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CN113307871B - 新型抗cd19抗体和cd19-car-t细胞的制备及其应用 - Google Patents

新型抗cd19抗体和cd19-car-t细胞的制备及其应用 Download PDF

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CN113307871B CN202010125005.2A CN202010125005A CN113307871B CN 113307871 B CN113307871 B CN 113307871B CN 202010125005 A CN202010125005 A CN 202010125005A CN 113307871 B CN113307871 B CN 113307871B
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Fuzhou Tuoxin Tiancheng Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种新型抗CD19抗体和CD19‑CAR‑T细胞的制备及其应用。具体地，本发明提供了一种CD19抗体，所述抗体靶向第一外显子缺失的CD19分子，可以用于复发性，耐药性肿瘤的治疗和检测。本发明还提供了包含该新型CD19特异性的CAR‑T细胞，及其制备方法和应用。

Description

新型抗CD19抗体和CD19-CAR-T细胞的制备及其应用
技术领域
本发明涉及药物领域，更具体地涉及新型
抗CD19抗体和CD19-CAR-T细胞的制备及其应用。
背景技术
B细胞包括前B细胞、早期发育的B细胞和成熟B细胞等。成熟B细胞通过末端分化成为浆细胞和恶性B细胞。大多数的前B急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、非霍奇金氏恶性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、普通急性淋巴细胞白血病和一些非急性淋巴母细胞性白血病都高表达CD19。在浆细胞上的CD19的表达进一步说明其可在不同的B细胞瘤例如多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、华氏瘤上表达。因此CD19被认为是多种血液肿瘤的靶标。
在现有的CD19抗体和CD19-CAR-T细胞治疗白血病或淋巴瘤中，常常由于CD19抗原片段丢失使得靶抗原完全或部分缺失，导致病人治疗后白血病复发。此外，现有的CD19-CAR-T细胞治疗中，在CAR结构被错误导入肿瘤细胞的情况下，可以导致肿瘤细胞上表达抗CD19的CAR，通过CAR结构成分中的scFV结合肿瘤自身的CD19分子，进而屏蔽肿瘤的CD19分子，使得肿瘤细胞不再能够被CD19-CAR-T细胞上同一结构的scFV所识别，导致肿瘤细胞不能被杀灭最终治疗失败。
因此，本领域迫切需要开发可以识别CD19不同表位，避免脱靶的新型抗CD19抗体以及包含该抗体的CD19-CAR-T细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供针对复发性肿瘤的CD19抗体和CD19-CAR-T细胞及其制备和应用。
在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.:1所示的CDR1，
SEQ ID NO.:2所示的CDR2，和
SEQ ID NO.:3所示的CDR3；
或者，
SEQ ID NO.:9所示的CDR1，
SEQ ID NO.:10所示的CDR2，和
SEQ ID NO.:11所示的CDR3；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD19结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:7所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.:15所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有本发明第一方面所述的重链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
在本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
或者，
SEQ ID NO.:4所示的CDR1’，
SEQ ID NO.:5所示的CDR2’，和
SEQ ID NO.:6所示的CDR3’；
或者，
SEQ ID NO.:12所示的CDR1’，
SEQ ID NO.:13所示的CDR2’，和
SEQ ID NO.:14所示的CDR3’；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD19结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.:8所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述轻链可变区具有SEQ ID NO.:16所示的氨基酸序列。
在本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有本发明第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)本发明第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)本发明第三方面所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：本发明第二方面所述的重链；和/或本发明第四方面所述的轻链。
在另一优选例中，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述人源化抗体的CDR区包含1、2、或3个氨基酸的变化。
在另一优选例中，所述的动物为非人哺乳动物，较佳地为鼠、羊、兔。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，较佳地为20％，更佳地为10％。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-7个，较佳地为1-3个，更佳地为1个。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代的至少一个氨基酸序列为同源性为至少80％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的衍生序列具有抑制细胞表面CD19或重组CD19蛋白的功能。
在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物形式。
在另一优选例中，所述衍生序列对CD19的亲和力KD为0.01nM-1nM，较佳地为0.02nM-0.1nM。
在另一优选例中，如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体靶向第一外显子缺失的CD19分子(不与CD19的第一外显子对应的表位结合)。
本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
本发明的第七方面，提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的单克隆抗体抗原结合区域的scFV段为特异性结合于CD19的结合区，并且所述scFv具有如本发明第一方面所述的重链可变区和如本发明第三方面所述的轻链可变区。
本发明的第八方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明第七方面所述的CAR构建物。
在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述免疫细胞是离体的。
在另一优选例中，所述免疫细胞为自体的。
在另一优选例中，所述免疫细胞为非自体的。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在另一优选例中，所述免疫细胞来自灵长目动物(优选为人)。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：
(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；
