CN113307791B

CN113307791B - 嘧啶基哌嗪脲类trpv1拮抗/mor激动双靶点化合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN113307791B
Application number: CN202110577983.5A
Authority: CN
Inventors: 严琳; 王玉睢; 高梦康; 乔振蕊; 王国豪; 宋德朴; 陈英达
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2021-05-26
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2041-05-26
Also published as: CN113307791A

Abstract

本发明公开了嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物具有结构通式Ⅰ

Description

嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，涉及嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物及其制备方法和应用。

背景技术

疼痛是神经系统之间复杂相互作用的结果，疼痛的形式又分为急性痛和慢性痛。其中慢性痛往往持续一个月以上，对人类健康伤害很大；相关数据显示全球成年人慢性疼痛发病率为30％，为了唤起人们对疼痛危害的关注，世界疼痛学会已经将每年的10月11日定为世界镇痛日。

目前使用的大多数强效止痛药都是通过阿片受体发挥作用，阿片受体属于G蛋白偶联受体，一般分为四种亚型：μ阿片受体(MOR)、δ阿片受体(DOR)、κ阿片受体(KOR)和σ阿片受体(SOR)，其主要参与机体镇痛和免疫应答等生理功能的为MOR。MOR在丘脑和中脑导水管周围灰质、腹侧被盖区、蓝斑核、伏隔核、海马等17个脑部区域及脊髓Ⅱ层神经元均有分布。激活MOR、抑制Ca²⁺内流，可阻止痛觉冲动的传导，达到镇痛效果，一直被用作治疗疼痛的最有效形式。但是MOR被持续激活，会引起MOR与G蛋白解偶联，并对环磷腺苷酸(cAMP)的抑制能力减弱，致使MOR失敏，引起阿片耐受、呼吸抑制、成瘾等不良反应。

瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)是主要在感觉神经元中表达的非选择性离子通道，在脑内如下丘脑、海马和纹状体区都有较为丰富的表达。TRPV1可被伤害性热刺激酸、炎症介质、香草素类化合物、G-蛋白偶联受体激活，引起Ca²⁺、Na⁺内流，促使神经元兴奋，释放P物质、降钙素基因相关肽等，参与机体的疼痛、炎症、高血压、免疫应答、呼吸系统、心血管系统、胃肠道等生理和病理活动。研究表明，拮抗TRPV1的激活能够有效的缓解啮齿动物模型的炎症和癌症的疼痛行为。因此，TRPV1拮抗剂被认为是治疗疼痛的有前途的药物。到目前为止，已有大量的TRPV1拮抗剂被设计开发出来，但由于在临床研究过程中伴随着体温升高和伤害性热感知丧失等副作用，阻碍了其进一步的发展。

研究发现，吗啡戒断会使在背根节神经元中的TRPV1受体功能增强，可能是解释阿片类戒断综合症中痛觉过敏新机制，联合阿片受体和TRPV1受体间的相互作用是一种潜在的疼痛治疗方法。双靶点药物不仅可以通过多种机制的组合产生协同治疗效果，而且还可以减少较于单一靶向药物所产生的不良反应，因此发明一种TRPV1拮抗/MOR激动双靶点药物具有广泛的应用前景。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐，以该化合物作为活性成分的药物不仅对TRPV1显示出明显的抑制活性，同时也能够对MOR显示出明显的激动活性。

本发明的目的之二在于提供嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐的制备方法。

本发明的目的之三在于提供嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防TRPV1和/或MOR介导的疾病的药物中的应用。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物具有结构通式Ⅰ：

式中R为

中的一种，Ar为卤代苯基或芳香杂环基。

进一步地，具体化合物为：

N-(4-溴苯基)-4-(4-(吡咯烷-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺、

N-(3,4-二氯苯基)-4-(4-(4-甲基哌啶-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺、

N-(3,4-二氯苯基)-4-(4-(4-苯基哌啶-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺、

N-(2,5-二氯苯基)-4-(4-(4-(N-苯基丙酰胺基)哌啶-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺、

N-(3-氯-4-甲基苯基)-4-(4-(4-(N-苯基丙酰胺基)哌啶-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺。

