CN113247946A - 一种自主装纳米生物催化剂及其制备方法和在丁醇生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自主装纳米生物催化剂及其制备方法和在丁醇生产中的应用，属于纳米材料的微生物制备和应用领域。本发明解决了现有生物丁醇制备过程中丁醇发酵效率慢和产量低下的问题。本专利提出了自主装纳米生物催化剂，该催化剂通过纳米硫化镉材料修饰丁醇发酵菌种获得，保留了生物丁醇发酵菌种室温下专一性强、污染少的优良特点，同时利用光催化剂纳米硫化镉的高效性，使得丁醇发酵速率及产量得到极大的提高，为生物丁醇的高效制备提供一条新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及种一种自主装纳米生物催化剂及其制备方法和在丁醇生产中的应用，属于纳米材料的微生物制备和应用领域。
背景技术
催化是自然界中普遍存在的重要现象，催化作用几乎遍及化学反应的整个领域。人类利用催化作用进行化学加工的实践具有悠久的历史。在19～20世纪，以不可再生的化石资源为经济基础的物质加工业取得了辉煌的成就，而进入21世纪，面对化石资源的不断枯竭、环境污染日益加剧的严重局面，人类面临着前所未有的生存与发展的危机。传统的物质加工业必须进行革命性转变，转向以生物可再生资源为原料、环境友好的、过程高效地生物加工业、其核心技术为生物催化与生物转化。因此人类社会的可持续发展迫切需要生物催化与生物转化技术。
工业生物技术作为后起之秀，其工业生物催化剂的一般在封闭系统中进行，在使用后可方便地消除隐患，具有生物安全性高的特点。然而生物催化与生物转化中还存在生物催化剂资源有限、适用范围狭窄以及效率低的等几个关键问题尚需解决。
作为优良的生物液体燃料，生物丁醇生产技术受到了广泛关注和研究。然而，丁醇发酵速率慢、发酵副产物多等不足，严重制约了生物丁醇技术的推广及应用。因此，提供一种更加经济高效的生物丁醇生产技术是十分必要的。
发明内容
本发明目的之一是解决传统生物丁醇制备过程中丁醇发酵效率慢和产量低下的问题。
本发明的另一目的是提供一种生物合成纳米硫化镉半导体材料的方法，该方法相对于化学合成而言具备条件温和、分散性高、光催化效果强等优点。
本发明的技术方案：
一种自组装纳米生物催化剂，该催化剂由菌体和菌体表面的纳米颗粒组成，所述的菌体为拜氏梭菌，所述的纳米颗粒为纳米硫化镉。
上述自组装纳米生物催化剂由拜氏梭菌混合纳米硫化镉半导体材料的仿生矿化方法得到，该方法为：将拜氏梭菌和Cd(NO3)2共同接种在P2培养基中培养，培养结束后收集沉淀，洗涤，获得自主装纳米生物催化剂。
进一步限定，制备自主装纳米生物催化剂的具体操作过程为：按照体积比为1:20的比例向P2培养基接入拜氏梭菌进行培养，培养初始时向P2培养基中接入Cd(NO3)2，然后在140rpm、37℃的条件下培养60h，培养后收集沉淀，洗涤干净后得到自主装纳米生物催化剂。
进一步限定，Cd(NO3)2接入量P2培养基浓度为0.1g/L、0.2g/L或0.3g/L。
更进一步限定，Cd(NO3)2接种方式为：使用厌氧水将Cd(NO3)2·4H2O配置成浓度为5g/L母液，然后按比例将母液接入到P2培养基中。
进一步限定，P2培养基为酵母浸粉3g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、半胱氨酸0.5g/L、硫酸镁0.2g/L、对氨基苯甲酸0.001g/L、硫胺素0.001g/L、生物素0.0001g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸亚铁0.01g/L、氯化钠0.01g/L、葡萄糖10g/L。
