以以0.055mM存在。

步骤(b)可以包括以上述的浓度暴露于含有这些中的每一种的培养基。步骤(b)可以包括在这种培养基中的培养。

所述诱导多能干细胞(iPSC)可以包含MYB独立的iPSC。

根据本发明的第二方面，提供了一种可从根据本发明的第一方面的方法获得的iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)。

根据本发明的第三个方面，本发明人提供了如所述的iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)与肝细胞的结合物。该结合物可包括共培养物。所述肝细胞可以包括原代人肝细胞(pHEP)。所述肝细胞可以包括iPSC衍生的肝细胞(iHep)。所述iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)和所述肝细胞可以是供体匹配的。它们可能源自相同的干细胞源。

作为本发明的第四个方面，提供了这种iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)或这种结合物或共培养物在确定药物的肝毒性的方法中的用途。所述药物可包括炎症相关的药物。它可以包括对乙酰氨基酚。所述药物可包括曲伐沙星。它可以包括氯丙嗪。

根据本发明的第五方面，本发明人提供了这种iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)或这种结合物或共培养物作为用于疾病或病症的模型的用途。

所述疾病或病症可包括肝损伤。所述疾病或病症可包括药物性肝损伤(DILI)。所述疾病或病症可包括肝脏疾病。所述疾病或病症可包括脂肪性肝炎。所述疾病或病症可包括胆汁淤积。所述疾病或病症可包括肝纤维化。所述疾病或病症可包括病毒性肝炎。

在第六方面，本发明提供了这类iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物中的用途。所述疾病或病症可包括肝脏疾病或病症。

所述疾病或病症可包括肝损伤。所述疾病或病症可包括药物性肝损伤(DILI)。所述疾病或病症可包括肝脏疾病。所述疾病或病症可包括脂肪性肝炎。所述疾病或病症可包括胆汁淤积。所述疾病或病症可包括肝纤维化。所述疾病或病症可包括病毒性肝炎。

在本发明的第七方面，提供了一种治疗或预防疾病或病症的方法。所述方法可以包括向需要这种治疗的患者施用或移植所述的iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)。所述疾病或病症可包括肝脏疾病或病症。

所述疾病或病症可包括肝损伤。所述疾病或病症可包括药物性肝损伤(DILI)。所述疾病或病症可包括肝脏疾病。所述疾病或病症可包括脂肪性肝炎。所述疾病或病症可包括胆汁淤积。所述疾病或病症可包括肝纤维化。所述疾病或病症可包括病毒性肝炎。

除非另有说明，否则本发明的实践将采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，其在本领域普通技术人员的能力范围内。这种技术在文献中进行了解释。参见，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Second Edition,Books 1-3,Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Ausubel,F.M.et al.(1995and periodic supplements；Current Protocols inMolecular Biology,ch.9,13,and 16,John Wiley&Sons,New York,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree,and A.Kahn,1996,DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；J.M.Polak and James O’D.McGee,1990,In Situ Hybridization:Principles and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(Editor),1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,Irl Press；D.M.J.Lilley andJ.E.Dahlberg,1992,Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis andPhysical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press；UsingAntibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol NO.I by Edward Harlow,DavidLane,Ed Harlow(1999,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies:A Laboratory Manual by Ed Harlow(Editor),David Lane(Editor)(1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN 0-87969-314-2),1855.Handbook of DrugScreening,edited by Ramakrishna Seethala,Prabhavathi B.Fernandes(2001,NewYork,NY,Marcel Dekker,ISBN 0-8247-0562-9)；和Lab Ref:A Handbook of Recipes,Reagents,and Other Reference Tools for Use at the Bench,Edited Jane Roskamsand Linda Rodgers,2002,Cold Spring Harbor Laboratory,ISBN 0-87969-630-3。这些通用文本中的每一个都通过引用并入本文。

附图说明

图1A至图1E是示出从iPSC分化iKC的图。

图1A是示出原理图和从iPSC产生EB和巨噬细胞前体

的图。EB在2天内形成并允许生长至第4天，然后收集它们并在分化培养基中生长以产生

然后，将

分化成库普弗细胞(iKC)。比例尺：200μm。

图1B是示出iKC前体中标记物基因表达的图：iPSC(浅灰色条)和

(深灰色条)。误差棒代表s.e.m，n＝3。

图1C至图1E是示出iKC(图1C)与原代人库普弗细胞、pKC(图1D)和非肝脏巨噬细胞

(图1E)相比的相差图像的图。比例尺：50μm。EB：胚状体。

图2A至图2H是示出iKC的基因标记物表达的图。

图2A是示出巨噬细胞标记物的原始表达水平(log2)的热图分析的图。

图2B至图2F是示出热图的图，其示出属于已知参与KC功能的通路的基因：细胞因子和炎性反应(B)、补体和凝血级联(图2C)、细胞凋亡的内在通路(图2D)、模式识别受体(图2E)和DNA结合蛋白信号传导抑制剂(ID)(图2F)。使用来自三个独立供体的新鲜解冻的pKC。三个独立批次的分化用于iKC。在分化期结束时(第7天)收集样品。*表示在pKC中上调的基因，#表示在iKC中上调至少2倍的基因(p<0.05)。

图2G是示出基因表达分析的图，其示出在分化期结束时(第7天)，与pKC相比，iKC中巨噬细胞标记物的表达。

图2H是示出iKC中KC特异性标记物在进行7天分化期的不同时间点处的基因表达的图(灰色阴影条)。单实线代表p<0.05，双实线代表p<0.01(双尾配对t检验)。误差棒代表s.e.m，n＝3。UD：未检测到。

图3A和图3B示出iKC的蛋白质标记物表达。

图3A示出iKC和pKC中通过免疫荧光检测的巨噬细胞标记物的蛋白质表达。细胞核用DAPI染色。比例尺：50μm。百分比表示使用荧光标记的细胞数和细胞总数(DAPI染色)计算的阳性染色细胞的比例。

图3B是示出流式细胞分析以确定iKC中CD68、CD163和CLEC-4F的标记物表达的代表性直方图。阳性门由未染色的样本和同种型对照定义。百分比表示来自三个独立分化的阳性细胞的比例。

图4A至图4E示出iKC和

之间标记物差异。

图4A示出转录谱的主成分分析，(图4B)树状图示出iKC与pKC、iPSC、单核细胞和其他非肝脏驻留

相比的层次聚类。

图4C是示出iKC和

中基因的表达水平的热图，据报道，它们已被报道在肝脏驻留的KC和其他非肝脏组织中驻留的

之间差异表达。示出三个独立批次的

和IKC的平均值。BMDM：骨髓来源的血液循环单核细胞，(图4D至图4E)CLEC-4F在基因和蛋白质水平的表达。UD：未检测到。比例尺：30μm。

图5A至图5E示出pKC和iKC之间的功能相似性以及与

的差异。

图5A示出iKC、pKC和

对荧光珠的吞噬作用。比例尺：30μm。分析了来自三个独立实验中的每一个的至少十张图像，并示出了代表性图像。细胞的灰色阴影代表CD163染色，亮白点(由白色箭头指向)示出被吞噬的珠子。

图5B和图5C示出iKC、pKC和

中吞噬作用的定量。细胞用CD163染色以定量每个图像视野中的细胞数量。荧光珠与CD163染色的共定位用于定量吞噬细胞的百分比。对每个细胞摄取的珠子进行计数，并将其归一化为每个图像视野中的细胞数，以获得每个细胞的平均珠子数。共聚焦显微镜用于确保仅对摄取的珠子进行计数。黑色实线代表p<0.01(双尾配对t检验)。误差棒代表s.e.m，n＝3。

图5D示出相差图像，其示出与有和没有LPS处理的

(下图)相比的iKC的形态(上图)。比例尺：100μm。

图5E示出在LPS刺激前后与pKC、

和pHep相比，iKC中IL-6和TNFα产生。虚线代表LPS处理前后细胞因子产生之间的倍数差异(虚线顶部显示了倍数)。实线代表p<0.05。误差棒代表s.e.m，n＝3。UD：未检测到，LPS：脂多糖，IL-6：白细胞介素6，TNFα：肿瘤坏死因子α，pHep：原代人肝细胞。

图6A-图6K示出建立肝细胞与KC共培养模型。

图6A示出左子图：共培养建立的原理，和右子图：示出pHep(白蛋白阳性)和pKC(CD163阳性)的共培养的图像；比例尺：50μm。

图6B示出在第5天CYP1A2、CYP3A4和CYP2B6在pHep的单培养物中的基础活性，以及pHep和pKC在培养基A(商业推荐的基于高级DMEM的培养基)和不含地塞米松(Dex)的William E培养基中中的共培养物的基础活性。实线代表p<0.05。误差棒代表s.e.m，n＝3。

图6C示出在第5天在不含Dex的William培养基中与pHep共培养时pKC中的巨噬细胞标记物(左子图)和KC特异性标记物(右子图)的基因表达。表达水平表示为相对于新鲜解冻的pKC的基因表达。

图6D示出在第5天在不含Dex的William E培养基中在pHep-pKC(浅灰色条)和pHep-iKC(深灰色条)的共培养物中CYP3A4和CYP2C19基因表达(左子图)和白蛋白产生(右子图)。

图6E示出在第5天在不含Dex的William培养基中与pHep共培养时iKC中巨噬细胞标记物(左子图)和KC特异性标记物(右子图)的基因表达。表达水平表示为相对于新鲜解冻的pKC的基因表达。

图6F示出在与pKC、iKC和

的共培养物中的pHep在暴露于不同浓度的测试化合物((图6F至图6H：APAP)和(图6I至图6K：曲伐沙星))后通过Alamar

测定评估的pHep的细胞活力，并与存在和不存在LPS的情况下肝细胞的单培养进行比较。细胞活力表示为用溶剂单独处理的细胞的百分比。水平实线表示50％的细胞活力。虚线代表未用LPS处理的培养物。实线代表用LPS处理的培养物。黑色曲线代表pHep的单培养物，灰色曲线代表共培养物。误差棒代表s.e.m，n＝3。*表示LPS激活的单培养物和共培养物之间的统计学显著差异；#表示未激活的单培物养和共培养物之间的统计学显著差异(p<0.05)。APAP：对乙酰氨基酚。

图7A至图7I示出将iKC应用于供体匹配的炎性模型以检测肝毒性和对胆汁淤积疾病进行建模。

图7A示出由供体错配的免疫细胞引发的免疫应答，显示为在没有任何内毒素刺激的情况下，在用LPS刺激时在pHep和pKC的单培养物中以及在iHep和iKC(供体匹配的共培养物；肝细胞和KC源自相同的iPSC来源)和pHep和pKC(供体错配的共培养物；不同的供体)的共培养物中的细胞因子、IL-6和TNFα的产生。误差棒代表s.e.m，n≥3。单实线代表p<0.05，双实线代表p<0.01。UD：无法检测。

图7B示出人iPSC-肝细胞(iHeps)(白蛋白阳性)和iKC(CD163阳性)的共培养物的图像；比例尺：50μm。

图7C示出在第5天在不含Dex的William培养基中与iKC共培养时iHep中肝脏标记物的基因表达。AFP：甲胎蛋白，ALB：白蛋白，AAT：α1-抗胰蛋白酶，ASGPR：脱唾液酸糖蛋白受体。