进一步地，所述药学上可接受的盐包括与下列酸形成的盐：盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、醋酸、三氟乙酸、丙酮酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、马来酸、苯磺酸或琥珀酸。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，合成路线A包括以下步骤：

(1)0℃下，将三乙胺滴加至2,4-二氯嘧啶的有机溶液中搅拌，向其中加入含取代基R的含氮杂环的有机溶液，反应得到化合物a；

(2)将步骤(1)制备得到的化合物a、哌嗪、无机碱依次加入到反应容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺搅拌溶解，加热至95-105℃反应得到化合物b；

(3)0℃惰性气体环境下，向反应容器中加入取代苯胺或含有胺基的芳香杂环化合物，加入有机溶剂溶解得到混合液，然后将三光气的有机溶液加入至混合液中，反应后再向其中加入步骤(2)制备得到的化合物b，于20-37℃下反应得到化合物Ⅰ；

合成路线B包括以下步骤：

(4)将苯胺溶于有机溶剂中，室温搅拌下依次加入冰醋酸、Boc-哌啶酮，反应后加入三乙酰氧基硼氢化钠，反应得到化合物d；

(5)0℃下，将步骤(4)制备得到的化合物d溶解于有机溶剂中，向其中加入三氟乙酸，20-37℃下反应得到化合物e；

(6)0℃下，将三乙胺加入到2,4-二氯嘧啶的有机溶液中搅拌得混合液，向其中加入步骤(5)制备得到的化合物e的有机溶液，20-37℃下反应得到化合物f；

(7)0℃下，将步骤(6)制备得到的化合物f加入到反应容器中，加入有机溶液溶解得混合液，向混合液中加入三乙胺、丙酰氯，20-37℃下反应得到化合物g；

(8)将步骤(7)制备得到的化合物g、哌嗪、无机碱依次加入到反应容器中，加入N,N-二甲基甲酰胺搅拌溶解，加热至95-105℃反应得到化合物h；

(9)0℃惰性气体环境下，向反应容器中加入取代苯胺或含有胺基的芳香杂环化合物，加入有机溶剂溶解得到混合液，然后将三光气的有机溶液加入至混合液中，反应后再向其中加入步骤(8)制备得到的化合物h，于20-37℃下反应得到化合物Ⅰ。

进一步地，所述路线A步骤(1)、(3)和路线B步骤(4)、(5)、(6)、(7)、(9)的有机溶液为二氯甲烷，路线A步骤(2)、路线B步骤(8)的有机溶液为N,N-二甲基甲酰胺。。

一种药物制剂，所述药物制剂包括通式Ⅰ所示的嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐、及其药学上可接受的载体。

进一步地，所述药物的剂型为片剂、胶囊、丸剂、栓剂、软胶囊、口服液、混悬剂或注射液中的一种或几种。

进一步地，该药物剂型为片剂，每片包含以下重量的原料：活性成分40mg、乳糖100mg、玉米淀粉40mg、硬脂酸镁1.5mg、乙醇10-15mL，所述活性成分为通式Ⅰ所示的嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐。

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：

嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防TRPV1和/或MOR介导的疾病的药物中的应用。

优选地，所述的TRPV1和/或MOR介导的疾病包括慢性疼痛、便秘、炎症等。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明提供了嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐，以该化合物作为活性成分的药物不仅对TRPV1显示出明显的抑制活性，同时也能够对MOR显示出明显的激动活性。本发明还提供了上述化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，具有反应条件温和的特点。本发明还提供了上述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防TRPV1和/或MOR介导的疾病的药物中的应用，该药物不仅可以阻断外周和中枢神经系统的疼痛传递，还可以减少与单一靶向相关的副作用，如MOR激动剂引起的恶心、嗜睡和呼吸抑制，以及TRPV1拮抗剂引起的伤害性热感减弱和明显的体温升高，具有良好的应用前景。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1

按照合成路线A制备N-(4-溴苯基)-4-(4-(吡咯烷-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(化合物1)：

