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CN113307863A - 一种聚天冬氨酸及其盐类抗体的制备方法和应用 - Google Patents

一种聚天冬氨酸及其盐类抗体的制备方法和应用 Download PDF

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CN113307863A CN202110569378.3A CN202110569378A CN113307863A CN 113307863 A CN113307863 A CN 113307863A CN 202110569378 A CN202110569378 A CN 202110569378A CN 113307863 A CN113307863 A CN 113307863A
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salt
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Abstract

本发明公开了一种聚天冬氨酸和/或其盐类抗体的制备方法和应用。本发明提供了一种聚天冬氨酸和/或其盐类的半抗原，然后将半抗原偶联载体蛋白得到人工抗原并免疫动物获得抗体，该抗体对聚天冬氨酸和/或其盐类具有高灵敏度和高特异性的识别能力，对游离氨基酸均无交叉反应，说明该抗体对聚天冬氨酸和/或其盐类具有良好的灵敏度和特异性和灵敏度，有效消除了游离氨基酸的干扰，为建立聚天冬氨酸和/或其盐类的免疫检测方法提供了核心材料。本发明同时公开了聚天冬氨酸和/或其盐类酶联免疫检测试剂盒、胶体金免疫层析试纸条及其在食品中的应用。

Description

一种聚天冬氨酸及其盐类抗体的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，具体地，涉及一种聚天冬氨酸及其盐类抗体的制备方法和应用。
背景技术
聚天冬氨酸钾是一种稳定剂，可以防止酒石酸氢钾晶体的生长，因此世界上有些地区或国家允许将其添加到葡萄酒等食品中。2016年3月17日，欧盟食品安全局(EFSA)就聚天冬氨酸钾作为稳定剂用于葡萄酒的安全性发布意见，批准了食品添加剂聚天门冬氨酸作为稳定剂用于葡萄酒，最大限量为300mg/L；2018年12月18日，澳新食品标准局(FSANZ)发布69-18号通告，批准聚天冬氨酸钾作为稳定剂用于葡萄酒，允许的最大使用限量为100mg/L；2021年2月22日，加拿大卫生部发布NOM/ADM-0162号文件，修订允许使用的添加剂清单，批准在葡萄酒中使用聚天冬氨酸钾。在国际上，各国虽批准使用聚天冬氨酸钾，但各国对其限量规范不同，有些国家未将其作为食品添加剂列入食品添加剂使用标准中，故存在非法使用风险，因此建立相应的检测方法，在国际贸易中非常必要。
目前，市面上没有针对食品中聚天冬氨酸钾的检测方法，已有的针对聚天冬氨酸钾的检测方法为《复混肥料(复合肥料)中聚天冬氨酸盐含量的测定分光光度法(DB22/T1851—2014)》，该标准目前已废止，并且该方法并不能针对食品基质中的聚天冬氨酸钾进行检测，灵敏度、特异性等不能满足检测需求。
相比于色谱方法，基于抗原-抗体特异性分子识别的免疫检测方法，在现场检测方面具有更大优势，表现出快速、灵敏、简便等特点，并且成本低廉，对操作人员技能要求较低。免疫分析方法研发的关键在于设计出合适的聚天冬氨酸钾半抗原、制备出灵敏度高、特异性强的抗体，但是现有技术中还未见有关于聚天冬氨酸钾半抗原、人工抗原、抗体及其应用的报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种聚天冬氨酸及其盐类抗体的制备方法和应用，本发明首先设计并制备了一种用于检测聚天冬氨酸和/或其盐类的半抗原，然后将所述半抗原偶联载体蛋白得到人工抗原并免疫动物获得聚天冬氨酸和/或其盐类抗体。该聚天冬氨酸和/或其盐类抗体对聚天冬氨酸和/或其盐类具有高灵敏度和高特异性的识别能力，为建立聚天冬氨酸和/或其盐类的免疫检测方法提供了核心原材料。
本发明的第一个目的是提供一种聚天冬氨酸和/或其盐类的半抗原。
本发明的第二个目的是提供聚天冬氨酸和/或其盐类半抗原在制备聚天冬氨酸和/或其盐类检测试剂盒中的应用，和/或在检测聚天冬氨酸和/或其盐类中的应用。
本发明的第三个目的是提供三种聚天冬氨酸和/或其盐类的完全抗原。
本发明的第四个目的是提供一种聚天冬氨酸和/或其盐类的完全抗原组合。
本发明的第五个目的是提供一种聚天冬氨酸和/或其盐类的抗体。