(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)；或
(iii)外源T细胞受体(TCR)T细胞(TCR-T细胞)
在另一优选例中，所述的免疫细胞包括：NK细胞、T细胞、NKT细胞、(γδ)T细胞、单核细胞、或巨噬细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞为CD19-CAR-T细胞
本发明的第九方面，提供了一种免疫偶联物，所述的免疫偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中，所述的药物为细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。
特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(vinca alkaloids)、或其组合。
在另一优选例中，所述的毒素选自下组：
耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述的可检测标记物选自下组：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、任何形式的纳米颗粒等。
在另一优选例中，所述的酶包括前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))。
在另一优选例中，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133 Yb-169、Yb-177、或其组合。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物为抗体药物偶联物。
在另一优选例中，所述的抗体药物偶联物如下分子式所示：
Figure BDA0002394143980000061
其中：
Ab是抗CD19的抗体，
LU是接头；
D是药物；
而且下标p是选自1-10，较佳地1-8的值。
在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或连接子进行偶联。
本发明的第十方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：本发明第一方面所述的重链可变区、本发明第二方面所述的重链、本发明第三方面所述的轻链可变区、本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的重组蛋白、本发明第八方面所述的免疫细胞、本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、或其组合，所述活性成分用于(a)制备检测试剂、检测板或试剂盒；(b)制备特异性靶向表达CD19的肿瘤细胞的药物；和/或(c)用于制备嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
在另一优选例中，所述检测试剂、检测板或试剂盒用于：
(1)检测样品中的CD19蛋白；和/或
(2)检测肿瘤细胞中内源性的CD19蛋白；和/或
(3)检测表达CD19蛋白的肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的检测试剂、检测板或试剂盒用于诊断表达CD19的肿瘤。
在另一优选例中，所述的药物用于治疗或预防表达CD19的肿瘤、肿瘤迁移、或肿瘤耐药。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括实体瘤、血液癌。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括复发性肿瘤，较佳地为经CAR-T细胞治疗后复发的肿瘤，如复发的血液源性肿瘤。
在另一优选例中，所述的表达CD19的肿瘤选自下组：膀胱癌、胆道癌、脑癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、颈癌、肾癌、唾液癌、胸腺上皮癌、甲状腺癌、卵巢癌、前列腺癌、直肠癌、脑胶质瘤、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤为耐药性肿瘤。
本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：本发明第一方面所述的重链可变区、本发明第二方面所述的重链、本发明第三方面所述的轻链可变区、本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的重组蛋白、本发明第八方面所述的免疫细胞、本发明第九方面所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
本发明的第十二方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)本发明第一方面所述的重链可变区、本发明第二方面所述的重链、本发明第三方面所述的轻链可变区、本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体；或
(2)本发明第六方面所述的重组蛋白；
(3)本发明第七方面所述的CAR构建物。
在另一优选例中，编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.：17或序列表SEQ ID NO.：19所示。
在另一优选例中，编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.：18或序列表SEQ ID NO.：20所示。
本发明的第十三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第十二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明的第十四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第十三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第十二方面所述的多核苷酸。
本发明的第十五方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中CD19的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与本发明第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在CD19。
本发明的第十六方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有本发明第五方面所述的抗体或本发明第九方面所述的免疫偶联物。
本发明的第十七方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明第五方面所述的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明第五方面所述的抗体的二抗；
或者，所述试剂盒含有本发明第十六方面所述的检测板。
本发明的第十八方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养本发明第十四方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白。
本发明的第十九方面，提供了一种治疗表达CD19的肿瘤的方法，所述方法包括：给需要的对象施用本发明第五方面所述的抗体、所述抗体的抗体-药物偶联物、或表达所述抗体的CAR-T细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述的方法还包括：给需要的对象施用其他药物或治疗方法进行联合治疗。
在另一优选例中，所述的其他药物或治疗方法包括：抗肿瘤免疫治疗药物、肿瘤靶向药物、肿瘤化疗药物、肿瘤放射治疗。
在另一优选例中，所述的抗肿瘤免疫治疗药物包括PD-1、PD-L1单抗。
在本发明的第二十方面，提供了一种制备嵌合抗体的方法，包括步骤：
将本发明第一方面所述的重链可变区和/或本发明第三方面所述的轻链可变区的核苷酸序列克隆入含有人抗体恒定区的核苷酸序列的表达载体后，通过转染动物细胞表达人-鼠嵌合抗体。
在本发明的第二十一方面，提供了一种制备人源化抗体的方法，包括步骤：
将本发明第一方面所述的重链可变区和/或本发明第三方面所述的轻链可变区中的CDR区的核苷酸序列植入含人源抗体FR区的核苷酸序列模板，再将其克隆入含有人抗体恒定区的表达载体后，通过转染动物细胞表达人源化抗体。
