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CN113278073A - 一种nkg2a纳米抗体及其应用 - Google Patents

一种nkg2a纳米抗体及其应用 Download PDF

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CN113278073A CN202110683827.7A CN202110683827A CN113278073A CN 113278073 A CN113278073 A CN 113278073A CN 202110683827 A CN202110683827 A CN 202110683827A CN 113278073 A CN113278073 A CN 113278073A
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Abstract

本发明涉及一种NKG2A纳米抗体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明所述NKG2A纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。采用本发明提供的NKG2A纳米抗体能够特异性结合NKG2A蛋白，灵敏度为0.532μg/ml，可用于免疫组织化学和WesternBlotting法检测组织中NKG2A的表达，为NKG2A基因功能的研究提供方法。

Description

一种NKG2A纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种NKG2A纳米抗体及其应用。
背景技术
骆驼科动物(羊驼、骆驼)和软骨鱼体内的一种天然缺失重链但仍然具有生物活性的特异性抗体称单域抗体，单域抗体的抗原结合位点(VHH)具有独立的抗原识别能力，独立表达的VHH又被称为纳米抗体。与传统的四联体抗体相比，纳米抗体的主要特点有：分子量小，结构简单，理化性质稳定等。纳米抗体的优良特性使其在多种方面具有优势：在抗体进入机体方面，纳米抗体能够穿过动物机体内的一些保护性屏障进入发病部位发挥作用，如血脑屏障、血睾屏障等；在抗原抗体结合方面，能够结合一些隐蔽的抗原表位，特别适用于比较难得到抗体的靶点，如GPCR、离子通道和酶活中心等；在降低生产成本方面，纳米抗体结构简单易于体外表达，同时体外表达不易产生包涵体，生产工艺简单。
NKG2A是NKG2家族中的“抑制性”成员，主要表达在CD56hiNK细胞、NKT细胞和CD8+αβT细胞亚群中。非经典MHC I类分子HLA-E是NKG2A-CD94的主要配体，表达水平比经典MHC I类分子低约25倍，在大多数正常组织中都有表达，NKG2A与HLA-E的相互作用能抑制NK细胞和T细胞的激活。NKG2A抑制剂能促进T细胞和NK细胞的抗肿瘤能力，有望和现有的免疫疗法互补，更好地治疗癌症患者。同时，更多肿瘤相关免疫检查点的开发对于给癌症患者提供选择尤为重要，而NKG2A是多种肿瘤如黑素瘤的免疫检查点。目前，还没有特异性结合NKG2A蛋白的纳米抗体的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种NKG2A纳米抗体及其应用。本发明所述NKG2A纳米抗体固有的分子量小、理化特征稳定、亲和力高和结构简单易于重组表达制备，能够穿过血脑屏障，在疾病的诊断与治疗中有较大的应用前景。采用本发明提供的NKG2A纳米抗体能够特异性结合NKG2A蛋白，灵敏度为0.532μg/ml，可用于免疫组织化学和Western Blotting法检测组织中NKG2A的表达。
本发明提供了一种NKG2A纳米抗体，所述NKG2A纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
优选的是，编码所述NKG2A纳米抗体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述技术方案所述NKG2A纳米抗体在制备结合NKG2A蛋白的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的NKG2A纳米抗体在制备结合NKG2A蛋白的免疫组织化学试剂中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的NKG2A纳米抗体在制备结合NKG2A蛋白的WesternBlotting检测试剂中的应用。
本发明提供了一种NKG2A纳米抗体及其应用。利用噬菌体展示技术进行淘筛，噬菌体展示技术能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，进而通过亲和富集法筛选表达有特异性蛋白质的噬菌体。本发明采用噬菌体展示实验技术研发的NKG2A纳米抗体能够特异性结合NKG2A蛋白，对NKG2A蛋白的灵敏度为0.532μg/ml，可用于免疫组织化学和Western Blotting法检测组织中NKG2A的表达。
附图说明
图1为本发明提供的Western Blotting对纯化的NKG2A-VHH-His检测；
图2为本发明提供的考马斯亮蓝检测纯化的NKG2A-VHH检测；
图3为本发明提供的WesternBlot法用NKG2A-VHH纳米抗体检测脾组织中NKG2A蛋白的表达；
图4为本发明提供的免疫组织化学法用NKG2A纳米抗体检测小鼠脾脏中NKG2A表达分布。
具体实施方式
本发明提供了一种NKG2A纳米抗体，所述NKG2A纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示：QLVESGGSLVQPGGSLRLSCAASGVALDHYTLGWFRRAPGKEREAVSCISGSEGGTYYADSVKGRFTISGNNAKETVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATPPFGAAVFDMCNPHFPFDYWGQGIQVTVSSAHH。