本发明的第六个目的是提供所述完全抗原和/或所述聚天冬氨酸和/或其盐类抗体在检测聚天冬氨酸和/或其盐类中的应用，和/或在制备检测聚天冬氨酸和/或其盐类的检测试剂盒或试纸条中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种聚天冬氨酸和/或其盐类的检测试剂盒。
本发明的第八个目的是提供一种聚天冬氨酸和/或其盐类的胶体金免疫层析试纸条。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明通过将半抗原偶联到载体蛋白上，制得三种完全抗原，将三种完全抗原分别用于动物免疫和作为包被原，制备聚天冬氨酸和/或其盐类的抗体，再利用包被原进一步建立聚天冬氨酸和/或其盐类的检测方法及检测试剂盒。
因此，本发明要求保护以下内容：
一种聚天冬氨酸和/或其盐类的半抗原，所述半抗原的结构式如式(II)所示：
Figure BDA0003082044260000031
其中R为
Figure BDA0003082044260000032
所述聚天冬氨酸和/或其盐类半抗原在制备聚天冬氨酸和/或其盐类检测试剂盒中的应用，和/或在检测聚天冬氨酸和/或其盐类中的应用。
优选地，所述聚天冬氨酸、聚天冬氨酸钾盐和/或聚天冬氨酸钠盐。
最优选地，所述聚天冬氨酸钾盐为聚天冬氨酸经氢氧化钾水解后的混合物，聚合度为6～11；所述聚天冬氨酸钠盐为聚天冬氨酸经氢氧化钠水解后的混合物，聚合度为6～11。
一种聚天冬氨酸和/或其盐类的完全抗原，所述完全抗原的结构式如式(III)或式(IV)所示，式中的n＝6～11(n为整数)，
Figure BDA0003082044260000041
优选地，所述完全抗原中的载体蛋白为牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)、乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)或者鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)中的一种或几种。
更优选地，式(III)所示完全抗原的载体蛋白为钥孔血蓝蛋白(KLH)。
更优选地，式(IV)所示完全抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)。
最优选地，式(IV)所示完全抗原是由活泼酯法偶联牛血清白蛋白(BSA)制得。
一种聚天冬氨酸和/或其盐类的完全抗原，所述完全抗原的结构式如式(V)所示，
Figure BDA0003082044260000051
其中R为
Figure BDA0003082044260000052
优选地，所述完全抗原中的载体蛋白为牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、乳铁蛋白或鸡卵清白蛋白中的一种或几种。
更优选地，式(V)所示完全抗原的载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。
最优选地，式(V)所示完全抗原是由SMCC法偶联载体蛋白制备所得。
一种聚天冬氨酸和/或其盐类的完全抗原组合，包括式(III)、式(IV)和式(V)所示的聚天冬氨酸和/或其盐类完全抗原。
优选地，所述完全抗原组合中的载体蛋白为牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、乳铁蛋白或鸡卵清白蛋白中的一种或几种。
更优选地，式(III)所示完全抗原的载体蛋白为钥孔血蓝蛋白(KLH)，式(IV)所示完全抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，式(V)所示完全抗原的载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。
优选地，所述完全抗原组合中，式(III)或式(IV)所示完全抗原作为包被原，式(V)所示的完全抗原作为免疫原。
更优选地，式(IV)所示完全抗原作为包被原，式(V)所示的完全抗原作为免疫原。
一种聚天冬氨酸和/或其盐类抗体，由式(II)所示的半抗原，和/或所述完全抗原组合中的一种或两种完全抗原制备所得。
优选地，所述聚天冬氨酸和/或其盐类抗体由式(V)所示完全抗原作为免疫原制备而得。
优选地，所述聚天冬氨酸和/或其盐类抗体为单克隆抗体、多克隆抗体任意的一种或几种。
更优选地，所述聚天冬氨酸和/或其盐类抗体为聚天冬氨酸和/或其盐类多克隆抗体。
