CN113227384A - 用于治疗肿瘤的药物组合物、药盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治疗对象中肿瘤的组合物，其包含治疗有效量的携带抑制量的靶向CTLA4的miRNA的外泌体和溶瘤病毒。其中，所述外泌体基序与所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列可操作地连接以增强所述靶向CTLA4的miRNA包装至所述外泌体中。

Description

用于治疗肿瘤的药物组合物、药盒和方法

技术领域

本发明涉及一种用于治疗肿瘤的药物组合物，特别涉及包含治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和治疗有效量的溶瘤病毒的药物组合物。本发明还涉及一种包含携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和溶瘤病毒的药盒，以及使用所述药物组合物和所述药盒治疗肿瘤的方法。

背景技术

癌症作为一种疾病是多方面的敌人，它可以屈服于指定的治疗方法，也可以对各种疗法产生抵抗力。肿瘤内的细胞子集对常规治疗方式有抵抗力，并且可以导致疾病复发。

手术治疗癌症是常见的局部治疗。除了血液系统的某些恶性肿瘤（例如白血病，淋巴瘤等）外，其他各种恶性肿瘤还具有一种或多种可以通过手术移除的有形实体瘤。但是，手术总是有一定的风险，并且经常有其他并发症或潜在的器官功能障碍。

迄今为止，非手术治疗癌症（主要是常规化学疗法、靶向生物疗法和放射疗法）尚未取得完全令人满意的结果。持续存在的问题包括靶标选择性低、耐药性、无法有效解决转移性疾病和严重的副作用。相反，目前整体上激发宿主免疫力来诱导针对肿瘤的全身反应的免疫疗法提供了许多临床前景。

溶瘤病毒代表了一类新的治疗药物，其被设计为在癌细胞中选择性地复制并杀死癌细胞，使正常细胞免受其影响。众所周知，由于肿瘤相关抗原（TAA）、病原体相关分子模式（PAMPS）和危险相关分子模式（DAMPS）从裂解的肿瘤细胞释放，溶瘤病毒能够刺激对肿瘤细胞的适应性免疫反应。这些反应还将肿瘤从冷肿瘤（免疫沙漠型）转变为热肿瘤（免疫炎症型）。一旦被抗原呈递细胞（APC）处理，TAA然后能够诱导抗肿瘤T细胞反应与抗病毒反应同时发生。基于这些独特的特征，溶瘤病毒现在被认为是癌症免疫治疗剂。然而，仅溶瘤病毒治疗仍不能治愈体积大的和/或转移的肿瘤，因此溶瘤病毒还需要额外的治疗剂来增强其抗肿瘤作用。溶瘤病毒的另一个优势是能够被工程化以编码治疗基因，该基因能够进一步帮助该病毒的总体抗肿瘤功效。

溶瘤病毒分为DNA病毒和RNA病毒。DNA病毒以腺病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒和牛痘病毒为主。RNA病毒包括呼肠孤病毒（reovirus）、柯萨基病毒（coxsackievirus）、脊髓灰质炎病毒（polio virus）、塞内卡谷病毒（Seneca valley virus）、麻疹病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒等。理想的溶瘤病毒应该能够有效降低对患者和人群的风险。例如，溶瘤病毒对患者应该具有肿瘤选择性、正常组织非致病性、体内非持续性、遗传（基因）稳定性。除上述特征外，溶瘤病毒还应该是非传染性的，并且人群已经对该病毒具有广泛的免疫。

尽管在临床前和临床环境中进行了广泛的研究和测试，但用于治疗肿瘤的方法仍然存在未满足的需求。

概述

一方面，本发明公开了一种携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体，其中外泌体包装相关的基序（下文中也指“外泌体基序”）被可操作地连接至靶向CTLA4的miRNA。在一个实施方案中，外泌体包含抑制量的靶向CTLA4的miRNA，其中靶向CTLA4的miRNA具有结合CTLA4的mRNA的种子序列；并且外泌体基序与靶向CTLA4的miRNA的种子序列可操作地连接以增强靶向CTLA4的miRNA包装至外泌体中。在一些实施方案中，外泌体基序位于靶向CTLA4的miRNA的种子序列的下游并与其共价连接。在一些实施方案中，外泌体基序位于靶向CTLA4的miRNA的种子序列的下游并通过连接子与其连接。在一些实施方案中，外泌体基序是通过突变靶向CTLA4的miRNA的除种子序列以外的一个或多个核酸而获得的。在一些实施方案中，外泌体基序是通过两个单个外泌体基序的组合产生的双倍基序。在一些实施方案中，当可操作地连接时，靶向CTLA4的miRNA与外泌体基序共享至少一个或两个核苷酸。

本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体、治疗有效量的溶瘤病毒和药学上可接受的载体。外泌体包含外泌体包装相关的基序，该基序任选地通过连接子可操作地连接至靶向CTLA4的miRNA。

本发明的另一方面涉及一种用于治疗肿瘤的药盒，其包含携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和溶瘤病毒。药盒可以进一步包含使用外泌体和溶瘤病毒治疗肿瘤的说明。

本发明的另一方面涉及一种用于治疗对象中的肿瘤的方法，该方法包含向该对象施用药学上有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体以及治疗有效量的溶瘤病毒。

本发明的另一方面涉及一种用于在对象中增强溶瘤病毒疗法的功效的方法，除溶瘤病毒疗法外，该方法还包含向有此需要的对象施用治疗有效量的本发明的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体。

通过阅读下面的描述，将容易获得本发明的其他方面。

附图说明

图1。左图是编码靶向CTLA4的miRNA的质粒的示意图。右图示出了靶向小鼠CTLA4基因的miRNA（miR-CTLA4）的核苷酸序列。以粗体、斜体和下划线突出显示的核苷酸表示外泌体包装相关的基序（外泌体基序）。

图2。设计的miRNA下调CTLA4。将接种在24孔板中的HEp-2细胞与0.25 μg表达miR-CTLA4或非靶标miRNA（NT）的质粒和0.25 μg编码His标记的小鼠CTLA4（mCTLA4-his）的质粒共转染。转染72小时后收获细胞，然后测量CTLA4和GAPDH的积累。

图3。暴露于含有miR-CTLA4的外泌体的细胞中CTLA4蛋白的积累。用10 μg选定的表达miR-CTLA4的质粒（1#、2#、3#和6#）转染HEp-2细胞（5x10⁶）。孵育4小时后，将细胞用PBS洗涤3次，以排除血清中外泌体的潜在污染，然后将细胞在不含胎牛血清（FBS）的培养基中再培养48小时。收集细胞上清液，并通过超速离心分离外泌体。将含有2.5x10⁵ HEp-2细胞的培养物与10 μg纯化的外泌体孵育。孵育24小时后，将培养液替换为新鲜培养基。再过48小时后，收获细胞，将细胞裂解液在10％变性凝胶中电泳分离，并与所示抗体反应。

图4。来自纯化外泌体的miR-CTLA4的分析。用10 μg所示的编码靶向CLTA4的miRNA（miR-CTLA4-3#）的质粒转染HEp-2细胞，并纯化外泌体。从细胞沉淀和外泌体中提取RNA。使用实时PCR分析对miR-CTLA4进行定量并相对于18s rRNA标准化。

图5。表达鼠IL-12（mIL-12）的溶瘤病毒（T2850）及其原型野生型HSV-1（F）基因组的示意图。反向重复序列（b'a'和a'c'，IR）区域被mIL-12表达盒取代。

