CN113278713B - 绵羊多角性状的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种分析绵羊多角性状的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用，涉及生物技术领域，本发明提供了270个体现绵羊多角性状的SNP位点组合，以及基于该位点组合形成的分子探针组合、基因芯片、试剂盒，利用本发明提供的位点组合及分子探针组合、基因芯片、试剂盒能对绵羊个体的多角性状进行分析，对早期难以度量的多角性状进行个体选择，缩短世代间隔，加速育种进程，节约大量的育种成本。

Description

绵羊多角性状的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及生物检测技术领域，更具体的涉及绵羊多角性状分子探针组合、基因芯片、试剂盒及应用。

背景技术

绵羊是世界上最重要的经济动物之一，品种资源，而多角绵羊是其中一类珍贵的绵羊遗传资源，研究者将头上长有两只以上角的绵羊定义为多角绵羊（如图1所示），其中以四个角的表型居多，也叫四角绵羊，它仅存在于少数古老的绵羊品种中，且很多多角绵羊品种已处于濒危状态，各国都开展了相关的保种和育种工作，如建立多角羊保护协会以促进多角羊群体的保种、育种和商业交流。目前在欧洲、美洲的多角绵羊品种主要包括Icelandic羊、Manx Logthan羊和Hebridean羊等。我国也有四个多角绵羊品种，包括泗水裘皮羊、阿勒泰羊、蒙古羊、巴什拜羊。由于生产管理上的不便，使得多角绵羊个体在这些品种中的比例非常低，有的濒临灭绝。另一方面，由于这些多角绵羊具有较高的观赏价值，近些年来，作为非传统绵羊品种，多角绵羊品种培育及基础研究越来越受到人们的重视。

然而，绵羊角的表型很难在早期发现，只能待其生长到半岁至1岁才会确定。因此借住以DNA为基础的诊断间接测定多角表型成为研究者们关注的领域。Alderson等认为角的遗传是由两个位点调控的，两个位点都为隐性纯合时，则绵羊为多角表型。Icelandic绵羊的研究表明，在多角性状和两角性状这一对表型中，多角为显性遗传。对Jacob sheep和Navajo-Churro sheep两个国外多角绵羊品种研究表明，在绵羊2号染色体132Mb处存在多角表型的关联位点。对我国蒙古羊、阿勒泰羊和泗水裘皮羊进行全基因关联分析发现，在绵羊2号染色体上132.6Mb处，存在与绵羊多角性状显著相关的SNP标记。中国专利文献CN105603092A也发现位于绵羊MTX2基因下游53449bp处的多角性状的SNP标记，但是，能够决定表型的SNP通常是高度复杂的。

正如已经商业化的绵羊SNP芯片（Illumina Ovine SNP50 Beadchip（50K）、Illumina Sheep HD Genotyping Beadchip（680K）和Illumina Ovine LD（5K）），覆盖了绵羊全基因组的超过 54K 个 SNP 位点，用于遗传育种、全基因组关联分析、数量性状基因座定位、基因优选及比较基因组学等研究，尽管集合了如此众多的SNP位点。但是现有的绵羊SNP芯片由于主要依据西方品种绵羊的数据，缺乏中国绵羊品种与国外绵羊品种结合的SNP 数据，仍存在位点均匀性不足、对功能性位点和区域的体现不足、超过10%的位点在中国绵羊群体为极低频位点等诸多问题，因此设计一款适用于中国绵羊群体且能对多角性状进行快速有效检测SNP芯片，有着十分重要的意义。

发明内容

为满足我国当前绵羊品种研究和保护上对绵羊多角性状的分析需求，本发明提供了一种分析绵羊多角性状的分子探针组合、基因芯片、试剂盒及应用，利用本发明提供的SNP位点信息，能够快速准确的实现绵羊多角性状评价、品种筛选、品种鉴定、品种溯源、绵羊育种，有利于绵羊系谱的重构、种质资源保护以及种质资源改良，耗时短、成本低、市场效益广阔。