式(III)、式(IV)和/或式(V)所述完全抗原，和/或所述聚天冬氨酸和/或其盐类抗体在检测聚天冬氨酸和/或其盐类中的应用，和/或在制备检测聚天冬氨酸和/或其盐类的检测试剂盒或试纸条中的应用。
优选地，所述检测试剂盒为酶联免疫试剂盒。
优选地，所述试纸条为胶体金免疫层析试纸条。
一种聚天冬氨酸和/或其盐类的检测试剂盒，由所述的聚天冬氨酸和/或其盐类完全抗原组合制备得到。
优选地，所述检测试剂盒包括式(III)、式(IV)和/或式(V)所述完全抗原，和/或所述聚天冬氨酸和/或其盐类抗体。
更优选地，所述检测试剂盒包括式(IV)所示完全抗原和所述聚天冬氨酸和/或其盐类抗体。
最优选地，所述检测试剂盒中式(IV)所示完全抗原作为包被原。
优选地，所述检测试剂盒为酶联免疫试剂盒。
更优选地，所述检测试剂盒的还包括：
式(IV)所示人工抗原处理过的酶标板：用碳酸盐缓冲液(0.01moL/L，pH＝9.6)将式(IV)所示人工抗原稀释为1μg/mL，每孔加入100μL，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入120μL封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存；
酶结合物：用辣根过氧化物酶标记所述聚天冬氨酸和/或其盐类抗体；
封闭液：1％的鱼胶蛋白(m/v)；
底物显色液：由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
终止液：10％硫酸(v/v)；
洗涤液：pH 7.4的0.5％～1.0％(v/v)吐温-20、0.01‰～0.03‰(v/v)叠氮化钠防腐剂和pH 7.4的0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液。
更优选地，所述检测试剂盒的使用方法为：
S1.将50μL待测样品加到式(IV)所示人工抗原包被过的酶标板中；
S2.将酶结合物用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))按1:11体积比进行稀释，加50μL到S1中酶标板对应的微孔中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应35min；
S3.将孔内液体甩干，加入洗涤液300μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；
S4.加入底物显色液A液50μL/孔，再加入底物显色液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min；
S5.加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。
一种聚天冬氨酸和/或其盐类的胶体金免疫层析试纸条，由所述聚天冬氨酸和/或其盐类抗体和所述完全抗原组合制备得到。
优选地，所述胶体金免疫层析试纸条包括：所述聚天冬氨酸和/或其盐类抗体的金标抗体、包被有所述人工抗原的纤维素膜、吸水垫、样品垫和PVC底板。
更优选地，所述胶体金免疫层析试纸条纤维素膜上包被的为式(IV)所示人工抗原。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明制备得到了聚天冬氨酸和/或其盐类半抗原，应用半抗原偶联载体蛋白得到人工抗原，并利用人工抗原制备聚天冬氨酸和/或其盐类抗体，该抗体对聚天冬氨酸和/或其盐类具有高灵敏度和高特异性的识别能力，对游离氨基酸均无交叉反应，说明该抗体对聚天冬氨酸和/或其盐类具有良好的灵敏度和特异性和灵敏度，有效消除了游离氨基酸的干扰，为建立聚天冬氨酸和/或其盐类的免疫检测方法提供了核心材料。
(2)本发明利用聚天冬氨酸和/或其盐类抗体开发了聚天冬氨酸和/或其盐类免疫检测试剂盒在食品中聚天冬氨酸和/或其盐类的免疫快速检测中的应用。本发明开发的酶联免疫试剂盒和胶体金免疫层析试纸条能够特异性识别聚天冬氨酸和/或其盐类，对聚天冬氨酸和/或其盐类的检测灵敏度高。
附图说明
图1为聚天冬氨酸和/或其盐类半抗原P9合成的色谱图结果。
图2为聚天冬氨酸和/或其盐类半抗原P9合成的质谱图结果。
图3为聚天冬氨酸和/或其盐类半抗原P9的具体结构。
图4为聚天冬氨酸和/或其盐类人工抗原P9-载体蛋白的合成路线图。
图5为聚天冬氨酸和/或其盐类人工抗原PASP-EDC-载体蛋白的合成路线
图6为KLH、P9与P9-KLH的紫外光谱图。
图7为KLH、PASP与PASP-GD-KLH紫外光谱图。
图8为BSA、PASP与PASP-EDC-BSA紫外光谱图。
图9为聚天冬氨酸和/或其盐类抗体对聚天冬氨酸钾的标准抑制曲线。
