CN113302494B - 一种用革兰氏阴性细菌感染快速检测脓毒病的新方法 - Google Patents

Abstract

一种用革兰氏阴性细菌感染快速检测脓毒病的方法，包括：血液培养、动态取样、稀释、加热、旋转、进一步稀释，并用动态内毒素测定系统(K‑LPS‑A)和鲎变形细胞溶解物(TAL或LAL)进行测定。检测GNB感染的新方法比传统的BD BACTEC系统快得多(提前数小时至十几小时)，特别适用于检测细菌负荷较低的脓毒病的早期阶段，有助于在更早的时间内做出适当的治疗决策。

Description

一种用革兰氏阴性细菌感染快速检测脓毒病的新方法

技术领域

本发明涉及医学领域，更具体地涉及用革兰氏阴性细菌感染快速检测脓毒病的方法。

背景技术

脓毒病是最危险的情况，需要立即进行专用治疗，因为每小时延迟会使死亡率增加5-10％，导致高达～30％的死亡。脓毒病的高发病率主要与创伤、感染、主要器官功能障碍和许多疾病，如癌症、衰老等的末期有关。快速检测系统侵入的病原体对于挽救生命至关重要。

目前，血培养仍是脓毒病诊断的金标准，其利用累积到一定水平的代谢产物，用BDBACTEC系统触发阳性报告基因。对于～50％的脓毒病患者，这需要大约16-24小时，对于其余的患者，大约需要＞24小时，这对于快速制定治疗决策来说所需的时间太长了。此外，并非BD BACTEC系统都能检测到血液中的所有GNB。

Thomas等人报道，在培养物中发现12个样品是内毒素阳性而没有相应的GNB。在这12种阳性内毒素检测中的7种中，可以提供这些阳性检测的实验室或临床解释。这组数据表明，非常需要一种新的测定来补偿GNB感染中BD BACTEC系统的“盲点”。

然而，在许多脓毒病病例中，特别是在脓毒病发作期间，即使使用最灵敏的鲎试剂也难以检测出血液内毒素。有人提出，只有当血浆LPS＞0.5EU/ml时，才能确定GNB引起的内毒素。然而这仅发生在患有感染性休克或严重脓毒病的患者中，这对于有效治疗来说为时已晚。

因此，本领域迫切需要开发灵敏、快速的LPS检测的方法，从而协助早期诊断GNB脓毒症并有助于监测治疗效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不仅有助于早期诊断GNB脓毒症，还有助于监测治疗效果的灵敏LPS检测的新方法。

本发明第一方面，提供了一种检测脓毒病患者血液中革兰氏阴性菌(GNB)产生的内毒素的方法，所述方法包括：血液培养、动态取样、稀释、加热、旋转(spin)、进一步稀释，并用动态浊度TAL测定(KT-TALA)系统和鲎变形细胞溶解物(TAL或LAL)进行测定，所述动态浊度TAL测定(KT-TALA)系统包括：

(A)用于血液培养、取样、稀释、加热、旋转(spin)，进一步稀释和以最佳条件进行测试的技术和装置；

(B)特殊鲎变形细胞溶解物试剂；

(C)用于动态浊度TAL测定的读数器(KT-TALA)。

在另一优选例中，所述方法包括血液培养、动态取样、稀释、加热、旋转或离心(spin)、进一步稀释，并用动态内毒素测定系统(K-LPS-A)和鲎变形细胞溶解物(TAL或LAL)进行测定，所述动态内毒素测定系统(K-LPS-A)包括：

