CN113226350B - 皮肤病治疗剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗或预防哺乳动物中的皮肤病的非天然多肽。哺乳动物能够很好地耐受所述多肽的施用。所述非天然多肽以高纯度提供。

Description

皮肤病治疗剂

引言

发明领域

本发明提供了一种适用于治疗和预防皮肤病、包括但不限于皮肤溃疡的药剂。

发明背景

皮肤病，包括慢性伤口，如溃疡，包括皮肤或粘膜上的疼痛，通常伴有组织崩解。典型地，这种皮肤病会导致表皮的丧失，通常是真皮的一部分、甚至皮下脂肪的丧失。这种皮肤病可由多种因素引起，例如但不限于血液循环受损。皮肤溃疡在人类中很常见，包括患有糖尿病的受试者(Ndip et al.,2012,Int.J.Gen.Med.,vol.5,p.129-134)。这种皮肤病是一个严重的医学和社会问题。

目前，这类皮肤病没有合适的治疗方法。根据目前的估计，患者必须接受数月甚至数年的治疗，这导致了巨大的成本以及患者和社会的沉重负担(Buchberger et al.,2010,GMS Health Technol.Assess.,vol.1(6),doc.12)。在某些情况下，替代措施，如通过使用卸载铸造设备(casting device)来缓解压力，是管理此类疾病的主要选择(Ndip et al.,2012,Int.J.Gen.Med.,vol.5,p.129-134)，但这种替代措施根本不能提供治愈性的治疗。

糖尿病患者经常出现皮肤病症:糖尿病在现代社会中很常见，据估计，每四名糖尿病患者中就有一名在其一生中会出现皮肤病，特别是足部溃疡(Ndip et al.,2012,Int.J.Gen.Med.,vol.5,p.129-134)。这种疾病通常需要长时间住院、康复、家庭护理和社会服务。因此，糖尿病导致的溃疡是一个严重的问题，鉴于糖尿病的日益流行，对全球疾病负担有巨大影响，目前缺乏治疗选择对相关受试者和社会都是不利的。

在寻求治愈性治疗的过程中，在过去，已经提出了一些人类生长因子用于皮肤病的治疗和潜在治愈，但是现在公认的是，支持在皮肤溃疡的治疗中使用人类生长因子的证据有限(Ndip et al.,2012,Int.J.Gen.Med.,vol.5,p.129-134)。过去曾设想用于治疗皮肤病的生长因子的一个例子是血小板衍生的生长因子(beclapermin，商标名Regranex)，但发现其给药与包括恶性肿瘤在内的严重副作用有关(Buchberger et al.,2010,GMSHealth Technol.Assess.,vol.1(6),doc.12；https://www.rxlist.com/regranex-side-effects-drug-center.htm#profession al)。测试的另一个例子是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，但发现G-CSF并不显著影响感染的解决或伤口愈合的可能性(Cruciani et al.,2005,Diabetes Care,vol.28,p.454-460)。文献中提出的另一个例子是表皮生长因子(EGF)，最初提出表皮生长因子具有意想不到的积极愈合效果(例如WO2003/075949A1)，但实际上没有基于EGF的治疗在商业上可用，这表明对这种药物的最初希望没有得到支持或证实。或者，人类神经生长因子(hNGF)已被提议具有促血管生成特性和促进伤口修复(Graiani等人，2004，Diabetologia，第47卷，第1047-1054页)，已被提议用于治疗某些神经毒性临床疾病，但临床试验令人沮丧(Apfel et al.,2000,J.Amer.Med.Assoc.,vol.284,p.2215-2221)，因此没有开发出基于神经生长因子的药物(例如参见https://www.gene.com/media/press-releases/4875/1999-04-08/phase-iii-tri al-with-nerve-growth-factor)。例如，虽然Graiani等人没有具体评论神经生长因子的同种异体作用，但众所周知，人类神经生长因子诱导疼痛(Dyck et al.1997,Neurology,vol.48,p.501-505,；Svensson et al.,2003,Pain,vol.104,p.241-247)。因此，人类神经生长因子不能作为治疗皮肤溃疡的合适治疗剂；尤其是由于其引起疼痛的活性和/或在耐受剂量下缺乏效率。因此，考虑到基于生长因子的治疗成功或证明有限，尤其是因为不希望的副作用，医学协会已经研究了其他潜在的药物。基于以上所述，白介素和其他非生长因子分子最近被提出用于治疗某些皮肤溃疡。例如，Genentech提出白细胞介素的衍生物，特别是白细胞介素22，其具有调节免疫系统的作用，可适用于治疗或预防皮肤溃疡，包括糖尿病性皮肤溃疡(例如，见https://www.gene.com/stories/mechanisms-of-healing)，但是没有这种药物可供患者使用，并且目前确定这种情况是否最终会改变。

因此，仍然需要一种有效治疗皮肤疾病的方法，该方法不会产生副作用，例如不可忍受的或其它方面不希望的副作用，还需要一种适用于该目的的治疗剂，该治疗剂是从业者能够以可靠和可接受的纯度得到的，用于对哺乳动物受试者、包括人类进行给药。

有待解决的问题

本发明的一个主要目的是提供在糖尿病和非糖尿病受试者中皮肤病、包括溃疡在内的治疗或预防，其不伴有不希望的或疼痛的副作用。还希望以足够的产量和纯度提供治疗活性剂，以便能够进行这种治疗。因此，本发明的一个目的包括消除与现有技术相关的缺点。具体的目的包括提供一种用于治疗患有皮肤病的患者、而没有不希望的副作用的可靠方法。

发明概述

本发明提供了用于治疗和/或预防哺乳动物受试者中皮肤病的多肽，其中该多肽选自SEQ ID NO:3的多肽和SEQ ID NO:4的多肽.这些多肽的特征在于人神经生长因子氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的突变，其中所述突变与伤害感受活性降低相关。特别是，hNGF中第100位的精氨酸被谷氨酸取代。

一种特别优选的多肽是SEQ ID NO:4的多肽。所述多肽的特征在于至少缺少61位的脯氨酸，更优选61位脯氨酸被另一个氨基酸取代。在SEQ ID NO:4中，SEQ ID NO:3中第61位的脯氨酸被丝氨酸取代。

优选地，所述哺乳动物受试者是人。

优选地，所述皮肤病的特征在于受试者身体的至少一部分上的受伤表面。优选地，所述皮肤病的特征在于受伤表面。更优选地，所述皮肤病是皮肤损伤(优选地，其特征在于真皮的至少部分消融)，任选地真皮的皮肤损伤。

优选地，损伤皮肤病包括至少一种溃疡，优选选自糖尿病性溃疡、创伤性溃疡、手术性溃疡、压迫性溃疡、慢性溃疡以及这些溃疡的任何组合。在替代但不相互排斥的实施方案中，所述皮肤病包括烧伤或机械损伤。

优选地，所述哺乳动物，优选人类，患有糖尿病或具有患糖尿病的倾向。在典型的实施方案中，糖尿病选自1型糖尿病和2型糖尿病。

在一个实施方案中，所述多肽以单次给药进行给药。

在另一个更优选的实施方案中，多肽被重复给药。在一个特别优选的实施方案中，所述多肽每天重复给药一至五次，优选每天两次。

在一个实施方案中，重复施用所述多肽，直到受伤身体表面闭合。或者，多肽被重复给药3至30天，优选7至14天。任选地，在完成所述间隔后停止给药。

在一个实施方案中，将所述多肽施用于患有糖尿病性神经性足溃疡(DFU)的受试者，优选在脚踝以下施用于受试者的足部。

优选地，所述多肽用于局部给药。更优选地，所述多肽被施用到受伤的身体表面。

优选地，待施用的多肽的剂量基于待治疗的受伤身体表面的表面来确定。优选地，在治疗开始时进行测定。在一个实施方案中，根据稍后给药时受伤身体表面的表面，为稍后给药调整剂量。在另一个实施方案中，给药剂量不针对稍后给药而调整，因此给药剂量仅取决于给药开始时(第一次给药)要治疗的受伤身体表面的表面，后续的剂量对应于第一次给药。

在一个实施方案中，剂量/每剂的量为每平方毫米被治疗的受伤身体表面为0.3至6微克多肽(0.3至6微克/平方毫米)。

在一个实施方案中，所述多肽包含在水性介质中，并且水性介质被给予所述哺乳动物受试者。

优选地，治疗和/或预防不会引起哺乳动物受试者的痛觉过敏。

在一个实施方案中，SEQ ID NO:3的多肽或SEQ ID NO:4的多肽可从生物来源获得。这可以包括纯化，即与其他分子(包括其他蛋白质，如宿主细胞蛋白质)分离。任选地，SEQ ID NO:3的多肽或SEQ ID NO:4的多肽可通过如下方法获得，该方法包括(再)折叠和/或色谱纯化和/或蛋白酶消化，以及任选地调节最终蛋白质浓度和/或制备所需的制剂。在一个实施方案中，多肽可通过重组表达和纯化获得，其中纯化包括在混合模式固定相上的纯化。

因此，本发明还提供了来自重组来源、并如本文所述进行纯化的SEQ ID NO:3多肽和SEQ ID NO:4多肽用于如本文所述的通过治疗对人体或动物体进行治疗的方法。

发明详述

本说明书的全部内容连同权利要求和附图一起公开了本发明的各个特征的具体和/或优选实施方式和变型。作为特别优选的实施例，本发明还考虑了通过将这里针对本发明描述的特定的和/或优选的实施例和变型中的两个或更多个组合而产生的那些实施例。因此，本公开还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物，以及所述实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物的任何和所有组合或任何两种或多种。因此，除非本文中特别说明或上下文另有要求，对单个实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物的引用应被理解为包含这些实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物中的一个和多个(即多于一个，例如两个或多个、三个或多个或所有)。除非特别说明或上下文另有要求，否则本文公开的每个实施例、方面和示例应被视为适用于本文公开的任何其他实施例、方面或示例，并可与其组合。

本领域普通技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，这里描述的本发明易于变化和修改。因此，本公开的范围不受这里描述的具体实施例的限制，这里提供这些具体实施例是为了说明和例证的目的。功能上或在其它方面等效的实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物都在本公开的范围内。对于本领域普通技术人员来说，显而易见的是，本公开包括本文字面描述的实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物的所有变化和修改。

本文引用的每个参考文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、说明书、演示文稿等。)，无论是上面的还是下面的，在此全部引入作为参考。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权先于特定的教导，和/或承认除了公知常识之外，特定的参考文献包含足够清楚和完整的信息，使得本领域技术人员能够实施。

