CN113278619B

CN113278619B - 双sgRNA、基因敲除载体、基因敲除STING基因的猪成纤维细胞系及其构建方法

Info

Publication number: CN113278619B
Application number: CN202110810993.9A
Authority: CN
Inventors: 王塑天; 张昆丽; 杨烨城; 黄秋艳; 孟繁明; 李剑豪
Original assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Animal Husbandry
Current assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Animal Husbandry
Priority date: 2021-07-19
Filing date: 2021-07-19
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2041-07-19
Also published as: CN113278619A

Abstract

本发明属于生物技术领域，其公开了一种双sgRNA，为靶向第四外显子的STING‑sgRNA 1‑3中之一和靶向第八外显子的STING‑sgRNA 4‑5中之一的组合。该双sgRNA搭载到表达载体上之后能够得到合适的基因敲除载体，以大片段敲除猪成纤维细胞STING基因，由此得到的猪成纤维细胞系具有适于克隆、无敲除基因修复能力、无外源基因引入的猪成纤维细胞系。同时，本发明还公开了该猪成纤维细胞系的构建方法。

Description

双sgRNA、基因敲除载体、基因敲除STING基因的猪成纤维细胞系及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种双sgRNA、基因敲除载体、基因敲除STING基因的猪成纤维细胞系及其构建方法。

背景技术

我国是世界上最大的猪肉生产和消费国，随着人民生活水平日益提高，我们对高产优质猪的需求逐渐增加。猪产品作为连接我国居民生活与猪产业健康发展的关键环节，其品质安全是我国畜牧业关注的焦点。猪瘟、猪链球菌病、仔猪腹泻等常见猪病的发生对我国养猪产业造成严重影响，严重危害我国猪产业安全。我国农业农村部第194号公告部署已经明确提出在我国的猪产业中实施减抗/禁抗饲养。然而在实施禁抗后的一段过程中，农户的畜禽发病率、死亡率和治疗用药的使用量可能会大幅提高，从而导致养殖水平可能在短期内下降，成本上升，行业将不可避免出现短期困难。因此深入了解关键抗病基因在猪抗病原菌感染中发挥的功能是猪抗病育种工作中的重要环节。

干扰素刺激因子STING(又名TMEM173，MITA，ERIS或MPYS)，是广泛存在于树突状细胞、巨噬细胞、T细胞、内皮细胞等细胞中的一种模式识别受体。STING基因编码379个氨基酸，当STING未活化时以二聚体形式通过其N端跨膜结构域锚定于内质网上，其C端含有一个球型结构域，位于细胞质中。活化的STING从内质网经高尔基体迁移至细胞核周围，在此处招募TBK1并引起其磷酸化，进而激活IRF3信号通路，诱导I型干扰素表达，激活免疫反应。除了IRF3，STING也能激活NF-κB、MAPK以及JNK/ERK信号通路，诱导细胞分泌炎症因子。不同病原微生物通过两种不同的方式激活STING，环二核苷酸(CDNs)中c-di-GMP和c-di-AMP作为关键的第二信使信号分子只能由细菌自身合成，这些CDNs通过氢键和疏水作用结合至STING二聚体的U型空隙中，导致STING构象发生变化而被激活，进而诱导I型干扰素产生。除此之外，进入胞质中的细菌/病毒双链DNA(dsDNA)可以被环GMP-AMP合酶(cGAS)识别结合，并催化合成环腺苷酸-鸟苷酸(cGAMP)，其可以直接与内质网上的STING结合，进而激活I型干扰素信号。许多病原微生物可以通过STING影响免疫细胞产生I型干扰素，进而影响机体的抗菌、抗病毒天然免疫反应。目前对STING基因的研究大部分集中于模式动物中，对猪源STING功能研究认知有限，猪STING基因在影响机体炎症、天然免疫等反应方面还有待探索。