图10为聚天冬氨酸和/或其盐类抗体对聚天冬氨酸的标准抑制曲线。
图11为聚天冬氨酸和/或其盐类抗体对聚天冬氨酸钠的标准抑制曲线。
图12为聚天冬氨酸和/或其盐类胶体金免疫层析试纸条的侧面示意图。
图13为聚天冬氨酸和/或其盐类胶体金免疫层析试纸条检测结果判定图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1聚天冬氨酸和/或其盐类半抗原的合成和鉴定
一、实验方法
(1)合成顺序：从序列C端到N端，步骤如下：
a.称取n当量树脂放入反应器，加入DCM(二氯甲烷)溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入序列中第一个氨基酸2n当量，加2n当量的DIEA(二异丙基乙胺)，适量的DMF(二甲基甲酰胺)，DCM(适量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜)，DIEA(二异丙基乙胺)、DMF(二甲基甲酰胺)、DCM，氮气鼓泡反应60min。然后加入约5n当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、MEOH洗净；
b.往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为2n当量)，2n当量HBTU(苯并三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸酯)及DIEA，N2鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测；
c.依步骤b的方式依次加入序列中不同的氨基酸并进行各种修饰；
d.将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量(切割液和树脂大约以10ml/g的比例)的切割液(组成是95％三氟乙酸，2％乙二硫醇，2％三异丙基硅烷，1％水)，震荡，滤掉树脂；
e.得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列的粗产物；
(2)多肽纯化：开发新工艺用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度。
(3)多肽冻干：纯化好的液体放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
(4)进行多肽检测及实验报告。
二、实验结果
合成结果包括HPLC图(图1)和质谱图(图2)。由保留时间和质谱图的碎片离子峰分析判断聚天冬氨酸和/或其盐类半抗原(P9)结构合成成功，其结构如式(II)所示，完整结构如图3所示，
Figure BDA0003082044260000091
其中R为
Figure BDA0003082044260000101
实施例2聚天冬氨酸和/或其盐类人工抗原的合成和鉴定
1、聚天冬氨酸和/或其盐类人工抗原的合成
使用实施例1中成功制备的式(II)所示半抗原和市购的式(I)所示半抗原(CAS:64723-18-8)，其中n＝6～11且n为整数，进行聚天冬氨酸和/或其盐类人工抗原的合成，
Figure BDA0003082044260000102
其具体操作如下：
(1)将式(II)所示半抗原通过SMCC法偶联载体蛋白，其具体合成路线如图4所示，具体步骤如下：
S1.将10mg载体蛋白溶解于200～1000μL 99.5％DMF中，得到A液；
S2.将4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(SMCC)溶解于200～1000μL 99.5％DMF中，得到B液；
S3.将B液在磁力搅拌下缓慢逐滴加入到A液中，在低温反应器0℃下搅拌过夜；用PBS缓冲液透析2天后得到C液，即SMCC修饰后的载体蛋白溶液；
S4.将式(II)所示半抗原溶于500～1000μL磷酸盐缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)，得到D液；
S5.在磁力搅拌下将D液缓慢滴加到C液(SMCC-载体蛋白)中，在室温下搅拌2h；用PBS缓冲液透析两天，每天4次，透析结束后将蛋白溶液收集到离心管中，得到蛋白偶联物，即聚天冬氨酸和/或其盐类人工抗原P9-载体蛋白，其结构如式(V)所示，分装于离心管中，于-20℃保存备用，
Figure BDA0003082044260000111
其中R为
Figure BDA0003082044260000121
