CN113234570B

CN113234570B - 一种检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片及检测方法

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Publication number: CN113234570B
Application number: CN202110350458.XA
Authority: CN
Inventors: 佘之蕴; 范安妮; 张娟; 黄宝莹; 周臣清; 陈满英; 刘海卿; 严家俊; 梁宇斌; 朱小钿; 苏妙仪
Priority date: 2021-03-31
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2041-03-31
Also published as: CN113234570A

Abstract

本发明提供一种检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片及检测方法，包括本体，所述本体排布设置有反应部，所述反应部包括对称设置的主流道，所述主流道的一端连接有缓冲腔，所述缓冲腔设有出液口，所述出液口设有封堵组件，所述出液口连接有微流道，所述微流道连接有反应池；所述反应池包括用于检测鸡肉成分、猪肉成分、牛肉成分的至少一项反应池，在所述反应池中独立进行LAMP扩增反应。本发明将环介导等温扩增技术和微流控芯片技术应用到食品动物源性成分检测领域，实现快速、便捷、准确、高通量的检测，研制了同时检测多种食品动物源性成分的微流控芯片，实现多种动物源成分的快速检测，为动物源性成分检测方法的选择提供保障。

Description

一种检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片及检测方法

技术领域

本发明属于食品动物源性成分检测技术领域，具体涉及一种检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片及检测方法。

背景技术

我国近年来出现许多严重的肉类掺假问题，这些掺假行为严重地侵害了消费者权益、危害了消费者身体健康，也侵犯了部分消费者的民族宗教信仰。目前，许多国家已经建立了相应的标准，并对市场上的肉制品进行了规范管理，我国近年也对肉制品的动物源性成分项目进行抽样检验。

我国现行标准对动物肉源性成分进行检测鉴定方法主要是基于DNA的荧光定量PCR技术，但是该技术仅能对单个成分或少数几个成分同时进行检测。随着分子生物学技术的发展，衍生出很多新型PCR技术，例如环介导等温扩增技术，该方法仅需恒温设备即可完成扩增，比传统PCR技术更快捷。这两种方法每次检测通量较低，在大批量的检验检疫应用中，产生的工作量仍旧非常大。

基因芯片作为分子生物学上的一个技术突破，以其高通量的特点，在病毒、微生物检测等领域得到了广泛应用。碟式芯片是一种新型的基因芯片，现在国内外的应用还比较少，它具有24个检测通道，可以进行多指标的并行检测，用于食品中的动物源性成分检测，极具前景。选取牛、鸡、猪等多种动物源性成分，建立基于碟式芯片技术同时检测多种动物源性成分的方法，弥补常规检测方法的缺陷，为进一步拓展多种动物源性成分的高通量检测奠定基础。

环介导等温扩增技术（LAMP）是利用能识别靶序列上6个位点的4个特殊设计的引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增核酸的新技术。基因芯片技术是指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。

微流控芯片技术是一种新型的基因芯片技术，以其多指标并行检测、各检测孔反应均一、结果可控、易自动化的特点，为食品动物源性成分的检测提供了广阔的应用前景。微流控技术中，如何实现样本的较均匀的分配和分配后不同反应孔之间的物理隔离是两个关键技术点。现有技术中的微流控芯片，在高通量检测过程中，存在样本往不同反应腔体的分配不均匀，加样后就马上会进行反应，无法实现样品反应进程的控制。

随着社会经济的发展和国际食品安全水平的提高，引起人们对于动物源性成分鉴别问题的高度重视，对于食品的安全性也有了更高的警惕性，保障食品安全，保证消费者的食用健康是当前的重点，因此开发高通量、高灵敏度以及快速的食品动物源性成分检测方法势在必行。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片及检测方法，本发明中，通过在缓冲腔中设置封堵组件，可实现进样过程中样液先充满缓冲腔，再进入到反应池反应，可实现样本往不同反应池的均匀分配，同时各反应部独立设置，可杜绝不同反应池之间的交叉污染，实现高通量、高灵敏度和稳定的检测；本发明将环介导等温扩增技术和微流控芯片技术应用到食物动物源性成分检测领域，实现快速、便捷、准确、高通量的检测，研制了同时检测多种食品动物源性成分的微流控芯片，实现多种动物源成分的快速检测，为动物源性成分检测方法的选择提供保障。

本发明的技术方案为：

一种检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片，其特征在于，包括本体，所述本体排布设置有反应部，所述反应部包括对称设置的主流道，所述主流道的一端连接有缓冲腔，所述缓冲腔设有出液口，所述出液口设有封堵组件，所述出液口连接有微流道，所述微流道连接有反应池；