在本发明中，编码所述NKG2A纳米抗体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：GCAGCTCGTGGAGTCAGGAGGAAGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAGTCGCTTTGGATCATTATACCTTAGGCTGGTTCCGCCGGGCCCCAGGGAAGGAGCGTGAGGCGGTTTCATGTATAAGTGGTAGTGAGGGTGGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCGGAAACAACGCCAAGGAGACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGCCGTTTATTACTGTGCAGCAACGCCCCCTTTCGGTGCAGCTGTTTTTGACATGTGTAATCCGCACTTTCCGTTTGACTACTGGGGCCAGGGGATCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGCACCACAG。
在本发明中，所述NKG2A纳米抗体的筛选方法，优选包括以下步骤：
1)将黑素瘤纳米库进行第一轮淘洗，得到B16-NKG2A-VHH1；
所述第一轮淘洗的NKG2A蛋白的包被浓度为20μg/ml；
2)将所述步骤1)得到的B16-NKG2A-VHH1依次进行第二轮、第三轮、第四轮淘洗和第五轮淘洗，得到噬菌体溶液；
所述第二轮淘洗的NKG2A蛋白的包被浓度为10μg/ml；
所述第三轮淘洗的NKG2A蛋白的包被浓度为8μg/ml；
所述第四轮淘洗的NKG2A蛋白的包被浓度为5μg/ml；
所述第五轮淘洗的NKG2A蛋白的包被浓度为5μg/ml；
3)将所述步骤2)得到的噬菌体溶液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；
4)将所述步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一次离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二次离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同NKG2A蛋白的反应性，以确定所述菌株与NKG2A蛋白具有反应性；
所述第一振荡的温度为35～42℃，所述第二振荡的温度为28～32℃；
所述第一离心的离心力为7500～8500g，所述第二离心的离心力为2000～2100g；
5)将所述步骤4)与NKG2A蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以所述质粒为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到纳米抗体VHH片段，将所述纳米抗体VHH片段与表达载体连接，得到重组质粒；
质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：
GTGAGGATCCGAGTCTGGAGGRRGCTTGGTGCA；
所述质粒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：
GACCSASGTCAYCGTCTCCTCAGTCGACTCAGA；
6)将所述步骤5)得到的重组质粒、pBAD18转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，将所述蛋白进行SDS-PAGE鉴定和Western Blotting鉴定，根据分子量大小和his-tag标签鉴定为NKG2A纳米抗体。
本发明对所述黑素瘤纳米库没有特殊限定，优选依据申请号为201910058785.0、发明名称为《一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法》的中国专利中公开的黑素瘤纳米库的构建方法构建得到即可。
本发明对所述黑素瘤纳米库进行第一轮淘洗，得到B16-NKG2A-VHH1，分装冻存于-80℃。
淘洗时用50mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液作为包被缓冲液，包被浓度20μg/ml，包被体积2ml，用NKG2A蛋白包被免疫管。
淘洗方法优选如下：
1)将500μl黑素瘤纳米文库接种于100ml 2×YTAG培养基，37℃200rmp振荡培养1小时至OD600为0.4；
2)加入KM13辅助噬菌体，100ml菌液加100μl KM13辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后振荡培养30min；
3)4000×g离心10min，去除培养基上清，用100ml 2×YTAK培养基重悬菌体沉淀，30℃200rmp振荡培养过夜；
4)次日上午11000×g，4℃离心过夜培养菌液10min，将上清转至新的离心瓶并加入20ml PEG/NaCl溶液，混匀冰浴90min；
5)11000×g，4℃离心30min，弃上清，而后再次离心2min，彻底吸尽上清；
6)使用1.3ml PBS缓冲液重悬沉淀，11600×g离心10分钟；
7)回收上清，命名为SR-B16-NKG2A-VHH1，取100μl待用于滴度测定，剩余同1.2mlMPBS溶液混合，室温共孵育1h，得到混合液(MPBS溶液处理过的NKG2A-VHH1)，待用。
包被蛋白处理优选如下：
1)包被蛋白次日，将免疫管内的液体倒出，使用PBS缓冲液洗管3次。
2)在每管中加满MPBS，室温封闭2h后使用PBS缓冲液洗管3次。
3)在免疫管中加入2ml上述淘洗步骤7)得到的混合液，室温孵育2h后使用PBST溶液洗管10次，而后用PBS缓冲液洗管10次。