CRISPR/Cas9系统是继锌指核酸酶和转录激活样效应因子核酸酶技术之后，于2012年起发展起来的第三代基因组编辑技术。 CRISPR 相关蛋白来源于古细菌，该蛋白仅利用一个短引导 RNA (guide RNA) 通过碱基配对识别靶点DNA，便可以完成对靶序列进行编辑。这些 CRISPR 间隔序列通常是噬菌体基因组上的特定序列，构成了 CRISPR 抗病毒的自然防御体系。此外CRISPR/Cas作为位点特异性核酸酶具有编辑效率高、靶点选择广以及操作简便等优势，并且可以同时对一个或多个基因进行编辑，为生物育种及医学基础研究拓展了方法道路。

STING基因影响机体炎症和天然免疫反应，在机体抗病原微生物感染中发挥着重要作用，可作为猪抗病育种的重要候选基因。然而目前尚未有关于猪STING基因大片段敲除载体以及猪STING基因敲除的猪成纤维细胞系构建的相关报道。

CN201910720572 .X公开了一种利用CRISPR-Cas9载体及慢病毒包装技术构建猪源细胞Sting敲除细胞株。所述构建方法能够成功构建猪源Sting蛋白缺失的稳定细胞株，该细胞株可作为工具细胞，用于研究Sting蛋白在细胞抗病毒感染过程中的作用抑制；探索其作为疫苗生产细胞株，保护易感动物免受口蹄疫病毒感染的可能性。

sting敲除猪源细胞的构建方法，包括以下步骤：/n1)针对5条sgRNA序列中的任意一条，设计引物，合成引物，退火，得到引物二聚体，将所述引物二聚体连入慢病毒CRISPR-Cas9载体，得到靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体；/n2)提取无内毒素步骤1)所述靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，得到无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体，将无内毒素的靶向猪源Sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒载体与包装质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2混合，共转染293T包装细胞，收获慢病毒；/n3)将步骤2)得到的慢病毒感染猪源细胞后在细胞培养液中培养，24小时后更换细胞培养液，加入puromycin或者hygromycin B进行筛选，筛选存活的细胞；/n4)加入puromycin或者hygromycin B 48小时后，消化细胞，以每孔1个细胞的密度接种于96孔板，使用完全培养液连续培养1～2周后，将细胞传代至12孔板；细胞长满后传代，传代同时取部分细胞提取核酸和蛋白，通过western blot和DNA测序鉴定筛选出sting敲除猪源细胞。

在其说明书中记载，其猪源细胞为PK-15细胞，即猪肾细胞，或，ST-40细胞，即猪睾丸细胞。

上述方法存在的缺陷在于：

1、上述方法制备得到的细胞株无法进行克隆。

2、采用上述慢病毒载体的方法会引入外源基因，对后续的克隆操作存在极大的不确定性风险。

3、上述方法仅仅进行了Sting基因的敲除，无法保证在后续的克隆过程中细胞并不会自动修复该缺失。

4、上述方法得到的细胞株必须经过测序才能确定Sting基因是否被敲除。

所以本案解决的技术问题是：如何开发出一款适用于克隆的、彻底杜绝细胞在克隆过程中敲除基因自动修复的情况、不引入外源基因的相关的双sgRNA、基因敲除载体、基因敲除STING基因的猪成纤维细胞系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双sgRNA，该双sgRNA搭载到表达载体上之后能够得到合适的基因敲除载体，以大片段敲除猪成纤维细胞STING基因，由此得到的猪成纤维细胞系具有适于克隆、无敲除基因修复能力、无外源基因引入的猪成纤维细胞系。同时，本发明还公开了该猪成纤维细胞系的构建方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种双sgRNA，为靶向第四外显子的STING-sgRNA 1-3中之一和靶向第八外显子的STING-sgRNA 4-5中之一的组合；

其中，靶向第四外显子的STING-sgRNA 1-3的正向序列和反向序列分别如核苷酸序列NO.1和NO.2、核苷酸序列NO.3和NO.4、核苷酸序列NO.5和NO.6所示；