更进一步限定，P2培养基制作需厌氧操作配置，取适量去离子水煮沸，后通入氮气10-20min，将上述药品依次溶于水中并分装，于115℃灭菌20min。
进一步限定，拜氏梭菌为Clostridiun beijerinckii NCIMB 8052，从中国微生物菌种保藏中心(CGMCC)处获得。
更进一步限定，拜氏梭菌使用前需用P2培养基进行活化培养。
应用上述方法制备的自主装纳米生物催化剂生产丁醇的方法，该方法为：将自组装纳米生物催化剂接种在P2培养基中，在光照下培养24h，利用自主装纳米生物催化剂进行丁醇发酵。
进一步限定，光照下培养条件为：光强为2000W/m2，温度为37℃，转速为140rpm。
应用上述方法制备的自主装纳米生物催化剂生产纳米硫化镉半导体材料，相对于化学合成而言具备条件温和、分散性高、光催化效果强等优点。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明利用拜氏梭菌作为生物矿化剂，在拜氏梭菌的细胞膜上合成了高效光催化能力的硫化镉半导体纳米材料，从而合成了自组装纳米生物催化剂。相较于纯菌的丁醇发酵效果，该自组装纳米生物催化剂保留了丁醇发酵菌的丁醇生产能力，同时耦合了优良的半导体纳米颗粒催化剂，在光照条件下具有更加优秀的丁醇发酵的能力。
(2)本发明合成纳米硫化镉半导体材料的方法是向P2培养基中加入适量Cd(NO3)2，镉元素是增加生态风险的主要污染物，其处理方法主要为沉淀、吸附和离子交换等。其中沉淀是效率较高的一种方法。利用生物矿化的方法可以有效将环境中的镉元素沉淀从而降低其毒性。
(3)本发明原材料廉价易得、合成步骤少、反应可控程度高、合成条件温和、分离方法简单易行、生产及使用成本较低。
附图说明
图1为不同Cd(NO3)2添加量下共培养后菌体的生物量对比曲线图；
图2为实施例1的拜氏梭菌菌体的透射电子显微镜结果图；
图3为实施例2的自主装纳米生物催化剂的透射电子显微镜结果图；
图4为实施例3的自主装纳米生物催化剂的透射电子显微镜结果图；
图5为实施例4的自主装纳米生物催化剂的透射电子显微镜结果图；
图6为实施例2的自主装纳米生物催化剂的XRD分析图；
图7为实施例3的自主装纳米生物催化剂的XRD分析图；
图8为实施例4的自主装纳米生物催化剂的XRD分析图；
图9为实施例1～4获得的自主装纳米生物催化剂催化发酵丁醇产量对比曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
实施例1：空白组
(1)拜氏梭菌的菌体获得：将保存的拜氏梭菌菌液接种到P2培养基中活化培养，再按照1:20的比例接种到新鲜P2培养基，按照140rpm、37℃的条件培养60h，获得拜氏梭菌菌液，对获得的拜氏梭菌菌液进行生物量的测定，测试结果如图1所示。由图1可知，在没有Cd(NO3)2添加的情况下，培养60h后拜氏梭菌菌液的OD600达到2.23±0.11，表明菌种生长状态良好。
对获得拜氏梭菌菌体进行透射电子扫描电镜测试，测试结果如图2所示。由图2可知，本实施例的拜氏梭菌菌体表面并没有纳米材料的生成，表明在没有Cd(NO3)2添加的情况下是不会生成硫化镉纳米材料的。
(2)丁醇发酵：离心收集菌体，将获得的拜氏梭菌菌体重新接入新鲜P2培养基中，并于2000W/m2、37℃、140rpm条件下培养24h。并进行丁醇发酵测试，测试结果如图9所示，经过24h的发酵其丁醇产量可以达到1.66±0.17g/L。