图6。瘤内注射T2850和含有CTLA4 miRNA的外泌体在同基因小鼠模型中抑制MFC和B16的肿瘤生长。将小鼠前胃癌MFC或小鼠黑色素瘤B16细胞分别皮下注射到615或C57BL/6J小鼠的右侧腹中。向平均80 mm³的MFC肿瘤或平均70 mm³的B16肿瘤肿瘤内注射50 ml的PBS（含10％甘油（w/v））（对照）或1×10⁷ pfu混合有10 μg外泌体的T2850，所述外泌体从非靶标（miRNA-NT exo）或CLTA4 miRNA（miRNA-CTLA4 exo）质粒转染的HEp-2细胞上清液纯化。测量肿瘤体积，并表示为每组中8只动物的平均值±SEM。

本发明的详细说明

定义

要注意的是，术语“一”或“一个”实体是指该实体中的一个或多个；例如，“外泌体”被理解为表示一个或多个外泌体。因此，术语“一个”、“一个或多个”和“至少一个”可以在本文中互换使用。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度与序列共有的匹配或同源位置的数目相关。“不相关的”或“非同源的”序列与本文的其中一个序列共享小于40％的同一性，优选小于25％的同一性。

一个多核苷酸或多核苷酸区域（或一个多肽或多肽区域）与另一个序列具有特定百分数（例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％）的“序列同一性”是指，当比对时，在比较两个序列时该百分比的碱基（或氨基酸）是相同的。这种比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定。

如本文所使用的，术语“连接子”是指含有两个或更多个相同的或不同的核苷酸的核苷酸序列的短片段，其中所述核苷酸选自腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）。

如本文所使用的，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性措施，目的是预防或减缓（减轻）不希望的生理变化或紊乱，例如肿瘤的进展。有益的或期望的临床结果包括，但不限于，缓解症状、减少疾病程度、稳定（即不恶化）肿瘤状态、抑制肿瘤生长、减小肿瘤体积、延迟或减慢肿瘤进展、改善或减轻肿瘤状态以及症状消失（无论是部分还是全部），无论是可检测的还是不可检测的。需要治疗的病人包括那些已经患有肿瘤的人，以及那些容易患有肿瘤的人。

“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指期望进行诊断、预后或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、家畜、农场动物和动物园动物、竞技动物或宠物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。本文的对象优选是人。

如本文所使用的，诸如“需要治疗的患者”或“需要治疗的对象”等短语包括受益于施用本公开的用于例如检测、诊断程序和/或治疗的组合物的对象，例如哺乳动物对象。

本发明尤其使用反义寡聚体和类似物用于调节编码CTLA4的核酸分子的功能或作用。本发明的寡聚物与其靶核酸的杂交通常称为“反义”。因此，被认为包括在本发明的一些优选实施方案的实践中的优选机制在本文是指“反义抑制”。此类反义抑制通常基于寡核苷酸链或区段的基于氢键的杂交，使得至少一条链或区段被切割、降解或以其他方式使其不可操作。在这方面，目前优选靶向特定核酸分子及其用于这种反义抑制的功能。

被干扰的RNA的功能可以包括诸如RNA易位至蛋白质翻译位点、RNA易位至细胞内远离RNA合成位点的位点、蛋白质从RNA翻译、RNA的剪接产生一种或多种RNA种类、以及涉及RNA参与或由RNA促进的催化活性或复合物形成。这种干扰靶核酸功能的一个优选结果是调节CTLA4的表达。在本发明的上下文中，“调节”和“表达调节”意指减少（抑制）编码基因的核酸分子（例如DNA或RNA）的量或水平。mRNA通常是优选的靶核酸。

在本发明的上下文中，“杂交”是指互补的寡聚体链的配对。在本发明中，优选的配对机制涉及氢键，其可以是寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基（核碱基）之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补的核碱基，其通过形成氢键而配对。杂交可以在不同的情况下发生。

当寡聚体与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而引起活性丧失时，反义寡聚体是特异性杂交的，并且在需要特异性结合的条件下，即在体内测定或治疗处理情况的生理条件下、在体外测定的情况进行测定的条件下，存在足够程度的互补性以避免反义寡聚体与非靶核酸序列的非特性结合。

在本发明中，短语“严格的杂交条件”或“严格的条件”是指本发明化合物与其靶序列杂交但与最少数量的其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下是不同的，并且在本发明的上下文中，寡聚化合物与靶序列杂交的“严格条件”由寡聚体的性质和组成以及它们被研究的测定法决定。

如本文所用，“互补的”是指寡聚化合物的两个核碱基之间精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸（寡聚化合物）的某个位置处的核碱基能够与靶核酸的某个位置处的核碱基形成氢键，则所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，然后，寡核苷酸和靶核酸之间氢键的位置被认为是互补位置。当每个分子中足够数量的互补位置被能够彼此结合成氢键的核碱基占据时，寡核苷酸和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互补。因此，“特异性杂交的”和“互补的”是用于表示足够数量的核碱基足够程度的精确配对或互补性，使得在寡核苷酸和靶核酸之间稳定的和特异性的结合的术语。

应理解，在本领域中反义寡聚体的序列不需要与其靶核酸的序列100％互补即可特异性杂交。此外，寡核苷酸可以在一个或多个区段上杂交，使得插入或相邻区段不参与杂交事件（例如环结构或发夹结构）。优选本发明的反义化合物与靶核酸内的靶区域具有至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％的序列互补性，更优选地是它们包含至少90％的序列互补性，甚至更优选地包含它们与被靶向的靶核酸序列内的靶区域至少95％或至少99％的序列互补性。例如，反义寡聚体的20个核碱基中的18个与靶区域互补并因此特异性杂交的反义化合物将代表90％的互补性。在该实施例中，剩余的非互补核碱基可以与互补的核碱基成簇或散布，并且不需要彼此邻接或与互补的核碱基邻接。因此，长度为18个核碱基的反义寡聚体具有4个非互补核碱基，其侧翼为与靶核酸完全互补的两个区域，与靶核酸具有77.8％的总体互补性，因此属于本发明的范围。可以使用本领域已知的BLAST程序（基础的局部比对搜索工具）和PowerBLAST程序常规地确定反义化合物与靶核酸的区域的互补百分比。

在本发明的上下文中，术语“寡核苷酸”是指核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）的寡聚物或聚合物或其模拟物、嵌合体、类似物和同系物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷间（骨架）键组成的寡核苷酸，以及具有相似功能的非天然存在部分的寡核苷酸。这种修饰或取代的寡核苷酸通常优于天然形式，因为其具有所需的性质，例如增强的细胞摄取、增强的对靶核酸的亲和力以及在核酸酶存在下增加的稳定性。

如本文所用，术语“microRNA”、“miRNA”或者“miR”是指起转录后调节基因表达的功能的RNA，通常通过结合靶信使RNA（mRNA）转录本的3’非翻译区（3’ UTRs）的互补序列，通常导致基因沉默。miRNA通常是小的调节RNA分子，例如长度为21或22个核苷酸。术语“microRNA”、“miRNA”和“miR”可互换使用。

如本文所使用的，术语“肿瘤”是指恶性组织，其包含不受控制地生长的转化细胞（即过度增殖性疾病）。肿瘤包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、浆细胞瘤等；以及实体瘤。可以根据本发明治疗的实体瘤的实施例包括但不限于恶性肿瘤和癌，例如黑色素瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤（Ewing’s tumor）、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤（Wilms’ tumor）、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌和前胃癌。

如本文所使用的，术语“CTLA4”是指“细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4”，其是能够通过抑制共刺激并向T细胞传递抑制信号来减弱T细胞活化的许多共抑制分子中的一个。CTLA4的氨基酸序列可从NCBI获得，登录号为NP_033973.2或NP_001268905.1。CTLA4也称为Ctla-4、Cd152或Ly-56。CTLA4的NCBI序列登录号为NC_000067.6，基因ID为12477。人CTLA4基因编码属于免疫球蛋白超家族的233个氨基酸蛋白质。CTLA4由一个侧翼为两个疏水区的V样结构域组成。CTLA4还可以改变免疫突触的结构，在T细胞增殖和分化中起关键作用。CTLA4的多态性与多种疾病的易感性有关，包括I型糖尿病、胆汁性肝硬变和格雷夫斯氏病（Graves' disease）。