4)在每管中加入2ml 100mM TEA溶液，室温轻摇15min洗脱结合的噬菌体，而后加入2ml Tris-HCl溶液中和。
5)将洗脱的噬菌体(命名为SC-B16-NKG2A-VHH1)转至50ml离心管，并加入16mlOD600为0.4的TG1菌液，37℃水浴30分钟，使洗脱的噬菌体感染TG1菌液。(并在免疫管内加入4ml的OD600为0.4的TG1菌液进行感染，最后合并，总共24ml的体积)
6)取100μl菌液待用于滴度测定，剩余菌液于4000g离心10min。
7)使用1ml 2×YT培养基重悬菌体沉淀，将重悬后的菌液涂布于5个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，置于30℃孵箱培养过夜。
8)次日用2×YT培养基收集平板上长出的菌落，加入60％的甘油至终浓度为15％，其即为一级文库菌，命名为B16-NKG2A-VHH1，分装冻存于-80℃。
测定拯救噬菌体滴度：SR-B16-NKG2A-VHH1进行梯度稀释，稀释度从10-7～10-13；每个稀释度取10μl噬菌体感染190μl OD600为0.4的TG1菌液；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算SR-B16-NKG2A-VHH1滴度。
测定洗脱噬菌体滴度：将用于滴度测定的菌液梯度稀释，稀释度从10-1～10-5；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算SC-B16-NKG2A-VHH1滴度；进而计算第一轮淘洗的输入输出比I/O。
在一轮淘洗的基础上，依次进行二至五轮淘洗，所述第二轮淘洗的NKG2A蛋白的包被浓度为10μg/ml，所述第三轮淘洗的NKG2A蛋白的包被浓度为8μg/ml，所述第四轮淘洗的NKG2A蛋白的包被浓度为5μg/ml，所述第五轮淘洗的NKG2A蛋白的包被浓度为5μg/ml。
在本发明中，所述步骤3)培养的温度优选为25～35℃，所述步骤4)感染的时间优选为25～35min，所述步骤4)孵育的时间优选为50～70min。
在本发明中，所述NKG2A纳米抗体的分子量为13KD。
本发明还提供了上述技术方案所述NKG2A纳米抗体在制备结合NKG2A蛋白的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的NKG2A纳米抗体在制备结合NKG2A蛋白的免疫组织化学试剂中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述的NKG2A纳米抗体在制备结合NKG2A蛋白的WesternBlotting检测试剂中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种NKG2A纳米抗体及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
NKG2A纳米抗体的筛选方法，包括以下步骤：
1)将黑素瘤纳米库(根据中国专利CN201910058785.0公开的方法制备即可)进行第一轮淘洗，得到B16-NKG2A-VHH1；
第一轮淘洗的NKG2A蛋白的包被浓度为20μg/ml；
2)将步骤1)得到的B16-NKG2A-VHH1依次进行第二轮、第三轮、第四轮淘洗和第五轮淘洗，得到噬菌体溶液；
第二轮淘洗的NKG2A蛋白的包被浓度为10μg/ml；
第三轮淘洗的NKG2A蛋白的包被浓度为8μg/ml；
第四轮淘洗的NKG2A蛋白的包被浓度为5μg/ml；
第五轮淘洗的NKG2A蛋白的包被浓度为5μg/ml；
3)将步骤2)得到的噬菌体液与TG1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；
4)将步骤3)得到的菌株与KM13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接ELISA检测，检测第二上清液同NKG2A蛋白的反应性，以确定所述菌株与NKG2A蛋白具有反应性；
第一振荡的温度为35～42℃，第二振荡的温度为28～32℃；
第一离心的离心力为7500～8500g，第二离心的离心力为2000～2100g；
5)将步骤4)与NKG2A蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以质粒为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到纳米抗体VHH片段，将纳米抗体VHH片段与表达载体连接，得到重组质粒；
质粒引物包括质粒上游引物(SEQ ID NO.3)和质粒下游引物(SEQ ID NO.4)；
6)将步骤5)得到的重组质粒、pBAD18转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行IPTG诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，将所述蛋白进行SDS-PAGE鉴定和Western Blotting鉴定，根据分子量大小和his-tag标签鉴定为NKG2A纳米抗体。
从已制备的黑素瘤纳米库进行第一轮淘洗，得到B16-NKG2A-VHH1，分装冻存于-80℃。
淘洗时用50mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液作为包被缓冲液，包被浓度20μg/ml，包被体积2ml，以NKG2A蛋白包被免疫管。
淘洗方法如下：
1)将500μl黑素瘤纳米库接种于100ml 2×YTAG培养基，37℃200rmp振荡培养1小时至OD600为0.4；
2)加入KM13辅助噬菌体，100ml菌液加100μl KM13辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后振荡培养30min；
3)4000×g离心10min，去除培养基上清，用100ml 2×YTAK培养基重悬菌体沉淀，30℃200rmp振荡培养过夜；