实施例2：接入0.1g/L的Cd(NO3)2
(1)自主装纳米生物催化剂的获得：将保存的拜氏梭菌菌液接种到P2培养基中活化培养，再按照1:20的比例接种到新鲜P2培养基，同时向P2培养基中接入0.1g/L的Cd(NO3)2(接入方式为使用厌氧水将Cd(NO3)2·4H2O配置成浓度为5g/L母液，然后按比例将母液接入到P2培养基中)，然后按照140rpm、37℃的条件培养60h。
对获得的拜氏梭菌菌液进行生物量的测定，测试结果如图1所示。由图1可知，在0.1g/L Cd(NO3)2添加的情况下，培养60h后拜氏梭菌菌液的OD600达到2.91±0.02，表明菌种生长状态受到低浓度镉离子的促进作用。
对获得的拜氏梭菌菌液进行透射电子扫描电镜测试，测试结果如图3所示。由图3可知，本实施例的拜氏梭菌菌体表面有纳米颗粒存在，而菌体外没有纳米颗粒存在，表明自主装纳米生物催化剂成功制备。
收集合成的纳米材料并进行XRD测试，测试结果如图6所示。由图6可知，本实施例的拜氏梭菌菌体表面的纳米颗粒成晶体存在，其吸收峰符合硫化镉纳米材料的吸收峰，证明了硫化镉纳米材料成功制备。
这是由于拜氏梭菌为丁醇发酵菌种，其细胞表面存在大量蛋白质、多肽、糖类和脂质等成分，这些生物成分存在许多基团，可将镉离子聚集于细胞表面。拜氏梭菌在生长和代谢过程中会降解培养基中的半胱氨酸组分，从而生成并释放H2S气体，H2S气体会与细胞表面的镉离子反应从而生成纳米硫化镉材料。
(2)丁醇发酵：离心收集自主装纳米生物催化剂并将其重新接入新鲜P2培养基中，并于2000W/m2、37℃、140rpm条件下培养24h。并进行丁醇发酵测试，测试结果如图9所示，经过24h的发酵其丁醇产量可以达到2.18±0.21g/L，丁醇产量得到大幅度提高。
这是由于细菌表面有机成分的调控，使其在细胞膜表面形成了具有体积小、比表面积大、高分散性和高稳定性的纳米硫化镉材料，同时在光照条件下电子传递也较为快速。在光照下，纳米硫化镉材料充当植物叶绿素的功能，为还原性产物丁醇的高效合成提供可能。
实施例3：接入0.2g/L的Cd(NO3)2
(1)自主装纳米生物催化剂的获得：将保存的拜氏梭菌菌液接种到P2培养基中活化培养，再按照1:20的比例接种到新鲜P2培养基，同时向P2培养基中接入0.2g/L的Cd(NO3)2，按照140rpm、37℃的条件培养60h。
对获得的拜氏梭菌菌液进行生物量的测定，测试结果如图1所示。由图1可知，在0.2g/L Cd(NO3)2添加的情况下，培养60h后拜氏梭菌菌液的OD600达到1.12±0.05，表明菌种生长状态受到镉离子的抑制作用。
对获得的拜氏梭菌菌液进行透射电子扫描电镜测试，测试结果如图4所示。由图4可知，本实施例的拜氏梭菌菌体表面有纳米颗粒存在，而菌体外没有纳米颗粒存在，表明自主装纳米生物催化剂成功制备。
收集合成的纳米材料并进行XRD测试，测试结果如图7所示。由图7可知，本实施例的拜氏梭菌菌体表面的纳米颗粒成晶体存在，其吸收峰符合硫化镉纳米材料的吸收峰，证明了硫化镉纳米材料成功制备。
(2)丁醇发酵：离心收集自主装纳米生物催化剂并将其重新接入新鲜P2培养基中，并于2000W/m2、37℃、140rpm条件下培养24h。并进行丁醇发酵测试，测试结果如表9所示，经过24h的发酵其丁醇产量仅有1.18±0.18g/L。
实施例4：接入0.3g/L的Cd(NO3)2
(1)自主装纳米生物催化剂的获得：将保存的拜氏梭菌菌液接种到P2培养基中活化培养，再按照1:20的比例接种到新鲜P2培养基，同时向P2培养基中接入0.3g/L的Cd(NO3)2，按照140rpm、37℃的条件培养60h。