(A)用于血液培养、取样、稀释、加热、离心，进一步稀释和以最佳条件进行测试的技术和装置；

(B)特殊鲎变形细胞溶解物(TAL或LAL)试剂；

(C)用于动态浊度法、动态显色法或终点显色法的动态孵育读数器。

在另一优选例中，所述的鲎变形细胞溶解物包括鲎试剂TAL或鲎试剂LAL。

在另一优选例中，所述的系统中，组件(C)为用于动态浊度法、动态显色法或终点显色法的动态孵育读数器。

在另一优选例中，所述受试者是人和动物。

在另一优选例中，所述测试目标是由革兰氏阴性细菌(GNB)在血液中产生的内毒素脂多糖(LPS)。

在另一优选例中，所述测试试剂是东方鲎变形细胞溶解物，TAL。

在另一优选例中，所述测试试剂是美洲鲎变形细胞溶解物，LAL。

在另一优选例中，所述方法包括动态取样和动态读数。

在另一优选例中，所述动态取样是每1-2小时。

在另一优选例中，所述动态浊度读数用于LPS靶向TAL的凝胶化过程。

在另一优选例中，所述动态读数为基于LPS靶向鲎变形细胞溶解物(TAL或LAL)的凝胶化过程的动态浊度法。

在另一优选例中，所述动态读数为基于LPS靶向鲎变形细胞溶解物(TAL或LAL)的凝胶化过程中加入的显色底物的显色反应的动态显色法。

在另一优选例中，所述动态读数为基于LPS靶向鲎变形细胞溶解物(TAL或LAL)的凝胶化过程中加入的显色底物的显色反应的终点显色法。

在另一优选例中，用于血液培养、取样和测试的整个过程由装置完全自动化。

在另一优选例中，可以用于与LPS检测有关的所有领域。

本发明第二方面，提供了一种检测体系，包括：

(a)用于血液培养、取样、稀释、加热、旋转，进一步稀释和以最佳条件进行测试的技术和装置；

(b)特殊鲎变形细胞溶解物(TAL或LAL)试剂；

(c)用于动态浊度TAL测定的读数器(KT-TALA)；和

(d)鲎变形细胞溶解物(TAL)。

在另一优选例中，所述检测体系包括：

(a)用于血液培养、取样、稀释、加热、旋转(或离心)，进一步稀释和以最佳条件进行测试的技术和装置；

(b)特殊鲎变形细胞溶解物试剂；和

(c)动态内毒素测定系统(K-LPS-A)。

本发明第三方面，提供了一种本发明第二方面所述的检测体系的用途，用于制备检测脓毒病患者血液中革兰氏阴性菌(GNB)产生的内毒素(LPS)的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还用于检测脓毒病患者血液中革兰氏阴性菌(GNB)产生的内毒素脂多糖。

在本发明的第四方面，提供了一种体外检测脓毒病患者(或疑似脓毒病患者)血液中革兰氏阴性菌(GNB)产生的内毒素的方法，所述方法包括：

(a)提供一血液样本，所述血液样本来自脓毒病患者或疑似脓毒病患者；

(b)对所述血液样本进行血液培养，并在培养过程中，进行动态取样和动态读数；和

(c)基于动态读数，测定所述血液中革兰氏阴性菌(GNB)是否产生内毒素。

在另一优选例中，在步骤(c)中，所述测定包括定性测定(即判断血液中革兰氏阴性菌(GNB)是否产生内毒素)、或定量测定(给出血液中革兰氏阴性菌(GNB)产生内毒素的量化结果)。

在另一优选例中，在步骤(b)中，进行n次动态取样，n为4-50的正整数，较佳地n为5-30，更佳地n为6-20。

在另一优选例中，每两个动态取样之间的时间间隔为0.25-3小时，较佳地0.5-2小时，如每隔20分钟，30分钟，45分钟，或1小时。

在另一优选例中，在步骤(b)中，在动态取样中，包括：对取出的培养物进行稀释、加热、旋转离心(spin)、和进一步稀释。

在另一优选例中，在步骤(b)中，在动态读数中，用内毒素的动态检测法进行检测和读数。

在另一优选例中，所述的动态检测选自下组：动态浊度法、动态显色法、终点显色法、或其组合。

在另一优选例中，所述的稀释为2-50倍稀释，较佳地5-20倍稀释。

在另一优选例中，加热是加热到50℃至沸腾温度，较佳地60-100℃，更佳地70-100℃。

在另一优选例中，所述加热的处理时间为1-25分钟，较佳地2-20分钟，更佳地3-15分钟。

在另一优选例中，离心是离心取出沉淀(包括加热处理所产生固态物质)，并取上清液。

在另一优选例中，进一步稀释为2-10倍稀释，较佳地3-8倍稀释。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。

在另一优选例中，所述的方法是体外方法。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了疑似患有GNB感染的血液中LPS检测的新步骤。