4)次日上午11000×g，4℃离心过夜培养菌液10min，将上清转至新的离心瓶并加入20ml PEG/NaCl溶液，混匀冰浴90min；
5)11000×g，4℃离心30分钟，弃上清，而后再次离心2min，彻底吸尽上清；
6)使用1.3ml PBS缓冲液重悬沉淀，而后将其分装于2个1.5ml离心管中，11600×g离心10min；
7)回收上清，命名为SR-B16-NKG2A-VHH1，取100μl待用于滴度测定，剩余同1.2mlMPBS溶液混合，室温共孵育1h，得到混合液(MPBS溶液处理过的NKG2A-VHH1)，待用。
包被蛋白处理：
1)包被蛋白次日，将免疫管内的液体倒出，使用PBS缓冲液洗管3次。
2)在每管中加满MPBS，室温封闭2h后使用PBS缓冲液洗管3次。
3)在免疫管中加入2ml上述淘洗步骤7)得到的混合液，室温孵育2h后使用PBST溶液洗管10次，而后用PBS缓冲液洗管10次。
4)在每管中加入2ml 100mM TEA溶液，室温轻摇15min洗脱结合的噬菌体，而后加入2ml Tris-HCl溶液中和。
5)将洗脱的噬菌体(命名为SC-B16-NKG2A-VHH1)转至50ml离心管，并加入16mlOD600为0.4的TG1菌液，37℃水浴30分钟，使洗脱的噬菌体感染TG1菌液。(并在免疫管内加入4ml的OD600为0.4的TG1菌液进行感染，最后合并，总共24ml的体积)。
6)取100μl菌液待用于滴度测定，剩余菌液于4000g离心10min。
7)使用1ml 2×YT培养基重悬菌体沉淀，将重悬后的菌液涂布于5个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，置于30℃孵箱培养过夜。
8)次日用2×YT培养基收集平板上长出的菌落，加入60％的甘油至终浓度为15％，其即为一级文库菌，命名为B16-NKG2A-VHH1，分装冻存于-80℃。
测定拯救噬菌体滴度：SR-B16-NKG2A-VHH1进行梯度稀释，稀释度从10-7～10-13；每个稀释度取10μl噬菌体感染190μl OD600为0.4的TG1菌液；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算SR-B16-NKG2A-VHH1滴度。
测定洗脱噬菌体滴度：将用于滴度测定的菌液梯度稀释，稀释度从10-1～10-5；每个稀释度取100μl菌液涂布2×YTAG固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算SC-B16-NKG2A-VHH1滴度；进而计算第一轮淘洗的输入输出比I/O。
在一轮淘洗的基础上，依次进行二至五轮淘洗：NKG2A蛋白包被浓度分别为10μg/ml、8μg/ml、5μg/ml、5μg/ml；拯救噬菌体滴度测定稀释度分别为10-7～10-12、10-8～10-11、10-8～10-11、10-8～10-11；洗脱噬菌体M13-NKG2A的滴度测定稀释度分别为10-1～10-6、10-1～10-6、10-8～10-11、10-8～10-11；洗脱的噬菌体用Tris-HCl溶液(1M，pH值为7.4)中和后，取200μl噬菌体感染800μl OD600为0.4的TG1菌液(取100μl进行梯度稀释，剩余的进行保菌)，而后做10-3～10-6共4个稀释度，每个稀释度涂布3个2×YTAG固体培养板(150mm平板)，每板100μl菌液，置于30℃培养过夜；对培养板菌落计数，计算滴度，并将培养板标记为平板，置于4℃冰箱待用。
特异性纳米抗体的筛选：
单克隆噬菌体上清的制备：从平板各挑取96个单克隆菌株共接种1块96孔深孔培养板，每孔中均含1ml 2×YTAG培养基，培养板分别标记为NKG2A文库菌株，于30℃振荡培养。8h后，从每孔中吸取50μl菌液接种于500ul 2×YTAG培养基，于37℃振荡培养，原平板的剩余菌液中则加入60μl 60％的甘油至终浓度为15％，冻存于-80℃。转接平板于37℃振荡培养1h后，在每孔中加入50μl KM13(60μl KM13+12ml 2×YTAG培养基)辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后37℃振荡培养40min。1800×g离心深孔板10min，弃上清并在每孔中加入400ul 2×YTAK培养基重悬沉淀，30℃振荡培养过夜。次日，最大转速2020xg离心20分钟，从各孔中吸250μl噬菌体上清转移至新的深孔板中，并在每孔中加入250μl封闭液(含3％BSA的PBS缓冲溶液)常温共孵育1小时，待用于间接ELISA检测。
特异性单克隆噬菌体的鉴定：通过间接ELISA试验检测噬菌体上清同NKG2A蛋白的反应性，具体方法如下：设计实验组、阴性对照组和BSA对照组，实验组与阴性对照组使用NKG2A蛋白，包被96孔酶标板，包被浓度为2μg/ml，BSA对照组使用BSA蛋白包被96孔酶标板，包被浓度为2ug/ml，每孔100μl，置于4℃过夜。次日弃孔内包被液体，在每孔中加入100μl封闭液于37℃封闭1h。弃孔内封闭液，实验组和BSA对照组在每孔分别中加入100μl封闭液处理过的五轮筛选得到的噬菌体上清作为一抗，阴性对照加入等量PBS，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板6次。在每孔中加入100μl二抗(HRP-M13 Antibody，稀释度1:6000)，37℃孵育1h。用PBST洗液洗板8次。在每孔中加入100μl显色底物，避光反应5～15min，而后在每孔中加入50μl终止液终止反应。将96孔酶标板置于读板机上读取OD450吸收值。对ELISA结果进行分析并确定阳性菌株。
将阳性孔对应的甘油菌接种于5ml 2×YTAG培养基，37℃振荡培养后将菌液送测序公司测序。待测序结果返回后，对测序结果进行分析，选择测序正确的菌株再次重复上述实验，验证阳性菌株，根据NKG2A单克隆阳性菌株ELISA鉴定结果(见表1)确定重组质粒构建菌株。