(2)将式(I)所示半抗原通过戊二醛法偶联载体蛋白，具体步骤如下：
S1.将式(I)所示半抗原溶解于50～200μL磷酸盐缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中，加入50～100μL 25％戊二醛(GA)(v/v)室温下避光搅拌反应1～3h，得到活化液；
S2.将10mg载体蛋白加入到磷酸盐缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中，得到载体蛋白溶液；
S3.在室温磁力搅拌下，将S1中的活化液缓慢逐滴加入到S2中的载体蛋白溶液中，反应24h；用PBS缓冲液透析两天，每天4次，透析结束后将蛋白溶液收集到离心管中，得到蛋白偶联物，即聚天冬氨酸和/或其盐类人工抗原PASP-GD-载体蛋白，如式(III)所示(n＝6～11，n为整数)，分装于离心管中，于-20℃保存备用，
Figure BDA0003082044260000122
(3)将式(I)所示半抗原通过活泼酯法偶联载体蛋白，其具体合成路线如图5所示，具体步骤如下：
S1.称取1moL式(I)所示半抗原，1.4moL NHS和1.6moL 99％EDC溶解于50～200μL99.5％DMF中，室温下避光搅拌2～4h，得到聚天冬氨酸和/或其盐类半抗原活化液；
S2.将10mg载体蛋白溶解于1mL的PBS缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中，再将S1中的聚天冬氨酸和/或其盐类半抗原活化液室温下缓慢逐滴加入，4℃反应12h；用PBS缓冲液透析2天，每天4次，透析结束后即得聚天冬氨酸和/或其盐类人工抗原PASP-EDC-载体蛋白，如式(IV)所示(n＝6～11，n为整数)，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用，
Figure BDA0003082044260000131
以上人工抗原的合成中，PBS缓冲液的配方为：Na2HPO4·12H2O 2.90g，NaCl8.50g，KCl 0.20g，KH2PO4 0.20g，加蒸馏水定容至1000mL；载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)。
2、聚天冬氨酸和/或其盐类人工抗原的鉴定
通过本实施例成功合成了六种人工抗原：P9-KLH、P9-BSA、PASP-GD-KLH、PASP-GD-BSA、PASP-EDC-BSA、PASP-EDC-KLH，其中人工抗原P9-KLH、PASP-GD-KLH和PASP-EDC-BSA，的紫外扫描结果如图6、图7和图8所示，说明人工抗原P9-KLH、PASP-GD-KLH和PASP-EDC-BSA成功合成。
实施例3聚天冬氨酸和/或其盐类抗体的制备
将实施例2制备的人工抗原PASP-EDC-KLH、PASP-GD-KLH、P9-KLH，分别与免疫佐剂(第一次免疫用完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)按体积比1:1乳化均匀，免疫新西兰大白兔。
所述新西兰大白兔体重为2.5～3kg，采用颈部和背部皮下多点注射，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。一周后心脏采血，收集到的血获得血清的方式为：将收集到的心脏血在37℃下温浴0.5～1h，然后在4℃下静置过夜，再用吸管吸取析出来的血清，接着在4℃下，3000～5000rpm离心10min，取上清，得到抗血清。抗血清采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化得到三种人工抗原作为免疫原制备的聚天冬氨酸和/或其盐类多克隆抗体，于-20℃冻存备用。
实施例4聚天冬氨酸和/或其盐类免疫原和包被原组合优化
一、实验方法
分别使用实施例2制备的人工抗原PASP-EDC-BSA、PASP-GD-BSA和P9-BSA作为包被原对实施例3制得的三种抗体通过ELISA法进行包被原筛选。
具体操作步骤如下：
(1)将实施例3中的三种聚天冬氨酸和/或其盐类抗体分别用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))稀释为1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000，同时设置空白对照孔(用PBST代替所述抗体稀释液)；