通常，除非特别定义，本文使用的所有技术和科学术语与本领域(例如医学、皮肤病学、神经学、遗传学、分子生物学、基因表达、细胞生物学、细胞培养、免疫学、神经生物学、色谱法、蛋白质化学和生物化学)普通技术人员通常理解的含义相同。例如以英语出版的教科书和评论文章通常定义了本领域普通技术人员通常理解的含义

表述“和/或”，例如，“X和/或Y”应理解为表示“X和Y”或“X或Y”，并应被理解为明确公开了“和”、“或”以及两种含义(“和”或“或”)。

如本文所用，除非另有说明，术语“约”、“大约”和“基本上”都表示大约或接近，并且在本文所述的数值或范围的上下文中，优选地表示在所述或要求保护的数值或范围周围+/-10％，更优选+/-5％。

除非另有明确说明，否则词语“包括”或诸如“包含”或“含有”的变体在本文的上下文中用于指示除了由“包含”引入的列表的成员之外，还可以任选地存在其他成员。然而，作为本发明的一个具体实施例，术语“包括”包括不再有其他成员存在的可能性，即，为了该实施例的目的，“包括”被理解为具有“由......组成”的含义。

除非另有明确说明，本发明的相对量的所有指示都是基于重量/重量。由通用术语表征的组分的相对量的指示是指由所述通用术语涵盖的所有特定变体或成员的总量。如果由通用术语定义的某一组分被指定以某一相对量存在，并且如果该组分被进一步表征为由通用术语涵盖的特定变体或成员，则意味着没有由通用术语涵盖的其它变体或成员另外存在，使得由通用术语涵盖的组分的总相对量超过指定的相对量；更优选地，根本不存在通用术语所涵盖的其他变体或成员。

除非本文中另有说明或者除非上下文中明确指出，否则本文中描述的所有方法和过程可以以任何合适的顺序来执行。

除非另有说明，本文使用的术语“药剂”通常指化合物或组合物，优选指化合物。药剂能够对活生物体和/或来自活生物体或衍生自活生物体的细胞产生作用，例如通过作用于细胞和/或身体组织，或在环境中。药剂剂的物理状态没有特别限制，除非另有说明，可以是空气、水和/或固体状态。药剂的类型没有特别限制，除非另有说明，因此，药剂可以是化学物质和/或生物分子，例如蛋白质或核酸。本文定义的特定药剂可用于本发明。

本文所用的“副作用”是指对受试者施用药剂(药物)而产生的不希望的有害作用。副作用包括但不限于发病率、死亡率、痛觉过敏综合征、疼痛、体重变化、酶水平、功能丧失或在微观、宏观或生理水平检测到的任何病理变化。副作用可能导致可逆或不可逆的变化，包括个体对其他化学物质、食物或操作(如药物相互作用)的敏感性增加或降低。

如本文所用，术语“色谱”、“色谱的”等通常指适用于混合物分离的技术，其中将混合物加入到称为“固定相”的非液体物质中，目的是至少部分分离混合物的一种或多种成分。为此，固定相可以暴露于流体和/或混合物可以溶解在流体中；与固定相接触的所述流体也可以称为“流动相”。一般而言，如本文所述，“通过色谱进行”的任何步骤可同义地称为“色谱步骤”。

本文所用的术语“流动相”具有本领域通常使用的含义，可以指色谱过程中与固定相接触的所有流体，即清洗流体以及包含感兴趣的蛋白质(如本文所述的一种或多种蛋白质)的流体(混合物)。在本发明中，如本文所述，经过层析的混合物通常包含一种或多种蛋白质，例如特别是本文所述的蛋白质，例如SEQ ID NO:3或4的多肽，它们中任何一种的前体，蛋白酶，和/或宿主细胞蛋白质(HCP)。

“固定相”通常包括通常包含基质的物质，基质是不溶于水的物质，通常为颗粒或凝胶形式，例如树脂。在许多情况下，包括本文所述的实施方案，固定相包含基质和可以结合包含在待进行色谱分析的混合物中的至少一种组分的部分。基质通常是不溶于水的物质，通常是颗粒或凝胶形式。基质的非限制性例子是琼脂糖凝胶和琼脂糖，例如高刚性琼脂糖。

本文所用的“色谱步骤”是指向色谱材料(优选固定相)中加入液体的动作，所述液体包含至少一种待分析和/或待纯化的化合物，所述化合物优选为蛋白质(在本发明的上下文中，所述蛋白质最优选为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽)、任选地用一种或多种洗涤溶液洗涤色谱材料，并洗脱所述至少一种化合物。在这种情况下，举例来说，以两个色谱步骤为特征的方法的特征在于，如上所述，将包含待分析和/或待纯化的至少一种这种化合物的液体加入到第一色谱材料中，并且在从其中洗脱之后，将包含至少一种这种化合物的液体加入到第二色谱材料中，如上所述，也从其中洗脱。任何“色谱步骤”的目的都是将混合物中包含的至少一种组分应用于固定相，优选色谱中，与固定相结合。这种化合物可以是本文所述的一种或多种蛋白质。化合物可以从固定相回收，例如通过交换流动相和/或通过随时间持续暴露于流动相。

术语“结合”，当用于色谱时，例如描述固定相的结合能力时，没有特别限制，但通常指非共价结合。因此，通常混合物中包含的至少一种组分，例如至少一种蛋白质，非共价结合到固定相。色谱步骤任选地但优选地包括洗涤结合有所述至少一种组分的固定相。该至少一种组分可以是至少一种蛋白质，例如本文所述的至少一种蛋白质。

这里使用的术语“异源”描述了由多种不同元素组成的东西。

在本发明的上下文中，术语“二硫化物”和“二硫键”在本领域通常使用的含义内使用。一般来说，“二硫化物”是指结构为R-S-S-R’的官能团。该连键也称为“SS键”，通常由两个巯基偶联而成。蛋白质中的二硫键是通过氧化折叠过程在半胱氨酸残基的巯基之间形成的；两个半胱氨酸残基的巯基之间的这种特定二硫键也可以称为“二硫桥”。不希望受限于特定的理论，本领域通常理解的是，在真核细胞中，二硫桥形成于内质网腔(和线粒体膜间空间)中，但通常不形成于胞质溶胶中，对于原核生物，二硫桥形成于周质(相应的生物体，特别是革兰氏阴性菌)；在真核细胞和原核细胞的细胞外环境的蛋白质中也可以发现二硫桥。

本文使用的术语“表达”、“表达的”和“表达”、“基因表达”等涉及在功能性基因产物的合成中使用来自基因的信息。基因表达至少包含转录，并且任选地包含一个或多个附加特征，任选地选自包含翻译和翻译后修饰的开放列表。在蛋白质在宿主细胞中重组表达的情况下，该术语通常意味着蛋白质由宿主细胞产生(在细胞的任何区室中和/或分泌和/或掺入包涵体中)，除非上下文另有规定。

这里使用的术语“异源”描述了由多种不同的元素或起源组成的东西。例如，在包含人基因(或编码非天然多肽、如本发明的多肽的基因)的非人宿主细胞中，所述基因对所述细胞是“异源的”，并且该细胞能够“异源”表达相应的基因。异源基因表达也可以称为“重组”。

术语“包涵体”具有本领域通常使用的含义，是指在宿主细胞的胞质溶胶或周质中发现的聚集体或颗粒；包涵体通常包含蛋白质，特别是在宿主细胞中重组表达的蛋白质。不希望受限于任何特定的理论，应当理解，在重组表达领域，包涵体通常包含重组表达的蛋白质，而宿主细胞蛋白质(HCP)、核糖体成分或DNA/RNA片段相对较少。不希望受限于任何特定的理论，应当理解的是，包涵体通常至少部分包含没有正确折叠的蛋白质(错误折叠的蛋白质)，特别是错误折叠的重组表达的蛋白质。应当理解，包涵体通常包含非正确折叠形式的蛋白质，即在本发明的上下文中，它们通常包含非正确折叠形式的根据本发明的多肽和/或其前体。术语“错误折叠”通常描述不处于天然构象的生物分子，例如核酸或多肽，即处于非正确折叠的形式

“分离的”是指实质上或基本上不含通常在其天然状态与其相伴的成分的材料。例如，本文所用的“分离的肽”或“分离的蛋白质”分别是指从细胞和细胞外环境(如组织)中纯化的肽或蛋白质，所述细胞和细胞外环境以天然存在的状态围绕该肽或蛋白质，例如从表达它的细胞(如宿主细胞)中纯化的肽或蛋白质。在另一种描述中，本文所用的“分离的肽”或“分离的蛋白质”等分别是指从肽或蛋白质的天然细胞环境中，以及从与所述肽或蛋白质通常所在环境的其它成分的结合中，体外分离和/或纯化肽或蛋白质。在另一个例子中，本文所用的“分离的细胞”是指已经从细胞和细胞外环境中纯化的细胞，例如以天然状态围绕它的组织或细胞集落，例如已经从通常与细胞相邻的环境中取出的宿主细胞。根据上文对单词“分离的”的定义，本文所用的“分离”是描述获得“分离的”物质的活性的动词，例如分离的细胞或分离的肽或蛋白质。

这里使用的术语“多”和“多个”表示多个，即两个或更多的任意数量。

本文使用的术语“突变”是指生物体、病毒或染色体外DNA或其他遗传元件的基因组核苷酸序列的改变。该术语还延伸到氨基酸序列的突变，特别是携带至少一个(非沉默的)突变的基因的氨基酸序列。除非另有说明，核苷酸序列的突变是永久性的改变。生殖系中存在的突变通常是可遗传的。一般来说，核苷酸序列的突变会导致序列中许多不同类型的变化:基因中的突变要么没有影响，要么改变基因的产物，要么阻止基因正常或完全发挥作用。突变也可以出现在非基因区域。除非另有说明，野生型序列用作描述突变的参考序列。因此，例如，当说给定突变体的特征在于多肽序列的第100位的突变时，这表明在第100位，突变体不具有与野生型多肽相同的氨基酸残基。核苷酸序列和/或氨基酸序列的特定类型的突变包括诸如缺失、取代、添加、插入和剪接变体的改变。核苷酸序列的“缺失”是指核苷酸序列中缺少一个或多个核苷酸。氨基酸序列的“缺失”是指多肽中缺少一个或多个氨基酸残基。核苷酸序列的“添加”是指核苷酸序列中存在一个或多个额外的核苷酸。氨基酸序列的“添加”是指在相关多肽中存在一个或多个额外的氨基酸残基。核苷酸序列的“取代”是指核苷酸序列中一个或多个核苷酸被另一个核苷酸取代。氨基酸序列的“取代”是指多肽中一个或多个氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代。核苷酸序列如开放阅读框的添加、缺失和替换可以是5’末端、3’末端和/或内部的。多肽的添加、缺失和取代可以在氨基末端、羧基末端和/或内部。核苷酸序列和/或多肽序列的“插入”是在相应序列的内部位置分别添加一个或多个核苷酸或者一个或多个氨基酸残基。术语“剪接变体”用于描述编码多肽序列的RNA与相应的野生型RNA的剪接不同，通常是核酸水平突变的结果，通常导致不同于野生型多肽的多肽翻译产物。术语“剪接变体”不仅可以针对相应的RNA使用，还可以针对相应的模板DNA序列(通常是基因组DNA)和针对由这种RNA编码的多肽序列使用。