NKG2A纳米抗体活性和亲和性：
原核表达重组质粒的构建：将上述测序结果正确的克隆株的甘油菌接种5ml 2×YTAG培养基培养，并利用质粒小量提取试剂盒提取质粒作为原核表达的模板质粒。之后设计用于原核表达的引物，并在引物的5’端和3'端分别引入BamHⅠ和SalI酶切位点。利用设计的引物扩增纳米抗体VHH序列，并通过上述酶切位点将其连接入pQE30原核表达载体，构建纳米抗体原核表达重组质粒以进行纳米抗体的NKG2A特异性鉴定。
原核表达的引物：
F(SEQ ID NO.3):GTGAGGATCCGAGTCTGGAGGRRGCTTGGTGCA；
R(SEQ ID NO.4):GACCSASGTCAYCGTCTCCTCAGTCGACTCAGA；
筛选步骤如下：
将重组质粒和pBAD18空载转化入BL21(DE3)菌株并获得相应的纳米抗体表达菌株。而后对纳米抗体进行诱导表达，具体方法为：
将转化后涂板后的菌液进行过夜培养，次日挑取培养板上的单克隆菌落过夜培养。将次日培养的菌液进行保菌。
吸取10μl甘油菌接种于5mlAmp抗性的LB培养基，37℃振荡培养过夜；
第二天吸取50μl菌液接种5mlAmp抗性的LB培养，各接种2管，37℃振荡培养至OD600为0.6；
在其中1管菌液中加入IPTG诱导(终浓度0.4mM)，另1管不加IPTG做为未诱导对照，15℃振荡培养过夜；
同时做BL21(DE3)空菌株对照，空菌株对照培养使用无抗性的LB培养基。
纳米抗体的SDS-PAGE鉴定：
将对纳米抗体的表达进行SDS-PAGE鉴定，具体方法为：
吸取1ml菌液于1.5ml离心管，13000rpm离心2min；
弃上清，使用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀2次；
用20μl PBS缓冲液重悬菌体沉淀，而后加入5μl 5×蛋白上样缓冲液，并于沸水中煮样5分钟。用10％的聚丙烯酰胺凝胶对样品进行电泳。待电泳结束后，用考马斯亮蓝染液染胶1h，而后用脱色液进行脱色。
具有抗NKG2A中和活性的纳米抗体的筛选：将筛选出的纳米抗体对应甘油菌株接种于5mlAmp抗性的LB培养基，37℃振荡培养10h后转接到500mlAmp抗性的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.6时加入IPTG(终浓度0.4mM)诱导表达，15℃振荡培养过夜。次日，对上述纳米抗体进行小量纯化。
NKG2A纳米抗体的亲和性：用5μg/ml的NKG2A包被ELISA板；经BSA封闭后将纯化稀释后的NKG2A纳米抗体作为一抗，分别梯度稀释到5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml，进行ELISA鉴定。
纯化产物的鉴定：经ELISA鉴定，筛选出亲和性最好的NKG2A纳米抗体，并对该抗体用WesternBlotting法进行his标签鉴定：经SDS-PAGE电泳后，转到NC膜，直接用his二抗进行标记，经显影术显示抗体。
结果：
测序和特异性单克隆噬菌体ELISA筛选结果
通过测序公司进行测序，选择能够正确表达VHH片段克隆菌株的进行间接ELISA方法检测单克隆对应的噬菌体上清同NKG2A蛋白的反应性，这些单克隆均同NKG2A蛋白有不同程度的反应性(表1)。
测序正确并预测的氨基酸序列为：
SEQ ID NO.1(NKG2A-VHH-A3-1)：
QLVESGGSLVQPGGSLRLSCAASGVALDHYTLGWFRRAPGKEREAVSCISGSEGGTYYADSVKGRFTISGNNAKETVYLQMNSLKPEDTAVYYCAATPPFGAAVFDMCNPHFPFDYWGQGIQVTVSSAHH；
SEQ ID NO.5(NKG2A-VHH-D2-1)：
QLVESGGGLVQAGRSLRLSCTASGFTLEHYAIGWFRQAPGKGREGISCISSNDDTPYYADFVKGRFTISRDNAKNTVFLQMNSLKCEDIVVVHSAIIRARGPRSPSPERTT；
SEQ ID NO.6(NKG2A-VHH-D3-1)：
QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVAGATLDYYKMGWFRQVPGKEREGVSCISRSGLGDGSGLRDGSTAYLDSVKGRFTISRDNTKSTVHLHMNSLKPEDTAIYFCAAAAPRFGERLCRLDEDDFGSWGQGTQVTVSSAHH；
SEQ ID NO.7(NKG2A-VHH-H4-1)：
QLVESGGGSVPPGSSLRLSCATSGFDLDGYAIMWFRQVPGKRREGVSCIRGSEGTKEYEDSVKGRFTISRDKSKNTVNLQMYNLKPEDTGTYYCAANPYRLCVFEDPQVFDYWGQGTQVIVASAHH；
SEQ ID NO.8(NKG2A-VHH-G7-2)：
QLVESGGGLVPPGGSLRLSCAVSGFTLDDYAIGWFRQVPGKEREGVSCIRSSEGTKEYEDSVKGRFTISRDKSTNTVNLQMYHQKPEDTGTYYCASNPYRLCVFEDPQVFHYWGQGIQVIVASAHH
SEQ ID NO.9(NKG2A-VHH-G8-2)：
QLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGGDLSYYAIGWFRQVPGKEREGVACIPYEDGYAKIYADSVKGRFTISRDIAKNTWYLEMDSLKTWDTAVYYCAASARVGFLFRQCTEKGYDYWGQGTQVTVASAHH；
SEQ ID NO.10(NKG2A-VHH-H2-2)：
QLVESGGGLVQAGRSLRLSCTASGFTLEHYAIGWFRQAPGKGREGISCISSNDDTPYYADFVKGRFTISRDNAKNTVFLQMNSLKCEDIVVVHSAIIRARGPRSPSPERTTAKTPAPGHYGQRAAAGAPVPYPDPLEPRAA；