在本发明的第二十二方面，提供了一种抑制肿瘤细胞生长和迁移的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第五方面所述的抗体、所述抗体的抗体-药物偶联物、或表达所述抗体的CAR-T细胞、或其组合。
在本发明的第二十三方面，提供了一种抑制肿瘤在模型动物体内生长的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第五方面所述的抗体、所述抗体的抗体-药物偶联物、或表达所述抗体的CAR-T细胞。
在另一优选例中，所述药物可以实施单独给药，或组合用药包括肿瘤免疫疗法、肿瘤靶向药物、细胞毒性药物、放射治疗。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了小鼠经过3次免疫后，血清中已产生抗第一外显子缺失的CD19(hCD19-D-mFc)抗体。
图2显示了HG27抗体、HG28抗体和抗全长CD19抗体均可结合293FT/hCD19-F细胞。
图3显示了HG27抗体和HG28抗体能够与CD19-DhFc融合蛋白(第一外显子缺失的CD19和人源Fc片段融合)结合，而CD19抗体(HIB19)则不能和CD19-DhFc融合蛋白结合。
图4显示HG27抗体和HG28抗体与人CD19抗体(HIB19)不存在竞争结合(图4上)，二者结合的抗原表位不同。而HG27和HG28相互竞争结合同一抗原表位(图4下)。
图5显示将CAR-T细胞与3种靶细胞按不同效靶比孵育，结果表明G27 CAR-T和HG28CAR-T细胞与已有的CD19抗体克隆来源的CAR-T细胞(CD19-CAR-T)具有同等效力的杀伤能力。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种新的抗CD19抗体以及包含该抗体的CD19-CAR。与现有抗体相比，本发明的抗体识别CD19不同表位，靶向第一外显子缺失的CD19分子。根据活性测试结果，本发明的抗体能够高特异性地结合CD19抗原，其KD分别为9.32×10-2nM、2.09×10-2nM，具有显著的抗肿瘤活性，可以用于复发性，耐药性肿瘤的治疗和检测。
术语
如本文所用，术语“结合物”是指能够与靶点结合的可溶性受体或其片段或其类似物，或抗体或其片段或其类似物。
如本文所用，术语“CD19结合物”、“CD19抗体”、“抗CD19抗体”、“本发明抗体”具有相同含义，是指能特异性识别CD19并与CD19结合的抗体或其片段或其类似物。
如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括CD19结合物与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种CD19结合物及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。
抗体
如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的不同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。IgG代表免疫球蛋白中最重要的一类，由于化学结构和生物功能差异，它又可以分为4个子类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ或λ链。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的FR区(FR)。4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区，即轻链高变区(LCDR),指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区，即重链高变区(HCDR),指HCDR1、HCDR2和HCDR3。发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。天然重链和轻链可变区中的四个FR区大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本文所用，术语“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。
如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指得自单个细胞来源的克隆分泌的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。所述的细胞可能是真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染宿主细胞表达的抗体分子。既保留了亲本鼠抗体的高特异性和亲和力，又使其人源Fc段能有效介导生物学效应功能。
如本文所用，术语“人源化抗体”，是本发明鼠抗的一种可变区改造形式，具有源自(或基本上源自)非人类抗体(优选小鼠单克隆抗体)的CDR区，和基本源自人源抗体序列的FR区和恒定区；即将鼠抗的CDR区序列嫁接到不同类型的人种系抗体构架序列上。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体性质的重组抗体。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个或1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本文中使用的术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”包括细胞介导的反应，其中，表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体后，引起靶细胞裂解。在各个方面，增强ADCC效应子功能可以意指增强的效价或增强的功效。实验背景中使用的“效价”意指当观察特定的治疗功效EC50时抗体的浓度(半最大有效浓度)。实验背景中使用的“功效”意指饱和水平的抗体的最大可能的效应子功能。
本文中使用的术语“ADCP”或“抗体依赖性细胞介导的吞噬作用”包括细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体后引起靶细胞的吞噬作用。
本文中使用的术语“CDC”或“补体依赖性细胞毒性”包括这样的反应，其中，一种或多种补体蛋白质组分识别靶细胞上结合的抗体，之后导致靶细胞的裂解。
本文中使用的术语“效应子功能”包括由抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用导致的生物化学事件。效应子功能包括FcγR介导的效应子功能，例如ADCC和ADCP，和补体介导的效应子功能，例如CDC。
本文中使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”指：包含能够结合抗原的胞外域、跨膜域和使胞质信号传到结构域的多肽(即胞内信号域)，胞内信号域指经由确定的信号传导途径通过产生第二信使而将信息传递到细胞内以调节细胞活性的蛋白质、或通过相应于此类信使而作为效应子发挥作用的蛋白质，包含初级信号域，还可以包括源自下文定义的刺激分子的功能信号传导结构域(即共刺激信号域)。胞内信号域产生可以促进CAR的细胞(例如CAR T细胞)的免疫效应子功能的信号，免疫效应子功能的例子，例如在CART细胞中，包括细胞裂解活性和辅助活性，包括细胞因子分泌。
术语“初级信号域”以刺激性方式调节TCR复合物的初始活化。一方面，初级信号域由例如TCR/CD3复合物与加载了肽的MHC分子的结合而引发，由此介导T细胞反应(包括但不限于，增殖、活化、分化等)。以刺激性方式起作用的初级信号域可以包含免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。在本发明中尤其有用的包含ITAM的初级信号域的例子包括但不限于，源自TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，CD278(也称作“ICOS”)和CD66d的序列，在特例的本发明CAR中，在任何一个或多个本发明CAR中胞内信号传导结构域包含胞内信号传导序列，例如CD3ξ的初级信号域。
术语“共刺激信号域”指“共刺激分子”，为T细胞上的关连结合性配偶体，其特异性结合共刺激配体，由此介导T细胞的共刺激反应，例如，但不限于，增殖。共刺激分子是有效免疫反应所需的、非抗原受体的细胞表面分子或其配体。共刺激分子包括但不限于，MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体、以及OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和CD19(CD137)。