(1)0℃下，将三乙胺(3.84mL)滴加到2,4-二氯嘧啶(2.05g，13.8mmol)的二氯甲烷溶液(30mL)中搅拌，再将吡咯烷(0.985g，13.8mmol)的二氯甲烷(20mL)逐滴添加到上述反应体系中，加热至室温，反应4h，TLC检测，反应完成后，饱和食盐水(30mL×3)洗涤，有机相用无水MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩，柱层析分离纯化(PE:EA＝50:1)，得2-氯-4-(吡咯烷-1-基)嘧啶(化合物a)。

(2)称取步骤(1)制备得到的2-氯-4-(吡咯烷-1-基)嘧啶(1.50g，8.194mmol)，无水哌嗪(0.705g，8.194mmol)，氢氧化钠(0.492g，12.291mmol)，依次加入到100mL圆底烧瓶中，并用N,N-二甲基甲酰胺(30mL)搅拌溶解，加热至100℃，反应10h，TLC检测，反应完成后，减压浓缩，饱和食盐水(40mL×4)洗涤，有机相用无水MgSO₄干燥，减压浓缩，柱层析分离纯化(EA)，得2-(哌嗪-1-基)-4-(吡咯烷-1-基)嘧啶(化合物b)。

(3)0℃氮气保护下，向100mL双颈瓶中加入4-溴苯胺(0.366g，2.144mmol)，加入干燥二氯甲烷(20mL)搅拌溶解，再加入三乙胺(0.891mL，6.432mmol)，将三光气(0.216g，0.729mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液缓慢滴加到双颈瓶中，反应30min，将步骤(2)制备得到的2-(哌嗪-1-基)-4-(吡咯烷-1-基)嘧啶(0.5g，2.144mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液缓慢滴加到双颈瓶中，升至室温，反应过夜，TLC检测，反应完成后，饱和食盐水(30mL×3)洗涤，有机相用无水MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩，柱层析分离纯化(PE:EA＝1:1)，得白色固体，N-(4-溴苯基)-4-(4-(吡咯烷-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(化合物1)，产率40.1％。

C₁₉H₂₄N₆O；40.1％yield,white solid；1H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δppm 8.70(s,1H,NH),7.84(d,J＝5.8Hz,1H,pyrimidine),7.58-7.50(m,2H,Ar-H),7.31-7.23(m,2H,Ar-H),5.78(d,J＝5.8Hz,1H,pyrimidine),3.79-3.64(m,4H,piperazine),3.59-3.45(m,4H,piperazine),3.35(s,4H,pyrrolidine),1.90(s,4H,pyrrolidine).

实施例2

按照合成路线A制备N-(3,4-二氯苯基)-4-(4-(4-甲基哌啶-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(化合物2)：

实施例2与实施例1的区别在于：用4-甲基哌啶、3,4-二氯苯胺分别替换了实施例1步骤(1)中的吡咯烷、步骤(3)中的4-溴苯胺，其余与实施例1相同。得到N-(3,4-二氯苯基)-4-(4-(4-甲基哌啶-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(化合物2)，产率46.5％。

C₂₁H₂₆Cl₂N₆O；46.5％yield,white solid；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δppm 7.93(d,J＝6.1Hz,1H,Pyrimidine),7.63(d,J＝2.4Hz,1H,Ar-H),7.34(d,J＝8.7Hz,1H,Ar-H),7.25(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H,Ar-H),6.91(s,1H,NH),5.95(d,J＝6.1Hz,1H,Pyrimidine),4.35(d,J＝13.2Hz,2H,Piperidine),3.96-3.78(m,4H,piperazine),3.67-3.54(m,4H,piperazine),2.85(td,J＝12.8,2.5Hz,2H,Piperidine),1.82-1.59(m,3H,Piperidine),1.26-1.10(m,2H,Piperidine),1.00(d,J＝6.1Hz,3H,CH₃).