SEQ ID NO.11(NKG2A-VHH-H7-2)：
QLVESGGGMVQSGGSLRLSCEASGFTFSMYGMRWVRQAPGKGPEWVSGISSDGESTYYSESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSNLRPEDTAQCYCVRRVPSSYAMDYWGKGSPVTVSSAHH
SEQ ID NO.12(NKG2A-VHH-H12-2)：
QLVESGGGLVQSGGSLNLSCAASGSITTMWAQRWYRQVPGKQRDLVASITDSGSTNYDDSVKGRFTISEDTTANTLDLQMDSLKPEDTAMYYCAASRADRSSSEGDFGMDYWGKGALVIVSSAHH
表1 NKG2A单克隆ELISA筛选结果
Figure BDA0003123563390000131
NKG2A纳米抗体亲和性检测：
ELISA检测后，利用Western blotting实验技术筛选带有His标签菌株，筛选得到的四株单克隆菌株：NKG2A-VHH-A3-1(SEQ ID NO.1)、NKG2A-VHH-D2-1(SEQ ID NO.5)、NKG2A-VHH-D3-1(SEQ ID NO.6)和NKG2A-VHH-H2-2(SEQ ID NO.10)做为特异性单克隆阳性菌株，进行后续试验。
对特异性单克隆进行后续原核表达载体的构建，成功构建NKG2A-VHH-A3-1，NKG2A-VHH-D2-1，NKG2A-VHH-D3-1，NKG2A-VHH-H2-2蛋白表达菌株，NKG2A纳米抗体诱导表达并纯化后，利用ELISA技术进行蛋白亲和检测，筛得一株阳性菌株，检测结果为：NKG2A-VHH-A3-1对NKG2A蛋白的灵敏度为0.532μg/ml(其余菌株与对照组区别较小，灵敏度差)；His标签检测(如图1所示)：用Western Blotting法对纯化的抗体进行His标签检测，具体为将纯化的纳米抗体作为待检蛋白进行western-blot鉴定，使用HRP Anti His-Tag Mouse抗体检测鉴定纯化的纳米抗体，结果发现分子量大小约为13kDa，符合纳米抗体大小，通过分子量大小和特异性结合判断为NKG2A纳米抗体，此NKG2A纳米抗体为灵敏度最高的纳米抗体，序列如SEQ ID NO.1所示。
将纯化的纳米抗体作为待检蛋白进行考马斯亮蓝鉴定，判断纯化的纳米抗体是否单一。图2为考马斯亮蓝检测纯化的纳米抗体。从图2可看出纯化得到的抗体比较单一，杂蛋白较少。
图3为Western blotting法用NKG2A-VHH纳米抗体(即序列如SEQ ID NO.1所示的NKG2A纳米抗体)检测脾组织中NKG2A蛋白的表达。选取小鼠脾脏组织中蛋白样品，将NKG2AVHH作一抗，HRPAnti His-Tag Mouse用作二抗，计算得出NKG2A蛋白分子量26kDa，通过Western blotting实验结果，发现在25kDa的Maker稍上方一点有明显条带，为本发明的目的条带(HEK-293T细胞系用作阴性对照组)。实验结果充分说明纯化的纳米抗体可用于western-blot一抗，且实验效果较为理想。
图4为免疫组织化学法用NKG2A纳米抗体检测小鼠脾脏中NKG2A表达分布，箭头标注的部位为用NKG2A-VHH标注的小鼠脾脏中表达NKG2A的部位。选取组织中蛋白样品，将NKG2A纳米抗体用作一抗，对照组用PBS替代，HRP Anti His-Tag Mouse用作二抗，实验结果充分说明纯化的纳米抗体可用于免疫组化一抗，且实验效果理想。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 一种NKG2A纳米抗体及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ala Leu Asp His Tyr Thr Leu
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ser Cys
35 40 45
Ile Ser Gly Ser Glu Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asn Asn Ala Lys Glu Thr Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Thr Pro Pro Phe Gly Ala Ala Val Phe Asp Met Cys Asn Pro His Phe
100 105 110
Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Gln Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
His His
130
<210> 2
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcagctcgtg gagtcaggag gaagcttggt gcagcctggg gggtctctga gactctcctg 60
tgcagcctct ggagtcgctt tggatcatta taccttaggc tggttccgcc gggccccagg 120
gaaggagcgt gaggcggttt catgtataag tggtagtgag ggtggcacat actatgcaga 180
ctccgtgaag ggccgattca ccatctccgg aaacaacgcc aaggagacgg tgtatctgca 240
aatgaacagc ctgaaacctg aggacacagc cgtttattac tgtgcagcaa cgcccccttt 300
cggtgcagct gtttttgaca tgtgtaatcc gcactttccg tttgactact ggggccaggg 360