靶向第八外显子的STING-sgRNA 4-5正向序列和反向序列分别如核苷酸序列NO.7和NO.8、核苷酸序列NO.9和NO.10所示。

其中，核苷酸序列NO.1～NO.10如下所示：

STING-sgRNA1-F:5’- CACCGGAATACACGCTCCGGTGGCT -3’（核苷酸序列NO.1）；

STING-sgRNA1-R: 5’- AAACAGCCACCGGAGCGTGTATTCC-3’（核苷酸序列NO.2）；

STING-sgRNA2-F:5’- CACCGAGAATACACGCTCCGGTGGC -3’（核苷酸序列NO.3）；

STING-sgRNA2-R: 5’- AAACGCCACCGGAGCGTGTATTCTC -3’（核苷酸序列NO.4）；

STING-sgRNA3-F:5’-CACCGAGCCACCGGAGCGTGTATTC-3’（核苷酸序列NO.5）；

STING-sgRNA3-R:5’-AAACGAATACACGCTCCGGTGGCTC-3’（核苷酸序列NO.6）；

STING-sgRNA4-F:5’- CACCGATCCTGTGACATGGCGAACA -3’（核苷酸序列NO.7）；

STING-sgRNA4-R:5’- AAACTGTTCGCCATGTCACAGGATC -3’（核苷酸序列NO.8）；

STING-sgRNA5-F: 5’-CACCGCCGGGAGGATCGGCTCGAGC-3’（核苷酸序列NO.9）；

STING-sgRNA5-R: 5’-AAACGCTCGAGCCGATCCTCCCGGC-3’（核苷酸序列NO.10）。

在上述的双sgRNA中，所述靶向第四外显子的STING-sgRNA 的正向序列和反向序列如核苷酸序列NO.1和NO.2或核苷酸序列NO.3和NO.4所示；靶向第八外显子的STING-sgRNA的正向序列和反向序列如核苷酸序列NO.7和NO.8所示。

更为优选地，所述靶向第四外显子的STING-sgRNA的正向序列和反向序列如核苷酸序列NO.3和NO.4所示；所述靶向第八外显子的STING-sgRNA的正向序列和反向序列如核苷酸序列NO.7和NO.8所示。

同时，本发明还公开了一种基因敲除载体，将如上所述的双sgRNA重组入表达载体中，得到基因敲除载体。

在上述的基因敲除载体中，所述表达载体为pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒。

在实际应用中，除了使用px459载体外，该实验同样也可以选择PX330和PX458载体，只不过对转染阳性的克隆的筛选方法有差异，px330、px458转染后需要使用流式细胞仪对转染阳性的细胞进行筛选，对仪器设备要求高。同时如果操作不熟练或仪器使用环境有问题，容易造成对分选出细胞的污染，导致实验失败。而px459转染阳性细胞的筛选仅在细胞培养皿内就可以完成，对设备、操作要求低，相对不易发生污染。

此外，本发明还公开了一种基因敲除STING基因的猪成纤维细胞系的构建方法，采用如上所述的基因敲除载体转染猪成纤维细胞，经药物筛选去除未敲除STING基因的细胞，挑取单克隆细胞培养扩大。

在上述的基因敲除STING基因的猪成纤维细胞系的构建方法中，采用嘌呤霉素进行药物筛选，至少经两次筛选。

最后，本发明公开了一种猪成纤维细胞系，采用如上所述的构建方法得到。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

以ZFN和TALEN技术为基础的基因编辑系统在进行基因敲除载体构建时，往往需要复杂的操作流程且试验的花销成本很高。而本发明中构建并使用的基因敲除载体为CRISPR/Cas9系统。该技术不仅可以简单、高效地试验对靶基因的定点敲除，并且不会引入外源标记基因，因此获得的基因敲除细胞系可以作为体细胞核移植的供体，为基因编辑猪的制备提供素材，为深入挖掘STING基因在病原微生物感染中发挥的作用的研究提供基础。

本发明采用的双sgRNA靶向敲除STING基因的方法可以在STING基因第四外显子和第八外显子产生两个DNA双链断裂，不仅可以增加基因组突变发生的频率，还可以得到2个sgRNA之间大片段缺失的敲除细胞株，造成基因的缺失突变。