对获得的拜氏梭菌菌液进行生物量的测定，测试结果如图1所示。由图1可知，在0.3g/L Cd(NO3)2添加的情况下，培养60h后拜氏梭菌菌液的OD600仅有1.12±0.08，表明菌种生长状态受到高浓度镉离子的抑制作用。
对获得的拜氏梭菌菌液进行透射电子扫描电镜测试，测试结果如图5所示。由图5可知，本实施例的拜氏梭菌菌体表面有纳米颗粒存在，而菌体外没有纳米颗粒存在，表明自主装纳米生物催化剂成功制备。
收集合成的纳米材料并进行XRD测试，测试结果如图8所示。由图8可知，本实施例的拜氏梭菌菌体表面的纳米颗粒成晶体存在，其吸收峰符合硫化镉纳米材料的吸收峰，证明了硫化镉纳米材料成功制备。
(2)丁醇发酵：离心收集自主装纳米生物催化剂并将其重新接入新鲜P2培养基中，并于2000W/m2、37℃、140rpm条件下培养24h。并进行丁醇发酵测试，测试结果如表9所示，经过24h的发酵其丁醇产量仅达到0.53±0.04g/L。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种自组装纳米生物催化剂，其特征在于，该催化剂由菌体和菌体表面的纳米颗粒组成，所述的菌体为拜氏梭菌，所述的纳米颗粒为纳米硫化镉。
2.一种权利要求1所述的自组装纳米生物催化剂的制备方法，其特征在于，该方法为：将拜氏梭菌和Cd(NO3)2共同接种在P2培养基中培养，培养结束后收集沉淀，洗涤，获得自主装纳米生物催化剂。
3.根据权利要求2所述的自组装纳米生物催化剂的制备方法，其特征在于，具体操作过程为：按照体积比为1:20的比例向P2培养基接入拜氏梭菌进行培养，培养初始时向P2培养基中接入Cd(NO3)2，然后在140rpm、37℃的条件下培养60h，培养后收集沉淀，洗涤干净后得到自主装纳米生物催化剂。
4.根据权利要求2或3所述的自组装纳米生物催化剂的制备方法，其特征在于，所述的Cd(NO3)2接入量P2培养基浓度为0.1g/L、0.2g/L或0.3g/L。
5.根据权利要求2所述的自组装纳米生物催化剂的制备方法，其特征在于，所述的Cd(NO3)2接种方式为：使用厌氧水将Cd(NO3)2·4H2O配置成浓度为5g/L母液，然后按比例将母液接入到P2培养基中。
6.根据权利要求2所述的自组装纳米生物催化剂的制备方法，其特征在于，所述的P2培养基为酵母浸粉3g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、半胱氨酸0.5g/L、硫酸镁0.2g/L、对氨基苯甲酸0.001g/L、硫胺素0.001g/L、生物素0.0001g/L、硫酸锰0.01g/L、硫酸亚铁0.01g/L、氯化钠0.01g/L、葡萄糖10g/L。
7.根据权利要求2所述的自组装纳米生物催化剂的制备方法，其特征在于，所述的拜氏梭菌为Clostridiun beijerinckii NCIMB 8052。
8.应用权利要求1所述的自组装纳米生物催化剂生产丁醇的方法，其特征在于，该方法为：将自组装纳米生物催化剂接种在P2培养基中，在光照下培养24h，利用自主装纳米生物催化剂进行丁醇发酵。
9.根据权利要求8所述的应用自组装纳米生物催化剂生产丁醇的方法，其特征在于，所述的光照下培养条件为：光强为2000W/m2，温度为37℃，转速为140rpm。
10.应用权利要求2所述的自组装纳米生物催化剂的制备方法生产纳米硫化镉半导体材料。
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