术语“突变体”通常是指不同于野生型序列的核酸序列或氨基酸序列。因此，突变核酸序列或氨基酸序列相对于各自的野生型序列具有至少一个突变。在核酸序列存在多态性、但在各自编码的多肽水平上没有反映出来的情况下(沉默突变、遗传密码的简并)，术语“突变体”在核酸水平上仅具体指编码突变多肽的那些核酸变体。突变体可以包含不同的突变组合，单独或组合，包括一个以上的突变和不同类型的突变。

根据本领域的共同含义，术语“神经生长因子”，缩写为“NGF”或“β-NGF”，代表参与某些神经元和其他细胞的生长、维持、增殖和存活的调节的神经营养因子和神经肽(例如，参见Levi-Montalcini,2004,Progress in Brain Research,vol.146,p.525-527)。除非上下文另有规定，术语神经生长因子仅代表野生型神经生长因子，不包括SEQ ID NO:3或4的多肽。野生型NGF是可从神经生长因子前体获得的2.5S，26-kDaβ亚单位，具有生物活性:野生型神经生长因子与至少两类受体结合:原肌球蛋白受体激酶A(TrkA)和低亲和力神经生长因子受体(LNGFR/p75NTR)。除非另有说明，术语“NGF”是指任何物种，优选哺乳动物物种的神经生长因子；然而，人类神经生长因子总是优选的。本文所用的“hNGF”代表人神经生长因子。除非上下文另有规定，术语“NGF”和“hNGF”是指野生型NGF，即hNGF代表野生型NGF。野生型人神经生长因子的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1的第121-239位(图24中的灰色)。非人类NGF的序列可以在例如在科学文献中，通过序列搜索例如BLAST，使用SEQ ID NO:1的第121-239位作为诱饵，以及在公共蛋白质数据库如Swissprot中获得。

术语“NGF突变蛋白”和“NGF的突变蛋白”，或关于NGF的“其突变蛋白”，在本文中可互换使用，指与野生型神经生长因子相比，特征在于至少一个突变的多肽，如本文进一步详细描述的。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的多肽是NGF的突变蛋白。优选地，NGF的突变蛋白与NGF，特别是人NGF具有80-99.5％的序列同一性，更优选地，突变蛋白与NGF，特别是人NGF具有90-99％的序列同一性。

关于NGF，术语“成熟的部分”、“成熟部分”可与术语“β-NGF”互换使用，是指特征在于它不包含神经生长因子的前肽(当然，也不包含前原肽)的NGF多肽。类似地，术语“成熟部分”也用于指SEQ ID NO:3或4的多肽，因为这些多肽同样不包含前肽(因此，当然也不包含前原肽)。优选地，成熟部分也不包含由野生型神经生长因子开放阅读框编码的C末端可切割肽；在人神经生长因子的情况下，这种C末端可切割肽由两个氨基酸残基“RA”(SEQ IDNO:1的240和241位)组成。更具体地说，成熟部分可通过用蛋白酶弗林蛋白酶(和能够精确地直接切割神经生长因子或SEQ ID NO:3或4的第一个氨基酸残基的N末端的其它蛋白酶。例如，人神经生长因子和许多直向同源物的弗林蛋白酶切割位点已知由序列R¹S²K³R⁴(单字母氨基酸代码，从N到C末端编号的序列；在图25中用方框标出)组成。在成熟的神经生长因子中，通常既没有弗林蛋白酶切割位点，也没有位于弗林蛋白酶切割位点N末端的任何氨基酸。举例来说，人神经生长因子的成熟部分由SEQ ID NO:1的氨基酸位置122-239代表的多肽组成。非人类NGF的成熟部分可以通过例如序列搜索和/或序列分析来鉴定，其中所述人类NGF的成熟部分用于序列比对。

术语“前体”，在本文中针对神经生长因子使用时，是指通过蛋白水解裂解可获得神经生长因子的任何肽序列。举例来说，pro-NGF和pro-NGF原及其变体都是神经生长因子前体的典型例子。本文所用的术语“前体”可以指其最C末端氨基酸残基是神经生长因子最C末端残基的前体，也可以指其在C末端延伸超过神经生长因子的最C末端残基的前体，只要神经生长因子可通过蛋白水解裂解获得即可：尽管野生型人pro-NGF的天然前体(SEQ IDNO:1)包含C末端二肽(SEQ ID NO:1中的氨基酸残基240和241，图1的粗体)，在本发明中优选前体不包含由野生型神经生长因子开放阅读框编码的C末端可裂解肽；在人NGF的情况下，这种C末端可裂解肽由两个氨基酸残基“RA”(SEQ ID NO:1的240和241)组成。

如本文所用，术语“前肽”或“前序列”通常可互换地指由神经生长因子开放阅读框的一部分编码的多肽序列，其N端直接与原肽相邻。举例说明：NGF的前肽由包含连续序列的序列组成，该连续序列的范围从SEQ ID NO:1的残基1至SEQ ID NO:1的残基18的连续序列组成。非人NGF前体的相应前肽的序列可通过序列搜索，如BLAST，使用SEQ ID NO:1的位置1-18作为诱饵，在科技文献中获得，以及在公共蛋白质数据库如Swissprot中获得。由前肽和pro-NGF组成的多肽或蛋白质在本文中可称为“前原NGF”，其中前肽的C末端与pro-NGF的N末端直接相邻。

本文使用的术语“原肽”(pro-peptide)或“原序列”(pro-sequence)通常可互换地指由神经生长因子开放阅读框的一部分自然编码的多肽序列，其在N端直接邻接成熟神经生长因子，但该多肽序列不包括前肽。举例说明:神经生长因子的野生型前体中含有原肽。神经生长因子前体的原肽由包含SEQ ID NO:1的残基19至SEQ ID NO：1的残基121的连续序列的序列组成。非人原神经生长因子的相应原肽的序列可以在例如科学文献中，通过序列搜索如BLAST，使用SEQ ID NO:1的位置19-121作为诱饵，以及在公共蛋白质数据库如Swissprot中获得。

本文所用的“pro-NGF”(原神经生长因子)是指包含神经生长因子成熟部分和相应原肽，但不包含相应前肽的肽序列。人pro-NGF由包含SEQ ID NO:1的残基19至SEQ ID NO:1的至少残基239的连续序列的序列组成。尽管野生型人pro-NGF包含一个C末端二肽(SEQ IDNO:1的氨基酸残基240和241，图25中的粗体)，优选在本发明中获得和使用的pro-NGF不包含由野生型神经生长因子开放阅读框编码的C末端可切割肽；在人神经生长因子的情况下，这种C末端可切割肽由两个氨基酸残基“RA”(SEQ ID NO:1的240和241)组成。非人pro-NGF的序列可在例如科学文献中，通过序列搜索如BLAST，使用SEQ ID NO:1的19-239位作为诱饵，以及在公共蛋白质数据库如Swissprot中获得。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，指的是RNA和DNA，包括cDNA、基因组DNA、合成DNA和含有核苷酸类似物、磷酸类似物和/或糖类似物的DNA/RNA等价物。核酸可以是双链或单链的(即有义链或反义链)。多核苷酸的非限制性例子包括基因、开放阅读框、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、siRNA、微小RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何类型和序列的分离核酸、核酸探针和引物以及核酸类似物。核酸可以具有任何类型的三维结构。

根据本发明，术语“肽”包括寡肽和多肽，是指包含两个或更多个、优选3个或更多个、优选4个或更多个、优选6个或更多个、优选8个或更多个、优选10个或更多个、优选13个或更多个、优选16个或更多个、优选21个或更多个以及优选多达8个、10个、20个、30个、40个或50个、特别是100个通过肽键共价连接到链上的氨基酸的物质。

术语“蛋白质”优选是指大的肽，优选是指具有100个以上氨基酸残基的肽，但是通常术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是同义词，并且在本文中可互换使用，除非上下文另有规定。因此，术语“SEQ ID NO:4的多肽”和“SEQ ID NO:4的蛋白质”具有相同含义。

术语“药学上可接受的”通常描述的是，在所使用的剂量下，可以将某种物质施用于受试者，任选地且优选地与药剂组合，而该药剂在所使用的剂量不会引起不可忍受的副作用。

术语“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的赋形剂”用于指溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等中的任何一种或多种，它们在生理上是相容的，并且适于如本文所述给予受试者，或者不会干扰这种给药。这种药学上可接受的载体的例子包括但不限于水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。特别是对于液体药物组合物的情况，可能优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学上可接受的载体可以进一步包含辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其可提高药物的保存期或有效性。根据本发明的组合物中通常包含药学上可接受的载体。

术语“药物活性剂”是指可用于对受试者给药的药剂，其中该药剂有益于例如改善疾病或障碍的症状。此外，“药物活性剂”在以治疗有效量给予受试者时，可对受试者的状况或疾病状态产生积极或有利的影响。优选地，药物活性剂具有治疗性质，并且可以被施用以改善、缓解、减轻、逆转、延迟疾病或病症的一种或多种症状的发作或者减轻其严重性。药物活性剂可具有预防性质，并可用于延迟疾病的发作或减轻这种疾病或病理状况的严重性。例如，如权利要求所述，本发明的药剂在本文中被认为是用于治疗囊性纤维化的药物活性成分。在另一个实例中，药物活性蛋白可用于治疗细胞或个体，其通常不表达蛋白，或不以所需水平表达，或错误表达蛋白，例如，药物活性蛋白可通过提供所需蛋白来补偿突变或足够高表达的缺乏。术语“药物活性肽或蛋白质”包括完整的蛋白质或多肽，也可以指其药物活性片段。它还可以包括肽或蛋白质的药物活性类似物。