在本发明中，一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域、和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域含有源自刺激分子的功能信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域、和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域含有源自共刺激分子的功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含源自一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR在CAR融合蛋白的氨基酸(ND端)包含可选的前导序列。一方面，CAR在胞外抗原识别结构域的N端还包含前导序列，其中前导序列任选地在CAR的细胞加工和定位至细胞膜的过程中从抗原识别结构域(例如scFv)切下。
本文中术语“CD3ζ”定义为GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质、或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。“CD3ζ结构域”定义为来自ζ链的胞质结构域的氨基酸残基，其足以功能性地传递T细胞活化所需的初始信号。一方面，ζ的胞质结构域包含GenBan登录号BAG36664.1的残基52至164、其功能性直向同源物—来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。
本文中术语“CD19”指TNFR超家族的成员，其具有GenBank Acc.No.AAA62478.2的氨基酸序列、或来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基；“CD19共刺激结构域”定义为GenBank ACC.No.AAA62478.2的氨基酸序列214-255，或来自非分类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。一方面，“CD19共刺激结构域”是SEQ ID NO：35中提供的序列、或来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。
抗CD19抗体
术语“CD19”包括但不限于人CD19的变体、同种型和物种同源物。在某些情况下，本发明的人源化抗体可与人以外的物种的CD19交叉反应。在某些情况下，抗体可以完全对一种或多种人CD19蛋白特异并且可以表现出物种或其它类型的非人交叉反应。示例性的人CD19的完整氨基酸序列具有SwissPort登录号P15391。CD19也被称为B细胞表面抗原B4，B细胞抗原CD19、CD19抗原或Leu-12。人CD19被Entrez Gene称为Gene ID：930，被HGNC称为HGNC：1633。CD19可以被称为CD19的基因编码。本文中“人CD19”的使用涵盖了人CD19的所有已知的或仍未被发现的等位基因和多态形式。
在本发明中，用作免疫抗原的CD19分子是第一外显子缺失的CD19分子，本发明的抗CD19抗体不与CD19分子的第一外显子对应的表位结合。
在现有的CD19抗体和CD19-CAR-T细胞治疗白血病或淋巴瘤中，常常由于CD19抗原片段丢失使得靶抗原完全或部分缺失，导致病人治疗后白血病复发。针对这些复发的机制，本发明提供了新的CD19抗体，设计靶向于CD19分子的新表位，不仅针对原有的CD19分子，同时还可靶向现有CD19抗体和CD19-CAR-T治疗后部分抗原片段缺失的CD19分子，因此，本发明的CAR-T细胞治疗既可以用于治疗原有的ALL/淋巴瘤病人，也可以用于治疗上述现有治疗后复发的病人；
现有的CD19-CAR-T细胞治疗中，在CAR结构被错误导入肿瘤细胞的情况下，可以导致肿瘤细胞上表达抗CD19的CAR，通过CAR结构成分中的scFV结合肿瘤自身的CD19分子，进而屏蔽肿瘤的CD19分子，使得肿瘤细胞不再能够被CD19-CAR-T细胞上同一结构的scFV所识别，导致肿瘤细胞不能被杀灭最终治疗失败。本发明抗体的scFV可以识别CD19的不同表位，其来源的抗体或CAR-T细胞的scFV可以识别被上述被屏蔽的肿瘤细胞，可以用于治疗上述原因导致现有CAR-T细胞治疗失败的病人。
同时，本发明抗CD19抗体或其scFV还可用于检测上述治疗失败病人或治疗后因抗原缺失或调变而复发病人的肿瘤细胞，而这些肿瘤细胞是已有CD19抗体自身所不能识别和检测。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人-动物嵌合抗体、优选为人源化抗体，更优选为全人源化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab’、(Fab’)2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
具体地，本发明提供了鼠源抗体HG27和HG28，抗体HG27包含SEQ ID NO.:1、SEQ IDNO.:2和SEQ ID NO.:3所示的重链可变区，以及SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:5和SEQ IDNO.:6所示的轻链可变区，抗体HG28包含SEQ ID NO.:9、SEQ ID NO.:10和SEQ ID NO.:11所示的重链可变区，以及SEQ ID NO.:12、SEQ ID NO.:13和SEQ ID NO.:14所示的轻链可变区。
本发明的抗体靶向第一外显子缺失的CD19分子，即不与CD19的第一外显子对应的表位结合。
本发明抗体涉及的各氨基酸序列如表1所示
表1
Figure BDA0002394143980000151
Figure BDA0002394143980000161
Figure BDA0002394143980000171
在本发明的另一个方面，本发明提供了结合人CD19的抗体或其片段的变体。因而本发明提供了抗体或其片段，具有与重链或轻链的可变区序列至少80％相同的重链和/或轻链可变区。优选的，重链和/或轻链可变区的氨基酸序列同一性是至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％，特别是96％，更特别97％，甚至更特别98％，最特别99％，包括例如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的氨基酸序列同一性。本文中关于氨基酸序列的同一性或序列中与结合人CD19的人源化抗体或其片段相同的氨基酸残基的百分比。因而，可以通过通常用于比较两条多肽的氨基酸位置相似性的标准方法，来确定序列同一性。使用计算机程序例如BLAST或FASTA，比对两条多肽各自氨基酸的最佳匹配(沿一条或两条序列的全长或者沿一条或两条序列预定的部分)。程序提供了默认的开放罚分和默认的空位罚分，评分矩阵例如PAM250(标准评分矩阵；参见Dayhoff等，in Atlas of Protein Sequence andStructure，第5卷，第三期增补(1978))可与计算机程序结合使用。例如，百分比同一性可计算为：相同匹配的总数乘以100，再除以匹配跨度中较长序列的总长度和为了比对两条序列向较长序列中倒入的空位数。
本发明还提供了结合人CD19的人源化抗体片段，所述片段选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fd、dAb、F(ab’)2、scFv、双特异性单链Fv二聚体、双抗体、三链抗体和与相同或不同抗体遗传融合的scFv。优选的片段是scFv、双特异性单链Fv二聚体和双抗体。本发明还提供了结合人CD19的全长人源化抗体。
核酸、载体和宿主细胞
本发明还提供了编码本发明抗体及其片段的分离的核酸、载体以及包含所述核酸或载体的宿主细胞。核酸可位于完整细胞中、细胞裂解液中或者以部分纯化的或基本纯化的形式。
可以使用标准的分子生物学技术获得本发明的核酸，例如可以通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术，获得编码抗体的轻链和重链或者编码VH和VL区段的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从文库回收编码抗体的一种或多种核酸。向宿主细胞中导入外源核酸的方法是本领域普遍已知的，并可随所使用的宿主细胞而变化。