此外，按本发明方法构建的基因敲除细胞株，由于存在基因的大片段缺失，通过特定引物，仅通过PCR方法就可以对发生大片段基因缺失的细胞进行快速鉴定。

本发明通过向猪成纤维细胞转染CRISPR-Cas9表达载体，可以在不引入任何外源基因的情况下获得的猪STING基因敲除细胞系。

相比于经STING基因敲除的PK-15和ST-40细胞不能用于后续克隆操作，本发明的细胞系可作为体细胞核移植的供体，为制备基因编辑猪提供素材。

同时，本发明的细胞系由于存在大片段基因缺失，相比于传统STING基因敲除的技术，其在后续的克隆过程中，不会产生细胞自动修复基因敲除部分的风险。

本发明的研究内容可为研究猪瘟、猪链球菌病等猪源疾病以及猪抗病育种提供研究工具。

本发明的敲除载体可以简单、快速、高效地达到STING基因大片段敲除的目的。

本发明的大片段敲除STING基因的猪成纤维细胞的方法可以在不引入任何外源基因的情况下获得的猪STING基因敲除细胞系。该细胞系可作为体细胞核移植的供体，为制备基因编辑猪提供素材。

本发明的STING基因敲除的成纤维细胞，对研究猪瘟、猪链球菌病等猪源疾病以及猪抗病育种具有重要意义，对研究大型哺乳动物机体天然免疫和炎症反应具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的PX459载体骨架图；

图2为本发明实施例1提供的STING大片段敲除PCR验证电泳图；

图3为本发明实施例1提供的STING大片段敲除的PCR产物测序结果分析；

图4为本发明实施例1提供的转染不同sgRNA转染组合后细胞中STING蛋白的表达水平；

图5为本发明实施例2提供的STING基因大片段缺失的PCR产物测序结果分析图；

图6为本发明实施例2提供的STING基因功能缺失细胞系中STING功能缺失结果验证图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

靶向STING基因的CRISPR/Cas9打靶载体的构建

1、利用NCBI数据库搜索猪STING的基因序列（Gene ID: 100217389），定位STING在基因组中不同转录本的重叠区的第一个外显子（第四外显子）和最后一个外显子（第八外显子）段，用于靶点设计。

利用网站http://crispor.tefor.net/设计sgRNA。其中靶向第四外显子的sgRNA片段分别命名为：STING-sgRNA1、STING-sgRNA2、STING-sgRNA3；靶向第八外显子的sgRNA片段分别命名为：STING-sgRNA4、STING-sgRNA5。根据BbsΙ限制性内切酶在sgRNA两端添加粘性末端，其方式为：在sgRNA序列5’端添加碱基CACCG得到正向片段；若sgRNA序列5’端第一个碱基不是G，则在sgRNA反向互补链的3’端加CAAA碱基序列并在5’端添加C碱基，作为反向片段；若sgRNA序列5’端第一个碱基为G，则在sgRNA反向互补链的3’端添加CAAA碱基序列作为反向片段。

最终得到的对应sgRNA序列如下：

STING-sgRNA3-F:5’-CACCGAGCCACCGGAGCGTGTATTC-3’（核苷酸序列NO.5）；

STING-sgRNA3-R:5’-AAACGAATACACGCTCCGGTGGCTC-3’（核苷酸序列NO.6）；

STING-sgRNA5-F: 5’-CACCGCCGGGAGGATCGGCTCGAGC-3’（核苷酸序列NO.9）；

构建靶向STING基因的CRISPR/Cas9打靶载体

pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0载体骨架如图1所示，具体构建方法如下：

（1）将合成的寡聚核苷酸（如核苷酸序列NO.1-NO.10中所示的3对靶向第四外显子的STING-sgRNA和2对靶向第八外显子的STING-sgRNA）退火为双链，退火反应条件为95℃，5min，然后自然冷却至室温；