所述封堵组件包括弹性挡板、限位板、弹性珠，所述弹性挡板设置于所述缓冲腔的中轴线区域，所述限位板对称设置于弹性挡板之间，所述弹性珠设置于所述限位板之间的区域；

所述反应池包括用于检测鸡肉成分、猪肉成分、牛肉成分的至少一项反应池，在所述反应池中独立进行LAMP扩增反应。

进一步的，所述用于检测鸡肉成分的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6；

所述用于检测猪肉成分的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ IDNO:7至SEQ ID NO:12；

所述用于检测牛肉成分的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ IDNO:13至SEQ ID NO:18。

本发明根据NCBI上已公布的鸡肉、猪肉、牛肉的基因的核酸序列，通过数据库中的BLAST比对，找出基因序列中的保守序列。然后登陆日本荣研化学公司的引物在线设计网页，设计出多套特异性的lamp引物，每套引物包括两条外引物F3、B3，两条内引物FIP、BIP，两条环引物LoopF、LoopB。对每套引物进行筛选，包括特异性、反应时间、反应温度，最终得到一套特异性好的引物。

进一步的，所述碟式芯片还包括空白对照、阴性对照和扩增阳性对照的LAMP引物组的反应池。

进一步的，

所述空白对照的反应池中不包埋任何模板；

所述阴性对照的反应池中用双蒸水代替DNA模板；

扩增阳性对照的反应池中包埋含有虾线粒体12SrRNA基因的DNA片段及其LAMP引物组，其引物组序列为SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:22。特别的，所述含有虾线粒体12SrRNA基因的DNA片段，依据SN/T 4419.22-2016 《出口食品常见过敏原LAMP系统检测方法第22部分：虾》中虾的引物和对应的DNA模板中选择。

进一步的，所述缓冲腔于弹性挡板与限位板之间的区域分别设有第一凹槽、第二凹槽，所述第一凹槽设置于所述出液口处。

进一步的，所述弹性珠与第一凹槽配合连接，与出液口相抵。

进一步的，所述弹性珠与第二凹槽配合连接，设置在弹性挡板与限位板之间的区域。

进一步的，所述弹性挡板与缓冲腔壁面的最小间距小于或等于弹性珠的直径。

进一步的，所述弹性珠的直径是所述出液口的宽度的1.2-1.6倍。

进一步的，所述主流道的另一端设置有连接孔。

进一步的，所述反应部通过连接孔连通，形成相互联通的进液通道。

进一步的，所述本体的水平截面为圆形，所述反应部以本体的圆心为基点阵列排布设置于所述本体。

进一步的，所述本体有至少一组相邻的反应部的连接孔不连通，相邻的反应部不连通的连接孔分别作为进样孔、出样孔，通过此设置，可满足同一芯片上平时检测试验的需求，提高检测结果的精确度。

特别的，所述弹性挡板、弹性珠可采用现有技术中可实现一定弹性形变的材料制得。

本发明中，在未反应时，弹性珠与第一凹槽配合连接，通过弹性珠封堵出液口，通过进样口注入样品，将样品储存在缓冲腔中；

当需要检测时，将微流控芯片放入到现有技术的微流控恒温扩增仪中，通过离心作用产生切向力，使得弹性珠往第二凹槽的方向位移，通过离心力的作用，弹性珠挤压弹性挡板使得弹性挡板形变，弹性珠落入第二凹槽中，出液口开启，样液通过出液口经过微流道进入到反应池中，开始反应；

通过限位板的作用，可以保证弹性珠始终落入到第一凹槽或第二凹槽中。

本发明中，通过在缓冲腔中设置封堵组件，可实现进样过程中样液先充满缓冲腔，再进入到反应池反应，可实现样本往不同反应池的均匀分配，同时各反应部独立设置，可杜绝不同反应池之间的交叉污染，实现高通量、高灵敏度和稳定的检测。

本发明通过离心力的作用，转换速度较快，能够实现微流控碟式芯片上多流道进样通道的开启与关闭，可以实现样品的便携式控制。

一种检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片的检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