实施例3

按照合成路线A制备N-(3,4-二氯苯基)-4-(4-(4-苯基哌啶-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(化合物3)：

实施例3与实施例1的区别在于：用4-苯基哌啶、3,4-二氯苯胺分别替换了实施例1步骤(1)中的吡咯烷、步骤(3)中的4-溴苯胺，其余与实施例1相同。得到N-(3,4-二氯苯基)-4-(4-(4-苯基哌啶-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(化合物3)，产率42％。

C₂₆H₂₈Cl₂N₆O；42％yield,white solid；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δppm 7.98(d,J＝6.1Hz,1H,Pyrimidine),7.63(d,J＝2.4Hz,1H,Ar-H),7.41-7.31(m,3H,Ar-H),7.31-7.22(m,4H,Ar-H),7.00(s,1H,NH),6.01(d,J＝6.1Hz,1H,Pyrimidine),4.55(d,J＝13.1Hz,2H,Piperidine),3.87(dd,J＝6.7,3.8Hz,4H,piperazine),3.60(dd,J＝6.5,3.9Hz,4H,piperazine),2.98(td,J＝12.9,2.6Hz,2H,Piperidine),2.83(tt,J＝12.2,3.6Hz,1H,Piperidine),2.07-1.90(m,2H,Piperidine),1.73(qd,J＝12.6,4.1Hz,2H,Piperidine).

实施例4

按照合成路线B制备N-(2,5-二氯苯基)-4-(4-(4-(N-苯基丙酰胺基)哌啶-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(化合物4)：

(1)称取苯胺(0.833g，8.954mmol)溶于二氯甲烷(40mL)中，室温搅拌下依次加入冰醋酸(0.513mL)，Boc-哌啶酮(1.783g，8.954mmol)，反应30min后，分批加入三乙酰氧基硼氢化钠(2.84g，13.43mmol)，反应5h，TLC检测，反应完成后，饱和食盐水(40mL×4)洗涤，有机相用无水MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩，得1-Boc-N-苯基哌啶-4-胺(化合物d)，无需纯化直接进行下一步反应。

(2)0℃下，将步骤(1)制备得到的1-Boc-N-苯基哌啶-4-胺(1.502g，5.44mmol)溶于干燥二氯甲烷(30mL)，再将三氟乙酸(30mL)缓慢滴加到反应体系，升至室温，反应2h，TLC检测，反应完成后，用NaHCO₃调节pH至8，饱和食盐水(40mL×4)洗涤，有机相用无水MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩，柱层析分离纯化(PE:EA＝5:1)，得N-苯基哌啶-4-胺(化合物e)。

(3)0℃下，将三乙胺(2.378mL)滴加到2,4-二氯嘧啶(1.237g，8.36mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液中搅拌，再将步骤(2)制备得到的N-苯基哌啶-4-胺(1.473g，8.36mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液逐滴加到上述反应体系，升至室温，反应4h，TLC检测，反应完成后，饱和食盐水(30mL×3)洗涤，有机相用无水MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩，柱层析分离纯化(PE:EA＝50:1)，得1-(2-氯嘧啶-4-基)-N-苯基哌啶-4-胺(化合物f)。

(4)0℃下，将步骤(3)制备得到的1-(2-氯嘧啶-4-基)-N-苯基哌啶-4-胺(1.024g，3.554mmol)加入100mL茄形瓶中，用二氯甲烷(25mL)搅拌溶解，加入三乙胺(1.478mL)，再将丙酰氯(0.620mL)逐滴加入上述反应体系，升至室温，反应2h，TLC检测，反应完成后，饱和食盐水(30mL×3)洗涤，有机相用无水MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩，柱层析分离纯化(PE:EA＝5:1)，得N-(1-(2-氯嘧啶-4-基)哌啶-4-基)-N-苯基丙酰胺(化合物g)。

(5)称取步骤(4)制备得到的N-(1-(2-氯嘧啶-4-基)哌啶-4-基)-N-苯基丙酰胺(1.045g，3.036mmol)，无水哌嗪(0.261g，3.036mmol)，氢氧化钠(0.182g，4.555mmol)，依次加入到100mL圆底烧瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺(35mL)搅拌溶解，加热至100℃，反应10h，TLC检测，反应完成后，减压浓缩，饱和食盐水(40mL×4)洗涤，有机相用无水MgSO₄干燥，减压浓缩，柱层析分离纯化(EA)，得N-苯基-N-(1-(2-(哌嗪-1-基)嘧啶-4-基)哌啶-4-基)丙酰胺(化合物h)。