gatccaggtc accgtctcct cagcgcacca cag 393
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgaggatcc gagtctggag grrgcttggt gca 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaccsasgtc aycgtctcct cagtcgactc aga 33
<210> 5
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Arg Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Leu Glu His Tyr Ala Ile
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Ile Ser Cys
35 40 45
Ile Ser Ser Asn Asp Asp Thr Pro Tyr Tyr Ala Asp Phe Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Phe Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Cys Glu Asp Ile Val Val Val His Ser Ala Ile
85 90 95
Ile Arg Ala Arg Gly Pro Arg Ser Pro Ser Pro Glu Arg Thr Thr
100 105 110
<210> 6
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Ala Val Ala Gly Ala Thr Leu Asp Tyr Tyr Lys Met
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys
35 40 45
Ile Ser Arg Ser Gly Leu Gly Asp Gly Ser Gly Leu Arg Asp Gly Ser
50 55 60
Thr Ala Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
65 70 75 80
Asn Thr Lys Ser Thr Val His Leu His Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
85 90 95
Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Ala Ala Ala Pro Arg Phe Gly Glu
100 105 110
Arg Leu Cys Arg Leu Asp Glu Asp Asp Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His
130 135
<210> 7
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Pro Pro Gly Ser Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asp Leu Asp Gly Tyr Ala Ile
20 25 30
Met Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Arg Arg Glu Gly Val Ser Cys
35 40 45
Ile Arg Gly Ser Glu Gly Thr Lys Glu Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr Val Asn Leu Gln
65 70 75 80
Met Tyr Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Asn Pro Tyr Arg Leu Cys Val Phe Glu Asp Pro Gln Val Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Ile Val Ala Ser Ala His His
115 120 125
<210> 8
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro Pro Gly Gly Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr Ala Ile
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys
35 40 45
Ile Arg Ser Ser Glu Gly Thr Lys Glu Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Asn Leu Gln
65 70 75 80
Met Tyr His Gln Lys Pro Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Ser
85 90 95
Asn Pro Tyr Arg Leu Cys Val Phe Glu Asp Pro Gln Val Phe His Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Ile Gln Val Ile Val Ala Ser Ala His His
115 120 125
<210> 9
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Gly Asp Leu Ser Tyr Tyr Ala Ile
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Cys