“治疗有效量”是指本发明的溶瘤病毒和/或外泌体以足以用于如上所述“治疗”的量被施用。在治疗特定个体的疾病或病症中治疗有效的量将取决于疾病的症状和严重程度，并且可以通过标准临床技术来确定。另外，可以任选地采用体外或体内测定来帮助确定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径以及疾病或病症的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。可以从体外或动物模型测试系统得出的剂量反应曲线中推断有效剂量。

如本文所使用的，术语“溶瘤病毒”是指设计、使用或有效杀死肿瘤细胞的本领域已知的任何溶瘤病毒。例如，溶瘤病毒包括I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、新城疫病毒、牛痘病毒、腺病毒、弹状病毒、非VSV弹状病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、流感病毒、任何这些病毒的突变株或任何这些病毒的基因工程株。另外，也可以对本发明中使用的溶瘤病毒进行基因工程改造，从而删除天然溶瘤病毒的一个或多个特征。另外地或替代地，可以对天然溶瘤病毒进行基因工程改造，以将一种或多种编码序列的外源片段引入病毒的基因组，从而提供病毒的一种或多种其他功能，例如免疫治疗或免疫刺激特性。例如，溶瘤病毒是表达IL-12的基因工程HSV-1溶瘤病毒。在另一个实施例中，溶瘤病毒是表达PD-1和IL-12的基因工程HSV-1溶瘤病毒。

靶向CTLA4的miRNA

术语“靶向CTLA4的多个miRNA”、“靶向CTLA4的一个miRNA”、“靶向CTLA4的miRNA”在本文中可互换使用，是指设计用于靶向或特异性结合编码蛋白质CTLA4的mRNA的小的非编码RNA（microRNA或miRNA），使得CTLA4在细胞中的转录、翻译和反过来表达受损、减少或消除。如上所述，miRNA不一定以100％特异性结合靶mRNA。已知miRNA具有种子序列（5'末端的2至8个核苷酸），其决定与靶mRNA结合的特异性，而剩余的核苷酸不一定与靶mRNA完全互补。因此，在一个实施方案中，miRNA具有核苷酸序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或者SEQ ID NO: 4中的任何一个种子序列。在一些实施方案中，靶向CTLA4的miRNA在递送至细胞后阻断细胞中CTLA4蛋白的表达。

携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体

外泌体是来自细胞膜的小的、相对尺寸均匀的囊泡。例如，外泌体可具有约30至约100 nm的直径。它们含有几种关键蛋白质（例如CD9、CD63、CD81、CD82、膜联蛋白、Flotillin等），此外它们包装蛋白质、mRNA、长非编码RNA和miRNA。外泌体将有效负载从一个细胞传递至另一个细胞。在进入受体细胞后，外泌体有效负载被释放到细胞质中。

在一些实施方案中，靶向CTLA4的miRNA通过外泌体递送至细胞。因此，在一个实施方案中，提供了携带如上所述的任何靶向CTLA4的miRNA的外泌体。本发明使用本文提到的“外泌体基序”的核苷酸序列片段，以促进或增强miRNA包装到外泌体中。在一个实施方案中，外泌体基序选自表1中确定的任何序列。

表1 与本发明的miRNA一起使用的外泌体基序的序列

序列ID	核苷酸序列	序列ID	核苷酸序列
				SEQ ID NO. 21	5’-GGAG-3’	SEQ ID NO. 36	5’-CGCC-3’
SEQ ID NO. 22	5’-GGAC-3’	SEQ ID NO. 37	5’-CGGG-3’
				SEQ ID NO. 23	5’-GGCG-3’	SEQ ID NO. 38	5’-CGGC-3’
SEQ ID NO. 24	5’-GGCC-3’	SEQ ID NO. 39	5’-CCCU-3’
				SEQ ID NO. 25	5’-GGGG-3’	SEQ ID NO. 40	5’-CCCG-3’
SEQ ID NO. 26	5’-GGGC-3’	SEQ ID NO. 41	5’-CCCA-3’
				SEQ ID NO. 27	5’-UGAG-3’	SEQ ID NO. 42	5’-UCCU-3’
SEQ ID NO. 28	5’-UGAC	SEQ ID NO. 43	5’-UCCG-3’
				SEQ ID NO. 29	5’-UGCG	SEQ ID NO. 44	5’-UCCA-3’
SEQ ID NO. 30	5’-UGCC	SEQ ID NO. 45	5’-GCCU-3’
				SEQ ID NO. 31	5’-UGGG	SEQ ID NO. 46	5’-GCCG-3’
SEQ ID NO. 32	5’-UGGC	SEQ ID NO. 47	5’-GCCA-3’
				SEQ ID NO. 33	5’-CGAG	SEQ ID NO. 48	5’-GGAGGAC-3’
SEQ ID NO. 34	5’-CGAC	SEQ ID NO. 49	5’-GGACUGGGAG-3’
				SEQ ID NO. 35	5’-CGCG-3’	SEQ ID NO. 50	5’-GGAGGAG-3’
SEQ ID NO. 51	5’-GGACGGAG-3’	SEQ ID NO. 52	5’-GGAGGCGGAG-3’

在一些实施方案中，外泌体基序被组合使用。例如，将表中确定的两个或更多个外泌体基序组合以形成双倍外泌体基序。基序可以通过将一个外泌体基序的5'末端连接至另一个外泌体基序的3'末端而被线性组合。在这种情况下，当一个外泌体基序的5'末端的第一个核苷酸与另一个外泌体基序的3'末端的最后一个核苷酸相同时，相同的核苷酸中的一个可以被设计为被省略。例如，“GGAG”（SEQ ID NO. 21）与“GGAC”（SEQ ID NO. 22）组合以形成双倍外泌体基序“GGAGGAC”（SEQ ID NO. 48）。而当一个外泌体基序的5'末端的第一个核苷酸与另一个外泌体基序的3'末端的最后一个核苷酸不相同时，两个外泌体基序可以通过一个连接子连接或通过共价键连接。例如，“GGAC”（SEQ ID NO. 22）与“GGAG”（SEQ IDNO. 21）可以通过连接子“TG”连接以形成双倍外泌体基序“GGACTGGGAG”（SEQ ID NO. 49），“GGAC”（SEQ ID NO. 22）与“GGAG”（SEQ ID NO. 21）也可以通过共价键连接以形成双倍外泌体基序“GGACGGAG”（SEQ ID NO. 51）。本发明还考虑了三倍或更多倍的外泌体基序，即由SEQ ID NO. 21至SEQ ID NO. 47中的三个或更多个基序组成的外泌体基序。因此，本文使用的术语“外泌体基序”意在包括能够增强或促进miRNA包装至外泌体的核苷酸序列，包括SEQ ID NO. 21至SEQ ID NO. 47的任何单个外泌体基序和任何由单个基序的组合产生的双倍（例如SEQ ID NO.48-52中任一个）、三倍或更多倍的外泌体基序。

在本发明中，外泌体基序与miRNA的种子序列可操作的连接。术语“可操作的连接”是指调节序列（例如外泌体基序）和核酸序列（例如miRNA的种子序列）之间的功能性连接，导致增强或促进miRNA包装进外泌体中。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。可操作地连接的RNA序列可以彼此邻接，也可以通过连接子连接。