(6)0℃氮气保护下，向100mL双颈瓶中加入2,4-二氯苯胺(0.204g，1.268mmol)，加入干燥二氯甲烷(20mL)搅拌溶解，加入三乙胺(0.527mL，3.804mmol)，将三光气(0.128g，0.431mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液缓慢滴加到上述反应体系，反应30min，将步骤(5)制备得到的N-苯基-N-(1-(2-(哌嗪-1-基)嘧啶-4-基)哌啶-4-基)丙酰胺(0.5g，1.268mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液缓慢滴加到双颈瓶中，升至室温，反应过夜，TLC检测，反应完成后，饱和食盐水(30mL×3)洗涤，有机相用无水MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩，柱层析分离纯化(PE:EA＝1:1)，得白色固体，N-(2,5-二氯苯基)-4-(4-(4-(N-苯基丙酰胺基)哌啶-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(化合物4)，产率44.5％。

C₂₉H₃₃Cl₂N₇O₂；44.5％yield,white solid；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δppm 8.37(d,J＝2.5Hz,1H,NH),7.91(d,J＝6.1Hz,1H,Pyrimidine),7.50-7.40(m,3H,Ar-H),7.30(s,2H,Ar-H),7.18-7.04(m,3H,Ar-H),6.98(dd,J＝8.6,2.5Hz,1H,Ar-H),5.89(d,J＝6.2Hz,1H,Pyrimidine),4.96(ddd,J＝12.2,8.5,3.9Hz,1H,Piperidine),4.45(d,J＝13.3Hz,2H,Piperidine),3.87(dd,J＝6.7,3.9Hz,4H,piperazine),3.62(dd,J＝6.6,4.0Hz,4H,piperazine),2.96(t,J＝12.8Hz,2H,Piperidine),1.96(p,J＝6.7,6.0Hz,4H,Piperidine),1.39-1.25(m,2H,CH₂),1.07(t,J＝7.4Hz,3H,CH₃).

实施例5

按照合成路线B制备N-(3-氯-4-甲基苯基)-4-(4-(4-(N-苯基丙酰胺基)哌啶-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(化合物5)：

实施例5与实施例4的区别在于：用3-氯-4-甲基苯胺分别替换了实施例4步骤(6)中的2,4-二氯苯胺，其余与实施例4相同。得到N-(3-氯-4-甲基苯基)-4-(4-(4-(N-苯基丙酰胺基)哌啶-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(化合物5)，产率52.3％。

C₃₀H₃₆ClN₇O₂；52.3％yield,white solid；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δppm 7.90(d,J＝6.1Hz,1H,Pyrimidine),7.55-7.39(m,4H,Ar-H),7.21(dd,J＝8.3,2.2Hz,1H,Ar-H),7.18-7.05(m,3H,Ar-H),6.69(s,1H,NH),5.87(d,J＝6.1Hz,1H,Pyrimidine),4.95(tt,J＝12.2,3.8Hz,1H,Piperidine),4.44(d,J＝13.2Hz,2H,Piperidine),3.81(dd,J＝6.7,3.8Hz,4H,piperazine),3.56(dd,J＝6.6,3.9Hz,4H,piperazine),2.94(td,J＝13.0,2.4Hz,2H,Piperidine),2.33(s,3H,Ar-CH₃),1.96(p,J＝9.0,8.2Hz,4H,Piperidine),1.36-1.25(m,2H,CH₂),1.06(t,J＝7.4Hz,3H,CH₃).