35 40 45
Ile Pro Tyr Glu Asp Gly Tyr Ala Lys Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Trp Tyr Leu
65 70 75 80
Glu Met Asp Ser Leu Lys Thr Trp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ser Ala Arg Val Gly Phe Leu Phe Arg Gln Cys Thr Glu Lys Gly
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ala Ser Ala His
115 120 125
His
<210> 10
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Arg Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Leu Glu His Tyr Ala Ile
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Ile Ser Cys
35 40 45
Ile Ser Ser Asn Asp Asp Thr Pro Tyr Tyr Ala Asp Phe Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Phe Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Cys Glu Asp Ile Val Val Val His Ser Ala Ile
85 90 95
Ile Arg Ala Arg Gly Pro Arg Ser Pro Ser Pro Glu Arg Thr Thr Ala
100 105 110
Lys Thr Pro Ala Pro Gly His Tyr Gly Gln Arg Ala Ala Ala Gly Ala
115 120 125
Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Ala Ala
130 135 140
<210> 11
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Ser Gly Gly Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr Gly Met
20 25 30
Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Gly
35 40 45
Ile Ser Ser Asp Gly Glu Ser Thr Tyr Tyr Ser Glu Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Ser Asn Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Gln Cys Tyr Cys Val Arg
85 90 95
Arg Val Pro Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Ser Pro
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala His His
115 120
<210> 12
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly Ser Leu
1 5 10 15
Asn Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Thr Thr Met Trp Ala Gln
20 25 30
Arg Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Gln Arg Asp Leu Val Ala Ser
35 40 45
Ile Thr Asp Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asp Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Glu Asp Thr Thr Ala Asn Thr Leu Asp Leu Gln Met
65 70 75 80
Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser
85 90 95
Arg Ala Asp Arg Ser Ser Ser Glu Gly Asp Phe Gly Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Lys Gly Ala Leu Val Ile Val Ser Ser Ala His His
115 120 125

Claims (5)

1.一种NKG2A纳米抗体，其特征在于，所述NKG2A纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的NKG2A纳米抗体，其特征在于，编码所述NKG2A纳米抗体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1或2所述NKG2A纳米抗体在制备结合NKG2A蛋白的药物中的应用。
4.权利要求1或2所述的NKG2A纳米抗体在制备结合NKG2A蛋白的免疫组织化学试剂中的应用。
5.权利要求1或2所述的NKG2A纳米抗体在制备结合NKG2A蛋白的WesternBlotting检测试剂中的应用。
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