为实现本发明的技术目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面、本发明提供270个SNP位点组合在分析绵羊多角性状中的应用，所述270个SNP位点组合的物理位置为：位于chr 2第132825735位，其脱氧核苷酸为A或T；位于chr 2第132825818位，其脱氧核苷酸为T或G;位于chr 2第132825839位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132826220位，其脱氧核苷酸为A或C；位于chr 2第132826222位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132826454位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第132826730位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132826732位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132826954位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132828895位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 2第132830333位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 2第132830887位，其脱氧核苷酸为T或A；位于chr 2第132833221位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132833405位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132833590位，其脱氧核苷酸为G或C ；位于chr 2第132833591位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 2第132833609位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132833616位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132833773位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132833921位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第132834401位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第132834792位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第132835651位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132836846位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第132837168位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132837588位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132837658位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132837669位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132837930位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132838045位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132838653位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132838666位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132838811位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132839013位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132839228位，其脱氧核苷酸为A或T；位于chr 2第132839669位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第132839909位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132840355位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132840473位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132841002位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132841062位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132841268位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 2第132841617位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第132843091位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132843869位，其脱氧核苷酸为A或T；位于chr 2第132843961位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132844298位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132845871位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132846379位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132846593位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第132847560位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 2第132848537位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132848553位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132848571位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132848655位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132849740位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132849948位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132850299位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132851592位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132851628位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132851666位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132851943位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132852031位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132852614位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 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2第60039203位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60039264位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60039289位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 2第60039979位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60039983位，其脱氧核苷酸为T或A；位于chr 2第60039984位，其脱氧核苷酸为T或A；位于chr 2第60040077位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60040285位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 2第60040356位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60040370位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60040394位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60040460位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60040864位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60041430位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60041451位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60041497位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60041692位，其脱氧核苷酸为T或A；位于chr 2第60041693位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60041860位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60041956位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60041995位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 2第60042020位，其脱氧核苷酸为T或A；位于chr 2第60042033位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60042172位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60042216位，其脱氧核苷酸为A或T；位于chr 2第60042509位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60043014位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60043145位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60043293位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 2第60043902位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60044053位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60044127位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60044264位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第60044277位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60044651位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第60045018位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第60045047位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60045167位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60045177位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60045321位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60045359位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60045460位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60046216位，其脱氧核苷酸为G或C；位于chr 2第60046371位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60046394位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60046528位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60046575位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60046895位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60047094位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60047361位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60047487位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60047565位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60047944位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60049078位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60049161位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60049242位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60049601位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60049944位，其脱氧核苷酸为A或C；位于chr 14第49900552位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 14第49900557位，其脱氧核苷酸为A或C；位于chr 14第49900667位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 14第49900687位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49900836位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49900869位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 14第49902973位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 14第49903271位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 14第49903544位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 14第49904575位，其脱氧核苷酸为G或C；位于chr 14第49905719位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 14第49907188位，其脱氧核苷酸为A或C；位于chr 14第49909362位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 14第49911215位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49913851位，其脱氧核苷酸为A或C；位于chr 14第49914228位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49914836位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49915022位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49916264位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49917274位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 14第49917475位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49918153位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 14第49918227位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49918801位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 14第49919012位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49920199位，其脱氧核苷酸为A或T；位于chr 14第49920546位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49920578位，其脱氧核苷酸为G或C；位于chr 14第49921119位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49921368位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 14第49922915位，其脱氧核苷酸为G或C；位于chr 14第49922962位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49923824位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49923890位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49923961位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 14第49924343位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49924545位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 14第49924595位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49925613位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49927635位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49931011位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49932355位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49933240位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49938363位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 14第49940937位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49946445位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49947099位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49947928位，其脱氧核苷酸为G或A；

其中，上述位点的物理位置信息基于绵羊 v4.0基因组序列比对确定。

第二方面、本发明提供一种分析绵羊多角性状的方法，将待测绵羊的基因组DNA的270个SNP位点基因型与对照绵羊基因组DNA的所述270个SNP位点基因型进行比较；所述270个SNP位点为第一方面所述的270个SNP位点。