(2)包被：将聚天冬氨酸和/或其盐类人工抗原PASP-EDC-BSA、PASP-GD-BSA和P9-BSA分别用包被液(0.05M磷酸盐缓冲溶液，pH 9.6)稀释至1μg/mL的浓度，再分别包被于96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃恒温水浴箱温育过夜，弃包被液，用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))洗涤2次；
每孔加入120μL封闭液(1％的鱼胶蛋白(m/v))，37℃封闭3h，弃去封闭液，拍板，在干燥箱37℃烘干备用；
(3)用PBST将1mg/mL聚天冬氨酸钾稀释1000倍，为1μg/mL聚天冬氨酸钾稀释液；
(4)所述酶标板每行加50μL 1μg/mL聚天冬氨酸钾稀释液(三组平行)，再加50μL/孔的步骤(1)中的聚天冬氨酸钾抗体稀释液，在37℃温育40min，洗涤5次；
(5)加入羊抗兔二抗IgG-HRP(5000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5次，拍板；
(6)加入显色液A液50μL/孔，再加入底物显色液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min；
(7)加入50μL 10％H2SO4终止反应，并在450nm处读取OD值；
所述显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺。
分别对聚天冬氨酸和聚天冬氨酸钠进行包被原的筛选，方法同上。
二、实验结果
经ELISA检测效价和抑制率如表1和表2所示。通过对不同的免疫原及包被原组合进行筛选后，最佳组合为：以人工抗原P9-KLH为免疫原，以人工抗原PASP-EDC-BSA/P9-BSA为包被原的组合。在该组合下，所述抗体不仅能特异性识别目标分析物聚天冬氨酸、聚天冬氨酸钾和聚天冬氨酸钠，且抗体灵敏度较好。
表1聚天冬氨酸钾4组免疫原和包被原组合的效价和抑制率数据
Figure BDA0003082044260000151
表2聚天冬氨酸及其钠盐效价及抑制率数据
Figure BDA0003082044260000152
实施例5聚天冬氨酸和/或其盐类的酶联免疫试剂盒
一、聚天冬氨酸和/或其盐类的酶联免疫试剂盒组成
检测聚天冬氨酸和/或其盐类的酶联免疫试剂盒，其包含下述组分：
(1)实施例2制备的人工抗原PASP-EDC-BSA处理过的酶标板：用包被液(0.05M磷酸盐缓冲溶液，pH 9.6)将人工抗原PASP-EDC-BSA稀释为1μg/mL，每孔加入100μL，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入120μL封闭液(1％的鱼胶蛋白(m/v))，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存；
(2)酶结合物：用辣根过氧化物酶标记实施例3制备的聚天冬氨酸和/或其盐类抗体；
(3)底物显色液：由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
(4)终止液：10％硫酸(v/v)；
(5)洗涤液：pH 7.4的0.5％～1.0％(v/v)吐温-20、0.01‰～0.03‰(v/v)叠氮化钠防腐剂和pH 7.4的0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液。
二、聚天冬氨酸和/或其盐类的酶联免疫试剂盒的使用
S1.将50μL待测样品加到人工抗原PASP-EDC-BSA处理过的酶标板中；
S2.将酶结合物用PBST(0.01M PBS，0.06％Tween-20(v/v))按1:11体积比进行稀释(即1份酶结合物加入11份PBST，现配现用)，加50μL/孔到S1中酶标板对应的微孔中，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应35min；
S3.将孔内液体甩干，加入洗涤液300μL/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；
S4.加入底物显色液A液50μL/孔，再加入底物显色液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min；
S5.加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。
实施例6聚天冬氨酸和/或其盐类的酶联免疫试剂盒标准曲线的建立
一、实验方法