在一些实施方案中，外泌体基序位于miRNA的种子序列的下游。在一些实施方案中，外泌体基序位于miRNA的种子序列的上游。在一些实施方案中，miRNA的种子序列侧翼为外泌体基序。在一个实施方案中，外泌体基序可操作地连接至miRNA的种子序列。在一个实施方案中，外泌体基序是通过突变miRNA的除种子序列以外的一个或多个核苷酸序列而获得的。在一个实施方案中，具有外泌体基序的靶向CTLA4的miRNA含有SEQ ID NO. 5、SEQ IDNO. 6、SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8的核苷酸序列。在一个实施方案中，具有外泌体基序的靶向CTLA4的miRNA是SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8的核苷酸序列。

在一些实施方案中，外泌体基序位于miRNA的种子序列的下游，种子序列的3'末端最后的核苷酸和外泌体基序的5'末端第一核苷酸共享相同的核苷酸，例如核苷酸“G”。例如，SEQ ID NO. 6示出了外泌体基序和种子序列之间核苷酸“G”的共享。在一些实施方案中，外泌体基序位于miRNA的种子序列的下游，种子序列的3'末端最后两个的核苷酸和外泌体基序的5'末端前两个核苷酸共享两个相同的核苷酸，例如，两个核苷酸“GG”。例如，SEQID NO. 8示出了外泌体基序和种子序列之间两个核苷酸“GG”的共享。

在一些实施方案中，外泌体基序位于miRNA的种子序列的下游，其通过连接子（例如“GC”）与种子序列连接。例如，SEQ ID NO. 7示出了外泌体基序与种子序列通过连接子“GC”连接。

除了种子序列和外泌体基序之外，miRNA还包括另外的核酸序列以促进与mRNA的靶区域的结合。这些另外的核酸通常位于外泌体基序的下游，具有几个核苷酸的长度，例如1至10个核苷酸。另外的核酸序列优选与靶mRNA的相应区段互补，但是，如上所述，不一定是100％互补的。

miRNA转移到外泌体中的方法是在本领域中可获得的，例如通过用miRNA表达载体和编码CTLA4的质粒共转染细胞，如实施例中所述。外泌体的分离、鉴定或表征在本领域中技术上是可行的。几种蛋白质，例如CD9、CD63、CD81、CD82、膜联蛋白、Flotillin等能够被用作外泌体的标记物。将miRNA包装到外泌体中的其他方法也适用于本发明。

本发明的外泌体含有抑制量的靶向CTLA4的miRNA。抑制量是指一旦所讨论的miRNA递送到肿瘤细胞中就足以抑制蛋白质CTLA4表达的量。

下表列出了本发明实施例中使用的miRNA、种子序列和miRNA-基序的核酸序列。

表2 miRNA、种子序列以及与外泌体基序连接的miRNA的核酸序列

方法与疗法

本发明的一个方面提供了一种用于治疗对象中肿瘤的方法，所述方法包含向有此需要的对象施用治疗有效量的本发明的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和治疗有效量的溶瘤病毒。

本发明的一个方面提供了一种用于在对象中增强溶瘤病毒疗法的功效的方法，除溶瘤病毒疗法外，所述方法还包含向有此需要的对象施用治疗有效量的本发明的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体。

在一些实施方案中，在本发明的方法中，携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和溶瘤病毒的施用通过给对象施用药物组合物来进行，所述药物组合物包含治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和治疗有效量的溶瘤病毒和药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，在本发明的方法中，携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和溶瘤病毒的施用是通过分别向对象施用携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和溶瘤病毒来进行的。在一些实施方案中，在溶瘤病毒的施用之前、同时或之后施用携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体。在这样的情况下，预期可以在彼此约12至72小时内以两种形式给对象施用。然而，在某些情况下，可能希望将治疗时间显著延长，在单独的施用之间间隔几天（2、3、4、5、6或7）至几周（1、2、3、4、5、6、7或8）的时间。

在一些实施方案中，携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体与溶瘤病毒同时施用。在一些实施方案中，携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体以包含治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和药学上可接受的载体的药物组合物的形式被施用，并且溶瘤病毒以包含治疗有效量的溶瘤病毒和药学上可接受的载体的药物组合物的形式被施用。在这样的实施方案中，包含治疗有效量的携带靶向CTLA4的miRNA的外泌体和药学上可接受的载体的药物组合物，以及包含治疗有效量的溶瘤病毒和药学上可接受的载体的药物组合物可以被包装在单个药盒中。

在某些实施方案中，任何药物组合物是肠胃外或非胃肠外施用，例如肿瘤内地、静脉内地、肌肉内地、经由皮肤地或皮内地。

在某些实施方案中，治疗肿瘤的方法增强溶瘤病毒疗法的抗肿瘤功效，例如就抑制肿瘤生长和/或减少肿瘤体积而言。因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种用于治疗肿瘤的方法，该方法包含将治疗有效量的如上所述的外泌体与治疗有效量的溶瘤病毒组合施用于有此需要的对象。在某些实施方案中，治疗肿瘤的方法防止与肿瘤有关的症状的发作、发展和/或复发。因此，在一些实施方案中，用于防止对象中与肿瘤相关的症状的方法包含将治疗有效量的如上所述的外泌体与治疗有效量的溶瘤病毒施用于有此需要的对象。

在一些实施方案中，溶瘤病毒包括I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、新城疫病毒、牛痘病毒、腺病毒、弹状病毒、非VSV弹状病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、流感病毒、任何这些病毒的突变株或任何这些病毒的基因工程株。在一些实施方案中，溶瘤病毒是表达IL-12的HSV-1溶瘤病毒。

考虑了本发明的方法来治疗各种肿瘤，特别是实体瘤。可以根据本发明治疗的实体瘤的实施例包括但不限于恶性肿瘤和癌，例如黑素瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌和前胃癌。

药物组合物和药盒

本发明的一个方面提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的如上所述的外泌体、治疗有效量的溶瘤病毒和药学上可接受的载体。该药物组合物被用于预防或治疗对象的肿瘤。可以在合适的药学上可接受的载体或赋形剂中制备药物组合物。

本发明的另一方面提供第一药物组合物，其包含治疗有效量的如上所述的外泌体和药学上可接受的载体。另外，本发明还提供第二药物组合物，其包含治疗有效量的溶瘤病毒和药学上可接受的载体。在这样的方面，本发明提供一种药盒，其包括以单个包装的第一药物组合物和第二药物组合物。该药盒可以进一步包括医师在临床使用期间可以参考的使用说明。

在一些实施方案中，溶瘤病毒包括I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、新城疫病毒、牛痘病毒、腺病毒、弹状病毒、非VSV弹状病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、流感病毒、任何这些病毒的突变株或任何这些病毒的基因工程株。在一些实施方案中，溶瘤病毒是表达IL-12的HSV-1溶瘤病毒。

在常规的储存和使用条件下，这些制剂/组合物包含防腐剂以防止微生物的生长。适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须具有一定的流动性，以达到易于注射的程度。该形式必须在生产和储存条件下保持稳定，并且必须进行防止微生物（例如细菌和真菌）的污染。

载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）、其合适的混合物和/或植物油。在分散的情况下，例如通过使用诸如卵磷脂的包衣维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，最好包括等渗剂，例如糖、氯化钠或磷酸盐缓冲盐水。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂（例如单硬脂酸铝和明胶），可以使可注射组合物的吸收延长。

对于肠胃外以水溶液施用，例如，溶液应适当地缓冲（如果需要的话），并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下、肿瘤内和腹膜内施用。就此而言，根据本发明的内容，能够使用无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1 mL的等渗NaCl溶液中，并且将其添加到1000 mL的皮下灌注液中，或者在所建议的输注位置注射（参见例如"Remington'sPharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580）。根据所治疗的对象的状况，剂量必然会发生一些变化。无论如何，负责施用的人员将确定个体对象的适当剂量。此外，对于人体施用，制剂应满足FDA所要求的无菌性、无热原性、一般安全性和纯度标准。