图7D示出在第5天在不含Dex的William培养基中与iHep共培养时iKC中

标记物(左子图)和KC特异性标记物(右子图)的基因表达。

图7E和图7F示出与iKC和

共培养的iHep在暴露于不同浓度的APAP后通过Alamar

测定评估的iHep的细胞活力以及与存在和不存在LPS的情况下的单培养进行比较。细胞活力表示为用溶剂单独处理的细胞的百分比。横穿的水平实线表示50％的细胞活力。虚线代表未用LPS处理的培养物。实线代表用LPS处理的培养物。黑线代表肝细胞的单培养物，灰线代表共培养物。误差棒代表s.e.m，n≥3。Hep：肝细胞。

图7G示出当用LPS和范式胆汁淤积药物氯丙嗪(CPZ,10μM)处理时iHep/iKC共培养物和iHep单培养物中IL-6和TNFα产生。水平表示为与未处理对照相比的倍数变化。

图7H示出与未处理对照相比，处理后iHep-iKC共培养物中FDA积累(左子图)；比例尺：50μm。(I)使用ImageJ定量胆汁酸积累。实线代表p<0.05。(J)与CPZ处理后的单培养物相比，共培养物中BSEP、MDR1和MRP1的基因表达。表达水平表示为未处理对照的倍数变化。误差棒代表s.e.m，n≥3。实线代表p<0.05。BSEP：胆盐输出泵，MDR1：多药耐药，MRP1：多药耐药相关蛋白。

图8A至图8E是示出iKC在不同培养基和细胞外基质配置上的活力、附着和密度的相差图像。

在单独的原代人肝细胞条件培养基(PHCM)(图8A)、PHCM和X-VIVO培养基(图8B)PHCM和RPMI-1640和10％血清(图8C)、PHCM培养基和X-VIVO和10％血清(图8D)和PHCM培养基和高级DMEM中分化7天。比例尺：100μm。

图9A-图9D示出肝细胞和KC共培养物模型的建立和用左氧氟沙星进行处理。

图9A示出第5天在含有Dex(浅灰色条)和不含Dex(深灰色条)的William E培养基中pHep单培养的CYP1A2、CYP3A4和CYP2B6的基础活性。

图9B示出在第1-5天在不含Dex的William E培养基中pHep单培养物、pHep-pKC和pHep-iKC共培养物中的CYP3A4和CYP2C19基因表达和白蛋白产生。误差棒代表sem，n＝3。

图9C和图9D示出用无肝毒性化合物左氧氟沙星处理pHep-pKC共培养物和iHeps-iKC。在存在和不存在LPS的情况下在暴露于不同浓度的左氧氟沙星后，通过Alamar

测定来评估与pKC共培养物的pHep(图9C)和与iKC共培养物的iHep(图9D)的细胞活力。各自的单培养物被用作对照。细胞活力表示为用溶剂单独处理的细胞的百分比。横穿的水平实线表示50％的细胞活力。虚线代表未用LPS处理的培养物。实线代表用LPS处理的培养物。黑线代表肝细胞的单培养物，灰线代表共培养物。

具体实施方式

肝脏巨噬细胞库普弗细胞(KC)在药物性肝损伤(DILI)和肝脏疾病(包括胆汁淤积、肝纤维化和病毒性肝炎)中发挥着关键作用。由于人KC的来源有限，KC在DILI和肝脏疾病的体外模型中的应用受到阻碍。

在体内，KC源于MYB独立的巨噬细胞祖细胞，其分化为肝脏特异性巨噬细胞以响应肝脏中的肝脏信号。

本发明人的目标是生成iPSC衍生的

前体

并在体外为它们提供肝脏信号，以驱动它们朝向肝脏特异性的

iKC。本发明人认为这种方法将允许产生肝脏特异性的和成熟的iKC的可再生来源，其可用于多种应用。

在这里，本发明人通过将MYB独立的iPSC分化为巨噬细胞前体并将它们暴露于肝脏信号以生成iPSC衍生的KC(iKC)来重现KC个体发生。

分子和功能测定表明iKC与pKC相似，但不同于其他非肝脏

表明它们是成熟的和肝脏特异性的。

iKC表达的巨噬细胞标记物(CD11/CD14/CD68/CD163/CD32)是原代成人KC(pKC)和KC特异性的CLEC-4F、ID1和ID3的0.3-5倍。iKC在刺激后与pKC相似的水平吞噬和分泌IL-6和TNFα，但与非肝脏巨噬细胞不同。与单独的肝细胞相比，肝细胞-iKC共培养物模型在检测由炎症相关药物、对乙酰氨基酚和曲伐沙星以及氯丙嗪诱导的胆汁淤积引起的肝毒性方面更敏感。总的来说，iKC是成熟的、肝脏特异性的和功能性的。

iKC与来自相同的iPSC供体的肝细胞共培养，以建立供体匹配的共培养物模型，该模型可以模拟炎症相关的肝毒性和胆汁淤积疾病。

与供体错配的对应物相比，供体匹配的iKC和iPSC-肝细胞共培养物表现出最小的非特异性背景反应。iKC为肝脏特异性巨噬细胞提供成熟的可再生人类细胞源，可用于开发体外模型以研究DILI和肝脏疾病例如胆汁淤积。

IPSC衍生的库普弗细胞(IKC)的产生

本发明人公开了一种从诱导多能干细胞(iPSC)产生库普弗细胞的方法。本发明人将这种库普弗细胞命名为iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)。

本发明人的方法涉及提供巨噬细胞前体细胞

这种巨噬细胞前体细胞可以源自诱导多能干细胞(iPSC)。

该方法进一步包括将巨噬细胞前体细胞

暴露于一种或多种使其分化为库普弗细胞的信号。所述信号可以包括肝脏信号并且巨噬细胞前体细胞

可以在这种肝脏信号的存在下进行培养。

所述iPSC衍生的库普弗细胞可以具有生物学特性，例如库普弗细胞的生物学活性。

库普弗细胞

库普弗细胞在Dixon LJ,Barnes M,Tang H,Pritchard MT,Nagy LE.Kupffercells in the liver.Compr Physiol.2013；3(2):785–797.doi:10.1002/cphy.c120026and Bilzer M,Roggel F,Gerbes AL.Role of Kupffer cells in host defense andliver disease.Liver Int.2006 Dec；26(10):1175-86中详细描述。

库普弗细胞，也称为星状巨噬细胞和库普弗-Browicz细胞，是位于肝脏中的专门的巨噬细胞，排列在血窦壁上。它们形成单核吞噬细胞系统的一部分。

Karl Wilhelm von Kupffer于1876年首次观察到这些细胞，他称它们为“星状细胞”(星细胞或肝星状细胞)，但错误地认为它们是肝脏血管的内皮的组成部分，并且来源于其中。1898年，经过几年的研究，Tadeusz Browicz正确地将它们鉴定为巨噬细胞。

库普弗细胞发育开始于卵黄囊，在那里它们分化为胎儿巨噬细胞。一旦进入血流，它们就会迁移至它们所停留的胎儿肝脏。在那里，它们完成了向库普弗细胞的分化。

除了清除任何细菌外，红细胞也被吞噬作用分解，其中血红蛋白分子被分离。珠蛋白链被重复使用，而含铁部分，亚铁血红素，被进一步分解成铁，其被重复使用，胆红素在肝细胞内与葡萄糖醛酸结合并分泌到胆汁中。

Helmy等人鉴定了存在于库普弗细胞中的受体，即免疫球蛋白家族(CRIg)的补体受体。没有CRIg的小鼠无法清除补体系统包被的病原体。CRIg在小鼠和人类中是保守的，并且是先天免疫系统的重要组成部分。

库普弗细胞激活是早期乙醇引起的肝损伤的主要原因，这在慢性酒精中毒中很常见。慢性酒精中毒和肝损伤涉及两个打击系统(hit system)。第二个打击的特点是激活Toll样受体4(TLR4)和CD14，这是库普弗细胞上内化内毒素(脂多糖或LPS)的受体。这会激活促炎性细胞因子(肿瘤坏死因子α或TNFα)的转录和超氧化物(促氧化剂)的产生。然后，TNFα将进入肝脏中的星状细胞，导致胶原蛋白合成和纤维化。纤维化最终会导致肝硬化或肝脏功能丧失。

从诱导多能干细胞(IPSC)产生巨噬细胞前体细胞

从iPSC产生巨噬细胞前体的方法是本领域已知的并且描述于例如：

Buchrieser J,James W,Moore MD.Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Macrophages Share Ontogeny with MYB-Independent Tissue-ResidentMacrophages.Stem Cell Reports.2017；8(2):334-345.doi:10.1016/j.stemcr.201612.020

Hale C,Yeung A,Goulding D,et al.Induced pluripotent stem cell derivedmacrophages as a cellular.system to study salmonella and other pathogens.PLoSOne.2015；10(5):e0124307.Published 2015 May 6.doi:10.1371/journal.pone.0124307

Mukherjee C.，Hale C.,Mukhopadhyay S.(2018)A Simple MultistepProtocolfor Differentiating Human Induced Pluripotent Stem Cells intoFunctional Macrophages.In:Rousselet G.(eds)Macrophages.Methods in MolecularBiology,vol 1784.Humana Press,New York，NY

Kazuyuki Takata，Tatsuya Kozaki,Christopher Zhe Wei Lee,Morgane SoniaThion,Masayuki Otsuka，Shawn Lim，Kagistia Hana Utami，Kerem Fidan，Dong ShinPark,BenoitMalleret,Svetoslav Chakarov,Peter See,Donovan Low,Gillian Low,Marta Garcia-Miralles,Ruizhu Zeng,Jinqiu Zhang,Chi Ching Goh,Ahmet Gul,SandraHubert,Bernett Lee,Jinmiao Chen,Ivy Low,Nurhidaya Binte Shadan,Josephine Lum,Tay Seok Wei,Esther Mok,Shohei Kawanishi，Yoshihisa Kitamura，Anis Larbi，Michael Poidinger，Laurent Renia，Lai Guan Ng，Yochai Wolf，Steffen Jung，Tamer

Evan Newell，Tara Huber，Eishi Ashihara，Sonia Garel，Mahmoud A.Pouladi，Florent Ginhoux.Induced-Phuripotent-Stem-Cell-Derived Primitive MacrophagesProvide a Platform for Modeling Tissue-Resident Macrophage Differentiationand Function.Immunity,Volume 47,Issue 1,2017,Pages 183-198.e6,ISSN 1074-7613，

所述方法可以包括第一步从诱导多能细胞(iPSC)产生胚状体(EB)和第二步从胚状体(EB)产生巨噬细胞前体细胞

所述第一步可以包括将所述iPSC暴露于一种或多种因子，例如在培养物中。所述iPSC可以暴露于骨形态发生蛋白-4(BMP-4，GenBank登录号Q53XC5)，优选以50ng/mL。所述iPSC可以暴露于血管内皮生长因子(VEGF，GenBank登录号NP_001165097)，优选以50ng/mL。所述iPSC可以暴露于干细胞因子(SCF，GenBank登录号P21583.1)，优选以20ng/mL。所述iPSC可以暴露于ROCK抑制剂，优选以10μM。所述iPSC可以同时暴露于所有这些因子。