图2显示了将结果与LPS标准曲线进行比较，以确定LPS在疑似血液中的GNB随时间增长时是否增加。

具体实施方式

经过广泛而深入的研究，本发明人首次意外地发现了一种在GNB感染的血液中检测LPS的新方法。具体地，本发明采用基于鲎试剂的动态检测系统(如K-LPS-A系统)，在体外检测GNB。与BD BACTEC系统相比，本发明的方法和系统(如K-LPS-A系统)可极大缩短检测时间。实验表明，在本发明中，检测GNB仅需9小时，这比传统BD BACTEC系统提早数小时至十几小时以上。此外，本发明的方法具有非常高的灵敏度。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“旋转(spin)”、“离心”可互换使用，指通过离心机的旋转进行离心操作。

鲎变形细胞溶解物

如本文所用，术语“特殊鲎变形细胞溶解物试剂”、“鲎变形细胞溶解物”、“鲎试剂”可互换使用，指来自鲎的用于检测内毒素的试剂，代表性的例子包括(但并不限于)：鲎试剂TAL或鲎试剂LAL。在本发明中，优选地，可使用灵敏度为0.2-1.0Eu/ml，较佳地0.25-0.5Eu/ml的鲎试剂。鲎试剂是检测内毒素优选试剂。

如本文所用，术语“鲎试剂TAL”或“TAL”可互换使用，指Tachypleus AmoebocyteLysate(TAL)，它是从东方鲎(Chinese horseshoe crab，Tachypleus tridentatus Leach)的血液中提取的鲎试剂。

如本文所用，术语“鲎试剂LAL”或“LAL”可互换使用，指Limulus AmebocyteLysate(LAL)，它是从北美鲎(North American horseshoe crab，Limulus polyphemus)的蓝血中提取的鲎试剂。

检测方法

在本发明中，对于疑似脓毒病的血液样本，先进行培养，并使用动态内毒素测定系统(K-LPS-A)动态测定由革兰氏阴性细菌(GNB)在血液中产生的内毒素(LPS)，从而对GNB脓毒病进行快速而灵敏的早期诊断。

在本发明中，来自GNB脓毒病的血液样本在合适温度(如37±2℃)下，在富含营养物中进行短时间(几小时)的培养，每隔一段时间(如约20分钟)GNB的数量快速加倍，从而大量产生/释放内毒素(如LPS)。产生的内毒素可通过K-LPS-A方法容易地检测到，并且比BDBACTEC系统血培养报告为LPS⁺GNB⁺脓毒病要早得多。

众所周知，由鲎(Limulus polyphemus)的阿米巴样细胞制备的鲎试剂是检测GNB的LPS的最敏感的试剂。鲎试剂的作用机制是内毒素激活丝氨酸蛋白酶C，然后激活丝氨酸蛋白酶B，并触发凝结酶的级联并形成凝胶，其可以用动态孵育读数器进行动力学记录。

在本发明中，可将这种灵敏的检测方法已广泛用于检测不同生物样本中的内毒素，如血液，尿液，腹水，胸腔积液，脑脊液，支气管肺泡灌洗液，空气和水。与传统的GNB培养试验相比，本发明基于鲎试验的检测更灵敏，更可靠。

在本发明中，代表性的基于鲎试剂的动态内毒素测定方法包括(但并不限于)：动态浊度法、动态显色法、终点显色法、或其组合。

动态浊度法、动态显色法、终点显色法，都是定量检测LPS的方法。按检测原理区分，动态浊度法是利用检测鲎试剂与LPS反应过程中的浊度变化而测定LPS含量的方法。动态显色法和终点显色法都是属于显色基质法。显色基质法是利用鲎试剂与LPS反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少而测定LPS含量的方法。

典型地，在本发明中，可采用动态内毒素测定系统(K-LPS-A)来进行基于鲎试剂的动态内毒素测定。

优选地，基于动态浊度法的检测方法可采用动态浊度TAL测定系统(KT-TALA)。

在本发明中，可以将检测值与标准值或标准曲线进行比较。例如，一种优选的方法是与标准曲线进行比较。

例如，当采用动态浊度法时，标准曲线的公式可以是公式Q1：

Log(Y)＝A*Log(X)+B (Q1)

其中，

Y＝反应时间(起始时间，如s、min或hr)，

A＝Y截距，

X＝内毒素浓度(如EU/ml)