实施例6

一种含实施例1化合物的片剂，每片片剂主要含下述重量配比的原料(mg)：活性成分(实施例1制备得到的化合物1)40mg、乳糖100mg、玉米淀粉40mg、硬脂酸镁1.5mg、乙醇10-15mL。

按本领域常规方法将上述原料、辅料混合、制粒、干燥、压片即获得片剂。

实验例1

1.1本发明实施例1至实施例5的化合物对TRPV1受体的体外活性检测

采用水母发光蛋白报告基因检测技术，细胞株稳定共表达水母发光蛋白和TRPV1受体。当受体受到激动时，细胞内的Ca²⁺增加，在Ca²⁺的参与下，腔肠素会将发光蛋白重构，在469nm处产生生物发光效应。通过对受刺激细胞内钙的释放导致产生的快速化学发光信号进行测量，能够筛选出对TRPV1受体有作用的待测样品。

化合物的TRPV1拮抗活性筛选实验做法为：将待测化合物和辣椒碱用DMSO配成10mM初始浓度，用台氏液稀释成0.1mM测试浓度，其中辣椒碱稀释成250nM。钙离子荧光探针初始浓度为5mM，用每毫升含有33mg Pluronic F-127的HBSS稀释成浓度为0.05mM。向每孔约含有10000个HEK-293-TRPV1细胞加10微升0.05mM浓度的钙离子荧光探针，37℃温孵。20分钟后，再加30μL含有1％FBS的HBSS，继续孵育40分钟。40分钟后，将细胞孔中HBSS及其他液体吸出，并用台氏液清洗细胞孔，然后每孔细胞加40μL浓度为0.1mM的待测化合物。每个化合物设置3个复孔，其中有3个细胞孔只加台氏液做空白对照，37℃下孵育30分钟，在激发波长488nm和发射波长526nm下测量荧光强度。然后每孔细胞加10μL浓度为250nM的辣椒碱，37℃孵育30分钟，在激发波长488nm和发射波长526nm下测量荧光强度。通过计算各组加辣椒碱前后的荧光强度差值来表征胞内钙离子相对浓度，以检测化合物对辣椒碱的拮抗程度，从而检测化合物对TRPV1受体的拮抗活性程度。

计算公式如下所示：

抑制率＝(空白组差值-实验组差值)/空白组差值*100％

空白组差值＝空白组加辣椒碱后荧光强度-空白组加辣椒碱前荧光强度

实验组差值＝实验组加辣椒碱后荧光强度-实验组加辣椒碱前荧光强度

激活率＝(空白组差值-实验组差值)/空白组差值*100％

空白组差值＝空白组加Forskolin后荧光强度-空白组加Forskolin前荧光强度

实验组差值＝实验组加Forskolin后荧光强度-实验组加Forskolin前荧光强度

结果如表1所示。

1.2本发明实施例1至实施例5的化合物对μ阿片受体的体外活性检测

Forskolin能够刺激人μ阿片受体高表达细胞株——OPRM1细胞cAMP的释放，而μ阿片受体激动剂能够抑制Forskolin刺激的cAMP释放。通过检测化合物对Forskolin刺激的cAMP释放的抑制作用，能够测定化合物对人μ阿片受体的激动活性。首先用一定浓度的Forskolin和不同浓度的待测化合物与人μ阿片受体高表达细胞株一起孵育。然后，使用Ultra cAMP试剂盒，基于时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)的原理，检测细胞中cAMP水平。

化合物的μ阿片受体的激动活性筛选实验做法为：CHO-K1OPRM1细胞培养于含双抗(100U/mL青霉素，100g/mL链霉素)与10％FBS的DMEM-F12培养基中。实验当天，用PBS/5mMEDTA分离细胞，离心收集。然后用Stimulation Buffer(14.5mL 1×HBSS,75μL 1M HEPES,30μL 250mM IBMX,200μL 7.5％BSAstabilizer,PH 7.4)重悬细胞，调整细胞浓度至1×105cells/mL。Stimulation Buffer中加入Forskolin(终浓度为1.5μM)与不同浓度化合物(终浓度为1000,200,40,8,1.6,0.32,0.064,0nM)，并以每孔5μL加入384孔板中。每孔再加入5μL细胞悬液(细胞量为500cells/孔)，室温孵育30min。然后，每孔加入5μL 4×Eu-cAMPtracer工作液(用cAMP Detection Buffer稀释Eu-cAMP stock solution 50倍)。然后每孔加入5μL 4×Ulight-anti-cAMP工作液(用cAMP Detection Buffer稀释ULight-anti-cAMPstock solution 150倍)。并在室温下孵育1h。384孔板用酶标仪(Perkin Elmer，Envision)TR-FRET方法检测cAMP水平，从而检测化合物对μ阿片受体的激活程度。各数值计算公式同实验例1.1，结果如表1所示。