第三方面、本发明提供一种分析绵羊多角性状的分子探针组合，所述分子探针组合检测待测样品中的第一方面所述的位点信息。

第四方面、本发明提供一种分析绵羊多角性状的基因芯片，其负载有第三方面所述的分子探针组合。

第五方面、本发明提供一种分析绵羊多角性状的试剂盒，其具有第三方面所述分子探针组合或第四方面所述的基因芯片。

第六方面、本发明提供一种分析绵羊多角性状的方法，应用第三方面所述的分子探针组合或第四方面所述的基因芯片或第五方面所述的试剂盒对待测样品进行检测。

第七方面、本发明提供第三方面所述的分子探针组合或第四方面所述的基因芯片或第五方面所述的试剂盒具有如下任一所述的用途：（1）在绵羊多角性状评价中的应用；（2）在绵羊品种鉴定中的应用；（3）在绵羊品种溯源中的应用；（4）在种羊系谱重构中的应用；（5）在绵羊种质资源保护中的应用；（6）在绵羊种质资源改良中的应用；（7）在绵羊品种筛选的应用；（8）在绵羊育种中的应用。

有益效果：

1、 本发明基于对国内外众多绵羊的遗传资源研究，提供一种仅由270个SNP位点组成的绵羊多角性状SNP位点组合，本发明提供的SNP位点组合能快速从基因水平上在表型未显现的早期对绵羊个体的多角性状进行检测，以判断绵羊的多角性状，对多角绵羊进行有效的保种，同时还能缩短世代间隔，加速育种进程，节约成本；此外，利用本发明提供的多角性状SNP位点组合，还能够从多角表型的角度实现绵羊品种的鉴定和溯源，为种质资源保护和种质资源的改良提供技术支持。

2、基于本发明提供的绵羊多角性状SNP位点形成的探针组合、基因芯片、试剂盒与现有的高密度芯片相比，通量小、成本低，分析更容易，普适性广，市场前景广阔。

附图说明

图1是具有多角性状的绵羊的照片；

图2是泗水裘皮羊Vs 小尾寒羊（SSS versus SXW）组的曼哈顿图；

图3是本申请对群体阈值分析的判定结果进行了显著性检验的结果图。

具体实施方式

下面参考具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《生物信息学与功能基因组学》原著第三版或者相关书籍进行，所采用的生物信息软件和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用材料来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

此外，还需要说明的是，本发明提供的位点组合及应用均是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才得以完成。

在本文前述的位点组合部分中所描述的特征和优点，同样适用于基于位点组合所形成的分子探针组合、基因芯片、试剂盒以及其应用，在此不再赘述。

需要说明的是，本发明所称的绵羊多角性状是根据绵羊角的数量划分，只有两只角的为少角，具有两只以上的角为多角。

本发明的所称的SNP是指单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，所述单个核苷酸的变异包括由单个碱基的转换、颠换、插入或缺失所导致的变异。

需要说明的是，本发明所称的分子标记为一切可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，包括但不限于基于分子杂交的分子标记，如RFLP、MinisatelliteDNA；基于PCR技术的分子标记，如RAPD、STS、SSR和SCAR；基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记；基于DNA芯片技术的分子标记，如SNP；基于EST数据库发展的分析标记技术等。本发明提供的分子标记可以用于基因组作图、和基因定位研究、基于图谱的基因克隆、物种亲缘关系和系统分类等。

需要说明的是，本发明所称的探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)，例如Taqman-MGB探针。

需要说明的是，本发明所称的试剂盒为本领域常规使用的任意一种包含检测或实验所用试剂，便于操作人员能够摆脱繁重的试剂配制及优化过程的盒子。在本发明的一个实施例中，其中包含有扩增本发明提供的位点信息的引物、检测本发明提供的位点信息的分子标记或探针或基因芯片，还包括扩增所用的酶和缓冲液，或者还检测用的荧光标记。