1）制备碟式微流控基因芯片：

所述碟式微流控基因芯片是上述的碟式微流控基因芯片；

2）提取待检样本的核酸；

3）恒温扩增反应体系的配制：

在体系区，吸取恒温扩增试剂加入离心管中，盖好管盖后将所述离心管移至模板加样区；

在所述模板加样区，加入步骤2）的核酸；

4）碟式微流控基因芯片加样：

在模板区，吸取在步骤3）配制好的核酸扩增反应体系，从进出样口将所述配制好的核酸扩增反应体系加入到所述碟式微流控基因芯片主通道中；

取封口膜，覆盖于进出样口上；

将加样后的所述碟式微流控基因芯片在低速离心机上离心备用；

5）恒温扩增：

预热恒温扩增微流控芯片核酸分析仪；

将所述碟式微流控基因芯片送入核酸分析仪中；

在65℃下恒温扩增60分钟；

6）结果判读；

7）检测完成后使用软件对荧光数据进行处理和分析。

本发明中，LAMP扩增实的反应体系如下表所示：

本发明中，食品动物源性成分DNA提取用核酸提取试剂盒。

微流控技术（Microfluidics）,又可称为微型全分析系统（Miniaturizedtotalanalysissystems，uTAS）及芯片实验室（Labonachip），是一种基于微机械加工、生物技术和纳米化学分析等技术发展而来的便携式高通量快速检测技术。微流控芯片是实现微流控技术的平台，其内部结构包括微米级的管道、腔室、气/液泵或阀门等流体器件，可对由微量生物大分子物质及化学试剂等成分组成的微流体进行控制。与其他检测技术相比，微流控芯片检测技术具有以下优势：一是缩减试剂成本；二是能够检测微量样品；三是检测通量高；四是微流体反应速率高，检测过程耗时短；五是自动化程度高，确保了检测结果的准确性、重复性和稳定性；六是便携性强，适用于现场检测。因此，微流控芯片技术在食品安全、医疗卫生及环境检测方面具有良好的应用前景。

本发明将环介导等温扩增技术和微流控芯片技术应用到食物动物源性成分检测领域，实现快速、便捷、准确、高通量的检测，研制了同时检测多种食品动物源性成分的微流控芯片，实现多种动物源成分的快速检测，具有更好的便捷性，更高的快捷性、特异性和灵敏度，为动物源性成分检测方法的选择提供保障。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为本发明一状态下的局部结构示意图；

图3为本发明另一状态下的局部结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片，其特征在于，包括本体10，所述本体排布设置有反应部1，所述反应部包括对称设置的主流道11，所述主流道的一端连接有缓冲腔12，所述缓冲腔设有出液口13，所述出液口设有封堵组件2，所述出液口连接有微流道14，所述微流道连接有反应池15；

所述封堵组件2包括弹性挡板21、限位板22、弹性珠23，所述弹性挡板设置于所述缓冲腔的中轴线区域，所述限位板对称设置于弹性挡板之间，所述弹性珠设置于所述限位板之间的区域；

所述空白对照的反应池中不包埋任何模板；

所述阴性对照的反应池中用双蒸水代替DNA模板；

扩增阳性对照的反应池中包埋含有虾线粒体12SrRNA基因的DNA片段及其LAMP引物组，其引物组序列为SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:22。

进一步的，所述缓冲腔于弹性挡板与限位板之间的区域分别设有第一凹槽121、第二凹槽122，所述第一凹槽设置于所述出液口处。

进一步的，所述主流道的另一端设置有连接孔16。

进一步的，所述本体有至少一组相邻的反应部的连接孔不连通，相邻的反应部不连通的连接孔分别作为进样孔3、出样孔4，通过此设置，可满足同一芯片上平时检测试验的需求，提高检测结果的精确度。

实施例2

一种实施例1检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片的检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

1）制备碟式微流控基因芯片：

所述碟式微流控基因芯片是上述的碟式微流控基因芯片；

2）提取待检样本的核酸；

3）恒温扩增反应体系的配制：

在所述模板加样区，加入步骤2）的核酸；

4）碟式微流控基因芯片加样：

取封口膜，覆盖于进出样口上；

5）恒温扩增：

预热恒温扩增微流控芯片核酸分析仪；

将所述碟式微流控基因芯片送入核酸分析仪中；

在65℃下恒温扩增60分钟；

6）结果判读；

7）检测完成后使用软件对荧光数据进行处理和分析。

本发明中，LAMP扩增实的反应体系如下表所示：

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。需注意的是，本发明中所未详细描述的技术特征，均可以通过任一现有技术实现。

序列表

<110> 广东产品质量监督检验研究院（国家质量技术监督局广州电气安全检验所、广东省试验认证研究院、华安实验室）

<120> 一种检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片及检测方法

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> J-1F3

<400> 1

caagcgagct acttgcga 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> J-1B3

<400> 2

gagctgtacc cccatcga 18

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> J-1FIP

<400> 3

gctcggtagg cttttcacct ctaatttgag cgaacccgtc tc 42

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> J-1BIP

<400> 4

agttccccct taacccaccc cattgctctt aaccccaacg t 41

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> J-1LF

<400> 5

gtcatcccac tcttttgcaa ca 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> J-1LB