通过将活性化合物以需要的量与上面列举的各种其它成分按需要合并在合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入含有基本分散介质和来自上面列举的所需其它成分的无菌载体中来制备分散液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分及任何其他所需成分的粉末。

本发明的组合物可以被配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐（与蛋白质的游离氨基形成），包括与无机酸（如盐酸或磷酸）或有机酸（如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等）形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱（例如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁）和有机碱（如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等）。在配制时，溶液将以与剂量配方相配的方式以及治疗上有效的量被施用。该制剂易于以各种剂型（如可注射溶液、药物释放胶囊等）施用。

如本文所使用的，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、载体、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、混悬剂、胶体等。用于药物活性物质的这样的介质和药剂在本领域是公知的。除了与活性成分不相容的任何常规的介质或试剂之外，预期其他介质或试剂可以用于所述治疗组合物中。补充的活性成分也可以并入组合物中。

短语“药学上可接受的”是指当施用于人时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和成分。含有蛋白质作为活性成分的水性组合物的制备是本领域公知的。典型地，这样的组合物被制备为注射剂，无论作为液体溶液或混悬液；也可以制备为适于在注射之前溶解或悬浮于液体中的固体形式。

实施例

原则上，增强抗肿瘤功效仅能够以三种方式进行，即通过使用肿瘤或细胞功能抑制剂、通过启动子的突变来调节关键基因的表达、或者通过向肿瘤递送靶向编码基因产物的mRNA的miRNA。在本报告描述的研究中，所需的外泌体有效载荷是miRNA。

miRNA是有效的工具，原则上能够被用于控制编码某些蛋白质的RNA的复制。目的是设计能够阻止细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4复制并且可以通过外泌体递送至被感染的细胞的miRNA。我们设计了10个靶向编码CTLA4的mRNA的miRNA。在这10个miRNA中，miR-CTLA4-1#、miR-CTLA4-2#、miR-CTLA4-3#和miR-CTLA4-6#在转染到易感细胞中后能有效阻断CTLA4的积累。为了促进miRNA包装到外泌体中，我们将miR-CTLA4-1#、miR-CTLA4-2#、miR-CTLA4-3#和miR-CTLA4-6#的序列合并至外泌体包装基序。显示miR-CTLA4-3#被包装到外泌体中并通过外泌体成功递送至易感细胞，其在易感细胞中保持稳定至少72小时。最后，结果显示，通过外泌体递送至肿瘤的miR-CTLA4-3#有效降低了CTLA4的表达。该报告中描述的方案能够被用于研究病毒基因功能，而无需实际删除或突变该基因。

将RNA并入外泌体中是序列依赖性的，并且由hnRNPA2B1（一种外泌体的组分）促进。hnRNPA2B1分为外泌体RNA，包含两种已知的外泌体包装基序（外泌体基序）中的一种。hnRNPA2B1的关键功能是调节mRNA运输至神经细胞中的轴突，其是通过结合称为RNA运输序列（RTS）的21-nt RNA序列介导的。该序列包含两个外泌体基序。

实施例显示，通过将包含溶瘤病毒和携带被设计为靶向编码CTLA4（在活化的T细胞表面表达的跨膜蛋白）的mRNA的miRNA的外泌体的组合物递送至肿瘤能够增强溶瘤病毒的抗肿瘤功效和减小肿瘤的体积。

材料和方法

细胞系。HEp-2细胞从美国菌种保藏中心获得，并在补充有5%（vol/vol）胎牛血清（FBS）的DMEM（Life Technologies）中常规培养。MFC（小鼠前胃癌）细胞由JOINNLaboratories，Inc.（中国北京）提供。B16（小鼠黑色素瘤）由深圳国际生物医学研究所（中国深圳）提供。

抗体。本研究中使用的抗体是抗-His-标签（Cat No. 66005-1-Ig，ProteintechGroup）和抗-GAPDH（Cat No.2118，Cell Signaling Technology）。

质粒构建。使用Life Technologies的BLOCK-iT™ RNAi Designer设计针对小鼠CTLA4的靶标miRNA序列，并由Ige Biotechnology（中国广州）合成。合成的miRNA片段用BamHI和XhoI限制酶消化，并克隆到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg对照质粒（Invitrogen）的相应位点。miRNA的序列如下：

miR-CTLA4-1#:

5’-AACCTTCAGTGGAGTTGGCGAGTTTTGGCCACTGACTGACTcGCCAACCACTGAAGGTT-3’(SEQID NO. 53);

miR-CTLA4-2#:

5’-CTTCAGTGGAGTTGGCGAGCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGCTCGCCCtCCACTGAAG-3’(SEQID NO. 54);

miR-CTLA4-3#:

5’-ACTGTGCTGCGGAGGACAAATGTTTTGGCCACTGACTGACATTTGTCCCGCAGCACAGT-3’(SEQID NO. 55);

miR-CTLA4-4#:

5’-CGACATTCACGGAGGAGAATAGTTTTGGCCACTGACTGACTATTCTCCCGTGAATGTCG-3’(SEQID NO. 56);

miR-CTLA4-5#:

5’-GAACCTCACCCTCCAAGGACTGTTTTGGCCACTGACTGACAGTCCTTGGGGTGAGGTTC-3’(SEQID NO. 57);

miR-CTLA4-6#:

5’-ATCCAAGGACTGGGAGCTGTTGTTTTGGCCACTGACTGACAACAGCTCAGTCCTTGGAT-3’(SEQID NO. 58);

miR-CTLA4-7#:

5’-ACTCATGTACCCTCCGCCATAGTTTTGGCCACTGACTGACTATGGCGGGGTACATGAGT-3’(SEQID NO. 59);

miR-CTLA4-8#:

5’-GGCAACGGGAGGCGGAGTTATGTTTTGGCCACTGACTGACATAACTCCCTCCCGTTGCC-3’(SEQID NO. 60);

miR-CTLA4-9#:

5’-GGGCAACGGGACGGAGATTTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAAATCTCTCCCGTTGCCC-3’(SEQID NO. 61);

miR-CTLA4-10#:

5’-TGACTGTGCTGCGGCGGACAAGTTTTGGCCACTGACTGACTTGTCCGCCAGCACAGTCA-3’(SEQID NO. 62)；

下划线表示成熟的miRNA序列。

带有His标签的小鼠CTLA4表达质粒（mCTLA4-his）购自YouBio Biotechnology（中国长沙）。

外泌体分离和定量。将在T150烧瓶中接种24小时的细胞用PBS充分漂洗，然后在无血清的培养基中孵育。18小时后，将无细胞的细胞外培养基以2000 g离心30分钟。收集上清液与推荐剂量的总外泌体分离试剂盒试剂（Thermo Fisher Cat No. 4478359）混合，在4℃下储存过夜，然后离心1 h。然后将沉淀的外泌体重悬于200 μl PBS中，或溶解在RIPA缓冲液中，然后根据制造商的说明使用增强型BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime Biotechnology，中国）通过BCA测定进行定量。通过针对标准曲线的校准来确定外泌体蛋白质含量，该标准曲线是通过将562 nm处的吸光度相对于牛血清白蛋白标准浓度作图来获得。