“开放阅读框”或“ORF”是一段连续的密码子，以起始密码子开始，以终止密码子结束。

本文使用的术语“受试者”和“患者”涉及哺乳动物。例如，在本发明的上下文中，哺乳动物是人类，非人灵长类动物，家养动物，包括但不限于狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等，实验动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔等，以及圈养的动物，如动物园的动物。这里使用的术语“受试者”和“患者”特别包括人。受试者(人或动物)有两组染色体；也就是说，受试者是二倍体。术语“患者”是指患有某种疾病、有患某种疾病的风险、已经患有某种疾病、或者预计将患有某种疾病、并且可以接受治疗(例如通过施用药剂)的受试者。患者的病情可能是慢性和/或急性的。因此，“患者”也可以被描述为接受治疗和/或需要治疗的受试者。

术语“治疗”应广义理解，指以预防或治疗受试者中病症为目标的受试者治疗。在优选实施方案中，治疗具体包括对受试者施用药剂。

本文使用的术语“胰蛋白酶”通常是指被分类为EC 3.4.21.4的蛋白水解酶。胰蛋白酶主要在氨基酸赖氨酸或精氨酸的羧基侧切割肽链，正常情况下，除非它们后接脯氨酸。不希望被理论所束缚，应当理解，胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，并且胰蛋白酶在许多脊椎动物的消化系统中是天然存在的，在那里它水解蛋白质。本发明中优选的是来自重组来源的胰蛋白酶。尽管在体内，胰蛋白酶是与原肽一起形成的(称为“胰蛋白酶原”)，但本文所用的术语“胰蛋白酶”优选指没有任何原肽的成熟胰蛋白酶。使用胰蛋白酶进行蛋白水解切割也可以称为“胰蛋白酶蛋白水解”或“胰蛋白酶化”，由胰蛋白酶切割产生的蛋白质被称为“胰蛋白酶化的”。

神经生长因子前体或SEQ ID NO:3或4多肽的“变体”是指这样的多肽或蛋白质，其中不是成熟神经生长因子(β-神经生长因子)的一部分或不是SEQ ID NO:3或4的一部分的氨基酸序列特征在于与野生型神经生长因子前体(如与野生型原神经生长因子或野生型前原神经生长因子)相比具有至少一个突变；所述至少一个突变优选在成熟神经生长因子(β-神经生长因子)氨基酸序列的N末端。因此，如本文所用，神经生长因子前体等的“变体”是指这样的肽或蛋白质，其中前肽和/或原肽的特征在于相对于前肽和/或原肽的氨基酸序列有至少一个突变，例如但不限于WO 2013/092776A1和US2018/0086805A1中描述的那些变体。例如，WO 2013/092776A1描述了pro-NGF的“变体”，其中(野生型)弗林蛋白酶切割位点由于一个或多个特定突变而缺失。

术语“载体”或“克隆载体”通常指可以导入宿主细胞的核酸。载体的例子包括但不限于质粒、噬菌体和所有其他类型的可导入宿主细胞的核酸。术语“载体”应广义理解，包括编码用于异源表达的肽或蛋白质的载体(这种载体可作为模板，用于转录物的产生)，以及不编码肽或蛋白质的载体。当载体存在于宿主细胞中时，第一种类型的载体将包含编码蛋白质或肽的开放阅读框，其可以被表达。尽管技术人员将选择的载体类型将取决于技术人员将选择的宿主细胞的类型，但是在特定情况下，用于所有普通宿主细胞(包括大肠杆菌)的克隆载体是商业上可获得的，因此技术人员将在充分考虑所选择的宿主细胞的情况下选择特定的载体。

术语“野生型”在本文中用于指通常在自然界中(优选在健康受试者中)发现的基因或蛋白质。非“野生型”的基因或蛋白质在本文中称为“突变型”或“突变的”等。例如，SEQID NO:1显示了野生型人神经生长因子前体的氨基酸序列；SEQ ID NO:2显示了野生型人神经生长因子的氨基酸序列。

本发明基于几个发现，这些发现是相互关联的，因此共同导致发明人得出本发明的各个方面，这些方面将在下面单独描述。

根据本发明的药剂

本发明提供了一种用于治疗和/或预防哺乳动物受试者中皮肤病的药剂。可用于对受试者给药的药剂，其中该药剂将有益于例如改善疾病或障碍的症状。特别地，可用于本发明的药剂是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽。因此，本发明特别提供了一种SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4的多肽用于治疗。该治疗通常包括对人体或动物体施用所述多肽，如下文所述。

根据本发明，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的多肽作为药物活性剂提供。通过本发明，提供SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽用于医学用途，特别是用于治疗和/或预防哺乳动物受试者的皮肤病。任选地，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽来自重组来源。因此，本发明还提供了SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的重组多肽用于医疗用途，如本文所述。

根据本发明的药剂，在本文中也称为“SEQ ID NO:3的多肽”或“SEQ ID NO:4的多肽”现在将更详细地描述。术语“SEQ ID NO:3的多肽”和类似术语在本文中表示包含由SEQID NO:3定义的氨基酸序列的多肽和/或具有同等生物活性的药剂。术语“SEQ ID NO:4的多肽”和类似术语在本文中表示包含由SEQ ID NO:4定义的氨基酸序列的多肽和/或具有同等生物活性的药剂。因此，这些术语也包括这些多肽的功能等同部分或类似物。多肽的生物等效部分的一个例子可以是SEQ ID NO:3多肽或SEQ ID NO:4多肽的结构域或亚序列，其包括使所述结构域或亚序列能够发挥与SEQ ID NO:3的全长多肽或SEQ ID NO:4的全长多肽或编码这种多肽的基因基本相同的生物学活性的结合位点。术语“基本上相同的生物活性”是指在实施例3和4中描述的测定法中，具有SEQ ID NO:3的多肽或SEQ ID NO:4的多肽的活性的至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少97％，至少98％或至少99％的相当部分或类似多肽。多肽的生物等效类似物的一个例子可以是融合蛋白，其包括SEQ ID NO:3多肽或SEQ ID NO:4多肽的氨基酸序列的至少部分，但它也可以是所述多肽的同源类似物。此外，模拟SEQ ID NO:3的多肽或SEQ ID NO:4的多肽的特定生物活性的完全合成的分子，将构成“生物等效类似物”。

更优选地，术语“SEQ ID NO:3多肽”和类似术语在本文中表示包含由SEQ ID NO:3确定的氨基酸序列的多肽；这种试剂可选地是融合蛋白，其尤其包含由SEQ ID NO:3确定的氨基酸序列。最优选地，术语“SEQ ID NO:3多肽”和类似术语在本文中表示由SEQ ID NO:3所确定的氨基酸序列组成的多肽；在该实施方案中，所述药剂由多肽组成，该多肽由SEQ IDNO:3确定的序列顺序的118个氨基酸残基组成的多肽组成。在这个和其他实施方案中，所述多肽任选地携带一个或两个或三个内部半胱氨酸键，使得半胱氨酸(Cys，C)残基彼此共价连接形成分子内二硫桥。半胱氨酸键优选等同于野生型人神经生长因子中的半胱氨酸键。

同样更优选地，术语“SEQ ID NO:4多肽”和类似术语在本文中表示包含由SEQ IDNO:4定义的氨基酸序列的多肽；这种药剂可选地是融合蛋白，其特别地包含由SEQ ID NO:4定义的暗示序列。最优选地，术语“SEQ ID NO:4多肽”和类似术语在本文中表示由SEQ IDNO:4定义的氨基酸序列组成的多肽；在此实施方案中，所述药剂由在序列顺序上有SEQ IDNO:4定义的118个氨基酸残基组成的多肽所组成。在这个和其他实施方案中，所述多肽任选携带一个或两个或三个内部半胱氨酸键，使得半胱氨酸(Cys，C)残基彼此共价连接形成分子内二硫桥。半胱氨酸键优选等同于野生型人神经生长因子中的半胱氨酸键。

本发明的多肽可以任选地以进一步的翻译后修饰为特征。这种翻译后修饰任选包括糖基化和/或磷酸化。然而，优选地，根据本发明的多肽没有糖基化和/或磷酸化。实际上，考虑到本文的实验实施例证明了对皮肤病的治愈的有益效果和有益的益处-不利效果比，由此所用的多肽是通过细菌中的胞质重组表达获得的，这通常不会导致糖基化和/或磷酸化，因此本发明的有益效果似乎不依赖于这种类型的翻译后修饰。因此，在优选的实施方案中，根据本发明的多肽的特征不在于具有糖基化和/或磷酸化。

通常根据本发明的多肽是非天然多肽，其不是由施用该多肽的受试者天然产生的。这不仅与受试者给药后可检测性的优点有关，而且也与需要对受试者给药(来自外部来源，例如根据本发明制备的组合物)，以获得治疗或预防疾病的成功的证明有关。

优选地，根据本发明的多肽是分离的多肽。更优选地，根据本发明的多肽基本上不含宿主细胞蛋白质、降解产物(例如，des-nona变体)和蛋白酶(例如，胰蛋白酶)。当根据本发明的多肽基本上不含宿主细胞蛋白质时，降解产物(例如，des-nona变体)和蛋白酶(例如，胰蛋白酶)也可被称为“纯多肽”。优选地，根据本发明的多肽作为纯多肽给药。更优选地，由SEQ ID NO:3组成的纯多肽和/或由SEQ ID NO:4组成的纯多肽的重量百分比相对于组合物中的总蛋白质为90％或更多，优选92％或更多，更优选93％或更多，更优选94％或更多，更优选96％或更多，更优选97％或更多，更优选98％或更多，更优选99％或更多，更优选99.2％或更多，更优选99.4％或更多，更优选99.6％或更多，更优选99.8％或更多，更优选99.9％或更多。基于本文的公开内容，包括实施例1和2，可以获得这种纯多肽。最优选地，根据本发明的纯多肽具有与药品生产质量管理规范(Good manufacturing practices，GMP)相容的纯度等级。

如本文的实验，特别是实施例3和4中所证明的，根据本发明的药剂的给药没有诱导任何痛觉过敏综合征(疼痛)，尽管该药剂与完全暴露的伤害性纤维(神经)直接接触；由于缺乏皮肤，它们被认为是完全暴露的，并且由于皮肤损伤，它们被认为是过度活化的。在这种极端情况下疼痛的消失尤为引人注目，因为该药物是通过局部给药，并反复给药于受损皮肤，也是在慢性情况下(详情见实施例)。考虑到令人沮丧的早期研究，即人类神经生长因子暴露于神经支配区域，即以暴露的伤害感受器为特征的区域(Svensson et al,2003,Pain,vol.104,p.241-247)，这也是特别显著的。上述令人惊讶的发现不能仅仅由根据本发明的药剂先前被描述为“无痛”的事实来解释，因为其诱发疼痛的能力从未在神经支配区域(即以暴露的伤害感受器为特征的区域)中进行过实验研究，更不用说在过度激活的神经上，如在皮肤损伤的情况下。此外，即使根据本发明的药剂的给药是组织神经再支配的原因(参见例如实施例3)，给药也与疼痛无关。除此之外，根据本发明的药剂对血管生成的积极作用(见实验实施例)令人惊讶，基于现有技术水平是无法预测的。血管生成被认为对组织形成和伤口闭合特别重要。总之，鉴于现有技术水平，这些有利效果的组合非常令人惊讶。