实施例1多角性状SNP位点组合的获得

1、绵羊个体的选择

为了实现国内外绵羊品种的更加全面的覆盖，申请人对遍布于亚洲、欧洲、非洲和中东的248个绵羊个体进行遗传信息采集，其中包括16个野羊亚洲摩弗伦品种、172个地方品种和60个培育品种，具体涉及到中国山东的小尾寒羊、泗水裘皮羊、大尾寒羊、洼地绵羊，中国江苏的湖羊，中国宁夏的滩羊，中国新疆的阿勒泰羊、巴什拜羊、杜泊绵羊、中国美利奴羊（细毛羊）、中国美利奴羊（超细毛羊）、萨福克羊、策勒黑羊、多浪羊、Waggir Sheep羊，芬兰的芬兰羊（Finnsheep）、荷兰的威桑岛羊（Ouessant）、设德兰羊（Shetland）、索洛格诺羊（Solognote）、哥特兰岛羊（Gotland）、德伦特希思羊（Drente Heathen），埃塞俄比亚的邦加羊（Bonga Sheep）、阿法尔羊（Afar Sheep），尼日尔的姆博罗罗羊（Mbororo Sheep），尼日利亚的扬卡羊（Yankasa Sheep），非洲乍得的西非矮羊（West African Dwarf Sheep）、乌达羊（Uda Sheep），非洲布基纳法索的贾隆凯羊（Djallonké Sheep）、摩西羊（Mossi Sheep）、萨赫勒羊（Sahelian Sheep），西非喀麦隆的喀麦隆羊（Cameroon Sheep），伊拉克的阿华西绵羊（Awassi Sheep）、哈姆达尼羊（Hamdani Sheep），阿塞拜疆的马泽克羊（Mazekh Sheep），伊朗的灰设拉子羊（Grey-Shiraz Sheep）、盖泽尔羊（Ghezel Sheep）、阿夫沙里羊（AfshariSheep）、沙尔羊（Shal Sheep）、马奎羊（Makui Sheep）、莫哈尼羊（Moghani Sheep），巴基斯坦的卡拉库尔羊（Karakul Sheep），伊朗舍赫尔科德的亚洲摩弗伦（Asiatic mouflon）。

2、绵羊全基因的总SNP集合的获得

采用本领域常规方法采集步骤1中绵羊个体中载有遗传信息的样本，该样本包括但不限于血液、细胞、组织、皮肤、毛发、排泄物等。提取样本中的遗传信息（例如DNA）进行高深度测序，利用SAMtools和GATK两种方式与2015 年发布的绵羊4.0 参考基因组（从NCBI获得）进行对比，并将两种方式获得共同结果形成一个SNP集合，共计2836万个SNP位点，作为绵羊全基因的总SNP集合。

需要说明的是，本发明所称的遗传信息（genetic information） 是指生物为复制与自己相同的东西、由亲代传递给子代、或各细胞每次分裂时由细胞传递给细胞的信息。

需要说明的是，提取样本中的遗传信息（例如DNA）进行高深度测序可以由生物公司完成，例如华大基因公司，illumina公司等，高深度测序方法采用本领域常规方法或生物公司的方法，在本发明的一个实施例中，采用平均测序深度为~25.7×，应用重测序分析流程进行高深度测序。

3、候选基因及所在功能区域的筛选

3.1 对不同多角性状的绵羊遗传信息样本处理

筛选不同多角性状的绵羊品种，并根据不同绵羊品种在多角性状上表现出来的显著差异，对相应的遗传信息样本进行分组，在本发明的一个实施例中，发明人将泗水裘皮羊Vs 小尾寒羊（SSS versus SXW）为一组。

3.2 对分组后不同多角性状的绵羊遗传信息的处理

应用XP-CLR扫荡每个绵羊组之间的多基因座等位基因频率差异，扫描出与多角性状相关的功能区域（扫描得到的曼哈顿图如图2所示，其中，图2为泗水裘皮羊Vs 小尾寒羊（SSS versus SXW），同时利用π ratio（即π值）挖掘每组中的绵羊品种中与多角性状相关的功能区域，然后取两种结果的交集，筛选出多角性状相关的功能区域。

参照已公开的基因研究成果对区域内的基因进行筛选，最终确定7个与多角性状相关的、功能十分确定的候选基因PCSK5、HOXD3、HOXD1、HOXD10、HOXD9、HOXD8、MEGF8，进而通过perl脚本确定上述候选基因对应的功能区域。