（2）将pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒 (Addgene#62988) 载体用内切酶BbsΙ进行酶切，具体酶切体系如下表：

酶切的工艺条件按照内切酶BbsΙ的说明书进行。

（3）将回收纯化后的PX459线性化产物（即（2）中经过酶切的载体，命名为PX459线性化载体）与分别与退火的双链STING-sgRNA1至双链STING-sgRNA5,16℃连接过夜，得到连接产物PX459-STING-sgRNA，连接体系如下表：

（4）将（3）中的连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞进行重组质粒扩增。

于42℃处理连接产物与感受态混合液的离心管2 min，随后取出离心管冰浴3min，加入1 mL无抗LB液体培养，37℃，220 rpm，震荡培养60 min。

将复苏好的菌液吸取200μL均匀涂布在含氨苄抗性的LB 固体培养皿中，37℃恒温培养箱倒置培养12 h。

（5）挑取单菌落继续扩大培养并测序，测序引物为U6启动子通用引物。对连接正确的菌落使用质粒去内毒素大提试剂盒提取质粒备用。

打靶效率检测

当成纤维细胞汇合度达到约60%时，使用Lipofectamine3000(LifeTechnologies，Carlsbad，USA)进行转染，每转染500ngPX459-STING-sgRNA加入1.5μLlip3000。

其中表达载体组共分为7组，分别为：

PX459空载组；

PX459-STING-sgRNA1+PX459-STING-sgRNA4组；

PX459-STING-sgRNA1+PX459-STING-sgRNA5组；

PX459-STING-sgRNA2+PX459-STING-sgRNA4组；

PX459-STING-sgRNA2+PX459-STING-sgRNA5组；

PX459-STING-sgRNA3+PX459-STING-sgRNA4组；

PX459-STING-sgRNA3+PX459-STING-sgRNA5组。

转染6h后换用含抗生素的新鲜培养基。

转染两天后，提取细胞基因组DNA，进行PCR扩增，并对PCR进行测序。

PCR鉴定所用的引物为STING-F1：5’-TGGATTTCTTGGTTCCTACAG-3’和STING-R1：5’-CGAGTCCTCACCCTGGTAGA-3’。扩增条件为95℃，5min；95℃，10s；58℃，30s；72℃，30s；72℃，5min；35个循环。

若琼脂糖凝胶出现195bp大小条带可以判定改细胞存在STING基因大片段缺失，反之则不会出现任何条带，PCR鉴定结果见图2，PCR产物测序结果见图3。同时提取细胞总蛋白，进行Western blotting，检测STING蛋白敲除效率，检测结果如图4。

结果表明：共转PX459-STING-sgRNA1+PX459-STING-sgRNA4组

和PX459-STING-sgRNA2+PX459-STING-sgRNA4组的猪成纤维细胞都会出现STING基因的大片段敲除。并且PX459-STING-sgRNA2+PX459-STING-sgRNA4组敲除效率更高，是所有组中对STING基因敲除效果最好的。优选地，在后续实验中使用该组合共转染细胞。

图4结果显示了PX459-STING-sgRNA2+PX459-STING-sgRNA4组敲除效率更高，是对敲除组合效率的确定。（sg2+4）处STING条带明暗度更低，说明STING蛋白表达水平最少，说明PX459-STING-sgRNA2+PX459-STING-sgRNA4组对STING基因敲除效率最高。

实施例2

基因敲除STING基因的猪成纤维细胞系的构建

（1）将上述切割效率高的质粒（实施例1中的经过筛选的表达载体组，PX459-STING-sgRNA2+PX459-STING-sgRNA4组）。用脂质体转染法重新转染细胞，转染24 h后用1.5µg/mL的嘌呤霉素对转染的细胞进行药筛处理3天，经2轮筛选后，对照组细胞全部死亡，将实验组细胞消化后，通过有限稀释法挑取单克隆细胞并扩大培养。