B＝回归曲线的斜率。

例如，在一个实施例中，A为-0.279，B为5.95，R²(相关效率)为0.994。

如果使用相同的批次试剂和相同的程序完成标准曲线，则可以将其存储在读数器或数据库中，作为以下分析的参考。但是，如果试剂发生变化或程序发生变化，则需要重新创建新标准作为新参考。将未知样品的结果与LPS标准曲线进行比较，以确定疑似血液中的GNB随时间而增加时，LPS是否会随其一同增加。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明的方法可极大缩短诊断GNB的时间，便于早期诊断GNB脓毒症。

(2)本发明的方法具有非常高的灵敏度，防止漏检。

(3)与BD BACTEC系统相比，本发明采用的检测系统可极大缩短检测时间，即检测GNB仅需9小时，检测GNB脓毒病比传统BD BACTEC系统提早约20小时，从而为尽早治疗赢得宝贵的时机。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例中用到的材料和试剂如无特殊说明，均为市售产品。

实施例1快速检测疑似脓毒病患者培养血液中LPS的方法

在本实施例中，对疑似患有GNB感染的血液中LPS检测，采用新步骤进行。简言之，将3-5ml血液加入培养瓶中。2小时后，每隔一小时取0.5ml样品用于LPS的动态测试。在用动态浊度(KT-TALA)系统或其他动态内毒素测定系统(K-LPS-A)进行LPS定量测定之前，将样品稀释、加热、旋转(离心)并再次稀释。

实施例2参考标准的制定

用无内毒素的水重构冻干的内毒素标准储备液，稀释至50、10、1、0.1、0.01和0EU/ml的终浓度，在微量培养板上进行三次独立实验。向每个孔中加入100μl TAL试剂后，将板置于动态孵育读数器(BioTek^TMELx808IULALXH)中，并且该读数器立即开始用动力学测定程序测定内毒素水平。在波长630nm下每30秒记录凝胶形成30-60分钟。

对于这组研究，产生的公式是Log(Y)＝A*Log(X)+B，其中Y＝反应时间(起始时间)，A＝Y截距，X＝内毒素浓度，B＝回归曲线的斜率。在这组研究中，A为-0.279，B为5.95，R²(相关效率)为0.994。

实施例3加热对GNB样品释放的LPS和测定特异性的影响

基于以下知识：(1)LPS具有两种形式，游离LPS和与完整细胞壁相关的LPS(Jorgensen等人，1973)；和(2)热不仅可以促进LPS的释放，而且还可以变性/沉淀干扰物质，并有助于更灵敏的定量LPS，采用热量作为样品制备的必要步骤。

如表1所示，在4、5、6、7、8和9小时收集一系列培养的大肠杆菌样品，并进行加热或不加热，对同时制备的成对样品比较检测的LPS水平。在第4小时，未加热样品的LPS为0.144EU/ml，而加热样品的LPS为6.689EU/ml。类似地，在第5、6、7、8小时，未加热的样品相对缓慢地从0.326、0.999、4.237升至10.706EU/ml，并且在第9小时＞14.125EU/ml时，而在第5小时，加热时间达到10.854，相当于第8小时未加热的样品。后来，在第6小时，加热的样品达到＞14.125，相当于第9小时未加热的样品，这表明加热步骤可以将LPS从不可检测的形式显著增加到可检测的形式，并减少测定的干扰因素，从而显著促进早期GNB感染中的LPS的检测。

表1 加热对GNB样品释放的LPS和测定特异性的影响^#

^#用不含LPS的水以1∶4的比例稀释样品，在100℃加热10分钟，在450g下旋转3分钟，然后将上清液以1∶10的比例进一步稀释，用KT-TAL系统进行LPS测定。以相同的趋势重复实验三次，即在GNB大肠杆菌组中，加热的样品的LPS远高于未加热的样品(^*P＜0.05)，而在革兰氏阳性金黄色葡萄球菌组中，加热和未加热样品之间的LPS没有差异。