外泌体分离。通过差速离心法纯化外泌体。HEp-2细胞（5x10⁶）用10 μg表达miR-CTLA4的质粒转染。孵育4小时后，将细胞用PBS洗涤3次以排除外泌体在血清中的潜在污染，并将细胞在不含胎牛血清（FBS）的培养基中再培养48小时。收集上清液，并在4℃下以300 g的转速旋转10分钟，以去除非贴壁细胞。然后将上清液在4℃下以12,000 g离心30分钟。将上清液转移到一个干净的聚碳酸酯瓶中，在4℃下以120,000 g超速离心70分钟。然后将沉淀的外泌体重悬于200 µl PBS中，然后根据制造商的说明使用增强型BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime Biotechnology，中国）通过BCA测定进行定量。通过针对标准曲线的校准来确定外泌体蛋白质含量，该标准曲线是通过将562 nm处的吸光度相对于牛血清白蛋白标准浓度作图来获得。

miRNA定量实时PCR。根据各自制造商的说明，使用TRIzol试剂（Thermo FisherScientific）从细胞中分离总RNA。该过程按所述进行。根据制造商的说明，使用mirVanaTMmiRNA分离试剂盒（Thermo Fisher Cat。AM1561）提取外泌体RNA。如TaqMan miRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems, Inc.）中所述，通过特异的茎环引物从50 ng总RNA中一式两份地逆转录测试的miRNA。使用TaqMan Universal Master Mix II试剂盒（购自AppliedBiosystems, Inc.），通过实时PCR测定miRNA的表达。通过与细胞18s rRNA比较，将miRNA拷贝数标准化。miR-CTLA4-3#的引物是根据Chen等人的方法设计的，并由Ige Biotechnology合成。序列如下所示：

miR-CTLA4-3#的茎环引物，

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATTTGT-3’(SEQ ID NO.63);

正向引物，5’-CCTGGACTGTGCTGCGGA-3’(SEQ ID NO. 64);

反向引物，5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3’(SEQ ID NO. 65);

探针，5’-(6-FAM) CACTGGATACGACTCGCCA (MGB)-3’(SEQ ID NO. 66)。

免疫印迹分析。收获细胞并用补充有1 mM蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）（Beyotime）和磷酸酶抑制剂（Beyotime）的RIPA裂解缓冲液（Beyotime）裂解，使细胞裂解物热变性，并通过SDS-PAGE分离，转移至聚偏二氟乙烯膜（Millipore）。蛋白质通过以下方法检测：先与适当的一抗一起孵育，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗（Pierce）和ECL试剂一起孵育，并暴露于薄膜或用ChemiDoc Touch Imaging System（Bio-Rad）捕获图像，然后使用ImageLab软件进行处理。使用ImageJ软件对相应条带的密度进行定量。

溶瘤病毒构建。示例性溶瘤病毒（以下也称为T2850）的构建涉及：删除I型单纯疱疹病毒F株（HSV-1）反向重复区（IR）来减轻神经毒性；插入编码鼠类细胞因子的活性异质二聚体（称为“p70”）的外源基因，称为白介素-12（mIL-12）异二聚体的mIL-12 p70分子，由IL-12 p40和p35亚基组成。IL-12的转录受Egr-1启动子控制，并伴有乙型肝炎病毒poly A信号。另外，IL-12的两个亚基的共翻译由位于两个基因之间的脑心肌炎病毒（EMCV）内部核糖体进入位点（IRES）指导。经修饰的HSV-1溶瘤病毒的构建和性质的更详细描述可从WO2017/181420获得。

动物模型。对于MFC，同系小鼠为615，对于B16肿瘤为C57BL/6。肿瘤是通过将1×10⁶个细胞皮下植入小鼠侧腹而产生的。将具有平均体积80 mm³的MFC肿瘤或70 mm³的B16肿瘤的小鼠随机分组并注射磷酸盐缓冲盐水PBS + 10％甘油（w/v）（对照）或1×10⁷ pfu混合有10 μg外泌体的T2850，所述外泌体从非靶标（miRNA-NT exo）或CLTA4 miRNA（miRNA-CTLA4 exo）质粒转染的HEp-2细胞上清液纯化。每三天测量一次肿瘤体积。

结果

能够抑制CTLA4积累的miRNA的设计和构建

第一系列实验的目的是设计靶向CTLA4（在活化的T细胞表面表达的跨膜蛋白）的miRNA。为此，我们构建了10个miRNA，分别命名为miR-CTLA4-1#、miR-CTLA4-2#、miR-CTLA4-3#、miR-CTLA4-4#、miR-CTLA4-5#、miR-CTLA4-6#、miR-CTLA4-7#、miR-CTLA4-8#、miR-CTLA4-9#和miR-CTLA4-10#。图1中示出的每个miRNA的序列包含在miRNA种子序列的下游示为外泌体包装相关基序（exo-motifs）的另外的序列。如图1所示，如材料和方法中所述的将miRNA克隆到miRNA表达载体的编码EGFP的开放阅读框的下游，命名为“pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg对照质粒”。

为了测试miRNA，将HEp-2细胞与上述miRNA表达载体（miRmCTLA4-1#、miRmCTLA4-2#、miRmCTLA4-3#、miRmCTLA4-4#、miRmCTLA4-5#、miRmCTLA4-6#、miRmCTLA4-7#、miRmCTLA4-8#、miRmCTLA4-9#、miRmCTLA4-10#）和在C末端用His标记的编码CTLA4的质粒（mCTLA4-His）共转染。如图2所示，在抑制CTLA4积累的过程中，miR-CTLA4-3#是10个构建体中最有效的。结果表明，miR-CTLA4-3#以更高效率抑制CTLA4的积累。miR-CTLA4-1#、miR-CTLA4-2#、miR-CTLA4-4#、miR-CTLA4-5#、miR-CTLA4-6#和miR-CTLA4-7#显示中等程度的作用，而非靶标（NT）、miR-CTLA4-8#、miR-CTLA4-9#和miR-CTLA4-10#质粒对CTLA4的积累没有影响（图2）。因此，选择miR-CTLA4-1#、miR-CTLA4-2#、miR-CTLA4-3#和miR-CTLA4-6#进行进一步研究。

通过外泌体递送的miR-CTLA4-3#降低转染的mCTLA4的表达

在该系列实验的第一步中，将每个含有5x10⁶ HEp-2细胞的复制培养物用10 μg所选表达miR-CTLA4（1#、2#、3#和6#）的质粒转染。孵育4小时后，将细胞用PBS洗涤3次，并将细胞在不含胎牛血清（FBS）的培养基中再培养48小时。然后，按照材料和方法中的描述纯化HEp-2中产生的外泌体。

第二步，用mCTLA4质粒转染每个含有2.5x10⁵ HEp-2细胞的培养物。24小时后，将其与10 μg第一步纯化的外泌体一起孵育。孵育24小时后，将培养液替换为新鲜培养基。再过48小时后，收获细胞，将细胞裂解液在10％变性凝胶中电泳分离，并与所示抗体反应。如图3所示，结果显示，通过外泌体递送的miR-CTLA4-3#降低转染的mCTLA4的表达，而通过外泌体递送的非靶标（NT）、miR-CTLA4-1#、miR-CTLA4-2#和miR-CTLA4-6#对转染的mCTLA4的表达没有影响。因此，选择miR-CTLA4-3#进行体内研究。

从纯化的外泌体中检测的miR-CTLA4的量

在这一系列实验中，将HEp-2细胞用10 μg所示的编码靶向CLTA4的miRNA（miR-CTLA4-3#）的质粒转染，收获细胞沉淀并在转染后的指定时间纯化外泌体。如材料和方法中所述，分别从细胞沉淀和纯化的外泌体中提取总RNA。使用实时PCR分析对miR-CTLA4进行定量并相对于18S rRNA标准化。结果表明，纯化的外泌体和细胞沉淀物中存在miR-CTLA4，并且纯化的外泌体中miR-CTLA4的拷贝数大于从细胞沉淀中获得的拷贝数（图4）。

包含含有miR-CTLA4-3#的外泌体和溶瘤病毒的组合物抑制肿瘤的生长

在这一系列实验的第一步中，用exo-miR-CTLA4-3#质粒转染HEp-2复制培养物，并将细胞培养48小时。然后，如材料和方法中所述纯化在HEp-2中产生的exo-miR-CTLA4-3#。