（2）对所有挑取的单核克隆细胞进行鉴定，提取细胞的基因组DNA进行PCR鉴定。PCR鉴定所用的引物为STING-F1：5’-TGGATTTCTTGGTTCCTACAG-3’（核苷酸序列NO.11）和STING-R1：5’-CGAGTCCTCACCCTGGTAGA-3’（核苷酸序列NO.12）。

扩增条件为95℃，5min；95℃，10s；58℃，30s；72℃，30s；72℃，5min；35个循环。若琼脂糖凝胶出现195bp大小条带可以判定改细胞存在STING基因大片段缺失，反之则不会出现任何条带。

为了进一步确定出现PCR阳性结果的细胞株为STING基因大片段缺失的细胞株，继续将PCR产物送测序，测序结果与野生型参考序列进行对比，确定在两个靶点之间发生大片段缺失，缺失片段大小为4963bp，如图5所示。

（3）STING基因敲除猪成纤维细胞株Western blotting验证：为进一步确认STING基因编码的蛋白丧失功能，分别提取野生型猪成纤维细胞、control（转染空载）和STING基因功能缺失的单克隆细胞株的总蛋白。如图6所示，在猪成纤维细胞中由于STING基因大片段缺失引起的蛋白翻译突变导致了STING基因功能缺失。

综上所述，本发明采用的双sgRNA靶向敲除STING基因的方法可以在STING基因第四外显子和第八外显子产生两个DNA双链断裂，不仅可以增加基因组突变发生的频率，还可以得到2个sgRNA之间大片段缺失的敲除细胞株，造成基因的缺失突变。

本发明通过向猪成纤维细胞转染CRISPR-Cas9表达载体，可以在不引入任何外源基因的情况下获得的猪STING基因敲除细胞系。该细胞系可作为体细胞核移植的供体，为制备基因编辑猪提供素材。为研究猪瘟、猪链球菌病等猪源疾病以及猪抗病育种提供研究工具。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

序列表

<110> 广东省农业科学院动物科学研究所

<120> 双sgRNA、基因敲除载体、基因敲除STING基因的猪成纤维细胞系及其构建方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

caccggaata cacgctccgg tggct 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

aaacagccac cggagcgtgt attcc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

caccgagaat acacgctccg gtggc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

aaacgccacc ggagcgtgta ttctc 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

caccgagcca ccggagcgtg tattc 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

aaacgaatac acgctccggt ggctc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

caccgatcct gtgacatggc gaaca 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 8

aaactgttcg ccatgtcaca ggatc 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 9

caccgccggg aggatcggct cgagc 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 10

aaacgctcga gccgatcctc ccggc 25

<210> 11

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 11

tggatttctt ggttcctaca g 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 12

cgagtcctca ccctggtaga 20

Claims

1.一种双sgRNA，其特征在于，包括靶向STING基因的第四外显子的sgRNA和靶向STING基因的第八外显子的sgRNA；

其中，所述靶向STING基因的第四外显子的sgRNA的正向序列和反向序列如核苷酸序列NO.1和NO.2、核苷酸序列NO.3和NO.4中任一所示；所述靶向STING基因的第八外显子的sgRNA的正向序列和反向序列如核苷酸序列NO.7和NO.8所示。

2.一种基因敲除载体，其特征在于，将如权利要求1所述的双sgRNA重组入表达载体中，得到基因敲除载体。

3.根据权利要求2所述的基因敲除载体，其特征在于，所述表达载体为pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒。

4.一种基因敲除STING基因的猪成纤维细胞系的构建方法，其特征在于，采用如权利要求2或3所述的基因敲除载体转染猪成纤维细胞，经药物筛选去除未敲除STING基因的细胞，挑取单克隆细胞培养扩大；

转染猪成纤维细胞的具体操作为：当成纤维细胞汇合度达到60%时，使用Lipofectamine3000 进行转染，每转染500ng基因敲除载体加入1.5μL Lipofectamine3000 。

5.根据权利要求4所述的基因敲除STING基因的猪成纤维细胞系的构建方法，其特征在于，采用嘌呤霉素进行药物筛选，至少经两次筛选。