实施例4离心对LPS回收率的影响

在测定凝胶的形成时，LPS与鲎试剂反应，因此需要样品清洁和透明。然而，在加热和变性后，血液样本变得混浊，需要通过旋转(spin)离心去除混浊的物质。

表2显示离心的速度和时间可能影响LPS的回收率。在Allegra 21R离心机中使用1.5ml管旋转混浊物质，发现当以10,000rpm旋转3min时，LPS丢失率为14.97％，而在3,000rpm下3min时，LPS损失8.75％，类似于不旋转的6.55％。该数据表明LPS可在旋转过程中共沉淀。高速旋转比低速旋转下拉更多的LPS。优化的旋转速度为3,000rpm，持续3分钟。如果样品清洁且透明，则可能不需要旋转。旋转的速度和时间很大程度上取决于样品的透明度。

表2 离心对LPS损失的影响^*

^*将来自同一BD BACTEC瓶的培养5天的阴性培养基分成几管，每管加入标准的1EU/ml LPS，以不同速度离心，测定LPS并以(1-测定的LPS/1.045)×100％计算LPS损失率。

实施例5样品稀释对LPS测定结果的影响

具有3-10ml全血的BD BACTEC培养瓶含有大量可能与鲎试剂结合并阻止其与LPS凝胶化的组分，即使存在大量LPS也可能产生阴性结果。虽然加热/离心过程可去除一些具有大分子量的干扰物质，但在测定之前优化的稀释将有助于减少具有小分子量的干扰物质。

为了确定优化的稀释因子，在BD BACTEC瓶中培养了4个样品(1个正常血液，命名为M1；3个患者血液，命名为CN1，2，3)，每个样品分成两个管：一个作为背景，另一个加入标准的1EU的LPS。加热成对样品，以3000rpm旋转3分钟并在KT-TALA测定之前以不同的比例(1∶10，1∶20，1∶40或1∶100)稀释。

结果(表3)显示，在1∶10稀释组，所有4对成对样品未检测到LPS(＜0.007EU/ml)，这表明高水平的干扰因子阻断LPS-TAL凝胶化。在1∶20稀释组中，4个加标液也显示出非常低水平的LPS(0.01～0.025EU/ml)。在1∶40和1∶100稀释组中，加入样品中的所有加标液显示其LPS水平接近1EU，高回收率为97.66％-118.99％。数据支持只有在干扰物质被稀释到一定的低水平后，鲎试剂TAL试剂才能开始与LPS反应并形成凝胶。采用这种新方法，最佳稀释倍数为1∶40至1∶100。

表3 加标样品回收试验的样品稀释的优化^#

#：在标有-S的所有试管中加入1EU/ml LPS，检测到的LPS应为～1，＜1EU/ml，这表明存在一些抑制试验系统的强因子。

M1^*：将加3ml血液的培养基作为背景对照。

M1-S^*：向M1^*中加入标准的LPS(1EU/ml)以进行不同稀释度下的LPS回收(％)。

CN1^*，CN2^*，CN3^*：将不添加LPS的来自BD瓶的临床血培养阴性样品作为背景对照。

CN1-S^*，CN2-S^*，CN3-S^*：在不同稀释度下，向CN1^*，CN2^*，CN3^*中加入标准的LPS(1EU/ml)，用于计算不同稀释度下的LPS回收率(％)。

实施例6 KT-TALA系统与BD BACTEC系统之间GNB检测时间的比较

本实施例的目的是将血培养与KT-TALA测定相结合，检测GNB比传统的BD BACTEC系统早得多。为了验证，将0.5McF的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(作为测试)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(作为阴性对照)以1∶10^-8、1∶10^-9、1∶10^-11、1∶10^-12的系列比例进行稀释，将同样数量的细菌注入两个BD BACTEC瓶，一个用于BDBACTEC检测器报告阳性检测时间，另一个用于37℃细菌振荡培养箱(功能类似于BD BACTEC检测器)，每小时进行采样，每小时在培养后3小时开始，以确定LPS检测为阳性的第一个时间点。

独立实验的结果(表4)显示，在实验1中，当以1∶10^-8接种GNB(从0.5McF开始)时，K-LPS-A系统的LPS阳性报告时间为3小时，比BD BACTEC系统的细菌阳性报告时间早(6.5至7.5小时)。在实验2中进一步证实了这种LPS早期检测和对GNB的特异性，这表明LPS报告时间比细菌阳性报告时间早6.5至8.5小时，并且在革兰氏阳性金黄色葡萄球菌培养基中未检测到LPS。当培养瓶中的细菌数量较少时，LPS早期报告时间的优势更为明显，实验3证明，GNB在1∶10^-9，1∶10^-11，1∶10^-12(从0.5McF开始)的浓度下，LPS阳性报告时间分别比细菌阳性报告时间早13h，16h或17h。这可能意味着在低负荷细菌感染的脓毒病的早期阶段，BDBACTEC系统检测GNB需要22-26小时，而KT-TALA系统(作为K-LPS-A系统之一)检测GNB的LPS仅需9小时，这将有助于医生在更早的时间做出适当的治疗决定。