4、多角性状SNP位点组合的获得

利用bedtools在总的SNP集合中寻找步骤3中确定的候选基因所在功能区域对应的SNP位点，得到与PCSK5、HOXD3、HOXD1、HOXD10、HOXD9、HOXD8、MEGF8共7个多角性状相关的功能基因相关联，且仅包含270个snp位点的多角性状位点组合。

实施例2将多角性状SNP位点组合用于制备引物组合及探针组合

本领域技术人员根据本发明提供的多角性状SNP位点组合中的每一个位点的序列信息设计引物，并将设计得到的引物利进行二级结构评估和Tm值评估，最终获得特异性好、灵敏度高，并且可以在同一反应条件下实现检测目的的引物。

其中，二级结构评估及Tm值评估可以采用本领域常用的任一一种方式进行，例如采用DNA folding form评估其二级结构，具体参见

，然后采用软件RaW-Probe评估其Tm值。

上述方法均为常规方法，根据本申请提供的多角性状SNP位点组合中的位点信息，不再需要付出创造性劳动的情况下就能获得，因此，根据本申请提供的多角性状SNP位点组合获得引物也属于本发明的保护范围。

同样的，利用本发明提供的多角性状SNP位点组合制备探针，例如tanqman探针也属于本发明的保护范围。

实施例3 将多角性状SNP位点组合用于制备基因芯片

本申请的SNP基因芯片是采用常规方法将实施例2获得的引物或探针固定在聚合物基片上，例如尼龙膜、硝酸纤维膜、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等，或将探针固定在玻璃板上，或在玻璃等硬质表面上直接合成实施例2获得的引物或探针，本申请的SNP基因芯片的使用方法与常规方法相同。

需要说明的是，本领域技术人员可以采用任一一种方式制备检测绵羊多角性状的SNP基因芯片，同样也可以委托生物公司制备，但是基于本申请提供的多角性状SNP位点组合制备的SNP基因芯片均属于本发明的保护范围。

实施例4 绵羊多角性状的分析试剂盒

本申请的提供的多角性状SNP检测试剂盒包括基于实施例1获得的SNP位点组合获得的引物或探针或基因芯片。根据使用类型的不同，还包括相应的检测试剂，例如当基于实施例1获得的SNP位点组合获得的为Taqman探针时，还包括荧光定量PCR反应常规使用的缓冲液、连接酶、AceQUniversal U+ Probe Master Mix V2，TaqMan Probe等。

本领域技术人员根据使用方式的不同配置不同的绵羊多角性状检测的SNP试剂盒，但是基于本申请提供的多角性状SNP位点组合配置的绵羊多角性状SNP检测试剂盒均属于本发明的保护范围。

实施例5绵羊多角性状的检测

基于本申请的实施例1提供的绵羊多角性状SNP位点组合设计的基因芯片对采购的21只的羊羔进行多角性状检测，同时培育羊羔至成年，观察成年羊的角性状，其中，多角的判断结果表示角的数量大于2个以上，少角的判断结果表示角的数量只有2个，基因检测结果及观察结果如表1所示：

表1 试验结果

样本	检测结果	观察结果
			H01、H08、H09、H10、H11、H20	多角	3-6个角
H02-H07、H12-H19、H21	少角	两个角

根据表1的结果可以看出，利用本发明提供的多角性状SNP位点设计的基因芯片的检查结果与观察结果一致。

本发明通过采集试验绵羊的外周血并提取其中的DNA，利用基因芯片提取的DNA进行分析，获得每只羊羔中每个位点的分型结果（即每个位点是否为纯合子、杂合子、突变型纯合子或碱基缺失的结果），计算每个位点的分型结果的频率值，并与群体阈值进行比较，获得检测结果。

需要说明的是，本申请的所述群体阈值是通过对多角群体，少角群体进行分析获得，方法同上。

本申请对多角群体，少角群体进行分析的判定结果进行了显著性检验（独立样本曼惠特尼U检验），结果如图3所示，根据图中结果可以看出，P<0.01，差异极显著，可见采用本发明方法进行判定的结果具有准确性和有效性。