为了表达蛋白质，可以将编码本发明抗体的核酸整合到表达载体中。多种表达载体可用于蛋白质表达。表达载体可包括自我复制的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。用于本发明的表达载体包括但不限于使蛋白质能够在哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、酵母和体外系统中表达的那些。如本领域已知的，多种表达载体是可商业或其他方式获得的。可用于本发明中来表达抗体。
在优选的实施方式中，编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQ ID NO.：17或序列表SEQ ID NO.：19所示；和/或，编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ ID NO.：18或序列表SEQ ID NO.：20所示。
在更优选的实施方式中，编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQ ID NO.：17所示,且编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ ID NO.：18所示；编码所述重链可变区的核酸如序列表SEQ ID NO.：19所示,且编码所述轻链可变区的核酸如序列表SEQ ID NO.：20所示。
具体地，上述核苷酸序列的编号如表2所示：
表2CD19抗体基因序列编号
克隆号 重链蛋白可变区 轻链蛋白可变区
HG27 17 18
HG28 19 20
制备所述核酸的方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
抗体的制备
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的抗CD19抗体。例如，可以用连接或天然存在的CD19同源二聚体或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。
在本发明中，以第一外显子缺失的人源CD19膜外蛋白和鼠源性Fc片段的融合蛋白作为免疫抗原，产生CD19特异性抗体，筛选所述抗体的生物学活性。生产本发明的抗CD19抗体的示例性方法描述于实施例1。
全人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本发明中，抗体是IgG抗体，使用IgG4亚型。通过用下文实施例中描述的生物学测定筛选抗体易于实现必需恒定结构域序列的最优化，以产生所需生物学活性。
同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本发明的化合物和方法中是可以用的。
人源化本发明的抗CD19抗体的示例性方法描述于实施例3。
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。具体地，宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、CHO-K1、HEK-293细胞。
优选的宿主细胞包括E.coli TG1或BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体)，或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)
本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。
含有抗CD19抗体的嵌合抗原受体T细胞
在另一优选例中，本发明提供多种嵌合抗原受体(CAR)，其中包含经工程化而增强结合CD19蛋白的抗体或抗体片段。在另一优选例中，本发明提供经工程化而表达CAR的细胞(例如T细胞)，其中该CAR T细胞(“CART”)表现出抗肿瘤性质。在另一优选例中，用CAR转化细胞，CAR在细胞表面表达。一些实施案例中，用编码CAR的病毒载体转导细胞(例如T细胞)。在一些实施案例中，病毒载体是慢病毒载体。一些实施方案中，细胞可以稳定地表达CAR。
在另一优选例中，CAR的抗CD19蛋白结合部分是scFv抗体片段。在另一优选例中，该抗体片段是功能性的，由此，与其所来自的IgG抗体相比，其保持等价的亲和结合力，例如其以相当的功效结合相同抗原。在另一优选例中，该抗体片段是功能性的，由此其提供生物化学反应，所述反应可以包括但不限于激活免疫反应、抑制从其靶抗原的信号传导起始、抑制激酶活性等。在另一优选例中，CAR的抗CD19抗原结合结构域是，相对于其所源自的鼠序列scFv被人源化的scFv抗体片段。
在另一优选例中，本发明CAR将特定抗体的抗原结合结构域和胞内信号传导分子组合在一起。例如，一些方面，胞内信号传导分子包括但不限于，CD3ξ链、4-1BB和CD28信号传导模块及其组合。在另一优选例中，本发明提供经工程化而表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)，其中该CAR T细胞(“CART”)表现出抗肿瘤性质。在另一优选例中，CAR的抗原结合结构域包含人源化的抗CD19抗体片段，其包含scFV。因此，本发明提供，经工程化导入T细胞中的，包含人源化抗CD19结合结构域的CD19-CAR，以及将其用于过继免疫治疗的方法。
在另一优选例中，CD19-CAR包含至少一个胞内信号传导结构域，其选择CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ξ信号结构域，及其任何组合。在另一优选例中，CD19-CAR包含至少一个胞内信号传导结构域，其来自一个或多个非CD137(4-1BB)或CD28的共刺激分子。
在另一优选例中，本发明CAR将特定抗体的抗原结合结构域和胞内信号传导分子组合在一起的同时增加了IFNβ表达元件。例如，一些方面，胞内信号传导分子包括但不限于，CD3ξ链、4-1BB和CD28信号传导模块及其组合。在另一优选例中，本发明提供经工程化而表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如T细胞)，其中该CAR T细胞(“CART”)表现出抗肿瘤性质。在另一优选例中，CAR的抗原结合结构域包含人源化的抗CD19抗体片段，其包含scFV。
应用
本发明提供了本发明抗体的用途，例如用于制备诊断制剂、或制备用于预防和/或治疗CD19相关的疾病的药物。所述CD19相关的疾病包括癌症、自身免疫疾病、病毒感染、移植物抗宿主病、炎症性疾病、免疫性疾病、或其组合。其中，所述的癌症包括实体瘤、血液癌，所述的实体瘤选自下组：膀胱癌、胆道癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌、胃癌、神经胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、肾癌、唾液癌、胸腺上皮癌和甲状腺癌、或其组合；所述的自身免疫疾病包括：系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、溃疡性结肠炎、I型糖尿病、银屑病、多发性硬化症、或其组合。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明的药物组合物可直接用于结合CD19蛋白分子，因而可用于预防和治疗CD19相关的疾病。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约100毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的药物组合物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
本发明还提供一种检测过表达CD19蛋白的细胞的方法，包括如下的步骤：上述的蛋白质与待检样品在体外接触，检测上述的蛋白质与所述待检样品的结合即可。
所述的过表达的含义为本领域常规，指CD19蛋白在待检样品中的RNA或蛋白质的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工以及蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达和功能活性提高(如在底物的酶水解作用增加的情况下)。
所述结合的检测方式是本领域常规的检测方式，较佳地为FACS检测。
本发明提供一种检测过表达CD19蛋白的细胞的组合物，其包括上述的蛋白质作为活性成分。较佳地，其还包括上述的蛋白质的功能片段组成的化合物作为活性成分。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的CD19抗体可以靶向现有CD19抗体和CD19-CAR-T细胞治疗后部分抗原片段缺失的CD19分子，可用于复发性白血病的治疗。