所述第二步可以包括将所述EB暴露于因子，例如在培养物中。所述EB可以暴露于巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，GenBank登录号P09603)，优选以100ng/mL。所述EB可以暴露于白细胞介素-3(IL-3，GenBank登录号AAC08706)，优选以25ng/mL。所述EB可以暴露于glutamax，优选以2mM。所述EB可以暴露于β-巯基乙醇，优选以0.055mM。所述EB可以同时暴露于一种或多种因子，例如所有这些因子。

所述EB可以暴露于培养基例如X-VIVO^TM15培养基(Lonza，Basel，Switzerland)中的一种或多种因子。

从诱导多能干细胞(iPSC)产生巨噬细胞前体细胞

的示例性方案

改编自Wilgenburg等[26]的示例性方案如下：

使用TrypLE^TM收获iPSC，离心并将细胞块重悬在干细胞维持培养基mTeSR^TM1中，该干细胞维持培养基mTeSR^TM1补充有50ng/mL骨形态发生蛋白-4(BMP-4，GenBank登录号Q53XC5)、50ng/mL血管内皮生长因子(VEGF，GenBank登录号NP_001165097)、20ng/mL干细胞因子(SCF，GenBank登录号P21583.1)和10μM ROCK抑制剂(Calbiochem,Billerica,MA,USA)。

将细胞以12,000个细胞/孔的密度接种到圆底、低粘附性、96孔板中，离心并在5％CO₂气氛中于37℃下孵育4天，然后收获胚状体(EB)。

在第二天更换75％的培养基。

在第4天，收获12个EB并转移到6孔板的每个孔中，并在X-VIVO^TM15培养基(Lonza，Basel，Switzerland)中培养，该X-VIVO^TM15培养基补充有100ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，GenBank登录号P09603)、25ng/mL白细胞介素-3(IL-3，GenBank登录号AAC08706)、2mMglutamax、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素和0.055mMβ-巯基乙醇(Sigma-Aldrich,Singapore)。

每五到七天更换三分之二的培养基。

在3到4周内由EB产生。

每周从所述培养基收集悬浮的

它们可用于进一步分化。

诱导多能干细胞(IPSC)

诱导多能干细胞(iPSC)在形态上与人胚胎干细胞相似，表达典型的人ESC-特异性细胞表面抗原和基因，在体外分化成多个谱系，并在注射到免疫功能不全的小鼠中时形成包含所有三个原胚层的分化衍生物的畸胎瘤。

人iPS细胞源自体细胞，通常通过Oct-3/4、Sox-2、c-Myc和Klf-4的表达而产生或通过Oct-3/4、Sox-2、Nanog和Lin28而产生。

产生诱导多能干细胞的方法是本领域已知的，并且描述于例如WO 2016/120493、EP2128245、US7682828等中。

如本文所用，术语“多能的”或“多能性”是指具有产生后代的能力的细胞，所述后代可在适当的条件下分化成共同表现出与来自所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特征的细胞类型。多能干细胞可以促进出生前动物、出生后动物或成年动物的许多或所有组织。

标准的现有技术可接受的测试，例如在8-12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可用于建立细胞群的多能性，但也可使用多种多能干细胞特征的鉴定来检测多能的细胞。细胞多能性是一个连续体，从可以形成胚体的每个细胞(例如胚胎干细胞和iPSC)的完全多能细胞到可以形成所有三个胚层的细胞、但可能不表现出完全多能细胞的所有特征(例如种系传递或产生完整生物体的能力)的不完全或部分多能细胞。在本发明的具体实施方案中，细胞的多能性从不完全或部分多能细胞增加至更多能的细胞，或在一些实施方案中至完全多能细胞。

多能性可以例如通过畸胎瘤形成、种系传递和四倍体胚胎补偿来评估。在一些实施方案中，如本文别处所讨论的多能性基因或多能性标记物的表达可用于评估细胞的多能性。

“多能干细胞特性”是指将多能干细胞与其他细胞区分开来的细胞特性。产生能够在适当的条件下分化成共同表现出与来自所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特征的细胞类型的后代的能力是多能干细胞的特征。

分子标记物的某些组合的表达或不表达也是多能干细胞特征。例如，人类多能干细胞表达来自以下非限制性列表的至少一些，并且任选地所有的标记：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-1、Oct4、Rexl和Nanog。与多能干细胞相关的细胞形态也是多能干细胞的特征。如本文所用，“体细胞”是指相对于胚胎干细胞的分化或部分分化的细胞。因此，该术语包括例如源自胚胎干细胞、但已分化的细胞，例如成纤维细胞。

术语“胚胎干细胞”用于指胚胎囊胚的内细胞团的多能干细胞(参见美国专利号5843780、6200806)。胚胎干细胞的区别特征定义了胚胎干细胞表型。因此，如果细胞具有胚胎干细胞的一种或多种独特特征使得该细胞可与其他细胞区分开，则该细胞具有胚胎干细胞的表型。说明性的区别胚胎干细胞特征包括但不限于基因表达谱、增殖能力、分化能力、正常核型、对具体培养条件的反应性等。[0024]如本文所用，“癌症干细胞”是指自我更新的和多能的癌细胞(参见，例如，美国专利号6,984,522)。这种细胞可以从任何肿瘤来源获得，包括原发性或任何转移性肿瘤部位、淋巴结、腹水或血液。癌症干细胞是根据其功能特征进行鉴定的，这些功能特征包括但不限于在连续移植中重新植入新肿瘤的能力，以及产生原始肿瘤的功能和表型细胞异质性的能力。

巨噬细胞前体细胞(PREMΦ)

从巨噬细胞前体细胞

产生iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)

所述巨噬细胞前体细胞可暴露于一个或多个肝脏信号以促进其成熟为库普弗细胞。例如，所述巨噬细胞前体细胞可以在包含一种或多种这种肝脏信号的细胞培养基中进行培养。

所述肝脏信号可包括由肝细胞分泌的一种或多种因子。为此，肝细胞可以在细胞培养基中培养，并且所述肝细胞释放的可溶性因子可以通过肝细胞培养条件化的培养基(原代肝细胞培养基，PHCM)的形式收集。

这种条件培养基可以被收集并将其添加至前巨噬细胞培养基以将它们暴露于信号。

所述巨噬细胞前体细胞可以暴露于单一因子或因子的结合物。

所述细胞培养基可包含高级DMEM。因此，所述细胞培养基可以补充有来自培养肝细胞的条件培养基，例如来自培养原代人肝细胞的条件培养基(原代人肝细胞条件培养基PHCM)。

所述细胞培养基可以包含补充剂。所述补充剂可以包括以下任何物质，例如以指定的浓度：

2.5mL青霉素/链霉素(10,000U/mL/(10,000μg/mL)终浓度：0.5％

人重组胰岛素(6.25μg/mL终浓度)

人转铁蛋白(6.25μg/mL终浓度)

亚硒(6.25μg/mL终浓度)

牛血清白蛋白(BSA)-(1.25g/mL)

亚油酸(5.35μg/mL终浓度)

HEPES，pH7.4(15mM终浓度)

GlutaMAX^TM 2mM终浓度

可能存在不止一种补充剂。所述补充剂可以为市购的混合物。例如，所述补充剂可以从Invitrogen购买(作为“混合物b”)https://www.thermofisher.com/sg/en/home/references/protocols/drug-discovery/adme-tox-protocols/media-supplement-guide.html

肝脏信号

根据本文描述的方法，巨噬细胞前体

细胞暴露于一个或多个肝脏信号以产生iPSC衍生的库普弗细胞。所述巨噬细胞前体

细胞可以在存在所述肝脏信号或每个肝脏信号的情况下进行培养。

高级DMEM

所述肝脏信号可以包括在高级DMEM中的培养。因此，所述培养基可包括含有来自另一来源(例如原代人肝细胞条件培养基(PHCM))的条件培养基的高级DMEM。

高级DMEM(Advanced DMEM)可以市购，例如从Thermo Fisher Scientific(目录号12491015)获得。

原代人肝细胞条件培养基(PHCM)

诸如原代人肝细胞条件培养基(PHCM)的所述条件细胞培养基可以通过在细胞培养基中培养诸如人肝细胞、其后代或由其衍生的细胞系的肝细胞；以及分离细胞培养基来获得。

培养原代肝细胞的方法是本领域众所周知的，并且例如在Shulman M,NahmiasY.Long-term culture and coculture of primary rat and humanhepatocytes.Methods Mol Biol.2013；945:287–302.doi:10.1007/978-1-62703-125-7_17中进行描述。

条件培养基可以在使用期间、使用之前或之后进行过滤或浓缩，或进行过滤和浓缩。例如，它可以通过膜过滤，例如具有尺寸或分子量截留的膜。它可能会受到切向力过滤或超滤。

例如，可以使用具有合适的分子量或尺寸截留的膜进行过滤。

任选过滤或浓缩或过滤和浓缩的所述条件培养基可以进行进一步的分离措施，例如柱层析。例如，可以使用具有多种柱的高效液相色谱(HPLC)。所述柱可以是尺寸排除柱或绑定柱。

iPSC衍生的库普弗细胞(IKC)

根据本文描述的方法制备的iPSC衍生的库普弗细胞可以表现出库普弗细胞的特性。库普弗细胞的特性可以包括生物学特性，例如生物学活性。

iPSC衍生的库普弗细胞可以表现出库普弗细胞(例如人库普弗细胞)的任何一种或多种生物学活性。iPSC衍生的库普弗细胞可以例如具有库普弗细胞的诊断、治疗或修复活性。

所述库普弗细胞可以包括天然库普弗细胞。所述天然库普弗细胞可以包括来自个体肝脏的库普弗细胞。所述天然库普弗细胞可以包括原代库普弗细胞。所述天然库普弗细胞可包括原代成人KC(pKC)。

这些实例表明，iPSC衍生的库普弗细胞包括库普弗细胞的生物学活性，并且能够替代库普弗细胞本身。iPSC衍生的库普弗细胞的生物学特性或生物学活性因此可以对应于库普弗细胞的生物学特性或活性。

该特性可以包括生物学特性，例如生物学活性。库普弗细胞的生物学活性的施例包括巨噬细胞标记物的表达、吞噬作用；激活后炎性细胞因子、生长因子或活性氧物质的释放；刺激后IL-6和TNFα的分泌，优选以LPS进行刺激。

iPSC衍生的库普弗细胞可以表现出一种或多种这类活性。iPSC衍生的库普弗细胞可以显示这些活性中的每种。

巨噬细胞标记物的表达

所述iPSC衍生的库普弗细胞可以表现出库普弗细胞的生物学特性，包括巨噬细胞标记物例如巨噬细胞特异性标记物的表达。

所述巨噬细胞标记物可以包括CD11(GenBank登录号NM_000632.3)、CD14(GenBank登录号NM_001174105.1)、CD68(GenBank登录号NM_001251.2)、CD163(GenBank登录号NM_203416.3)or CD32(GenBank登录号NM_001136219.1)。作为替换或另外，所述巨噬细胞标记物可以包括CLEC-4F(GenBank登录号NM_173535.2)、ID1(GenBank登录号NM_181353.2)或ID3(GenBank登录号NM_002167.4)。