工业应用

本领域技术人员基于本申请提供的仅由270个SNP位点组成的绵羊多角性状SNP位点组合可以制成的绵羊多角性状的SNP探针组合及SNP芯片，在基因组水平上对绵羊个体的多角性状进行评价，从而在早期进行育种选择，缩短世代间隔，节约大量的育种成本，有利于多角绵羊品种保护，有助于多角绵羊的溯源，建议种羊系谱，进行种质资源保护和种质资源改良。

以上所述仅为帮助理解本发明的优选实例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员在此基础上对本发明作出的各种改动或者修改，同样应属于本发明的范围。

Claims (7)

1.270个SNP位点组合在分析绵羊多角性状的应用，所述270个SNP位点组合的物理位置为：位于chr 2第132825735位，其脱氧核苷酸为A或T；位于chr 2第132825818位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第132825839位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132826220位，其脱氧核苷酸为A或C；位于chr 2第132826222位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132826454位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第132826730位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132826732位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132826954位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132828895位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 2第132830333位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 2第132830887位，其脱氧核苷酸为T或A；位于chr 2第132833221位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132833405位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132833590位，其脱氧核苷酸为G或C；位于chr 2第132833591位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 2第132833609位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132833616位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132833773位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132833921位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第132834401位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第132834792位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第132835651位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132836846位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第132837168位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132837588位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132837658位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132837669位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132837930位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132838045位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132838653位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132838666位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132838811位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132839013位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132839228位，其脱氧核苷酸为A或T；位于chr 2第132839669位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第132839909位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132840355位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132840473位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132841002位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132841062位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132841268位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 2第132841617位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第132843091位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132843869位，其脱氧核苷酸为A或T；位于chr 2第132843961位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132844298位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132845871位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132846379位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132846593位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第132847560位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 2第132848537位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132848553位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132848571位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132848655位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132849740位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132849948位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132850299位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132851592位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132851628位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132851666位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132851943位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132852031位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132852614位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132852897位，其脱氧核苷酸为A或C；位于chr 2第132854512位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132854948位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132855519位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132855701位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第132855868位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132855969位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 2第132856384位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第132856707位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132857538位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132857775位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132858280位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132858747位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第132859330位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132859435位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第132860032位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132860207位，其脱氧核苷酸为G或C；位于chr 2第132860248位，其脱氧核苷酸为A或C；位于chr 2第132861376位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132861784位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132863365位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132863782位，其脱氧核苷酸为T或A；位于chr 2第132863870位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132863952位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132865640位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第132868112位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132868454位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132870246位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132872192位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第132872449位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第132872527位，其脱氧核苷酸为A或T；位于chr 2第132872748位，其脱氧核苷酸为A或T；位于chr 2第132873251位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132873521位，其脱氧核苷酸为A或C；位于chr 2第132874646位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132875222位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第132876030位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132876681位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132877049位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第132877364位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132881057位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132881098位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132882535位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132882608位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132882853位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132883132位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132883789位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 2第132883989位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第132884643位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 2第132884690位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第132891838位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第132892087位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第60001530位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 2第60001673位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60001691位，其脱氧核苷酸为G或C；位于chr 2第60002923位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60006808位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60006908位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 2第60007631位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60007812位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60012432位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60012594位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60014923位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60015029位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 2第60015359位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60015544位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60016466位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60017733位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60017736位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60017952位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 2第60018220位，其脱氧核苷酸为G或C；位于chr 2第60018874位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60021082位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60021298位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60021417位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60022459位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60022896位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60023802位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60024130位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60024907位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60025366位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60029085位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60029750位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 2第60032390位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60033975位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60034509位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60035422位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60035442位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60035538位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60035773位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60036154位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60036201位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60036339位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60036369位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60036453位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 2第60037337位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第60037642位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60037928位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60038626位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60038775位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60039203位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60039264位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60039289位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 2第60039979位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60039983位，其脱氧核苷酸为T或A；位于chr 2第60039984位，其脱氧核苷酸为T或A；位于chr 2第60040077位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60040285位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 2第60040356位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60040370位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60040394位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60040460位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60040864位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60041430位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60041451位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60041497位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60041692位，其脱氧核苷酸为T或A；位于chr 2第60041693位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60041860位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60041956位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60041995位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 2第60042020位，其脱氧核苷酸为T或A；位于chr 2第60042033位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60042172位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60042216位，其脱氧核苷酸为A或T；位于chr 2第60042509位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60043014位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60043145位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60043293位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 2第60043902位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60044053位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60044127位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60044264位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第60044277位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60044651位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第60045018位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 2第60045047位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60045167位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60045177位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60045321位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60045359位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60045460位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60046216位，其脱氧核苷酸为G或C；位于chr 2第60046371位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60046394位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60046528位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 2第60046575位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60046895位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60047094位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60047361位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60047487位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60047565位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 2第60047944位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60049078位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60049161位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60049242位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 2第60049601位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 2第60049944位，其脱氧核苷酸为A或C；位于chr 14第49900552位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 14第49900557位，其脱氧核苷酸为A或C；位于chr 14第49900667位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 14第49900687位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49900836位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49900869位，其脱氧核苷酸为T或G；位于chr 14第49902973位，其脱氧核苷酸为C或A；位于chr 14第49903271位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 14第49903544位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 14第49904575位，其脱氧核苷酸为G或C；位于chr 14第49905719位，其脱氧核苷酸为C或G；位于chr 14第49907188位，其脱氧核苷酸为A或C；位于chr 14第49909362位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 14第49911215位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49913851位，其脱氧核苷酸为A或C；位于chr 14第49914228位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49914836位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49915022位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49916264位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49917274位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 14第49917475位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49918153位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 14第49918227位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49918801位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 14第49919012位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49920199位，其脱氧核苷酸为A或T；位于chr 14第49920546位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49920578位，其脱氧核苷酸为G或C；位于chr 14第49921119位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49921368位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 14第49922915位，其脱氧核苷酸为G或C；位于chr 14第49922962位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49923824位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49923890位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49923961位，其脱氧核苷酸为G或T；位于chr 14第49924343位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49924545位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 14第49924595位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49925613位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49927635位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49931011位，其脱氧核苷酸为C或T；位于chr 14第49932355位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49933240位，其脱氧核苷酸为A或G；位于chr 14第49938363位，其脱氧核苷酸为G或A；位于chr 14第49940937位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49946445位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49947099位，其脱氧核苷酸为T或C；位于chr 14第49947928位，其脱氧核苷酸为G或A；