任选地，根据本发明，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽以有效量给予有此需要的受试者。下文描述了给药的细节、有效量和有此需要的受试者。

由SEQ ID NO:3组成的多肽和由SEQ ID NO:4组成的多肽分别在一个或两个位置上不同于人神经生长因子(NGF，也称为野生型人NGF或野生型NGF，见SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。根据本发明的多肽相对于SEQ ID NO:2的多肽的差异在治疗或预防皮肤病和无副作用方面具有显著效果，如本文详细公开的和本文实验实施例支持的。

神经生长因子(NGF)是特定神经元群体发育和存活所需的神经营养因子。神经生长因子是一种同二聚体肽，自然触发神经元的增殖和稳态。在体内，神经生长因子与至少两种类型的受体结合:原肌球蛋白受体激酶A(tropomyosine receptor kinase A，TrkA)和低亲和力NGF神经营养因子受体p75(low-affinity NGF neurotrophin receptor p75，LNGFR/p75NTR/p75)。两者都与人类和动物的某些疾病有关，尽管各自的作用机制可能不同。已经提出了几种神经生长因子的治疗应用，但是很少成熟到进入市场。

然而，过去设想的神经生长因子的许多治疗用途尚未成熟到上市的治疗性神经生长因子产品，其中一个原因是，神经生长因子除了对神经元的增殖和稳态的期望作用外，还与疼痛有关:当局部或全身给药时，它会引起痛觉过敏(Lewin et al.,1994,Eur.J.Neurosci.,vol.6,p.1903-1912；Della Seta et al.,1994,Pharmacol.Biochem.Behav.,vol.49,p.701；Dyck et al,1997,Neurology,vol.48,501-505；McArthur,et al.,2000,Neurology,vol.54,p.1080-1088；Svensson et al.,2003,Pain,vol.104,p.241-247；Ruiz et al.,2004,Brain Res.,vol.1011,p.1-6)。作为一种解决方案，开发了突变型的神经生长因子(“突变蛋白”)，其与降低的伤害感受活性(“无痛性神经生长因子”)相关联，并且其特征在于与TrkA受体相互作用的NGF结构域中的至少一个突变(WO 2008/006893 A1,Malerba et al.PLOS One,2015,vol.10,e0136425)。然而，这种多肽迄今还没有以药学上可接受的纯度提供给公众，并且还没有被提出或开发用于治疗或预防皮肤疾病，这可能也是考虑到在该治疗领域中对生长因子研究的偏见和研究的普遍负面经验。

根据本发明，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽的稳定性以及由此的长期纯度可以通过这里描述的方面和实施例来获得和/或改进。因此，本发明不仅提供了一种新的皮肤病治疗或预防方法，而且还提供了适合于这种治疗或预防的药剂，其纯度等级适合于治疗应用，包括对哺乳动物的给药。本发明的药剂以前不能以这样有利的纯度等级为公众获得。

SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽在自然界中没有被发现，也可以称为非天然多肽。因此，根据本发明的药剂不是野生型神经生长因子，尤其不是野生型人神经生长因子。

优选地，以高纯度提供根据本发明的非天然多肽。任选地，所述多肽包含内部二硫键。任选地，所述多肽被适当折叠。任选地，所述多肽可溶于水性介质。

本发明部分基于两种皮肤溃疡动物模型的实验。在这些模型中，在糖尿病小鼠中通过圆形活检穿孔或通过压力加载循环诱导皮肤溃疡，并且本发明的多肽通过局部应用。与安慰剂治疗的动物相比，该多肽诱导了溃疡愈合时间的显著和剂量依赖性改善。这种改善在没有与疼痛相关的副作用的剂量下是明显的，因此证明了对现有技术的潜在益处。

特别地，在糖尿病皮肤溃疡的体内模型中产生的数据表明，本发明的多肽是无痛的，但仍保留靶向神经生长因子受体系统的活性，因此提供了用于治疗或预防皮肤病的治疗手段。事实上，本发明的多肽保留了野生型神经生长因子对于有助于溃疡愈合的血管生成和神经再支配方面的营养特性，而不会在局部应用部位和全身水平上发挥野生型神经生长因子的促伤害感受作用。

本发明提供了用于治疗和/或预防哺乳动物受试者中皮肤病的多肽，其中该多肽选自SEQ ID NO:3的多肽和SEQ ID NO:4的多肽。因此，本发明还提供了SEQ ID NO:3或SEQID NO:4的多肽用于通过治疗对人体或动物体进行治疗的方法中，如本文所述。

更具体地，本发明涉及SEQ ID NO:3的多肽和SEQ ID NO:4的多肽的特定治疗用途，其中所述特定治疗用途是治疗和/或预防哺乳动物受试者的皮肤病。因此，本发明还提供了SEQ ID NO:3的多肽和SEQ ID NO:4的多肽用于通过治疗来治疗人体或动物体的方法，其中所述治疗包括治疗和/或预防哺乳动物受试者中的皮肤病。哺乳动物受试者通常是需要这种治疗的受试者。

SEQ ID NO:3的多肽以及SEQ ID NO:4的多肽的特征在于人神经生长因子(hNGF，SEQ ID NO:2)的氨基酸序列中的突变，其中所述突变与伤害感受活性降低相关。特别是，hNGF第100位的精氨酸被谷氨酸取代。本发明部分基于以下令人惊讶的发现，即可以获得治疗效果而没有现有技术已知的副作用。

不希望受限于特定的理论，优选根据本发明的多肽包含一个或多个二硫桥，最优选三个二硫桥。成熟且适当折叠的成熟人NGF的特征在于三个二硫桥(连接位置位置编号指SEQ ID NO:1；见Wiesmann etal.,1999,Nature,vol.401,p.184-188)。不希望受限于特定的理论，优选根据本发明的多肽包含等价的二硫桥(通过将根据本发明的多肽与SEQ ID NO:1的多肽进行比对，本领域技术人员可以获得起位置编号，参考Wiesmann等人，见上文)。

描述是否存在不利影响

优选地，治疗和/或预防不会对施用或已经施用所述多肽的受试者造成副作用或不利效果。在这种情况下优选不存在的一种副作用或不利效果是痛觉过敏或疼痛。因此，优选地，施用根据本发明的药剂不会诱发任何痛觉过敏综合征(疼痛)。

重要的是要指出，与施用与疼痛相关的参照化合物(如野生型神经生长因子)相比，没有疼痛不仅仅会导致更愉快(或更少不愉快)的治疗，而且至少部分是成功治疗或预防皮肤疾病的原因:考虑到根据本发明的多肽优选局部施用，更优选局部施用到皮肤疾病(例如溃疡)的部位，因此没有疼痛将使被治疗的受试者能够接受将多肽施用到身体表面上而没有不良反应，例如刮去或洗掉或以其他方式去除上述多肽以消除疼痛，由此本发明多肽将保持暴露于受伤的身体表面，从而发挥治疗上有益的效果，例如治疗或预防皮肤疾病。因此，没有与本发明多肽相关的疼痛将适于克服消费者的不情愿和监管当局的担忧。换句话说，与与疼痛相关的药物相比，没有疼痛将与利益风险比的显著增加相关。

特别地，优选地，治疗和/或预防不会引起哺乳动物受试者的痛觉过敏。在一个实施方案中，施用本发明多肽的受试者没有遭受机械性痛觉超敏(mechanic allodynia)。更准确地说，在施用本发明多肽的受试者中不会诱发机械性痛觉超敏，因此施用所述多肽的受试者不会遭受机械性痛觉超敏。

在一个实施方案中，施用本发明多肽的受试者没有热痛觉超敏。更准确地说，在施用本发明多肽的受试者中不会诱发热痛觉超敏，因此施用所述多肽的受试者不会遭受热痛觉超敏。

在这种情况下优选不存在的另一种副作用或不利效果是恶性肿瘤或癌症。特别地，对受试者施用本发明的多肽优选与异常细胞生长无关，甚至更优选与具有侵入或扩散至身体其他部位的可能性的异常细胞生长无关。特别优选的是，对受试者施用本发明的多肽优选与皮肤癌，特别是真皮或表皮的癌症无关。在这点上，与现有技术相比，根据本发明的治疗或给药具有显著的优点，例如，用血小板衍生生长因子(beclapermin，商标名Regranex)进行的商业治疗。因此，与本发明多肽相关的恶性肿瘤的缺乏预期适合于克服消费者的不情愿和监管当局的担忧。换句话说，与恶性肿瘤相关的药物相比，没有恶性肿瘤与效益风险比显著增加相关。

因此，总之，优选地，向受试者施用本发明的多肽不伴有副作用，例如恶性肿瘤和/或疼痛。

通常，受试者对本发明药物的给药耐受性良好。特别地，优选地，根据本发明的多肽的给药与受试者中抗药物抗体的形成无关。事实上，由于根据本发明的多肽的氨基酸序列仅在一个或两个氨基酸位置上不同于野生型人神经生长因子，因此人类的免疫耐受性是特别有利的，并且施用本发明的多肽与人类中抗药物抗体的形成无关是合理的。

优选地，根据本发明的给药积极影响以下一个或多个:炎症、细胞外基质沉积、神经支配和血管生成。

多肽的可检测性

优选地，根据本发明使用的多肽可以被针对内源性(例如人)神经生长因子的特异性试剂选择性识别。术语“选择性识别的”和“可检测的”在本文中可互换使用，通常指生物样品中蛋白质的特异性鉴定，优选通过分子手段。

在这方面，根据本发明的多肽优选可被抗体或其他免疫反应分子检测到。

可被抗体或其他免疫反应分子检测的蛋白质也可称为抗原。在一些实施方案中，生物样品的特征在于展示或不展示一种或多种特定抗原。在本发明的上下文中，施用给受试者的多肽优选在施用多肽后从受试者获得的生物样品中可检测到。显示蛋白质存在的一种非限制性方式是通过蛋白质印迹，但是其他免疫学方法同样包含在本发明的上下文中。抗体或其他免疫反应性分子或者自身被标记(例如荧光团标记)，或者被标记的第二抗体或为此目的添加的其他免疫反应性分子识别。因此，在一些情况下，还加入辅助检测的二级分子，例如任选标记的二级抗体，以促进检测。