对这些标记物的表达进行测定是本领域公知的。

吞噬作用

所述iPSC衍生的库普弗细胞可以表现出库普弗细胞的生物学特性，例如吞噬作用。

吞噬作用测定是本领域已知的并且例如在实施例8中描述。

所述iPSC衍生的库普弗细胞在激活后可以释放炎性细胞因子、生长因子或活性氧物质。所述iPSC衍生的库普弗细胞可以在刺激后分泌IL-6和TNFα，优选以LPS进行刺激。这类测定是本领域已知的并且在实施例例如实施例7中进行描述。

iPSC衍生的库普弗细胞的用途

如上所述，所述iPSC衍生的库普弗细胞可用作库普弗细胞的替代品。具体地，所述iPSC衍生的库普弗细胞可用于库普弗细胞目前正在使用的或在未来可能使用的任何治疗目的。

很明显，这里描述的方法和组合物能够从iPSC产生库普弗细胞。因此，库普弗细胞的任何用途都将同样适用源自iPSC的库普弗细胞。

通过本文所述的方法和组合物产生的iPSC衍生的库普弗细胞可用于或用于制备用于治疗疾病或病症的药物组合物。这类疾病或病症可包括肝脏疾病或病症，优选选自肝损伤、药物性肝损伤(DILI)、肝脏疾病、脂肪性肝炎、胆汁淤积、肝纤维化和病毒性肝炎。因此，iPSC衍生的库普弗细胞可用于治疗这类疾病。

iPSC衍生的库普弗细胞，例如根据本文描述的方法和组合物制备的库普弗细胞，可用于多种商业上重要的研究、诊断和治疗目的。

所述iPSC衍生的库普弗细胞可特别用于制备用于治疗疾病或病症的药物组合物。这类疾病或病症可包括肝脏疾病或病症，优选选自肝损伤、药物性肝损伤(DILI)、肝脏疾病、脂肪性肝炎、胆汁淤积、肝纤维化和病毒性肝炎。

通过本文所述的方法和组合物制备的iPSC衍生的库普弗细胞与原代库普弗细胞具有相似或相同的特性。因此，所述iPSC衍生的库普弗细胞可用于任何已知使用原代库普弗细胞或有可能使用原代库普弗细胞的应用。

肝损伤

肝损伤，也称为肝裂伤，是对肝脏遭受的某种形式的创伤。这可能通过钝力(例如车祸)或尖锐的异物(例如刀)发生。肝损伤占所有创伤的5％，使其成为最常见的腹部损伤。

由于其位于腹腔中的较前位置，并且其尺寸较大，容易发生枪伤和刺伤。它在隔膜下方的牢固位置也使其特别容易受到剪切力。此类损伤的常见原因是钝力机制，例如机动车事故、跌倒和运动损伤。通常，这些钝力通过肝脏结构及其周围消散，并对该组织的内部微结构造成不可修复的损害。随着冲击速度的增加，肝脏组织的内部损伤也作为例证—即使组织本身在机械和微观结构上是各向同性的。大多数遭受这种损伤的人还伴随着另一种损伤。

药物性肝损伤(DILI)

以下描述摘自David S,Hamilton JP.Drug-induced Liver Injury.USGastroenterol Hepatol Rev.2010；6:73-80。

药物性肝损伤(DILI)很常见，几乎所有类别的药物都会导致肝脏疾病。

药物不良反应是肝损伤的重要原因，可能需要停药、住院治疗或者甚至肝移植。

事实上，药物性肝毒性是美国急性肝功能衰竭的最常见原因。由于肝脏负责集中和代谢大多数药物，因此它是药物引起的损伤的主要目标。

在肝毒性药物中，对乙酰氨基酚(扑热息痛)是最常研究的。

然而，范围广泛的不同药理学制剂可引起肝损伤，包括麻醉剂、抗癌药物、抗生素、抗结核制剂、抗逆转录病毒药物和心脏病药物。此外，大量的传统医学疗法和草药也可能具有肝毒性。

DILI可能是给药药物或其代谢物直接毒性的结果，或者损伤可能是由免疫介导的机制导致的。

脂肪性肝炎

脂肪性肝炎是一种脂肪肝疾病，其特征是肝脏的炎症，伴有肝脏中的脂肪堆积。单纯的脂肪在肝脏中的沉积被称为脂肪变性，这些共同构成了脂肪肝的变化。

脂肪肝疾病有两种主要类型：酒精相关的脂肪肝疾病和非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。NAFLD的危险因素包括糖尿病、肥胖症和代谢综合征。

存在炎症时，它被称为酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。任何一种原因的脂肪性肝炎都可能发展为肝硬化，现在认为NASH是不明原因肝硬化的常见原因(至少在西方社会)。NASH也与溶酶体酸性脂肪酶缺乏有关。

胆汁淤积

胆汁淤积是胆汁不能从肝脏流到十二指肠的情况。两个基本区别是阻塞性胆汁淤积和代谢性胆汁淤积，所述阻塞性胆汁淤积的胆管系统中可能因胆结石或恶性肿瘤而发生机械阻塞，所述代谢性胆汁淤积，即胆汁形成障碍，可能由于遗传缺陷或许多药物的副作用后天获得。

肝纤维化

肝硬化，也称为肝硬变或肝性硬化，是肝脏因长期损伤而无法正常运作的病症。这种损伤的特征在于疤痕组织取代了正常肝组织。通常，该疾病在数月或数年内缓慢发展。早期，通常没有症状。随着疾病恶化，人可能会变得疲倦、虚弱、发痒、小腿肿胀、皮肤发黄、容易瘀伤、腹部积液或皮肤上出现蜘蛛状血管。腹部积液可能会自发感染。其他严重的并发症包括肝性脑病、食道静脉扩张或胃静脉扩张的出血和肝癌。肝性脑病会导致意识模糊并可能导致失去知觉。

肝硬化最常由酒精、乙型肝炎、丙型肝炎和非酒精性脂肪肝引起。通常，酒精性肝硬化的发生需要多年来每天饮用超过两或三杯酒精饮品。非酒精性脂肪肝疾病有多种原因，包括超重、糖尿病、高血脂和高血压。肝硬化的许多不太常见的原因包括自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、血色病、某些药物和胆结石。诊断基于血液检测、医学影像和肝活检。

肝硬化的某些原因，例如乙型肝炎，可以通过接种疫苗来预防。治疗部分地取决于背后的原因，但目标通常是防止恶化和并发症。建议在所有肝硬化病例中避免酒精。乙型和丙型肝炎可以用抗病毒药物治疗。自身免疫性肝炎可以用类固醇药物治疗。如果疾病是由于胆管阻塞引起的，则熊去氧胆酸可能有用。其他药物可能对并发症例如腹部或腿部肿胀、肝性脑病和食管静脉扩张等有用。在严重的肝硬化中，肝移植可以为一个选项。

2015年，肝硬化影响了约280万人，导致130万人死亡。在这些死亡中，酒精导致348,000人死亡，丙型肝炎导致326,000人死亡，乙型肝炎导致371,000人死亡。在美国，死于肝硬化的男性多于女性。对这种情况的第一个已知描述是公元前5世纪的希波克拉底(Hippocrates)。术语肝硬化是在1819年发明的，源自希腊语，表示患病肝脏的黄色。

病毒性肝炎

病毒性肝炎是由病毒感染引起的肝脏炎症。它可以以急性形式作为近期感染存在，发病相对较快，或以慢性形式存在。

病毒性肝炎的最常见原因是五种不相关的嗜肝病毒，即甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎。其他病毒也可引起肝脏炎症，包括巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒和黄热病。也有大量记录的由单纯性疱疹病毒引起的病毒性肝炎的病例。

最常见的肝炎类型可以预防或治疗。甲型肝炎和乙型肝炎可以通过接种疫苗来预防。丙型肝炎可以有效治疗，但费用昂贵。

在2013年，约有150万人死于病毒性肝炎，最常见的原因是乙型和丙型肝炎。东亚是受影响最严重的地区。

结合物

所述iPSC衍生的库普弗细胞可以与任何其他细胞类型结合使用。合适的细胞类型可以包括肝细胞类型，例如肝细胞。

所述肝细胞可以包括来自已知肝细胞系例如hepg2的细胞。它可以包括本领域已知的任何其他肝细胞源，例如heparg。

所述肝细胞可以包括原代人肝细胞(pHEP)或iPSC衍生的肝细胞(iHep)。

所述细胞类型可能与iPSC衍生的库普弗细胞共享遗传背景。例如，所述结合物中的iPSC衍生的库普弗细胞和细胞类型可以源自相同的供体或匹配的供体。

所述结合物中的iPSC衍生的库普弗细胞和细胞类型可以在一起培养，例如在共培养物中。

实施例

除非另有说明，常见的细胞培养耗材和生长因子获自Life Technologies(Carlsbad,CA,USA)and R&D Systems(Minneapolis,MN,USA)。

实施例1.材料和方法：细胞培养

iPSC-IMR90(WiCell Research Institute,Madison,WI)在mTeSR^TM1培养基(StemCell Technologies,Vancouver,BC,Canada)中基质胶(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)包被的组织培养板上培养并保持，如前所述[24,25]。

冷藏保存的pKC(Life Technologies)根据调整的制造商的说明进行保持和培养。简而言之，将细胞在37℃水浴中解冻并重悬在冷KC解冻/平板培养基中，该培养基包含高级DMEM、5％FBS和补充剂混合物A(Life Technologies)。混合物的主要成分包括：人重组胰岛素(4μg/ml)、glutamax(2mM)、HEPES(15mM)和100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素。细胞在4℃下以150g离心，细胞块重悬在KC解冻/平板培养基中。对细胞进行计数并将12,000个细胞铺板到96孔板(Nunc,Naperville,IL,USA)的每个孔中，该板预先包被有中性的1.5mg/ml

牛胶原蛋白溶液，1型(Advanced Biomatrix,San Diego,CA,USA)。使细胞附着24小时后，将培养基更换为KC保持培养基，该培养基包含高级DMEM、5％FBS和补充剂混合物B(Life Technologies)，细胞直接用于测定或与肝细胞共培养。混合物B的主要成分包括：人重组胰岛素(6.25μg/ml)、人转铁蛋白(6.25μg/ml)、亚硒酸(6.25ng/ml)、牛血清白蛋白(1.25mg/ml)、亚油酸(5.35μg/ml)、glutamax(2mM)、HEPES(15mM)和100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素。

冷藏保存的pHep获自Life Technologies和BD Biosciences(Franklin Lakes,NJ,USA)，并如前所述进行培养[24]。每天更换培养基。从所述培养物中收集的培养基用作原代人肝细胞条件培养基(PHCM)。将三个不同批次的pHep和pKC用于实验。