表4 KT-TAL比BD BACTEC系统更快地检测培养瓶中的GNB^*

^*将大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌(测试)和金黄色葡萄球菌(阴性对照)调节至0.5McF，并以1∶10⁸，1∶10⁹，1∶10¹¹或1∶10¹²的系列比例进一步稀释。

将两个等量的细菌注入两个BD BACTEC瓶中，一个瓶置于BD BACTEC检测器中用于GNB阳性检测报告的时间，另一个置于实验室37℃细菌振荡器用于每小时LPS取样，在培养后3小时开始。进行KT-TAL测定以在不同时间点检测GNB的LPS。通过减去两个报告时间来确定两次测定之间的阳性检测时间的差异。

实施例7新方法检测GNB脓毒病比传统BD BACTEC系统早得多

为了证明本发明方法可以比传统的BD BACTEC系统更早地检测到GNB感染的脓毒病，将来自疑似脓毒病的患者的10ml血液分别注射到两个BD BACTEC瓶中，每个注射5ml，其中一个用于BD BACTEC系统以报告病原体，另一个用于K-LPS-A系统测定，作为培养后不同时间的取样。BD BACTEC系统在28.5小时报告GNB病原阳性，而K-LPS-A系统检测到LPS在培养后12小时呈阳性，这表明本发明的新方法比传统BD BACTEC系统早16.5小时检测到GNB。感染的病原体被鉴定为鲍氏不动杆菌(acinetobacter baumannii)。

表5 鲍氏不动杆菌脓毒病患者培养样品中LPS的动态测试^*

^*将疑似脓毒病的患者的10ml血液分别注入2个BD BACTEC瓶中，各5ml，一个用于BD BACTEC系统报告病原体，另一个用于在指定时间点进行LPS的测定取样。在28.5小时，BDBACTEC系统报告病原体阳性，并且在培养后12小时检测到LPS，差异为16.5小时。感染的病原体被鉴定为鲍氏不动杆菌(acinetobacter baumannii)。

实施例8鲎变形细胞溶解物的来源对K-LPS-A系统的影响

鲎试剂是由海洋节肢动物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含有能被微量LPS激活的凝固酶原，凝固蛋白原，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，目前使用的鲎试剂来源于东方鲎试剂(TAL)或美洲鲎试剂(LAL)。

为确定鲎变形细胞溶解物的来源对K-LPS-A系统的影响，在本实施例中，选取了1、2、3、4、5和9小时收集一系列培养的大肠杆菌培养液，分别用东方鲎试剂(TAL)和美洲鲎试剂(LAL)检测，结果如下：

表6 鲎变形细胞溶解物的来源对K-LPS-A系统的影响^#

^#分别用东方鲎试剂(TAL)和美洲鲎试剂(LAL)检测不同培养时间的大肠杆菌培养液。

以相同的条件重复实验三次，变异系数均小于5％，表明东方鲎试剂(TAL)和美洲鲎试剂(LAL)检测LPS没有差异。

实施例9不同的动态检测方法对K-LPS-A系统的影响

在本实施例中，为了确定检测方法对K-LPS-A系统的影响，选取了国际标准品(CSE)稀释成多个浓度(10EU/ml、5EU/ml、1EU/ml、0.5EU/ml)，分别用动态浊度法、动态显色法、终点显色法稀释后的国际标准品(CSE)，结果如下：

表7 检测方法对K-LPS-A系统的影响^#

^#分别用动态浊度法、动态显色法、终点显色法检测检测不同培养时间的大肠杆菌培养液。

以相同的条件重复实验三次，变异系数均小于5％，这表明动态浊度法、动态显色法、终点显色法检测LPS没有差异。

讨论

脓毒病是一种危害生命的全身性感染，需要在快速测定病原体的基础上进行适当和快速的治疗。革兰氏阴性菌(GNB)是内毒素(LPS)作为其特征性替代生物标志物的主要致病病原体。