根据本发明，如果水平高于检测极限和/或如果水平高到足以允许通过添加到样品中的抗原特异性抗体结合，则认为生物样品中存在抗原。根据本发明，如果表达水平低于检测极限和/或如果表达水平太低而不能被加入样品的抗原特异性抗体结合，则认为抗原没有在细胞上表达。

抗体或其他免疫反应分子可以识别细胞上的表位。术语“表位”是指分子如抗原中的抗原决定簇，即分子中被免疫系统识别(即结合)的部分或片段，例如被抗体或其它免疫反应性分子识别的部分或片段。对任何特定抗原特异的表位的检测通常允许推断该特定抗原存在于被分析的细胞上。

在一个实施方案中，从受试者，特别是施用了本发明多肽的受试者获得的样品可以通过免疫表型确定(Immunophenotyping)来表征。“免疫表型确定”通常是指细胞或样品可以通过抗原特异性分子如抗体或其他免疫反应性分子来表征，这些分子被添加到样品中以确定抗原是否存在。免疫表型确定包括使用各种方法进行细胞分选，包括流式细胞术，以及对裂解细胞和裂解样品的分析方法，如蛋白质印迹法。

在本发明中，特别优选即使存在野生型神经生长因子，如野生型人神经生长因子，也能特异性检测的多肽。尽管氨基酸序列的任何突变，例如任何点突变,可以使多肽特异性可检测，即使在相应的未突变野生型多肽存在的情况下也如此，因此SEQ ID NO:3的多肽和SEQ ID NO:4的多肽中的每一种即使在存在野生型人神经生长因子的情况下也可以初步特异性检测到，特别是SEQ ID NO:4，其有能够区分所述多肽和野生型人神经生长因子的抗体可供利用(WO 2008/006893 A1)。

因此，优选地，该多肽的特征在于至少不存在脯氨酸(脯氨酸存在于SEQ ID NO:2的位置61，作为参考),更优选61位的脯氨酸被另一个氨基酸取代。在一个特别优选的实施方案中，61位的脯氨酸被丝氨酸取代。在该优选实施方案中，根据本发明使用的多肽是SEQID NO:4的多肽。该多肽的特征在于至少缺少61位的脯氨酸，更优选61位脯氨酸被另一个氨基酸取代。在SEQ ID NO:4中，SEQ ID NO:3中61位的脯氨酸被丝氨酸取代。

受伤的身体表面

根据本发明，对受伤的身体表面施用本发明的多肽。

受伤的身体表面包括但不限于溃疡(静脉溃疡、动脉溃疡、压力溃疡、糖尿病溃疡)、手术后伤口、褥疮、烧伤、撕裂伤、切口、碰伤、擦伤、刺伤)等。具有这种受伤身体表面的受试者将在下面进一步描述，并且以下对受伤身体表面的描述适用于所有这种受试者，除非上下文另有规定。

在一个实施方案中，本文提供了根据本发明的药剂用于治疗或预防皮肤疾病，其中所述皮肤疾病选自溃疡、手术后伤口、褥疮、烧伤、撕裂伤、切口、碰伤、擦伤和穿刺伤口。

在一个实施方案中，本文提供了根据本发明的药剂用于治疗或预防溃疡，其中所述溃疡选自静脉溃疡、动脉溃疡、压力溃疡和糖尿病溃疡。

在一些实施例中，受伤的身体表面具有1毫米或更大的直径。一般来说，当本文提到受伤身体表面的“直径”时，对于非圆形受伤身体表面而言，术语“直径”指受伤身体表面的最大直径，从受伤身体表面的一个边界跨过受伤身体表面到受伤身体表面的对面边界测量。对于圆形受伤身体表面，直径对于从受伤身体表面的一个边界跨过受伤身体表面到受伤身体表面的对面边界的任何测量方向而言当然是相等的。可以用尺子或其他合适的方法在受伤身体表面的外表面上确定直径。

在一些实施例中，受伤身体表面具有1毫米至50厘米的直径。在一些实施例中，受伤的身体表面具有2毫米至20厘米的直径。直径为0.5厘米或更大，优选1厘米或更大的受伤身体表面在本文中也可称为“大”受伤身体表面。本发明也适用于治疗大的受伤身体表面，例如大的溃疡(例如参见实施例4)。在一些实施例中，受伤身体表面具有3毫米至10厘米的直径。在一些实施例中，受伤身体表面具有4毫米至5厘米的直径。在一些实施例中，受伤身体表面具有5毫米至4厘米的直径。在一些实施例中，受伤身体表面具有6毫米至3厘米的直径。在一些实施例中，受伤身体表面具有7毫米至1厘米的直径。在一些实施例中，受伤身体表面具有8毫米至1厘米的直径。在一些实施例中，受伤身体表面具有大约6mm的直径。在一些实施例中，受伤身体表面具有大约12mm的直径。

根据本发明的药剂特别适合的受试者

根据本发明，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽可以给需要这种给药的受试者给药。需要这种给药的受试者可以是患有本文所述疾病的受试者、有患这种疾病风险的受试者或以其它方式患有这种疾病的受试者。该药剂以治疗有效量给予受试者治疗有效量可由医生根据本文的公开内容确定。

具体而言，将根据本发明的多肽给予哺乳动物受试者。受试者也可以称为“患者”。最优选地，哺乳动物受试者是人。

本发明还涉及治疗患有皮肤病的患者的方法，其中该方法包括施用有效量的SEQID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽给病人。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用，特别是提及本文所述的以皮肤病为特征的患者/受试者之时。

优选地，所述皮肤病的特征在于受试者身体的至少一部分上的受伤表面。优选地，所述皮肤病的特征在于受伤的表面(受伤的身体表面)。受伤的身体表面已经在例如上面描述过，并且以下对受试者的描述适用于这些受试者的所有这些受伤的身体表面，除非上下文另有规定。

更优选地，所述皮肤病是或包括皮肤损伤，优选地特征在于真皮的至少部分消融的皮肤损伤，任选地真皮的皮肤损伤。在一个实施例中，受伤的身体表面是或包括损伤，特别是皮肤损伤。

尽管术语如“皮肤病”、“创伤”、“受伤身体表面”、“慢性创伤”、“溃疡”和其它术语在本文中以单数形式使用，但本发明也适用于患有多种皮肤病、创伤、受伤身体表面、慢性创伤、溃疡和其它此类疾病的受试者。

优选地，受伤的身体表面是或包括至少一个慢性伤口。因此，根据本发明的药剂的给药适合于治疗或预防至少一种慢性伤口。在本发明的上下文中，术语“慢性伤口”应被广义地理解，并包括但不限于所有类型的溃疡，无论是否在本公开中明确提及，褥疮、烧伤、机械皮肤消融。特别地，在各自物种的健康受试者的典型愈合时间窗内未能愈合的伤口包含在该术语内。除此之外，受试者身体表面在七天或更长时间内，如14天或更长时间、21天或更长时间、1个月或更长时间、或一年或更长时间内未能愈合和/或闭合的所有伤口都包括在术语“慢性伤口”中。为了治疗或预防这种慢性伤口，可以将根据本发明的药剂施用于所有这种类型的慢性伤口。

在本发明的上下文中，术语“预防”应广义理解，不仅包括预防疾病的发作，还包括预防疾病的进展。特别地，在受伤身体表面的情况下，例如慢性伤口，例如溃疡，术语“预防”还包括防止受伤身体表面的延伸的进一步发展，例如受伤身体表面的进一步加深和/或受伤身体表面直径的增加。

在本发明的上下文中，术语“治疗”应广义理解，包括但不限于疾病症状的改善。实际上，这里的实验实施例优选并且也证明了，实现皮肤病的改善，例如伤口的(部分)闭合，是这里要求保护的本发明的优选组成部分。事实上，获得所要求的治疗效果是本发明的功能性技术特征。此处的实施例使所述功能性技术特征作为施用本发明多肽的直接结果是可实现的变得可信。换句话说，本发明人已经确定本发明的多肽是在患有皮肤病的受试者中实现改善的原因。所述皮肤病的特征优选为受伤身体表面。

本发明特别适用于患有皮肤病的受试者亚组。本文描述了这样的亚组。特定受试者也可能属于本文所述的一个或多个亚组；将根据本发明的多肽施用于属于本文所述亚组之一的受试者同样包括将根据本发明的多肽施用于属于本文所述一个以上亚组的受试者。

本发明不限于受伤身体表面的具体原因。例如，本发明包括糖尿病原因以及非糖尿病原因。

受伤的身体表面可以在身体的任何一个或多个部位。优选的是四肢上的受伤身体表面，例如手臂(包括手)和腿(包括脚)，但是躯干或头部或身体其他部位的受伤身体表面也可以施用本发明的多肽。在一些实施例中，受伤的身体表面在腿上或脚上，更优选在脚上。这种实施方案在糖尿病患者中很常见，但是对这种特定受伤身体表面的给药不限于糖尿病患者。

在一些实施方案中，根据本发明的多肽用于对经历过手术的受试者给药。因此，根据本发明的多肽适于治疗或预防所述一种或多种术后并发症如褥疮和/或治疗外科伤口。

优选地，受伤的身体表面包括至少一个溃疡。根据本发明，多肽可以施用到受伤身体表面的至少一部分。本文所用的“至少一部分”包括0至100％之间的任何比例，例如10至90％，20至80％，30至70％，40至60％，约50％；因此，多肽可以施用到整个受伤的身体表面或其任何部分。任选地，给药还包括邻近受伤身体表面的皮肤区域。

优选地，皮肤病包括至少一个溃疡。根据本发明，多肽可被施用到一个溃疡的至少一部分。本文所用的“至少一部分”包括0至100％之间的任何比例，例如10至90％，20至80％，30至70％，40至60％，约50％；因此，多肽可以施用到溃疡的整个表面或其任何部分。任选地，给药还包括邻近溃疡的皮肤区域。

糖尿病是一种常见的衰弱性疾病，影响包括皮肤在内的多种器官。目前估计，30％至70％的1型和2型糖尿病患者在其一生中的某个时候会出现糖尿病皮肤并发症。不考虑这些不以任何方式限制本发明的理论考虑，检测糖尿病的方法在本领域是众所周知的。在一个实施方案中，检测糖尿病的方法不是本发明的一部分，但是它们有助于确定有患皮肤病风险的受试者亚组，例如本文所述的那些，并且这可以受益于根据本发明对这种皮肤病的治疗或预防。在一些实施方案中，根据本发明的药剂用于对患有神经病(例如特别是周围神经病)的糖尿病患者给药。在患有健康状况如糖尿病的人中检测神经病变和预测足部溃疡发展的方法是已知的(例如但不限于WO2010/128519A1)。