实施例2.材料和方法：iHep、

iKC和

的体外分化

iPSC分化成肝细胞，如前所述[26]。至少三个独立批次的分化的iPSC衍生的肝细胞(iHep)用于所有测定。分化完成后，使用先前优化的方案[25]收获细胞，从而用于进一步实验。

iPSC衍生的巨噬细胞前体

是使用Wilgenburg等[26]采用的方案产生的。简而言之，使用TrypLE^TM收获iPSC，离心并将细胞块重悬在干细胞保持培养基mTeSR^TM1中，该干细胞保持培养基mTeSR^TM1补充有50ng/mL骨形态发生蛋白-4(BMP-4，GenBank登录号Q53XC5)、50ng/mL血管内皮生长因子(VEGF，GenBank登录号NP_001165097)、20ng/mL干细胞因子(SCF，GenBank登录号P21583.1)和10μM ROCK抑制剂(Calbiochem,Billerica,MA,USA)。将细胞以12,000个细胞/孔的密度接种到圆底、低粘附性、96孔板中，离心并在5％CO₂气氛中在37℃下孵育4天，然后收获胚状体(EB)。在第二天更换75％的培养基。在第4天，收获12个EB并转移到6孔板的每个孔中，并在X-VIVO^TM15培养基(Lonza,Basel,Switzerland)中培养，该X-VIVO^TM15培养基补充有100ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，GenBank登录号P09603)、25ng/mL白细胞介素-3(IL-3，GenBank登录号AAC08706)、2mM glutamax、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素和0.055mMβ-巯基乙醇(Sigma-Aldrich,Singapore)。每五到七天更换三分之二的培养基。

在3到4周内由EB产生。每周从培养基中收集悬浮的

并用于进一步分化。

使用X-VIVO^TM15培养基将

分化成

该X-VIVO^TM15培养基补充有100ng/mLM-CSF(GenBank登录号P09603)、2mMglutamax和100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素[26]。分化持续了5至7天。这些细胞被称为非肝脏巨噬细胞

因为在分化过程中没有提供肝脏特异性信号。

为了确定产生iKC的最佳培养条件，筛选了几种不同的培养条件。这些条件包括细胞外基质底物(含和不含胶原蛋白I)、与PHCM结合的不同基础培养基(X-VIO 15、RPMI 1640和高级DMEM)、血清补充剂和这些因素的结合物。优化后，

经受PHCM和高级DMEM(加上补充剂)的混合物以产生iKC。从3个不同批次的pHep的培养中收集PHCM。这3个不同批次的PHCM与三个不同批次的

一起使用以产生三个批次的iKC。分化5至7天后，细胞就可以收获了。这些源自

的肝脏特异性

样细胞被称为iKC。

实施例3.材料和方法：单培养物和共培养物的实验建立

对于共培养，将

pKC或iKC以每孔12,000至15,000个细胞的密度接种到胶原I包被的96孔板上。将细胞接种在它们各自的培养基中24小时。细胞附着后，去除培养基并以

密度的2.5倍的密度将iHep或pHep接种在含有补充剂混合物B的William E培养基中。在一些实验中，使用具有补充剂混合物B的高级DMEM(培养基A)。将匹配的肝细胞单培养物对照接种到与共培养物相同的培养基中，并且以与共培养物相同的密度。

实施例4.材料和方法：定量的实时PCR(qPCR)

使用RNeasy Micro-kit(Qiagen,Hilden,Germany)分离RNA，使用NanoDropTM ND-1000分光光度计(Life Technologies)确定RNA量，使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)将RNA转化为cDNA。7000快速实时PCR系统(AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)用于qPCR，其使用从GeneCopoeia，Inc.(Rockville，MD，USA)市购的引物。将所有标记物基因的表达水平归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的表达水平。

实施例5.材料和方法：免疫荧光

免疫染色如[24]所述进行。使用以下一抗：兔抗CD68(Abcam,Cambridge,U.K)、山羊抗白蛋白(Abcam)、小鼠抗CD163(AbD Serotec,Raleigh,NC,USA))、小鼠抗CD32(AbDSerotec)、山羊抗CLEC4F(Santa Cruz Biotechnology Inc.,Santa Cruz,CA,USA)和小鼠抗-CD11(Abcam)。应用Alexa Fluor 488偶联的抗小鼠(Life Technologies)和AlexaFluor 555偶联的抗兔(Life Technologies)二抗。细胞核用DAPI染色，并用Olympus BX-DSU显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)进行成像。使用Image J软件测量荧光强度，并使用荧光标记的细胞数和细胞总数(DAPI染色的)计算表达特异性标记物的细胞的百分比。10个代表性图像用于定量。

实施例6.材料和方法：流式细胞术

使用标准染色程序制备用于流式细胞术分析的细胞。用于免疫荧光的相同抗体用于流式细胞术。阳性门由未染色的样品和同型对照进行确定。数据由LSRFortessa(BDBioscience)获得并由Flow Jo(Tree Star,Inc.)进行分析。

实施例7.材料和方法：细胞因子产生

在收集培养基之前，将细胞用100ng/ml脂多糖(LPS)处理16小时。根据制造商的说明，使用人白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNFα)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Abcam)测量培养基中的IL-6和TNFα的水平。

实施例8.材料和方法：吞噬作用

为了测量吞噬作用，将FluoSpheres羧酸盐修饰的微球(1.0μm)以每个细胞2个颗粒的比例添加到相应的无血清细胞培养基中。在37℃下孵育30分钟后，用PBS洗涤细胞，以去除结合至细胞外的颗粒。使用3.7％甲醛进行固定，并用兔抗CD163进行染色以定量图像的每个视野中的细胞数。荧光珠与CD163染色的共定位被用于定量吞噬细胞的百分比。对每个细胞摄取的珠子进行计数，并将其归一化为图像的每个视野中的细胞数，以获得每个细胞的平均珠子数。使用Zeiss LSM 510 Meta共聚焦显微镜(Carl Zeiss，Jena，Germany)对颗粒的摄取进行定量，以确保仅对摄取的珠子进行计数，并排除附着在细胞表面的珠子。进行了三个独立批次的实验(n＝3)，并分析了每批至少10张图像，从而用于定量吞噬作用。

实施例9.材料和方法：细胞活力测定

根据制造商的说明，使用Alamar

细胞活力测定(Life Technologies)在用药物处理后24小时测量分化的肝细胞的细胞活力。以下药物用于细胞活力测定：对乙酰氨基酚、曲伐沙星和左氧氟沙星(所有药物均来自Sigma)。在DMSO中制备药物的储备溶液，然后在培养基中稀释以获得所需的工作浓度。对照仅用溶剂进行处理(在不存在测试化合物的情况下)并被认为是100％活力值。

实施例10.材料和方法：微阵列分析

使用RNeasy Micro-kit(Qiagen)分离RNA，并将其发送至新加坡科学技术和研究局分子和细胞生物学研究所的微阵列设备，在那里使用Bioanalyzer 2100(Agilent)分析RNA样本的质量，使用GeneChip Human Gene 2.0 ST阵列(Affymetrix)进行微阵列。Expression Console软件(Affymetrix)用于归一化数据(探针集摘要、初始数据质量检查、背景校正和log2转换)。使用转录组分析控制台分析归一化的数据。先前发表的IMR90[27]、BMDM[28]、

肺泡

小胶质细胞[31]的数据也包括在数据分析中。首先确定常见基因，然后使用R(版本3.3.2)进行主成分分析(PCA)和聚类分析。对于层次聚类，应用了欧几里德(Euclidean)距离测量和完全聚集方法。所有微阵列数据均已存放在国家生物技术信息中心基因表达综合公共数据库中，登录号为GSE99734。

实施例11.材料和方法：细胞色素P450(CYP)活性

在培养的第5天，确定三种CYP酶(即CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4)的基础活性，如前所述[25]。将细胞与含有CYP特异性底物(CYP1A2：200μM非那西丁、CYP2B6：200μM安非他酮和CYP3A4：5μM咪达唑仑)的培养基一起孵育。所述底物获自Sigma。根据先前描述的程序[32]，通过液相色谱-质谱法(LC-MS Finnigan LCQ Deca XP Max，Agilent 1100系列)分析上清液中的药物代谢产物。

实施例12.材料和方法：胆汁酸积累

iHep-iKC共培养物和iHep单培养物用100ng/ml LPS和10μM氯丙嗪(CPZ)处理24小时。将细胞与10μM二乙酸荧光素(FDA)一起孵育并孵育30分钟。去除含有FDA的培养基并用培养基洗涤细胞三次以去除任何残留的FDA。胆汁酸积累的图像使用Olympus BX-DSU来获取，并使用Image J软件进行定量，并相对于未处理的对照进行归一化。

实施例13.材料和方法：统计分析

使用用于iPSC衍生的细胞：iHep、

和iKC的3个独立批次的分化以及用于pHep和pKC的3个独立批次(供体)。双向配对学生t检验用于成对统计比较，方差分析用于微阵列数据分析(集成在转录组分析控制台中)。结果表示为3个独立实验的平均值±平均值的标准误差(s.e.m)。

实施例14.结果：iPSC通过

分化成iKC

根据van Wilgenburg等人采用的方法[26]，从iPSC-IMR90分化

胚状体(EB)在无血清且无饲养层条件下形成并保持在培养物中(图1A)。

产生开始于约第18天，可以每周从分化培养物的上清液中收获。

的EB形成、保持、附着和产生与先前的报道一致[26]。

表达

标记物CD14、CD68、CD163、CD11和CD32，它们在iPSC中以非常低的水平(<0.1倍)表达(图1B)。

为了将

分化为iKC，本发明人确定了与PHCM结合使用的最佳培养条件。这些条件包括最佳底物、血清浓度和基础培养基。单独添加PHCM导致细胞活力差和iKC的附着，如不健康和崩解的形态所示(补充图1A)。通过PHCM与X-VIVO的结合(已用于

分化的既定方案[26])，有或没有胶原蛋白(代表性图像示出在图8B)，没有改善不健康的细胞形态。细胞要么以大块聚集在一起，要么似乎正在崩解。当使用RPMI 1640代替X-VIVO时获得了类似的结果(数据未显示)。向培养基中添加10％血清也没有显著改善细胞的形态，并且令人意外的是没有帮助细胞附着(不到50％的细胞在分化的第5天仍然附着；图8C、图8D)。有趣的是，用PHCM和高级DMEM的结合物处理

导致了健康的细胞形态和附着(图8E)。因此，本发明人使用该结合物从

产生iKC(图1A)。每3天更换一次培养基。将iKC的形态与pKC比较，具有相似的直径和表型(图1C、图1D)，并且与

不同，

显示出更细长的形状和伸展的形态(图1E)。本发明人连续进行了微阵列、基因表达分析、免疫染色和功能分析，以评估iKC是否确实与pKC相似且与

不同。

实施例15.结果：iKC以与pKC相似的水平表达

和KC特异性标记物：基因表达

为了评估iKC和pKC在全局基因表达水平上的相似性，本发明人使用微阵列来分析

标记物的表达和对KC功能重要的通路：参与补体和凝血级联、细胞凋亡、细胞因子和炎性反应、模式识别和DNA结合蛋白(ID)信号传导的抑制剂的基因。将iKC中的基因表达与pKC的基因表达进行比较。iKC以与pKC相似的水平表达关键的