表1

注：NE：空白对照组抑制率为0。

由表1可知，本发明制备得到的化合物1至化合物5对TRPV1抑制率和MOR的激活率均大于50％，说明受试化合物同时具有TRPV1抑制活性和MOR的激动活性。

实验例2

本发明实施例1至实施例5的化合物对小鼠疼痛模型的影响

为测试福尔马林诱导的小鼠舔足行为，本发明将小鼠按体重随机分组，每组6只。测试前30分钟腹腔注射给药，剂量均为30mg/kg，空白组给予等容积的0.5％CMC-Na。测试时将2％福尔马林溶液注射到后爪，然后在30分钟内评估小鼠对注射的爪子舔咬的反应。评估分为两个阶段，第一个阶段(0-5min)为急性痛，第二阶段(20-30min)为慢性痛。结果如表2所示。

表2

注：t检验，与空白组相比，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

由表2可知，在福尔马林诱导的疼痛模型中，本发明制备得到的化合物1至化合物5作用于实验小鼠后，第一阶段舔足时间在29.34-39.42s，相对于空白实验组时间短约24.5％-43.8％；第二阶段舔足时间在27.83-40.25s，相对于空白实验组时间短约26.5％-49.2％。由此可知本发明制备得到的化合物与空白组相比有显著差异，在第一阶段急性痛和第二阶段慢性痛中均表现出较强的镇痛作用。

综上，本发明提供了嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐，以该化合物作为活性成分的药物不仅对TRPV1显示出明显的抑制活性，同时也能够对MOR显示出明显的激动活性。本发明还提供了上述化合物的制备方法，具有反应条件温和的特点。本发明还提供了上述化合物在制备治疗和/或预防TRPV1和/或MOR介导的疾病的药物中的应用，该药物不仅可以阻断外周和中枢神经系统的疼痛传递，还可以减少与单一靶向相关的副作用，如MOR激动剂引起的恶心、嗜睡和呼吸抑制，以及TRPV1拮抗剂引起的伤害性热感减弱和明显的体温升高，具有良好的应用前景。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims

1.嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物具有结构通式Ⅰ：

式中R为

中的一种，Ar为卤代苯基。

2.如权利要求1所述嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，具体化合物为：

N-(4-溴苯基)-4-(4-(吡咯烷-1-基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺、

3.如权利要求1或2所述嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述药学上可接受的盐包括与下列酸形成的盐：盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、醋酸、三氟乙酸、丙酮酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、马来酸、苯磺酸或琥珀酸。

4.如权利要求1或2所述的嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，合成路线A包括以下步骤：

(2)将步骤(1)制备得到的化合物a、哌嗪、无机碱依次加入到反应容器中，加入有机溶液搅拌溶解，加热至95-105℃反应得到化合物b；

合成路线B包括以下步骤：

(8)将步骤(7)制备得到的化合物g、哌嗪、无机碱依次加入到反应容器中，加入有机溶液搅拌溶解，加热至95-105℃反应得到化合物h；

5.如权利要求4所述的嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述路线A步骤(1)、(3)和路线B步骤(4)、(5)、(6)、(7)、(9)的有机溶液为二氯甲烷，路线A步骤(2)、路线B步骤(8)的有机溶液为N,N-二甲基甲酰胺。

6.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包括权利要求1或2所述嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐、及其药学上可接受的载体。

7.如权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊、丸剂、栓剂、软胶囊、口服液、混悬剂或注射液中的一种或几种。

8.如权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，该药物剂型为片剂，每片包含以下重量的原料：活性成分40mg、乳糖100mg、玉米淀粉40mg、硬脂酸镁1.5mg、乙醇10-15mL，所述活性成分为权利要求1或2所述的嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐。

9.如权利要求1或2所述嘧啶基哌嗪脲类TRPV1拮抗/MOR激动双靶点化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防TRPV1和/或MOR介导的疾病的药物中的应用。