根据本发明的多肽可施用于糖尿病受试者的皮肤损伤，优选特征在于在该受试者中至少部分切除真皮的皮肤损伤，任选地切除真皮的皮肤损伤。在一个实施例中，受伤的身体表面是或包括损伤，特别是这种对象的皮肤损伤。优选地，给药包括对糖尿病患者的溃疡，特别是足部溃疡给药。

糖尿病溃疡，尤其是糖尿病足溃疡，是糖尿病的主要并发症。在本发明的上下文中，术语“糖尿病性溃疡”没有特别的限制，除了溃疡是糖尿病患者的溃疡之外。根据一些估计，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者发生非创伤性截肢的风险可能高5至15倍(例如WO2003/075949A1)。如果未经治疗或治疗不成功，糖尿病足溃疡在某些受试者中可能难以治愈，甚至可能需要截肢，特别是如果伴有其他并发症或疾病，如感染。事实上，糖尿病会影响多器官系统。糖尿病的皮肤表现对健康有各种各样的影响，从美学上的影响到未经治疗甚至可能危及生命的影响。糖尿病的皮肤病学影响描述于例如Rosen et al.,2000,Endotext,De Groot et al.,Eds,,South Dartmouth(MA,USA),MDText.com,Inc.。本发明提供了对糖尿病的这种皮肤病学影响的治疗和/或预防。

在一些实施方案中，根据本发明的多肽用于对已经接受手术的糖尿病患者给药。因此，根据本发明的多肽适于治疗或预防所述一种或多种术后并发症，例如糖尿病患者的褥疮和/或治疗外科伤口。

一般来说，除了糖尿病性溃疡，尤其是糖尿病性足部溃疡，以及褥疮和大/深的外科伤口，即使在药物治疗下也可能难以愈合，这可能是由于所涉及的面积大的结果。如果这些伤口不及时治疗，它们会恶化，随后可能变得无法治愈并威胁生命。本发明提供了对糖尿病的这种皮肤病学影响的治疗和/或预防。实际上，根据本发明，有效的医学治疗不仅可以帮助患者从这些皮肤并发症中恢复，而且还可以使他们获得更好的生活质量，减少医疗护理或费用，甚至延长寿命。

本发明还适用于治疗糖尿病患者和非糖尿病患者中大面积的受伤身体表面，特别是溃疡。在一些实施例中，本发明适用于直径为5毫米或更大，例如1厘米或更大的大受伤身体表面的治疗。上文描述了受伤身体表面的进一步细节，包括受伤身体表面直径的某些实施例。

因此，本发明提供了优于目前治疗方法的优点，目前的治疗方法常常不能提供治疗大面积伤口的有效方法。本发明提供了对糖尿病受试者和非糖尿病受试者中包括大面积伤口在内的这种皮肤病学影响的治疗和/或预防。

根据本发明，该多肽适用于治疗或预防压力损伤，包括慢性压力损伤。尤其是压力损伤，包括压力溃疡、压疮、褥疮溃疡和褥疮。

在优选的实施方案中，根据本发明的药剂用于治疗或预防溃疡，并且为此目的，对溃疡施用。根据本发明，施用所述多肽的溃疡优选选自糖尿病性溃疡、创伤性溃疡、手术性溃疡、压迫性溃疡、慢性溃疡以及这些溃疡的任意组合。在具体实施方案中，溃疡选自糖尿病创伤性溃疡、糖尿病外科溃疡、糖尿病压力性溃疡、糖尿病慢性溃疡、创伤性糖尿病溃疡、创伤性外科溃疡、创伤性压力性溃疡、创伤性慢性溃疡、慢性外科溃疡、慢性压力性溃疡和其他溃疡。在一些实施方案中，溃疡选自糖尿病受试者的创伤性溃疡、手术性溃疡、压迫性溃疡和慢性溃疡。在一些实施方案中，所述溃疡选自非糖尿病受试者的创伤性溃疡、手术性溃疡、压迫性溃疡和慢性溃疡。

本发明不限于患有一个溃疡的受试者，也不限于患有多个溃疡的受试者。在患有多个溃疡的受试者中，本发明不限于仅治疗这些溃疡中的一个，也不限于治疗一定数量的这些溃疡，也不限于治疗所有这些溃疡。因此，术语“溃疡”，无论它们在本公开中是以单个溃疡或多个溃疡使用，均明确地包括所有那些实施方案，而不限于受试者上的任何特定数量的溃疡，也不限于正在治疗的任何特定数量的溃疡。

已经证实糖尿病足溃疡可能与神经病变(神经病性溃疡)、外周血管疾病(缺血性溃疡)或两者(神经缺血性溃疡)有关，尽管最终的致病途径可能涉及这些主要危险因素和其他致病因素(如创伤)的组合。因此，在一个实施方案中，本发明的多肽用于预防和/或治疗缺血性溃疡，包括缺血性足部溃疡。在另一个实施方案中，本发明的多肽用于预防和/或治疗神经病性溃疡，包括神经病性足部溃疡。最后，本发明的多肽可用于预防和/或治疗神经缺血性溃疡，包括神经缺血性足部溃疡。所有上述溃疡任选为糖尿病性溃疡，尽管这不是必需的。

在一些实施方案中，将根据本发明的多肽给予患有缺血的受试者。缺血可能是局部的，也可能是全身的。在一些实施方案中，根据本发明的给药可以减少受试者的局部缺血。局部缺血的减轻可以是局部的，也可以是全身的。

在一些实施方案中，将根据本发明的多肽给予患有神经病的受试者。在优选的实施方案中，根据本发明的药剂用于对患有神经病，例如特别是周围神经病的受试者给药。这些受试者可以是糖尿病或非糖尿病受试者。事实上，据报道，大多数糖尿病溃疡患者有潜在的神经病变(Ndip et al.,2012,Int.J.Gen.Med.,vol.5,p.129-134)。因此，在一个优选的实施方案中，将本发明的多肽给予患有神经病的糖尿病患者。神经病可能是局部的，也可能是全身的。在一些实施方案中，根据本发明的给药可以减少受试者的神经病变。神经病变的减轻可以是局部的和/或全身的。在一个实施方案中，神经病变的减轻包括施用本发明多肽的区域的神经病变的减轻。在一个实施方案中，神经病变的减轻包括施用本发明多肽的器官中神经病变的减轻。

根据本发明的治疗或预防可以通过施用，优选局部施用本发明的多肽来进行。在一些实施例中，给药在医院进行。在一些实施例中，治疗不是在医院进行的。

任选地但不相互排斥地，皮肤病包括至少一种烧伤或机械损伤。因此，本发明还包括烧伤和机械损伤的治疗或预防，由此这种损伤的治疗实际上比预防更有意义。

优选地，施用本发明多肽的哺乳动物，优选人，患有糖尿病或具有患糖尿病的倾向；相应的受试者在本文中被称为“糖尿病受试者”。在典型的实施方案中，糖尿病选自1型糖尿病和2型糖尿病。

足部溃疡和其他皮肤病在糖尿病患者中很常见。基于本发明，可以治疗和/或预防这种其他皮肤病。糖尿病患者足部溃疡的主要原因之一是神经病变(神经损伤)，使得患者难以识别足部损伤，如割伤、擦伤和压迫。

因此，在一个实施方案中，将多肽给予患有足部溃疡的受试者。在一个实施方案中，将多肽给予患有糖尿病足溃疡(DFU)的受试者。事实上，足部溃疡及其伴随的并发症在糖尿病患者中很常见，其中大多数患有潜在的神经病变(Ndip et al.,2012,Int.J.Gen.Med.,vol.5,p.129-134)。这种溃疡也被称为糖尿病性神经病性足溃疡。因此，优选地，将该多肽给予患有糖尿病性神经病性足溃疡的受试者。

任选地，根据本发明的多肽的给药还包括改善受试者的美学外观，特别是受试者身体表面的美学外观的方面。在一些实施例中，伤口闭合是根据本发明给药的结果。在一些实施例中，疤痕形成最小。因此，与未治疗的受试者相比，根据本发明的给药还为治疗的受试者提供了美容优势。因此，本发明还涉及对受试者进行美容性治疗的方法，其中该方法包括施用根据SEQ ID NO:3或4的多肽。

在另一个实施方案中，根据本发明的药剂用于治疗或预防皮肤上的癌症，例如但不限于血管瘤，和/或与这些癌症相关的皮肤病。

在另一个实施方案中，根据本发明的药剂用于治疗或预防皮肤病，所述皮肤病由受试者的遗传性疾病引起或受受试者的遗传性疾病影响。

给药

本发明提供了用于对受试者给药的异源多肽。

优选地，所述多肽用于局部给药。因此，优选地，将本发明的多肽施用于皮肤，或者如果皮肤受伤或缺失，施用于身体表面上如果皮肤没有受伤或缺失就会发现皮肤的部位。在一些实施方案中，多肽被施用到表皮上。在一些实施方案中，多肽被施用到真皮上。在一些实施方案中，多肽被施用到通常在表皮下发现的组织上，例如但不限于皮下区域。

更优选地，多肽被施用到受伤的身体表面。换句话说，根据本发明的多肽优选局部给药，更优选局部给药到皮肤病(例如溃疡)的部位。

根据本发明的给药通常不涉及受试者的手术。在一个实施方案中，本发明多肽的给药不包括或不包含对身体进行实质性物理干预的侵入性步骤，该步骤需要专业的医学专业知识才能进行，并且即使在需要专业护理和专业知识的情况下进行，也会带来实质性的健康风险。相反，在更典型的实施方案中，本发明多肽的给药，特别是局部给药，通常被认为对受试者是安全的，因此多肽可以由受试者自己给药，特别是在人类受试者的情况下。

任选地，在给药之前和/或期间和/或之后，溃疡被伤口敷料覆盖。可用的各种类型的伤口敷料不受本发明的限制。因此，可以使用任何伤口敷料，除非技术上明显不合适。在一些实施方案中，在施用伤口敷料的同时施用根据本发明的多肽；任选地，伤口敷料包含本发明的多肽，任选地以在给药前应用于伤口敷料的水性介质的形式。