其中，上述位点的物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列比对确定。

2.分析绵羊多角性状的方法，将待测绵羊的基因组DNA的270个SNP位点基因型与对照绵羊基因组DNA的所述270个SNP位点基因型进行比较；

其中，所述270个SNP位点为权利要求1所述的应用中的270个SNP位点组合。

3.分析绵羊多角性状的分子探针组合，所述分子探针组合检测待测样品中的权利要求1所述的应用中的270个SNP位点信息。

4.分析绵羊多角性状的基因芯片，所述基因芯片负载有权利要求3所述的分子探针组合。

5.分析绵羊多角性状的试剂盒，其具有权利要求3所述的分子探针组合或权利要求4所述的基因芯片。

6.分析绵羊多角性状的方法，应用权利要求3所述的分子探针组合或权利要求4所述的基因芯片或权利要求5所述的试剂盒对待测样品进行检测。

7.权利要求3所述的分子探针组合或权利要求4所述的基因芯片或权利要求5所述的试剂盒的用途，其具有如下任一所述的用途：

(1)在绵羊多角性状评价中的应用；

(2)在绵羊品种鉴定中的应用；

(3)在绵羊品种溯源中的应用；

(4)在种羊系谱重构中的应用；

(5)在绵羊种质资源保护中的应用；

(6)在绵羊种质资源改良中的应用；

(7)在绵羊品种筛选的应用；

(8)在绵羊育种中的应用。

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