第二步，如材料和方法中所述构建溶瘤病毒T2850（图5）。然后将小鼠前胃癌MFC或小鼠黑素瘤B16细胞分别皮下注射到615或C57BL/6J小鼠的右侧腹中，以产生肿瘤。将具有平均体积约80 mm³的MFC肿瘤或70 mm³的B16肿瘤的小鼠随机分为3组并瘤内单一注射50 ml含10％甘油（w/v）的磷酸盐缓冲盐水PBS（对照组，n = 8）或1×10⁷ pfu混合有10 μg外泌体的T2850，所述外泌体从非靶标（T2850 + miRNA-NT exo）或CLTA4 miRNA（T2850 + miRNA-NT exo）质粒转染的HEp-2细胞上清液纯化。

最后，每3天测量一次肿瘤体积，直到注射后28天。在前胃癌小鼠的实验中，结果显示，对照、T2850 + miRNA-NT exo和T2850 + miRNA-CTLA4 exo中的肿瘤体积在注射后逐渐增加，并且注射T2850 + miRNA- CTLA4 exo的小鼠的肿瘤体积比对照和T2850 + miRNA-NTexo的增长更慢。注射28天后，注射T2850 + miRNA-CTLA4 exo的小鼠的肿瘤体积比对照和T2850 + miRNA-NT exo的小鼠的肿瘤体积更小（图6A）。在黑色素瘤的小鼠的实验中，对照组的小鼠在注射后16天死亡。注射10天后，注射T2850 + miRNA-NT exo和T2850 + miRNA-CTLA4 exo的小鼠的肿瘤体积没有增加。注射后10到22天之间，注射T2850 + miRNA-NT exo和T2850 + miRNA-CTLA4 exo的小鼠的肿瘤体积逐渐增加，而注射T2850 + miRNA-CTLA4exo的小鼠的肿瘤体积比对照和T2850 + miRNA-NT exo 的增长更慢。注射22天后，注射T2850 + miRNA-NT exo的小鼠的肿瘤体积迅速增加，但是注射T2850 + miRNA-CTLA4 exo的小鼠的肿瘤体积逐渐减小（图6B）。

该系列实验的结果表明，包含含有miR-CTLA4-3#的外泌体和溶瘤病毒的组合物增强了溶瘤病毒的抗肿瘤功效并抑制了肿瘤的生长。

结果表明，miR-CTLA4-3#被包装在外泌体中，易于递送至易感细胞。我们还说明了通过外泌体递送的miRNA在受体细胞中持续存在至少72 h。最后，我们已经说明，包含含有miR-CTLA4-3#的外泌体和溶瘤病毒的组合物增强了溶瘤病毒的抗肿瘤功效并抑制了肿瘤的生长。本文呈现的结果还表明，如果被靶向的基因在病毒复制中起重要作用，那么miRNA可以被用于定义被靶向的基因功能以及阻断病毒复制。在许多情况下，它可以避免删除被靶标的基因来定义其功能的繁琐过程。

应当理解，虽然本发明已经通过优选实施方案和任选的特征被具体公开，但是对本文所呈现的内容的修改、改进和变化是本领域技术人员容易意识的，并且这些修改、改进和变化被认为是在本发明的范围内。本文提供的材料、方法和实施例是优选的实施方案的代表，是示例性的，并非意图作为对本发明范围的限制。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用明确地整体并入本文，其程度如同每个单独地通过引用并入一样。如果发生冲突，以本说明书（包括定义）为准。本文说明性描述的公开内容可以在缺少本文未具体公开的任何要素、限制的情况下适当地被实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被广泛地阅读而不受限制。另外，本文使用的术语和表达被用作描述性的而非限制性的术语，并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所述特征的任何等效物或其部分，但应认识到，在本发明所要求保护的范围内可以进行各种修改。

序列表

<110> 深圳市亦诺微医药科技有限公司

<120> 用于治疗肿瘤的药物组合物、试剂盒和方法

<130> 21D-1814-CNP

<160> 66

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-1# 种子序列

<400> 1

accuuca 7

<210> 2

<211> 7

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-2# 种子序列

<400> 2

uucagug 7

<210> 3

<211> 7

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-3# 种子序列

<400> 3

cugugcu 7

<210> 4

<211> 7

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-6# 种子序列

<400> 4

uccaagg 7

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-1# + 外泌体基序

<400> 5

aaccuucagu ggaguuggcg a 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-2# + 外泌体基序

<400> 6

cuucagugga guuggcgagc a 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-3# + 外泌体基序

<400> 7

acugugcugc ggaggacaaa u 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-6# + 外泌体基序