标记物，例如CD163、CD200R和CD86，但CD83除外，它在pKC中上调了4.4倍(图2A)。91.5％参与关键功能通路的基因在pKC和iKC中具有相似的表达(差异表达基于至少2倍的变化，且p值<0.05)。188个分析的基因中仅15个在pKC和iKC中差异表达(图2B至图2F，表1)。

表1：pKC和iKC中上调和下调的KC功能通路中涉及的基因的总结。示出在通路中涉及的基因的表达的热图显示在图2A至图2F中。

这15个基因包括11个在pKC中上调的基因：参与细胞因子和炎性反应的IL-6、集落刺激因子1、血小板衍生生长因子亚基A、白细胞介素1β和II类主要组织相容性复合体(HLA-DRB1)(分别为4.7、3.1、2.9、7.8和320倍；图2B)，参与补体和凝血级联的补体C7、凝血因子8和von Willebrand因子(分别为10.3、8.0和9.0倍；图2C)，参与细胞凋亡的caspase7和b-细胞淋巴瘤2(分别为2.3和6.2倍；图2D)和参与模式识别的C型凝集素域家族1成员B上调了10倍(图2E)。参与补体和凝血级联的纤溶酶原激活剂和缓激肽受体B1(图2C)，参与模式识别的清道夫受体B类成员1(图2E)和细胞周期蛋白E1(ID信号转导，图2F)在iKC中分别上调了2.4、9.7、3.73和3.3倍。参与pKC和iKC之间这些通路的其余172个基因的表达水平没有显著差异。总的来说，这些结果证明了iKC和pKC之间的转录组学相似性。

然后，本发明人通过qPCR确认了关键

和KC特异性基因的表达。F4/80已被充分证明是小鼠KC的代表性标记物，但不是人类细胞的代表性标记物[18]。CD14结合KC的CD32、CD68和CD11亚群的分类已被用于定义人类中的KC[33]。CD163已被用作激活的

的标记物。与pKC相比，iKC的表达倍数对于CD14为3.2±1.6，对于CD163为1.8±0.5，对于CD32为4.3±1.8(图2G)。iKC中的CD68和CD 11表达为pKC的约30％。除了这些

特异性标记物外，iKC还以与pKC相当的水平表达KC特异性标记物：ID1[34]、ID3[34]和C型凝集素域家族4成员F(CLEC-4F)[35、36]。与pKC相比，iKC的表达倍数对于ID1为3.5±0.7，对于ID3为1.4±0.2，对于CLEC-4F为0.5±0.2(图2G)。

为了确认KC特异性标记物的表达确实是由于从

至iKC的分化的进展，本发明人通过qPCR进一步检查了整个分化期间KC特异性标记物的表达动力学。ID1在第1天和第3天之间上调1.8±0.8倍，在第3天和第5天之间上调2.2±0.7倍，在第5天和第7天之间上调3.9±0.8倍(图2H)。分化期间ID1的总体上调为14±5(第7天与第1天)。与第1天相比，ID3在第7天上调3.7±0.4倍，与第5天相比，上调3.4±0.96倍(图2H)。在第1-5天未检测到CLEC-4F，但在第7天以与pKC相似的水平检测到(图2H)。总体而言，iKC在

和KC特异性标记物表达方面是成熟的，在7天分化期间逐渐增加。

实施例16.结果：iKC以与pKC相似的水平表达

和KC特异性标记物：蛋白质表达

本发明人通过免疫染色分析了iKC和pKC在蛋白质水平上的相似性(图3A)。iKC，与pKC类似，在蛋白质水平上表达

特异性标记物和KC特异性标记物CLEC-4F。表达

特异性标记物的细胞的百分比被定量：CD68⁺:iKC 93.1±1.4％和pKC 88.0±2.9％，CD163⁺:iKC 96.8±3.3％和pKC 93.8±1.2％，CD11⁺:iKC 90.5±4.1％和pKC 87.5±9.5％,CD32⁺:iKC 92.2±5.3％和pKC 94.9±3.3％，CLEC-4F⁺:iKC 92.9±6.8％和pKC 94.3±6.7％。使用iKC中的关键巨噬细胞标记物CD68和CD163以及KC特异性标记物CLEC-4F的流式细胞术分析确认免疫荧光结果(图3B)。CD68⁺、CD163⁺和CLEC-4F⁺iKC的百分比分别为77±1.4％、73.9±3.3％和63.5±6.8％。总体而言，iKC和pKC在蛋白质水平上显示出相似的标记物表达。

实施例17.结果：iKC表达非肝脏巨噬细胞中不存在的肝脏特异性巨噬细胞标记物

本发明人使用转录组微阵列分析来比较iKC与

和非肝脏组织驻留

的分子特征：来自可用公共数据库的

和小胶质细胞[31]。分析中包括iPSC-IMR90[27](iKC的干细胞源)、BMDM[28]和pKC(阳性对照)。基于主成分分析(PCA)，与iPSC和BMDM以及小胶质细胞、

和

(图4A)相比，iKC和pKC分为不同的组。这通过所述样本的层次聚类得到证实，表明iKC与pKC聚类在一块，而不是与iPSC、BMDM或非肝脏巨噬细胞(图4B)。总体而言，全局基因表达分析表明，iKC的表达模式与pKC相似，但与其他非肝脏

不同。

作为一个集合，先前鉴定为与肝脏特异性

明确相关但与其他非肝脏组织驻留

群体明确无关的基因[34,35]揭示了，与本发明人实验室产生的

相比，iKC表达这些标记物的2至16倍表达(图4C)。在这方面，

被包括，以证明在没有肝脏特异性信号

的情况下的干细胞分化方案不会产生具有与iKC相同功能的细胞。这些结果，与PCA和聚类分析相结合，示出iKC中的不同分子特征与肺泡

或小胶质细胞(图4A、图4B)相比，表明iKC确实表达了肝脏

特异性标记物，而不是其他非肝脏驻留

标记物。总之，微阵列分析揭示了iKC和pKC之间的高度相似性(图4A、图4B和图2A至图2F)，而不是脑或肺中iKC和

或

之间的相似性，表明iKC的肝脏特异性。

本发明人通过基因和蛋白质表达确认了iKC和

之间标记物表达的差异。本发明人报道了三种KC特异性标记物：ID1和ID3以及CLEC-4F在iKC中的表达(图2G、图2H)。在这些标记物中，CLEC-4F是一个关键的标记物，与其他

相比，其在KC中的表达有所不同。因此，本发明人分析了pKC和

在CLEC-4F中的表达是否不同。CLEC-4F在qPCR示出的基因表达水平(图4D)和免疫荧光示出的蛋白质水平(图4E)两者上在iKC中表达，但不在

中表达。iKC中CLEC-4F的基因表达平均为pKC的51％，但由于检测的不同批pKC中CLEC-4F表达的水平不同，因此不显著。这一起示出了iKC的肝脏特异性标记物表达，它与pKC相似但与

不同。

实施例18.结果：iKC的功能与pKC相似但与

不同

本发明人确定了iKC在功能水平上是否与pKC相似并且与

不同。与

相比，KC表现出更高水平的吞噬作用和更低水平的细胞因子产生[37,38]。本发明人检查了iKC和

的吞噬作用的水平是否不同。iKC、pKC和

与荧光珠一起孵育一小时，并使用共聚焦荧光显微镜分析吞噬珠的数量。所有三种细胞类型：iKC、pKC和

都吞噬了珠子(图5A)。与

(42±12％)相比，更高百分比的iKC(82±8％)和pKC(61±7％)吞噬了珠子(图5B)。与

(每个细胞1个珠子)相比，iKC(每个细胞3个珠子)中细胞摄取的珠子的平均数量也更高(图5C)。pKC摄取的珠子的平均数量(每个细胞2个珠子)高于

尽管这种差异没有统计学意义。总体而言，与

相比，iKC，与pKC相似，在执行吞噬作用方面更活跃。

由于肝脏和肠道之间的解剖学联系，KC是暴露于肠源性毒素(包括LPS)的第一种细胞。LPS结合蛋白(LBP)可促进LPS-LBP复合体的形成并与KC上的CD14受体相互作用，其最终导致通过Toll样受体4(TLR4)的信号传导[39]。TLR4信号转导可驱动KC产生一系列促炎性和抗炎性细胞因子和趋化因子[39]；TNFα和IL-6是研究最充分的细胞因子[3,9,40]。为了在体外检查iKC对LPS激活和TNFα和IL-6产生的反应性，本发明人用100ng/ml LPS刺激iKC16小时。pKC和

的处理方式类似。在孵育期结束时收集培养基并分析形态变化和细胞因子产生。LPS激活在iKC中诱导了从圆形到扁平和伸展的典型形态变化(图5D，上子图)。这种形态变化类似于

(图5D，下子图)。LPS激活诱导了iKC中IL-6产量增加35倍(图5E)。重要的是，iKC中的诱导倍数与pKC的诱导倍数范围相同(25倍)。iKC和pKC中的IL-6水平之间在基础水平(无LPS处理)和LPS诱导水平(基础iKC和pKC分别为148和139pg/百万细胞/24小时；LPS处理：iKC和pKC分别为5260和3420pg/百万细胞/24小时)方面没有观察到显著差异。pHep中的IL-6产生低于可检测水平。iKC示出用LPS处理后TNFα产生增加(图5E)。iKC中TNFα产生的增加倍数(33倍)与pKC中的增加倍数(35倍)相似。LPS激活后pHep中TNFα产生低于可检测水平。与pKC和iKC相比，

显示出更高水平的LPS诱导的IL-6和TNFα产生(IL-6：103倍，TNFα：>1000倍；由于无法检测到未经LPS处理的水平，因此未报告确切的倍数诱导值，图5E)。总之，iKC示出LPS诱导的细胞因子产生增加，其水平与pKC相似，与

相比，这些水平要低得多，这证实iKC确实表现出类似KC的功能。

实施例19.结果：类似于pKC，iKC可以与肝细胞共培养以用于功能性体外肝模型

本发明人研究了iKC是否可以在不损害任何一种细胞类型的功能的情况下与肝细胞共培养。如图6A所示建立pHep和iKC/pKC的共培养物。细胞接种完成后24小时被视为共培养的第1天，在此添加最佳共培养基并保持细胞用于后续检测。当模型用于诸如药物测试的应用时，治疗将在第2天开始，并且测定在第3-5天进行，这取决于治疗的持续时间(通常进行24-72小时)。