使用实施例5中的酶联免疫试剂盒，分别对聚天冬氨酸标准品溶液(浓度分别为0μg/L，1.25μg/L，25μg/L，500μg/L，10000μg/L，200000μg/L)、聚天冬氨酸钾标准品溶液(浓度分别为0μg/L，1.25μg/L，25μg/L，500μg/L，10000μg/L，200000μg/L)和聚天冬氨酸钠标准品溶液(浓度分别为0μg/L，1.25μg/L，25μg/L，500μg/L，10000μg/L，200000μg/L)进行检测，分别测定其在450nm处的每孔OD值。采用四参数曲线拟合方法，分别绘制聚天冬氨酸、聚天冬氨酸钾和聚天冬氨酸钠标准曲线图。
二、实验结果
聚天冬氨酸的标准曲线如图10所示，所述聚天冬氨酸和/或其盐类抗体的半抑制浓度(IC50)为13.94ng/mL，检测限为0.6ng/mL；聚天冬氨酸钾的标准曲线如图9所示，抗体的半抑制浓度(IC50)为13.58ng/mL，检测限为0.4ng/mL；聚天冬氨酸钠的标准曲线如图11所示，抗体的半抑制浓度(IC50)为14.47ng/mL，检测限为0.9ng/mL。说明本发明制备得到的抗体和试剂盒对聚天冬氨酸和/或其盐类具有高灵敏度的识别能力，对聚天冬氨酸和/或其盐类的检测灵敏度高，并且满足对天冬氨酸钾的检测要求。
实施例7聚天冬氨酸和/或其盐类的酶联免疫试剂盒的特异性测定
一、实验方法
使用实施例5中的免疫酶联试剂盒，对聚天冬氨酸钾与聚天冬氨酸、聚天冬氨酸钠及其他类似物(游离氨基酸)进行检测，用交叉反应率(CR)表示特异性，交叉反应越小，特异性越好。用以下公式计算聚天冬氨酸及其盐类和各类似物的交叉反应率(CR)：
Figure BDA0003082044260000161
二、实验结果
聚天冬氨酸钾与聚天冬氨酸、聚天冬氨酸钠及其他类似物(游离氨基酸)交叉反应实验结果如表3所示，结果发现：所述试剂盒对聚天冬氨酸钾的交叉反应率为100％，IC50值为13.6ng/mL，；所述试剂盒对聚天冬氨酸钠的交叉反应率为93.85％；所述试剂盒对聚天冬氨酸的交叉反应率为97.42％；对其类似物(游离氨基酸)无交叉反应。说明所述酶联免疫试剂盒对聚天冬氨酸及其盐类具有高特异性，有效消除了游离氨基酸的干扰。
表3聚天冬氨酸钾与聚天冬氨酸、聚天冬氨酸钠及其他类似物交叉反应实验结果
Figure BDA0003082044260000171
Figure BDA0003082044260000181
Figure BDA0003082044260000191
Figure BDA0003082044260000201
注：NR表示无反应。
实施例8聚天冬氨酸和/或其盐类的酶联免疫试剂盒的添加回收实验
一、实验方法
选取葡萄酒等食品(包括红葡萄酒、白葡萄酒)为加标样本，分别以3种浓度100mg/L、200mg/L和400mg/L加入聚天冬氨酸钾标准品，并分别设置未加标样品且经验证不含聚天冬氨酸钾。待测样品的处理方法均为50倍稀释提取，具体操作：取2g(精确到0.001g)样本于250mL干燥烧杯中，准确加入98g超纯水，振荡摇匀，然后静置10min，取上清液为待测样品备用。
按以下回收率公式计算：回收率＝(样品聚天冬氨酸钾检出浓度-未加标样品聚天冬氨酸钾检出浓度)/标浓度×100％。
二、实验结果
添加回收实验的结果如表3所示。结果显示红葡萄酒、白葡萄酒的添加回收率均在80％～120％之间，变异系数均小于15％，证明试剂盒的精密度高，稳定性好，能满足聚天冬氨酸钾的检测要求。
表3样本添加回收试验结果
Figure BDA0003082044260000211
实施例9检测聚天冬氨酸和/或其盐类的免疫层析试纸条
一、聚天冬氨酸和/或其盐类的免疫层析试纸条的制备
1、金标抗体的制备和结合垫的制备
采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，制备平均直径在40nm的胶体金悬浮液。
先将胶体金用0.2mol的K2CO3溶液调节pH至8.2，然后采用经典NaCl滴定法确定抗体标记量，最终选择将30μg实施例3所制备的聚天冬氨酸和/或其盐类抗体和1mL胶体金溶液进行标记，得到金标抗体，4℃保存。
用XYZ-3000三维喷膜仪把4％的BSA(m/v)溶液以8μL/cm的量喷在玻璃棉上，使用干燥箱42℃干燥50min，再把上述金标抗体以6μL/cm的量喷在玻璃棉上，用干燥箱42℃干燥50min后真空干燥保存。
2、纤维素膜的制备
用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为1mg/mL的人工抗原PASP-EDC-BSA(包被原)以1.2μL/cm的量喷在纤维素膜的一侧，作为检测线(T线)。用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为120μg/L的羊抗兔IgG以1.2μL/cm的量喷在纤维素膜的另一侧，作为对照线(C线)，两线间隔8mm。