<400> 6

ctaaagacac ccacctttgt caa 23

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Z-1F3

<400> 7

atcattctga ggagctacg 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Z-1B3

<400> 8

ttgttggatc cggtttcg 18

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> Z-1FIP

<400> 9

gaaaagcccc ctcagattca ttctagtcat cacaaatcta ctatcagc 48

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> Z-1BIP

<400> 10

accctcacac gattcttcgc aggaatatga gatgtacggc 40

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Z-1LF

<400> 11

aggtctgttc cgatataagg gata 24

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Z-1LB

<400> 12

cttccacttt atcctgccat tca 23

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> N-1F3

<400> 13

taatcggagc cctacgag 18

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> N-1B3

<400> 14

ttcagttaaa tcaaatggag ct 22

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> N-1FIP

<400> 15

ggacccactt attaggagta ctgatcagta gcacaaacaa tctcat 46

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> N-1BIP

<400> 16

agaacaaata tggttaatcc tcccatttgt ttctgctagt gttgag 46

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> N-1LF

<400> 17

ggataattgc tagcgttact tcgt 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> N-1LB

<400> 18

gcatggcctc tagcaataat atga 24

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> X-F3

<400> 19

tagaaaccga cctggctc 18

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> X-B3

<400> 20

tcataagatt aagttacttt aggga 25

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213> X-FIP

<400> 21

gcagcagtta taaaggaagg tctcggtctg aactcaaatc atgt 44

<210> 22

<211> 44

<212> DNA

<213> X-BIP

<400> 22

ccttaattca acatcgaggt cgacagcgta atcttctttg agag 44

Claims

1.一种检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片，其特征在于，包括本体，所述本体排布设置有反应部，所述反应部包括对称设置的主流道，所述主流道的一端连接有缓冲腔，所述缓冲腔设有出液口，所述出液口设有封堵组件，所述出液口连接有微流道，所述微流道连接有反应池；

所述封堵组件包括弹性挡板、限位板和弹性珠，所述弹性挡板设置于所述缓冲腔的中轴线区域，所述限位板对称设置于弹性挡板之间，所述弹性珠设置于所述限位板之间的区域；

所述反应池包括用于检测鸡肉成分、猪肉成分、牛肉成分的至少一项反应池，在所述反应池中独立进行LAMP扩增反应；

所述缓冲腔于弹性挡板与限位板之间的区域分别设有第一凹槽和第二凹槽，所述第一凹槽设置于所述出液口处；

所述弹性珠与第一凹槽配合连接，与出液口相抵；

所述弹性珠与第二凹槽配合连接，设置在弹性挡板与限位板之间的区域。

2.根据权利要求1所述的检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片，其特征在于，所述用于检测鸡肉成分的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:6；

所述用于检测猪肉成分的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:12；

所述用于检测牛肉成分的反应池中用于核苷酸扩增的引物组的序列为SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:18。

3.根据权利要求2所述的检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片，其特征在于，所述碟式芯片还包括空白对照、阴性对照和扩增阳性对照的LAMP的反应池。

4.根据权利要求3所述的检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片，其特征在于，所述空白对照的反应池中不包埋任何模板；

所述阴性对照的反应池中用双蒸水代替DNA模板；

5.根据权利要求1所述的检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片，其特征在于，所述弹性挡板与缓冲腔壁面的最小间距小于或等于弹性珠的直径；所述弹性珠的直径是所述出液口的宽度的1.2-1.6倍。

6.根据权利要求1所述的检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片，其特征在于，所述主流道的另一端设置有连接孔；所述反应部通过连接孔连通；所述本体的水平截面为圆形，所述反应部以本体的圆心为基点阵列排布设置于所述本体。

7.一种权利要求1-6任一项所述的检测食品动物源性成分的高通量碟式芯片的检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

1）制备高通量碟式芯片：

2）提取待检样本的核酸；

3）恒温扩增反应体系的配制：

在所述模板加样区，加入步骤2）的核酸；

4）高通量碟式芯片加样：

在模板区，吸取在步骤3）配制好的核酸扩增反应体系，从进出样口将所述配制好的核酸扩增反应体系加入到所述高通量碟式芯片主通道中；

取封口膜，覆盖于进出样口上；

将加样后的所述高通量碟式芯片在低速离心机上离心备用；

5）恒温扩增：

预热恒温扩增微流控芯片核酸分析仪；

将所述高通量碟式芯片送入核酸分析仪中；

在65℃下恒温扩增60分钟；

6）结果判读；

7）检测完成后使用软件对荧光数据进行处理和分析。