在共培养中保持肝细胞和KC两者的功能是至关重要的。由于肝细胞和KC对培养基的要求不同，本发明人首先优化了共培养的培养基条件。地塞米松(Dex)对肝细胞活力和代谢活动很重要[29]，但不利于KC功能，尤其是细胞因子的产生[9]。用于肝细胞的典型基础培养基是William E培养基，而制造商推荐的用于KC的基础培养基是高级DMEM。本发明人在单培养物和共培养物中测试了推荐的基于高级DMEM的培养基，称为培养基A、含和不含Dex的William E培养基。所有其他培养基成分都相同。在pHep的单培养物和pHep-pKC的共培养物两者中，在CYP1A2、CYP3A4和CYP2B6(它们是肝细胞功能的关键标记物)基础活性方面，不含Dex的William E培养基优于培养基A(图6B)。在共培养物中，在培养基A与不含Dex的William E培养基中用CYP特异性底物处理后的代谢物产生分别为3.3±1.05与9.7±2.1(CYP1A2)、1.1±0.3与2.9±0.3(CYP3A4)和2.8±1.2与10.9±2.8(CYP2B6)pmol/min/百万细胞。虽然CYP1A2和CYP3A4活性在含有Dex的培养基中略高，但在含有和不含Dex的培养基中代谢物产生的差异没有统计学意义(图9A)，表明从培养基中去除Dex不会显著损害肝细胞功能。当pKC在不含Dex的William E培养基中培养时，与新鲜解冻的pKC相比，

标记物和KC特异性标记物表达在第5天保持或改善(图6C)。与新鲜pKC相比，CD14、CD68、CD163、CD11和CD32的

标记物表达分别为18.1±0.3、3.1±1.7、1.7±3.3、3.3±0.9和1.2±0.2倍。与新鲜pKC相比，KC特异性标记物ID1、ID3和CLEC-4F的表达分别为11.1±3.1、2.8±0.7和5.5±3.2倍。这些结果表明，不含Dex的William E培养基是保持两种细胞类型的功能的最佳培养基，并用于后续实验。

为了确定iKC是否可以与pHep共培养，本发明人分析了与iKC共培养时的pHep功能，并将它们与第5天的pHep-pKC共培养物进行了比较(图6D)。CYP3A4和CYP2C19的基因表达相对于第1天的表达水平进行归一化。在pHep-iKC共培养中第5天CYP3A4上调2.4倍，CYP2C19上调4.7倍，这表明CYP功能在第1天和第5天之间没有下降甚至改善。倍数上调与pHep-pKC共培养物相似(CYP3A4为2.8倍，CYP2C19为9.5倍)。在pHep-pKC和pHep-iKC共培养物中，第5天的白蛋白产生分别为1.6±0.4和1.7±0.01pg/细胞/24小时。仔细检查后，在pHep-pKC、pHep-iKC共培养物和pHep单培养物中，在第1、3和5天之间没有观察到CYP基因表达和白蛋白功能的显著下降(图9B)。与新鲜pKC相比，iKC中CD14、CD68、CD163、CD11和CD32的

标记物表达为0.7-6.1倍，KC特异性标记物表达为5.3±2.7(ID1)、1.9±0.4(ID3)和1.1±0.1倍(CLEC-4F)(图6E)。这些结果证实：1)在pHep培养物中加入KC是无害的，并且可以进一步提高肝细胞和KC两者的功能；以及2)iKC可以在与肝细胞的共培养物中作为pKC的替代细胞源。

实施例20.结果：当用于炎性共培养物模型时，iKC中的毒性反应与iKC相似但与

不同

本发明人分析了iKC是否可用于肝脏模型以检测炎症相关的肝毒性。pKC、iKC和

与pHep共培养并与pHep单培养物进行比较。用内毒素(LPS，以模拟炎症)和范式肝毒物制剂对乙酰氨基酚(APAP)处理单培养物和共培养物24小时；并测量细胞活力(图6F至图6H)。细胞活力被定量为与载体对照(DMSO)相比的活细胞百分比。与单培养物对照相比，在pHep-pKC(图6F)和pHep-iKC(图6G)的共培养物中观察到更高的细胞死亡，表现为毒性曲线向左的典型偏移。pHep-pKC和pHep-iKC共培养物的IC₅₀分别为12.5mM和25mM，而单培养物的IC₅₀为45mM。在

共培养物和pHep单培养物之间没有观察到细胞死亡的差异(图6H)。这些结果表明，与单培养物相比，pHep-KC共培养物代表了更敏感的肝毒性测试模型。在本发明人的研究中产生的iKC可以重现pKC与pHep共培养时显示的反应。

不能在共培养物中模仿这种反应。当细胞用曲伐沙星处理时观察到类似的趋势(图6I至图6K)。与单培养物对照相比，在pHep-pKC(图6I)和pHep-iKC(图6J)的共培养物中观察到更高的细胞死亡，这在高于50μM的浓度下更为明显。当细胞用100μM的曲伐沙星处理时，pHep-pKC和pHep-iKC共培养物中的细胞活力分别为53.8％和55.8％，而单培养物中73.8％的肝细胞是活的。在单培养物和

共培养物之间没有观察到细胞活力的差异(图6K)。

总体而言，与pKC类似，与肝细胞单培养物相比，与肝细胞共培养的iKC对范式肝毒物显示出不同的毒性反应。在与

共培养的肝细胞中未观察到这种差异。因此，iKC是作为炎性条件下肝毒性测试的细胞源的pKC的合适替代品。

实施例21.结果：iKC可以与iHep共同培养用于肝毒性测试的供体匹配的炎性模型

肝细胞和KC的供体匹配细胞源对于避免在与供体错配的肝细胞一起培养时由KC引起的背景反应很重要[9]。这种背景反应涉及被激活的免疫细胞，即使在没有具体刺激物(如内毒素)的情况下，也会影响模型的特异性。尽管这种错配诱导的反应通常涉及淋巴细胞或自然杀伤细胞的识别，但本发明人研究了供体匹配的细胞源是否对肝细胞-KC共培养物很重要。本发明人的数据显示，在pHep-pKC(来自不同供体的原代人肝细胞和KC)的供体错配共培养物中，细胞因子的产生(IL-6和TNFα)也会升高，甚至在没有内毒素处理的情况下(图7A)。供体匹配的共培养物(来自相同的iPSC源的肝细胞和KC)没有显示出这种细胞因子升高(图7A)。甚至在加入LPS后，pHep单培养物也没有显示出任何内毒素刺激，这表明供体错配的共培养物中的细胞因子水平升高是由于KC反应。先前的报道支持了供体错配培养物中细胞因子产生的增加[41]。由于KC产生的细胞因子会影响肝细胞功能[42]，因此在没有任何刺激的情况下避免供体错配共培养物中的背景激活非常重要。因此，供体匹配的共培养物对于肝毒性和肝脏疾病建模很重要。

为了产生供体匹配的干细胞衍生的肝细胞和KC共培养物模型，本发明人将iPSC(IMR90)衍生肝细胞(iHep)与来自相同的iPSC-IMR90系的iKC共培养(图7B)。除了脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)外，与iHep单培养物相比，iHep-iKC共培养物中关键肝脏标记物的基因表达上调了2.4-10.8倍，这表明与iKC共培养有助于改善iHep功能(图7C)。除了CD14和CD11外，与iKC单培养物相比，当与iHep共培养时，iKC中的

标记物和KC特异性标记物的基因表达分别高1.2-1.7倍和6.9-18.1倍(图7D)。因此，iHep和iKC可以在供体匹配的模型中共培养，从而可以保持或改善单个细胞类型的功能。

将所述供体匹配的共培养物模型(iHep-iKC)进一步用APAP处理并测量细胞活力。在没有LPS激活的情况下，单培养物和供体匹配的共培养物之间没有显著差异(图7E)，这表明背景串扰最小。这与pHep-pKC和pHep-iKC的供体错配的共培养物形成对比(图6F和图7G)，其中甚至在不添加LPS的情况下，在共培养物中也能观察到反应。与单培养物(IC₅₀：54mM)相比，仅在添加LPS(IC₅₀：27mM)后，才在供体匹配的iHep-iKC中观察到细胞活力的变化(图7E)。这表明供体匹配的模型更具特异性，并且使得在供体错配的共培养物中观察到的背景反应最小化。当使用

代替iKC与IMR90衍生的肝细胞共培养时，未观察到细胞活力或IC₅₀的差异(图7F)，这表明该模型需要iKC而不仅仅是任何

样细胞。本发明人还在与阳性化合物APAP相似的条件下测试了阴性化合物左氧氟沙星。原代和干细胞两者衍生的培养物在肝细胞和iKC的单培养物和共培养物中都显示出超过90％的细胞活力(图9C、图9D)，这表明剂量响应的差异对肝毒物具有特异性。

总的来说，这些结果表明，1)使用iKC和iHep成功建立了供体匹配的共培养物模型。在共培养物中，两种细胞类型的性能都得到了保持或改善；2)与供体错配的培养物相比，供体匹配的共培养物模型显示出较少的背景反应；以及3)剂量响应对iKC(

没有显示出类似的响应)和范式阳性肝毒物(用无毒化合物未观察到毒性)具有特异性。

实施例22.结果：iHep-iKC共培养物可用于模拟胆汁淤积

KC已被证明与胆汁淤积的发病机制有关[43]。胆管结扎的体内胆汁淤积模型已被用于证明功能活性的变化，例如KC中细胞因子分泌升高[43]。KC中细胞因子的产生反过来会影响肝细胞中转运体的表达[42]。pHep和非实质细胞的体外共培养显示胆汁酸积累和胆汁转运体的下调[4]。为了确定iHep-iKC共培养物模型是否可用于研究具体肝脏疾病诸如胆汁淤积、范式胆汁淤积诱导化合物，添加CPZ以激活iHep-iKC共培养物。与未处理的对照相比，IL-6和TNFα的产生分别增加了4.5和6.5倍(图7G)。观察到显著的胆汁酸积累，这表明胆汁酸转运受损，这是胆汁淤积的关键事件(图7H、图7I)。胆盐输出泵(BSEP)的mRNA表达同时下降：0.3±0.1倍，多药耐药性(MDR1)同时下降：0.4±0.2倍和多药耐药相关蛋白1(MRP1)同时下降：0.5±0.2倍(图7J)，这暗示了积累的潜在机制[44,45]。胆汁酸积累、细胞因子产生和转运体基因表达减少仅在共培养物中观察到，而在单培养物中未观察到(图7G、图7I、图7J)。这些结果表明iHep-iKC共培养物模型可以在体外重现胆汁淤积病理，并且可能适用于研究潜在的疾病机制并有助于抗胆汁淤积药物的筛选。

实施例23.讨论

这里首次报道了从干细胞(iKC)生成成熟的、功能性的人KC的方法。iKC将成为开发可模拟肝脏的基础和炎性状态的炎性体外模型的重要工具。本发明人的结果表明，与pKC相似，iKC表现出与

不同的

样和KC特异性标记物和功能。与单培养物相比，使用这些iKC建立的肝细胞共培养物模型显示对范式肝毒物制剂和范式胆汁淤积制剂的不同反应。

KC的起源存在争议。基于单核吞噬细胞系统[17]，一个基本和普遍的观念是组织驻留的

源自BMDM。相比之下，最近的几项研究报道，许多组织驻留的

群，包括KC，在发育过程中源自胚胎前体，并通过自我更新来保持自身[19-21]。最近的研究表明，干细胞衍生的

和MYB独立的组织驻留

之间存在共同的个体发生[23]。基于这些证据，在本发明人的研究中，干细胞衍生的

产生的组织特异性

(在这种情况下，肝脏特异性

即KC)模拟了发育的自然步骤。

该iKC分化方案的一个重要优势是，在

后，iKC可以每周从相同的培养物中产生。本发明人和之前的报道[26]已经表明这些培养物可以保持数月，因此也可以长时间产生iKC，而不是从每批的初始干细胞源重新开始分化过程。这可以节省相当于每批KC分化的三周的时间和成本，因为从iPSC产生