3、免疫层析试纸条的组装
把纤维素膜粘贴在PVC底板中间部位上，吸水垫(层析吸水纸)一端粘贴在纤维素膜上侧和纤维素膜重叠1mm；结合垫粘贴在纤维素膜一端重叠1mm；样品垫(滤血膜)粘贴在结合垫另一端重叠2mm；组装好的试纸板用斩切机切成3.05mm宽的试纸条。
图12为聚天冬氨酸和/或其盐类胶体金免疫层析试纸条的侧面示意图，其中1为PVC底板；2为样品垫；3为结合垫；4为纤维素膜；5为检测线(T线)；6为对照线(C线)；7为吸水垫。
二、聚天冬氨酸和/或其盐类的免疫层析试纸条
聚天冬氨酸和/或其盐类的免疫层析试纸条包括：依次设置在PVC底板上的样品垫(滤血膜)、上述制备的结合垫、上述制备的纤维素膜和吸水垫。
三、免疫层析试纸条的使用
1、样品前处理
液体样品1(红葡萄酒)和液体样品2(白葡萄酒)
称取2g(精确到0.001g)样品于250mL干燥烧杯中，准确加入98g水，振荡摇匀，然后静置10min，取上清液待测。
2、快速检测试纸条检测及判断
(1)待测样品1的检测
用移液枪吸取待测样品1溶液于所述免疫层析试纸条的样品垫上，室温反应，根据所述免疫层析试纸条的显色情况判定结果。
(2)待测样品2的检测
使用免疫层析试纸条对待测样品2进行检测，具体方法同(1)中所述。
(3)样品1(样品2)的检测判定结果
聚天冬氨酸和/或其盐类胶体金免疫层析试纸条检测结果判定如图13所示，
阴性(－)：质控线(C线)显色，若检测线(T线)也显色，表示样品中不含有聚天冬氨酸及其盐类或其含量低于8μg/g(6μg/g)，判为阴性；
阳性(+)：质控线(C线)显色，若检测线(T线)不显色，表示样品中含有聚天冬氨酸和/或其盐类且其含量高于8μg/g(6μg/g)，判为阳性；
无效：当质控线(C线)不显色时，无论检测线(T线)是否显色，均表示实验结果无效。
实施例10聚天冬氨酸和/或其盐类的免疫层析试纸条检出限的测定
一、实验方法
取液体样品1(红葡萄酒)和液体样品2(白葡萄酒)，液体样品1和液体样品2中分别添加一系列浓度的标准药物，经实施例9中的样品前处理，用实施例9中的免疫层析试纸条对样品进行检测，通过肉眼定性判断，确定可视检测限。
二、实验结果
具体结果见下表。
表4试纸条检出限的测定
Figure BDA0003082044260000231
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种聚天冬氨酸和/或其盐类的半抗原，其特征在于，所述半抗原的结构式如式(II)所示：
Figure FDA0003082044250000011
其中R为
Figure FDA0003082044250000012
2.权利要求1所述的半抗原在制备聚天冬氨酸和/或其盐类检测试剂盒中的应用，和/或在检测聚天冬氨酸和/或其盐类中的应用。
3.一种聚天冬氨酸和/或其盐类的完全抗原，其特征在于，所述完全抗原的结构式如式(III)或式(IV)所示；式中的n＝6～11；
Figure FDA0003082044250000021
4.一种聚天冬氨酸和/或其盐类的完全抗原，其特征在于，所述完全抗原的结构式如式(V)所示，
Figure FDA0003082044250000022
其中R为
Figure FDA0003082044250000031
5.一种聚天冬氨酸和/或其盐类的完全抗原组合，其特征在于，包括权利要求3和权利要求4中的完全抗原。
6.根据权利要求5所述完全抗原组合，其特征在于，权利要求3所述完全抗原作为包被原，权利要求4所述完全抗原作为免疫原。
7.一种聚天冬氨酸和/或其盐类的抗体，其特征在于，使用权利要求1所述的半抗原，和/或采用权利要求5所述的完全抗原组合中的一种或两种制备所得。
8.权利要求3所述完全抗原、权利要求4所述完全抗原和/或权利要求7所述抗体在检测聚天冬氨酸和/或其盐类中的应用，和/或在制备检测聚天冬氨酸和/或其盐类的检测试剂盒或试纸条中的应用。
9.一种聚天冬氨酸和/或其盐类的检测试剂盒，其特征在于，由权利要求5所述的聚天冬氨酸和/或其盐类完全抗原组合制备得到。
10.一种聚天冬氨酸和/或其盐类的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，由权利要求7所述抗体和权利要求5所述完全抗原组合制备得到。
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