(b)本发明的scFV可以识别现有CD19-CAR-T细胞治疗后，部分屏蔽了CD19分子的肿瘤细胞，可以用于治疗上述原因导致的CAR-T细胞治疗失败的患者。
(c)本发明的CD19抗体或其scFV还可用于检测上述治疗失败病人或治疗后因抗原缺失或调变而复发病人的肿瘤细胞。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1抗CD19抗体的制备
(一)免疫小鼠和血清效价测定
选用雌性、8周龄的Balb/c小鼠，将通过大肠杆菌表达的以第一外显子缺失的人源的CD19膜外蛋白和鼠源Fc片段的融合蛋白(hCD19-D-mFc)作为免疫抗原。首次免疫时，按100μg hCD19-D-mFc融合蛋白与等量CFA佐剂乳化，采用皮下注射的方式免疫，共免疫3次，间隔为1周。免疫2周后取外周血检测血清效价。将血清与表达人CD19的白血病细胞CA46或Raji细胞在4℃条件下孵育30min,用PBS洗涤两次,加入二级抗体在4℃孵育30min,再以PBS洗涤两次后，利用流式细胞仪检测血清效价。
结果如图1所示，经过3次免疫后，小鼠血清中已产生抗hCD19-D-mFc的抗体。
(二)产生抗体的杂交瘤细胞筛选
取免疫后的小鼠脾脏分离细胞，与SP2/0细胞用PEG1500进行融合。融合细胞悬于20％FCS IMDM培养液中，并接种于96孔培养板内，加HAT进行筛选，上清经ELISA和FACS筛选得到两个阳性克隆，HG27抗体和HG28抗体。
将筛选的抗CD19抗体(HG27抗体和HG28抗体)与表达人源CD19膜外全长蛋白(hCD19-F)的293FT细胞孵育，通过流式细胞仪进行检测结合活性。
结果如图2所示，HG27、HG28和抗CD19抗体均可结合293FT/hCD19-F细胞。
(三)ELISA检测抗体与CD19蛋白的结合
将第一外显子缺失的CD19和人源Fc片段的融合蛋白(hCD19-D-hFc)作为底物进行ELISA实验，鉴定筛选出的抗体能否特异结合第一外显子缺失的CD19蛋白。
将融合蛋白(hCD19-D-hFc)包被在ELISA半孔板上，4℃放置过夜，洗后用10％FCSPBS封闭1h，分别加入不同浓度的HG27或HG28抗体或CD19抗体(HIB19，Biolegend)，洗后加入抗mIgG-HRP作用1h,再加入TMB底物显色15min,加终止液后，ELISA法检测。
结果如图3所示，HG27和HG28能够与CD19-D-hFc蛋白结合，而CD19抗体(HIB19,Biolegend)不能和CD19-D-hFc蛋白结合。
(四)抗体表位(epitope)竞争结合实验
利用已知CD19阳性的白血病细胞CA46作为靶细胞，进行抗体结合/竞争的检测。
以人淋巴瘤细胞(CA46)为靶细胞，分别与10ug过量的HG27和HG28抗体在4℃孵育30min，用1％小牛血清的PBS洗涤后，加入0.1ul抗人CD19抗体(anti-hCD19-FITC，eBioscience)或0.1ug链霉亲和素(streptavidin)标记的自制抗体HG27-biotin和HG28-biotin，4℃孵育20min，洗后用流式细胞仪进行分析。
结果如图4所示，HG27和HG28两个克隆抗体与人CD19抗体(eBioscience，HIB19)不存在竞争结合(图4上)，HG27和HG28相互竞争结合同一抗原表位(图4下)。
实施例2第一外显子缺失的CD19特异性嵌合抗原受体修饰的T细胞制备
(一)第一外显子缺失的CD19嵌合抗原受体慢病毒表达载体的构建
从杂交瘤细胞(HG27和HG28)中提取RNA，通过反转录合成DNA链，连接到T载体中，挑选克隆，测序分析，确定抗体的轻重链氨基酸序列及CDR区域。分别将第一外显子缺失的CD19质粒(HG27、HG28质粒)，与pRSV-Rev、pMDLg/pRRE及pCMV-VSVG辅助质粒按一定比例混合，共转染293FT细胞。转染48h后，分别收集含有HG27和HG28慢病毒的细胞培养上清，4℃、3000rpm离心5min。上清经0.22uml滤器过滤后，-80℃冻存备用。
(二)第一外显子缺失的CD19嵌合抗原受体T淋巴细胞的制备
取50ml志愿者新鲜外周血，通过淋巴细胞分离液、密度梯度离心方法分离外周血单核细胞(PBMC)。利用Pan T cell isolation Kit(美天旎)对细胞进行磁珠标记，并分离纯化出T淋巴细胞。纯化后的T细胞，再利用CD3/CD28磁珠进行T淋巴细胞激活和增殖。
收集激活的T淋巴细胞，重悬在RPMI1640培养基中。用HG27和HG28慢病毒分别感染1×106个活化的T淋巴细胞，将细胞悬液加在6孔板中，置37℃、5％CO2培养箱中孵育过夜。第二天，再次离心并更换新鲜培养基，每隔2天加入新鲜培养基，继续扩大培养。培养至第8天时，离心收集CAR-T细胞(HG27 CAR-T、HG28 CAR-T)，并用适宜的冻存液重悬，液氮中冻存备用。
结果显示，成功制备获得HG27 CAR-T细胞和HG28 CAR-T细胞。
实施例3CAR-T细胞杀伤急淋白血病细胞的杀伤能力比较
取制备的嵌合抗原受体T细胞(HG27 CAR-T、HG28 CAR-T)，及靶细胞(慢性髓系白血病细胞K562、白血病细胞系Nalm6、人Burkitt’s淋巴瘤细胞CA46)，计数，将CAR-T细胞密度调整为1×106/ml，分别按照效靶比2:1、10:1、20:1共培养。对照细胞为PBMC、CD19 CAR-T细胞。共培养18h后，检测CD19+肿瘤靶细胞在总细胞中的比例，用抗体(CD19-Fc)标记靶细胞，用流式细胞仪进行检测，比较细胞杀伤效果，结果见图5。
结果如图5所示，HG27 CAR-T或HG28 CAR-T细胞与已有的CD19抗体克隆来源的CAR-T细胞(CD19-CAR-T)具有同等效力的杀伤能力。
已有的CD19抗体的克隆号为FMC63(B19)(FITC)，CD19-CAR-T为自制。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 福州拓新天成生物科技有限公司
<120> 新型抗CD19抗体和CD19-CAR-T细胞的制备及其应用
<130> P2019-0505
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> PRT
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<212> PRT
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly His Thr Leu Thr Asp Tyr Glu
1 5
<210> 10
<211> 8
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Ile Asp Pro Glu Asn Gly Gly Val
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Thr Arg Arg Thr Gly Thr Tyr
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Leu Val Ser
1
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100 105 110
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115 120 125
Glu Ile Lys Arg
130
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
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1 5 10 15
Thr Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr
20 25 30
Gly Thr Cys Ala Gly Thr Ala Ala Thr Thr Gly Cys Ala Gly Gly Thr
35 40 45
Gly Thr Cys Cys Ala Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys
50 55 60
Ala Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Gly
85 90 95
Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Cys Gly Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys
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Cys Thr Cys Gly Gly Gly Cys Cys Ala Cys Ala Cys Ala Thr Thr Thr
130 135 140
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195 200 205
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210 215 220
Thr Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Cys Cys Thr Ala Cys Ala Ala Thr
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Cys Ala Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala
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Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Cys Thr Ala Cys Thr Gly
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Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Cys Gly Gly Thr Gly Ala Thr Gly
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Thr Thr Gly Gly Thr Thr Gly Thr Thr Ala Cys Ala Gly Ala Gly Gly
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Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Cys Thr Ala Thr Thr Ala Thr
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<211> 399
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
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Thr Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr
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Gly Thr Cys Ala Gly Thr Ala Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Gly Thr
35 40 45
Gly Thr Cys Cys Ala Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys
50 55 60
Ala Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Ala Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ala Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Gly
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100 105 110
Cys Gly Thr Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys
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Thr Thr Cys Gly Gly Gly Cys Cys Ala Cys Ala Cys Ala Cys Thr Thr
130 135 140
Ala Cys Thr Gly Ala Cys Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Thr Gly Cys
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Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Cys
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Ala Cys Cys Thr Ala Thr Ala Cys Ala Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly
180 185 190
Gly Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Ala
195 200 205
Thr Thr Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Gly
210 215 220
Thr Gly Gly Thr Gly Thr Thr Gly Cys Cys Thr Ala Cys Ala Ala Thr
225 230 235 240
Cys Ala Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala
245 250 255
Ala Gly Gly Cys Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Ala Cys Thr Gly Cys
260 265 270
Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys Thr
275 280 285
Ala Cys Ala Thr Cys Cys Thr Ala Cys Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys
290 295 300
Thr Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys Ala Thr Cys
305 310 315 320
Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Cys Cys Gly Thr Cys
325 330 335
Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys
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Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Thr Ala Cys Thr Gly
355 360 365
Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys Thr
370 375 380
Cys Thr Cys Ala Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala
385 390 395
<210> 20
<211> 399
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ala Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gly Thr Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys
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Ala Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr Thr
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Ala Gly Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr Cys Gly Gly
35 40 45
Gly Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly Gly Thr Gly Ala Thr Gly