需要三周。这使得每批干细胞培养物的iKC产量高。例如，如果在6个孔中接种60万个iPSC(12个EB；每个EB 1.2×10⁴个iPSC＝每孔10万个iPSC)，每周可以从6个孔(每孔20万个

)中产生120万个

万个iKC(约80％的分化效率)。在连续8周的连续单核细胞生成后，可以从相同的培养物中累积产生960万个

万个iKC。该比率与之前的报道一致，其中

在培养物中持续产生[26]。如果不能连续产生

则在上述实施例中接种的60万个iPSC将产生120万个

万个iKC，并且必须建立新的培养物以重新开始分化过程。

本发明人将iKC的标记物表达和功能活性与文献中报道的进行了比较。CD14、CD11、CD32、CD68和CD163已被用作人KC的标记物[33]。本发明人的基因表达分析表明iKC表达的CD14、CD32和CD163的水平与pKC相似。CD68和CD11表达低于pKC。据报道，人肝脏中的CD14⁺KC可分为CD32⁺、CD68⁺和CD11⁺亚群，CD11^-CD32⁺细胞可能代表驻留肝脏KC[33]。这可能解释了本发明人的iKC培养物中CD11表达水平较低的原因。据报道，KC中LPS刺激后的TNFα产生为4000pg/ml[46]；在本发明人的研究中，iKC产生了10,000pg/ml的TNFα。据报道TNFα的诱导倍数(通过比较LPS刺激前后的细胞因子水平进行计算)分别为5倍[47]和10倍[48]。在本发明人的研究中，pKC和iKC的这种诱导倍数分别为35倍和33倍。据报道，LPS刺激后的IL-6产生为800pg/ml[46]，而诱导倍数据报道为34倍[47]和5倍[48]。在本发明人的研究中，LPS刺激后的IL-6产生为2018p g/ml和5200pg/ml，pKC和iKC的诱导倍数分别为25倍和35倍。这些细胞因子产生的比较表明，iKC产生的细胞因子水平与报道的值和pKC相似。关于KC和

之间功能性差异的报道表明，与其他

相比，KC显示出更高水平的吞噬作用和更低水平的细胞因子产生。[37,38]本研究中开发的iKC，与pKC类似，与

相比，LPS刺激后产生低水平的IL-6和TNFα(IL-6：iKC-35倍，pKC-25倍和

倍；TNFα：iKC-33倍，pKC-35倍和

倍；图4F)和更高水平的吞噬作用。

先前的报道表明，当与KC和细胞因子共培养时，肝细胞中CYP的表达和活性受到抑制[49,50]。使用动物细胞的肝细胞和KC的共培养物[9]表明了，在内毒素刺激存在的情况下施用范式肝毒物制剂增加了模型的敏感性，即在较低浓度下检测到肝毒性，表现为典型的剂量响应曲线的左移。这并不奇怪，因为肝毒性药物可以激活KC[51]，从而反过来影响肝细胞的功能[52]。然而，在人类肝脏模型中进行此类研究的报道是有限的。来自公司如Hepregen和Life Technologies的简要报道表明，人肝细胞/KC共培养物和肝细胞单培养物之间的毒性反应存在差异[47,53]。在本发明人的研究中开发的肝细胞和iKC的共培养物表明，当培养物用APAP和曲伐沙星处理时，剂量反应曲线左移。有趣的是，在pHep和pKC的共培养物中，即使未将LPS添加到培养物中也观察到这种偏移。一种可能的解释是，甚至在没有LPS处理的情况下，来自不同供体(错配的供体：pHep和pKC)的细胞的共培养物也可能激活KC[9]。本发明人来自供体匹配的共培养物(肝细胞和KC两者来自iPSC-IMR90；图7)的结果进一步支持了这一点，其中仅当LPS添加到系统中时才观察到左移。由于供体匹配的原代细胞的可用性有限，使用iKC将提供这样的额外优势，即从相同的干细胞源获得肝细胞和KC两者。这种供体匹配的细胞可能有助于未来在个性化医疗中的潜在应用。

iPSC作为原代细胞的可再生替代细胞源是有用的，并允许研究其生物学和应用如细胞治疗和药物测试。使用iPSC衍生细胞的主要瓶颈是它们通常保留未成熟的表型。虽然多个实验室先前的工作已经证明了从iPSC产生不同细胞谱系的能力，但获得成熟的成人样细胞仍然是该领域的主要挑战。iPSC衍生的细胞，包括β细胞[15]、树突细胞[14]、肺细胞[12]、心肌细胞[16]和肝细胞[13]，显示出未成熟的或胎儿的表型。这些未成熟的细胞可能有助于研究未成熟的人组织，但它们在需要成熟的成人样细胞的应用中的使用仍然受限。在本发明人的研究中产生的iKC不仅是功能性的而且还是成熟的，正如它们与商业获得的成人pKC的相似性所描述的那样。这允许将这些细胞用于需要成熟表型的研究。

实施例24.结论

本发明人已经证明，本研究中产生的iKC在功能上胜任并且与pKC相似。iKC代表了人KC的一种新的可再生细胞源，并允许将这种细胞用于人类体外炎性肝模型，从而用于肝毒性测试和肝脏疾病(如胆汁淤积)研究。iKC的应用可以进一步扩展到开发其他炎症相关的肝脏疾病诸如肝纤维化和肝细胞癌的模型以及个性化医疗。

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在本文件及其权利要求中，动词“包括”及其变体以其非限制性意义使用以表示包括该词之后的项目，但不排除未具体提及的项目。此外，不定冠词“a”或“an”对元素的引用并不排除存在多于一个元素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个元素。因此，不定冠词“a”或“an”通常表示“至少一个”。

本文件中提及的每项申请和专利，以及上述每项申请和专利中引用或参考的每份文件，包括在每项申请和专利的审查期间(“申请引用文件”)，以及对于每项申请和专利以及在任何申请引用的文件中引用或提及的任何产品的任何制造商的说明或目录，在此通过引用并入本文。此外，本文中引用的所有文件，本文中引用的文件中引用或参考的所有文件，以及本文中引用或提及的任何产品的任何制造商的说明或目录，均通过引用并入本文。

在不背离本发明的范围和精神的情况下，对本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员来说将是明显的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应被过度地限制于这些特定的实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员来说明显的用于实施本发明的所述模式的各种修改都旨在权利要求的范围内。

Claims (16)

1.一种产生iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)的方法，包括以下步骤：

(a)提供源自诱导多能干细胞(iPSC)的巨噬细胞前体

(b)在存在肝脏信号的情况下培养所述巨噬细胞前体

以及

(c)从中获得iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)；

其中，所述iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)显示出原代库普弗细胞优选原代成人KC(pKC)的生物学特性。

2.根据权利要求1的方法，其中，所述肝脏信号包括暴露于原代人肝细胞条件培养基(PHCM)和高级DMEM，优选在原代人肝细胞条件培养基(PHCM)和高级DMEM中培养。

3.根据权利要求1或2的方法，其中，所述生物学特性选自：

(a)巨噬细胞标记物的表达；

(b)吞噬作用；

(c)激活后炎性细胞因子、生长因子或活性氧物质的释放；或者

(d)刺激后IL-6和TNFα的分泌，优选用LPS刺激。

4.根据权利要求3的方法，其中，所述生物学活性包括表达巨噬细胞标记物，并且：

(a)所述巨噬细胞标记物选自：CD11(GenBank登录号NM_000632.3)、CD14(GenBank登录号NM_001174105.1)、CD68(GenBank登录号NM_001251.2)、CD163(GenBank登录号NM_203416.3)和CD32(GenBank登录号NM_001136219.1)；或者

(b)所述巨噬细胞标记物选自：CLEC-4F(GenBank登录号NM_173535.2)、ID1(GenBank登录号NM_181353.2)和ID3(GenBank登录号NM_002167.4)。

5.根据任一项前述权利要求的方法，其中，所述巨噬细胞前体

通过以下方式源自诱导多能干细胞(iPSC)：

(a)培养所述诱导多能干细胞(iPSC)以产生胚状体(EB)；以及

(b)培养所述胚状体(EB)以产生巨噬细胞前体

细胞。

6.根据权利要求5的方法，其中，步骤(a)包括暴露于以下情况并优选在存在以下的情况下进行培养：优选50ng/mL的骨形态发生蛋白-4(BMP-4，GenBank登录号Q53XC5)，优选50ng/mL的血管内皮生长因子(VEGF，GenBank登录号NP_001165097)，优选20ng/mL的干细胞因子(SCF，GenBank登录号P21583.1)，优选10μM的ROCK抑制剂。

7.根据权利要求5或6的方法，其中，步骤(b)包括暴露于以下情况并优选在存在以下的情况下进行培养：优选100ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，GenBank登录号P09603)，优选25ng/mL的白细胞介素-3(IL-3，GenBank登录号AAC08706)，优选2mM的glutamax，优选0.055mM的β-巯基乙醇。

8.根据任一项前述权利要求的方法，其中，所述诱导多能干细胞(iPSC)是MYB独立的iPSC。

9.根据任一项前述权利要求的方法获得的iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)。

10.根据权利要求9的iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)与肝细胞例如原代人肝细胞(pHEP)或iPSC衍生的肝细胞(iHep)的结合物例如共培养物，优选其中所述肝细胞是供体匹配的，优选来自相同的干细胞源。

11.根据权利要求9的iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)或根据权利要求10的结合物或共培养物在确定药物的肝毒性的方法中的用途，所述药物优选选自：炎症相关药物、对乙酰氨基酚、曲伐沙星和氯丙嗪。

12.根据权利要求9的iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)或根据权利要求10的结合物或共培养物作为用于疾病或病症的模型的用途。

13.根据权利要求12的用途，其中，所述疾病或病症选自：肝损伤、药物性肝损伤(DILI)、肝脏疾病、脂肪性肝炎、胆汁淤积、肝纤维化和病毒性肝炎。

14.根据权利要求9的iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)，其用于治疗或预防疾病或病症例如肝脏疾病或病症的方法中，所述疾病或病症优选选自：肝损伤、药物性肝损伤(DILI)、肝脏疾病、脂肪性肝炎、胆汁淤积、肝纤维化和病毒性肝炎。

15.根据权利要求9的iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)在制备用于治疗或预防疾病或病症例如肝脏疾病或病症的药物中的用途，所述疾病或病症优选选自：肝损伤、药物性肝损伤(DILI)、肝脏疾病、脂肪性肝炎、胆汁淤积、肝纤维化和病毒性肝炎。

16.一种治疗或预防疾病或病症例如肝脏疾病或病症的方法，所述疾病或病症优选选自：肝损伤、药物性肝损伤(DILI)、肝脏疾病、脂肪性肝炎、胆汁淤积、肝纤维化和病毒性肝炎，其中所述方法包括向需要这种治疗的患者施用或移植根据权利要求9的iPSC衍生的库普弗细胞(iKC)。

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