在本发明中，本发明人首先开发了一种新的快速而灵敏的体外检测方法。

在本发明中，首先通过GNB培养增加LPS，然后使用鲎变形细胞溶解物(如TAL或LAL)，通过动态内毒素测定系统(K-LPS-A)检测培养基的LPS。结果表明，在高GNB浓度下，LPS可在培养后3小时检测到，而BD BACTEC阳性报告在9.5-10.5小时，相比提前6.5-7.5小时；在低GNB浓度下，BD BACTEC系统检测GNB需要22-26小时，但K-LPS-A系统仅需9小时来检测GNB的LPS，提前13-17小时。

综上所述，本发明的检测GNB感染的新方法比传统的BD BACTEC系统快得多，特别是适用于检测细菌负荷较低的脓毒病的早期阶段，这将有助于在更早的时间内做出适当的治疗决策。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (16)

1.一种非诊断性的检测血液中革兰氏阴性菌产生的内毒素的方法，其特征在于，所述方法包括：血液培养、动态取样、稀释、加热、旋转、进一步稀释，并用动态浊度读数器和鲎变形细胞溶解物进行测定，所述动态浊度TAL测定系统包括：

(A)用于血液培养、取样、稀释、加热、旋转，进一步稀释和以最佳条件进行测试的技术和装置；

(B)鲎变形细胞溶解物试剂；以及

(C)用于动态浊度TAL测定的读数器；

所述的鲎变形细胞溶解物为鲎试剂LAL；

所述血液为全血；

并且，通过所述稀释和进一步稀释，在测定之前将样品稀释至1:40-1：100比例。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加热为100℃加热10分钟。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于检测由革兰氏阴性细菌在血液中产生的内毒素脂多糖。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动态取样是每1-2小时取样。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动态浊度法用于检测LPS靶向鲎变形细胞溶解物LAL的凝胶化过程。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用于血液培养、取样和测试的整个过程由装置完全自动化。

7.一种非诊断性的检测血液中革兰氏阴性菌产生的内毒素的方法，其特征在于，所述方法包括：血液培养、动态取样、稀释、加热、离心(spin)、进一步稀释，并用动态内毒素测定系统和鲎变形细胞溶解物进行测定，所述动态内毒素测定系统包括：

(A)用于血液培养、取样、稀释、加热、离心，进一步稀释和以最佳条件进行测试的技术和装置；

(B)特殊鲎变形细胞溶解物试剂；以及

(C)用于动态浊度法、动态显色法或终点显色法的动态孵育读数器；

所述的鲎变形细胞溶解物为鲎试剂LAL；

所述血液为全血；

并且，通过所述稀释和进一步稀释，在测定之前将样品稀释至1:40-1：100比例。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，加热为100℃加热10分钟。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括动态取样和动态读数。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述动态浊度法用于检测LPS靶向鲎变形细胞溶解物LAL的凝胶化过程。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述动态显色法用于检测LPS靶向鲎变形细胞溶解物的凝胶化过程中加入的显色底物的显色反应。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述终点显色法用于检测LPS靶向鲎变形细胞溶解物的凝胶化过程中加入的显色底物的显色反应。

13.一种非诊断性的体外检测血液中革兰氏阴性菌产生的内毒素的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)提供一血液样本；

(b)对所述血液样本进行血液培养，并在培养过程中，进行动态取样和动态读数；和

(c)基于动态读数，测定所述血液中革兰氏阴性菌(GNB)是否产生内毒素；

在步骤(b)中，在动态取样中，包括：对取出的培养物进行稀释、加热、旋转离心、和进一步稀释；

步骤(b)中，在动态读数中，用内毒素的动态检测法进行检测和读数；并且，所述的动态检测选自下组：动态浊度法、动态显色法、终点显色法、或其组合；

所述动态检测法用鲎变形细胞溶解物进行测试；

所述的鲎变形细胞溶解物为鲎试剂LAL；

所述血液为全血；

并且，通过所述稀释和进一步稀释，在测定之前将样品稀释至1:40-1：100比例。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，进行n次动态取样，n为4-50的正整数。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，进行n次动态取样，n为5-30的正整数。

16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，进行n次动态取样，n为6-20的正整数。