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Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Cys
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Thr Cys Cys Ala Cys Thr Cys Ala Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Gly
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100 105 110
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115 120 125
Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala Gly Ala Gly Cys
130 135 140
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145 150 155 160
Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Ala Thr Ala Thr Thr Thr Gly Ala Ala
165 170 175
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180 185 190
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260 265 270
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275 280 285
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Gly Ala Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala
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Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Thr Thr Ala Thr Thr Ala Thr
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Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly
370 375 380
Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Ala Cys Gly Gly
385 390 395

Claims (20)

1.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有重链和轻链，所述重链包括重链可变区，所述轻链包括轻链可变区，其中：
(1)所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.:1所示的CDR1，
SEQ ID NO.:2所示的CDR2，和
SEQ ID NO.:3所示的CDR3；并且
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.:4所示的CDR1’，
SEQ ID NO.:5所示的CDR2’，和
SEQ ID NO.:6所示的CDR3’；
或者，
(2)所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.:9所示的CDR1，
SEQ ID NO.:10所示的CDR2，和
SEQ ID NO.:11所示的CDR3；并且
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.:12所示的CDR1’，
SEQ ID NO.:13所示的CDR2’，和
SEQ ID NO.:14所示的CDR3’。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
5.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
7.一种CAR构建物，其特征在于，所述的CAR构建物的单克隆抗体抗原结合区域的scFV段为特异性结合于CD19的结合区，并且所述scFv具有如权利要求1所述的抗体的重链可变区和轻链可变区。
8.一种重组的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达外源的如权利要求7所述的CAR构建物。
9.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分为如权利要求1所述的抗体、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、细胞毒性药物、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
10.如权利要求9所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或连接子进行偶联。
11.如权利要求10所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述的连接子选自下组：4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥酸亚胺酯(MCC)、马亚酰亚胺基己酰基(MC)、6-马来酰亚氨基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(mc-val-cit-PAB)和双取代马来酰亚胺类连接子。
12.一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求6所述的重组蛋白、如权利要求8所述的免疫细胞、如权利要求9所述的抗体药物偶联物、或其组合，其特征在于，所述活性成分用于(a)制备检测试剂、检测板或试剂盒；(b)制备特异性靶向表达CD19的肿瘤细胞的药物；和/或(c)用于制备嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
13.一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、如权利要求6所述的重组蛋白、如权利要求8所述的免疫细胞、如权利要求9所述的抗体药物偶联物、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
14.一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的抗体；或
(2)如权利要求6所述的重组蛋白；
(3)如权利要求7所述的CAR构建物。
15.一种载体，所述的载体含有如权利要求14所述的多核苷酸。
16.一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如权利要求15所述的载体或基因组中整合有如权利要求14所述的多核苷酸。
17.一种体外非诊断性检测样品中CD19的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如权利要求1所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在CD19。
18.一种检测板，所述的检测板包括：基片和测试条，所述的测试条含有如权利要求1所述的抗体或如权利要求9所述的抗体药物偶联物。
19.一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如权利要求1所述的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有如权利要求1所述的抗体的二抗；
或者，所述试剂盒含有如权利要求18所述的检测板。
20.一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如权利要求16所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如权利要求1所述的抗体或如权利要求6所述的重组蛋白。
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