<400> 8

auccaaggac ugggagcugu u 21

<210> 9

<211> 7

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-4# 种子序列

<400> 9

gacauuc 7

<210> 10

<211> 7

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-5# 种子序列

<400> 10

aaccuca 7

<210> 11

<211> 7

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-7# 种子序列

<400> 11

cucaugu 7

<210> 12

<211> 7

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-8# 种子序列

<400> 12

gcaacgg 7

<210> 13

<211> 7

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-9# 种子序列

<400> 13

ggcaacg 7

<210> 14

<211> 7

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-10# 种子序列

<400> 14

gacugug 7

<210> 15

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-4# + 外泌体基序

<400> 15

cgacauucac ggaggagaau a 21

<210> 16

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-5# + 外泌体基序

<400> 16

gaaccucacc cuccaaggac u 21

<210> 17

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-7# + 外泌体基序

<400> 17

acucauguac ccuccgccau a 21

<210> 18

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-8# + 外泌体基序

<400> 18

ggcaacggga ggcggaguua u 21

<210> 19

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-9# + 外泌体基序

<400> 19

gggcaacggg acggagauuu a 21

<210> 20

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-10# + 外泌体基序

<400> 20

ugacugugcu gcggcggaca a 21

<210> 21

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 21

ggag 4

<210> 22

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 22

ggac 4

<210> 23

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 23

ggcg 4

<210> 24

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 24

ggcc 4

<210> 25

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 25

gggg 4

<210> 26

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 26

gggc 4

<210> 27

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 27

ugag 4

<210> 28

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 28

ugac 4

<210> 29

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 29

ugcg 4

<210> 30

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 30

ugcc 4

<210> 31

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 31

uggg 4

<210> 32

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 32

uggc 4

<210> 33

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 33

cgag 4

<210> 34

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 34

cgac 4

<210> 35

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 35

cgcg 4

<210> 36

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 36

cgcc 4

<210> 37

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 37

cggg 4

<210> 38

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 38

cggc 4

<210> 39

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 39

cccu 4

<210> 40

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 40

cccg 4

<210> 41

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 41

ccca 4

<210> 42

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 42

uccu 4

<210> 43

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 43

uccg 4

<210> 44

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 44

ucca 4

<210> 45

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 45

gccu 4

<210> 46

<211> 4

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 46

gccg 4

<210> 47

<211> 4

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 47

gcca 4

<210> 48

<211> 7

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 48

ggaggac 7

<210> 49

<211> 10

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 49

ggacugggag 10

<210> 50

<211> 7

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 50

ggaggag 7

<210> 51

<211> 8

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 51

ggacggag 8

<210> 52

<211> 10

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 外泌体基序

<400> 52

ggaggcggag 10

<210> 53

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-1#的序列

<400> 53

aaccttcagt ggagttggcg agttttggcc actgactgac tcgccaacca ctgaaggtt 59

<210> 54

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-2#的序列

<400> 54

cttcagtgga gttggcgagc agttttggcc actgactgac tgctcgccct ccactgaag 59

<210> 55

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-3#的序列

<400> 55

actgtgctgc ggaggacaaa tgttttggcc actgactgac atttgtcccg cagcacagt 59

<210> 56

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-4#的序列

<400> 56

cgacattcac ggaggagaat agttttggcc actgactgac tattctcccg tgaatgtcg 59

<210> 57

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-5#的序列

<400> 57

gaacctcacc ctccaaggac tgttttggcc actgactgac agtccttggg gtgaggttc 59

<210> 58

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-6#的序列

<400> 58

atccaaggac tgggagctgt tgttttggcc actgactgac aacagctcag tccttggat 59

<210> 59

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-7#的序列

<400> 59

actcatgtac cctccgccat agttttggcc actgactgac tatggcgggg tacatgagt 59

<210> 60

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-8#的序列

<400> 60

ggcaacggga ggcggagtta tgttttggcc actgactgac ataactccct cccgttgcc 59

<210> 61

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-9#的序列

<400> 61

gggcaacggg acggagattt agttttggcc actgactgac taaatctctc ccgttgccc 59

<210> 62

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-10#的序列

<400> 62

tgactgtgct gcggcggaca agttttggcc actgactgac ttgtccgcca gcacagtca 59

<210> 63

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-3#的茎环引物

<400> 63

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacatttgt 50

<210> 64

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-3#的正向引物

<400> 64

cctggactgt gctgcgga 18

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> miR-CTLA4-3#的反向引物

<400> 65

ccagtgcagg gtccgaggta 20

<210> 66

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<220>

<221> misc_feature

<223> 6-羧基荧光素(6-FAM)被连接至 5'末端并且

小沟结合物(MGB) 被连接至3'末端

<400> 66

cactggatac gactcgcca 19

Claims (41)

1.一种用于治疗对象中肿瘤的药物组合物，其包含：

治疗有效量的外泌体，和

治疗有效量的溶瘤病毒，

其中所述外泌体包含抑制量的靶向CTLA4的miRNA和外泌体基序，所述外泌体基序与所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列可操作地连接以增强所述靶向CTLA4的miRNA包装至所述外泌体中。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列包含SEQ IDNO. 1至SEQ ID NO. 4的核酸序列中的任何一个。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述外泌体基序为选自SEQ ID NO. 21至SEQ IDNO. 49的核酸序列。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述外泌体基序位于所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列的下游并与其共价连接。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述外泌体基序是通过突变所述靶向CTLA4的miRNA的除种子序列以外的一个或多个核酸而获得的。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述外泌体基序是通过两个单个外泌体基序的组合产生的双倍基序，其中所述两个单个外泌体基序中的任何一个是选自SEQ ID NO. 21至SEQ ID NO. 47的核酸序列。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述双倍基序具有SEQ ID NO. 48的核酸序列。

8.根据权利要求1所述的组合物，当可操作地连接时，其中所述靶向CTLA4的miRNA和所述外泌体基序共享至少一个核苷酸或两个核苷酸或通过连接子连接。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述连接子由两个或更多个选自腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）的核苷酸组成。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述连接子是-GC-。

11.根据权利要求1所述的组合物，当可操作地连接时，其中所述靶向CTLA4的miRNA和所述外泌体基序具有SEQ ID NO. 7的核酸序列。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述溶瘤病毒选自I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、新城疫病毒、牛痘病毒、腺病毒、弹状病毒、非VSV弹状病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、流感病毒、任何这些病毒的突变株或任何这些病毒的基因工程株。

13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肿瘤是恶性肿瘤。

14.根据权利要求14所述的组合物，其中所述恶性肿瘤选自黑色素瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌和前胃癌。

15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述对象是人。

16.一种用于治疗对象中肿瘤的药盒，其包含：

（a）治疗有效量的外泌体，其中所述外泌体包含抑制量的靶向CTLA4的miRNA和外泌体基序，所述外泌体基序与所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列可操作地连接以增强所述靶向CTLA4的miRNA包装至所述外泌体中，

（b）治疗有效量的溶瘤病毒，以及任选地

（c）使用说明。

17.根据权利要求16所述的药盒，其中所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列包含SEQ IDNO. 1至SEQ ID NO. 4的核酸序列中的任何一个。

18.根据权利要求16所述的药盒，其中所述外泌体基序是选自SEQ ID NO. 21至SEQ IDNO. 49的核酸序列。

19.根据权利要求16所述的药盒，其中所述外泌体基序位于所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列的下游并与其共价连接。

20.根据权利要求16所述的药盒，其中所述外泌体基序是通过突变所述靶向CTLA4的miRNA的除种子序列以外的一个或多个核酸而获得的。

21.根据权利要求16所述的药盒，其中所述外泌体基序是通过两个单个外泌体基序的组合产生的双倍基序，其中所述两个单个外泌体基序中的任何一个选自SEQ ID NO. 21至SEQ ID NO. 47的核酸序列。

22.根据权利要求21所述的药盒，其中所述双倍基序具有SEQ ID NO. 48的核酸序列。

23.根据权利要求16所述的药盒，当可操作地连接时，其中所述靶向CTLA4的miRNA和所述外泌体基序共享至少一个核苷酸或两个核苷酸或通过连接子连接。

24.根据权利要求23所述的药盒，其中所述连接子由两个或更多个选自腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）的核苷酸组成。

25.根据权利要求24所述的药盒，其中所述连接子是-GC-。

26.根据权利要求16所述的药盒，当可操作地连接时，其中所述靶向CTLA4的miRNA和所述外泌体基序具有SEQ ID NO. 7的核酸序列。

27.根据权利要求16所述的药盒，其中所述溶瘤病毒选自I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、新城疫病毒、牛痘病毒、腺病毒、弹状病毒、非VSV弹状病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、流感病毒、任何这些病毒的突变株或任何这些病毒的基因工程株。

28.根据权利要求16所述的药盒，其中所述肿瘤是恶性肿瘤。

29.根据权利要求28所述的药盒，其中所述恶性肿瘤选自黑色素瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胃癌和前胃癌。

30.根据权利要求16所述的药盒，其中所述对象是人。

31.一种外泌体，其包含抑制量的靶向CTLA4的miRNA和外泌体基序，所述外泌体基序与靶向CTLA4的miRNA的种子序列可操作地连接以增强所述靶向CTLA4的miRNA包装至所述外泌体中。

32.根据权利要求31所述的外泌体，其中所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列包含SEQID NO. 1至SEQ ID NO. 4的核酸序列中的任何一个。

33.根据权利要求31所述的外泌体，其中所述外泌体基序选自SEQ ID NO. 21至SEQ IDNO. 49的核酸序列。

34.根据权利要求31所述的外泌体，其中所述外泌体基序位于所述靶向CTLA4的miRNA的种子序列的下游并与其共价连接。

35.根据权利要求31所述的外泌体，其中所述外泌体基序是通过突变所述靶向CTLA4的miRNA的除种子序列以外的一个或多个核酸而获得的。

36.根据权利要求31所述的外泌体，其中所述外泌体基序是通过两个单个外泌体基序的组合产生的双倍基序，其中所述两个单个外泌体基序中的任何一个选自SEQ ID NO. 21至SEQ ID NO. 47的核酸序列。

37.根据权利要求36所述的外泌体，其中所述双倍基序具有SEQ ID NO. 48的核酸序列。

38.根据权利要求31所述的外泌体，当可操作地连接时，其中靶向CTLA4的miRNA和外泌体基序共享至少一个核苷酸或两个核苷酸或通过连接子连接。

39.根据权利要求38所述的外泌体，其中所述连接子由两个或更多个选自腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）的核苷酸组成。

40.根据权利要求39所述的外泌体，其中所述连接子是-GC-。

41.根据权利要求31所述的外泌体，其中靶向CTLA4的miRNA和外泌体基序具有SEQ IDNO. 7的核酸序列。

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