优选地，将多肽施用于患有足部溃疡的受试者，施用到所述受试者脚踝以下的足部。

在一个实施方案中，多肽在单次给药中给药。

在另一个更优选的实施方案中，多肽被重复给药。在一个特别优选的实施方案中，多肽每天重复给药1至5次。在一个实施方案中，多肽每天给药一次(也参见实施例3)。在一个实施方案中，多肽每天给药两次(也参见实施例5)。在一个实施方案中，多肽每天给药三次。在一个实施方案中，多肽每天给药四次。在一个实施方案中，多肽每天给药五次。特别优选的是，每天两次向人类受试者施用该多肽。如本文所公开的，所有上述给药优选在几天的过程中重复。例如，多肽可以重复给药3至30天，优选7至14天，并且在优选这些天的每一天中给药一至五次。

在一个实施方案中，重复施用多肽，直到伤口身体表面闭合。或者，多肽在一次给药中给药，并且在该次给药后停止给药。或者，多肽重复给药3至30天，优选7至14天。任选地，在完成所述间隔后停止给药。

在一些实施方案中，所述药剂以与伤害感受纤维(神经)直接接触的方式给药。在一些实施方案中，所述药剂是以直接接触完全暴露的伤害感受纤维(神经)的方式给药的药剂；在缺少皮肤的情况下，伤害感受性纤维(神经)被认为是完全暴露的，这在受伤的身体表面的情况下是典型的。在一些实施方案中，所述药剂是以这样的方式给药的药剂，即它与过度活化的伤害感受性纤维(神经)直接接触；伤害感受性纤维(神经)被认为因皮肤损伤而被过度激活。在一些实施方案中，所述药剂是以这样的方式给药的药剂，即它与过度活化的伤害感受性纤维(神经)直接接触。优选地，特别是在这样的实施方案中，该药剂不会引起痛觉过敏综合征(疼痛)。以前没有任何具有这种性质的药剂交由医学界使用。出于这个和其他原因，本发明提供了一个主要优点。

剂量

本文所述的药剂和组合物以有效量给药。根据本发明，“有效量”是指单独或与其它剂量一起实现所需反应或所需效果的量或剂量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选涉及对疾病进程的抑制。这包括减缓疾病的进展，优选地，中断或逆转疾病的进展。疾病或病症治疗中的期望反应也可以包括延迟所述疾病或病症的发作或预防所述疾病或病症的发作。在一些实施方案中，期望的反应包括局部和/或全身性地完全治愈病症的症状。

本文所述的药剂或组合物的有效量将取决于待治疗的病症或障碍、障碍的严重程度、施用药剂的受试者的个体参数，例如年龄、生理状况、并发症(如果存在)、体格和重量、治疗持续时间、伴随治疗的类型(如果存在)、具体的施用途径和其他参数。因此，本文所述药剂的给药剂量可取决于各种这样的参数。在初始剂量不足以引起患者反应的情况下，可以使用更高的剂量(或通过不同的、更局部化的给药途径获得更高的有效剂量)。

根据本发明，用于治疗和/或预防皮肤疾病(如慢性皮肤溃疡和烧伤)的人类受试者的治疗剂给药的合适和治疗有效剂量可以基于用于治疗和/或预防皮肤疾病(如慢性皮肤溃疡和烧伤)的啮齿动物受试者(特别是小鼠)的治疗剂给药的实验确定的合适和治疗有效剂量来确定。指南可在“Guidance for Industry Chronic Cutaneous Ulcer and BurnWounds—Developing Products for Treatment”(由U.S.Department of Health andHuman Services Food and Drug Administration,2006出版)中找到。

动物创伤模型(实施例3和4)有助于建立药理学反应，以及评估创伤治疗产品的潜在毒性。在一些实施方案中，给予受试者的剂量是实施例3或实施例4或实施例5中公开的剂量。

优选地，待施用的多肽的剂量基于待治疗的受伤身体表面的表面来确定。优选地，在治疗开始时进行测定。在一个实施例中，根据后面给药时受伤身体表面的表面，为后面的给药调整剂量。在另一个实施方案中，给药剂量不随后面的给药而调整，因此给药剂量仅取决于给药开始时(第一次给药)要治疗的受伤身体表面的表面，随后的剂量对应于第一次剂量。

在一个实施方案中，剂量/每剂的量为每平方毫米被治疗的受伤身体表面0.3至6微克多肽(0.3至6微克/平方毫米)。

可选地，在根据本发明的所有实施例中，剂量是基于治疗时受伤身体表面(例如溃疡)的实际尺寸来计算的。换句话说，剂量可以在每个给药时间点根据该时间点受伤身体表面(例如溃疡)的实际大小进行计算(重新计算)。

获得多肽的方法

在一个实施方案中，SEQ ID NO:3的多肽和SEQ ID NO:4的多肽可从生物来源获得。任选地，SEQ ID NO:3的多肽和SEQ ID NO:4的多肽可通过重组表达获得。为此目的，将编码相应多肽的开放阅读框引入重组蛋白质的来源，例如宿主细胞或无细胞系统进行蛋白质表达。事实上，考虑到人神经生长因子在体内仅以微量产生，小鼠神经生长因子通常以各种蛋白质的异质混合物产生(见WO 2000/022119 A1)，并且本发明的多肽是非天然的、从而根本不在体内产生，因此根据现有技术中对野生型神经生长因子的等效建议，产生本发明多肽的最有意义的可能性是通过重组表达(WO 2000/022119 A1,WO 2008/006893 A1；Rattenholl et al.,Eur.J.Biochem,2001,vol.268,p.3296-3303,US2018/0086805 A1)。然而，获得足够施用于哺乳动物的纯度等级的这种多肽一直是一个挑战。如本文详细公开的，本发明人已经克服了这个挑战(也参见实施例1和2)。

优选地，根据本发明的多肽可通过在细菌中重组表达获得。更优选地，根据本发明的多肽可通过细菌中的胞质重组表达获得。一般来说，细菌细胞，特别是大肠杆菌，能够重组生产大量重组蛋白，但是，如同许多其它重组表达的基因的情况一样，在细菌中生产重组神经生长因子和类似的多肽导致生物学无活性的翻译产物，该产物然后以聚集体(所谓的包涵体(IBs))的形式在细胞(胞质溶胶)中积累(WO2000/022119A1；US2018/0086805A1)。与神经生长因子相反，已知pro-NGF相当不稳定，需要在低回收率下进行高强度的重折叠和纯化，这使得细菌中通过pro-NGF生产神经生长因子的过程相对困难和昂贵。因此，与细菌产生的神经生长因子和类似的细菌产生的多肽(通过相应的原形式)相关的主要困难涉及重组蛋白的折叠、加工和纯化。这些困难现已解决(见实施例1和实施例2)。因此，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的多肽可以适于哺乳动物(包括人)给药的纯度等级获得。

优选地，根据本发明的多肽与原序列一起表达。没有限制，合适的原序列是野生型人神经生长因子的原序列(SEQ ID NO:1的氨基酸位置18-121)，通常与SEQ ID NO:3或4的多肽的N-末端融合。对于野生型神经生长因子，虽然不是成熟神经生长因子的一部分，因此也不是神经生长因子的生物功能所必需的，但共价连接的原序列的存在表明促进了重组神经生长因子从包涵体的再折叠，同时伴随着成熟部分的二硫键形成(β-神经生长因子)。因此，与来自包涵体的成熟神经生长因子的体外重折叠相比，共价连接的原序列的存在对重折叠的产量和速率有积极的影响(Rattenholl et al.,Eur.J.Biochem,2001,vol.268,p.3296-3303)。不希望受限于特定的理论，在此对SEQ ID NO:3和4同样是可信和可以推测的。

因此，当根据本发明的多肽已经在包涵体中产生时，需要正确的折叠，这通常在翻译后实现，如同从共价连接的原序列切割一样；过去已经提出了复杂的折叠、切割和纯化方法，特别是对于野生型人神经生长因子。值得注意的是，大多数已发表的关于神经生长因子的研究采用了以前由Rattenholl et al.(2001,Eur.J.Biochem,vol.268,p.3296-3303)建立的一般重折叠方法。在最初的研究中，详细研究了蛋白质重折叠的几个参数(如温度、重折叠时间、重折叠反应的pH值、精氨酸、谷胱甘肽和蛋白质浓度)，并评估了它们对重折叠效率的影响。Rattenholl等人的方案依赖于原形式的再自然化，该原形式具有非常差的溶解度，可在原核生物中重组生产后从包涵体中获得，由此pro-NGF以变性浓度溶解在变性剂的溶液中，转移到不变性或弱变性的溶液中，从而保持溶解性，并且溶解的变性pro-NGF可呈现生物活性构象，包括如天然神经生长因子中形成二硫键，然后纯化神经生长因子并蛋白水解去除原序列(例如WO 2000/022119A1；Rattenholl et al.,Eur.J.Biochem,2001,vol.268,p.3296-3303)。值得注意的是，在这项研究中发现，与较高的蛋白质浓度相比，较低的蛋白质浓度导致正确折叠产物的更高的比产量。举例来说，每升重折叠反应中约50毫克的蛋白质浓度导致约25％的正确折叠的pro-NGF的比产率，而当蛋白质浓度为每升500毫克时，该分数降低到10％。在此基础上，Ratenholl等人提出，重折叠溶液中的蛋白质浓度必须非常低:根据Ratenholl等人的说法，产率预期为每升重折叠反应中15-20毫克正确折叠的蛋白质。然而，这将需要扩大规模(例如超过实验室规模)来纯化甚至几百毫克的重组蛋白。

尽管人pro-NGF含有蛋白酶Furin的天然切割位点(Arg¹-Ser²-Lys³-Arg⁴；R¹S²K³R⁴)，并且弗林蛋白酶在体内在该位点切割pro-NGF，但弗林蛋白酶不能在商业上相关的纯度或数量获得。根据本发明，当根据本发明的多肽与原序列一起在例如大肠杆菌中表达时，优选被市售的蛋白酶胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)切割。事实上，据报道，对于野生型神经生长因子，胰蛋白酶可以产生令人满意的具有生物活性的成熟神经生长因子，最终可以纯化(Rattenholl et al.,Eur.J.Biochem,2001,vol.268,p.3296-3303)，并且重组表达的pro-NGF的基于胰蛋白酶的蛋白水解同时被其他人采用(例如D'Onofrio et al.,2011,PLoS One,vol.6,e20839)。然而，后来表明，用胰蛋白酶切割野生型pro-NGF以产生β-神经生长因子有几个缺点，因为低量的胰蛋白酶会导致切割不足，而高量的胰蛋白酶会进一步降低切割的选择性，因为胰蛋白酶能够切割任何精氨酸和赖氨酸残基(R和K残基)的C末端，因此通过用胰蛋白酶消化含R¹S²K³R⁴-的pro-NGF，将获得几种替代的消化产物；因此，使用胰蛋白酶作为切割酶将导致正确切割的神经生长因子的产量非常低，并导致纯化和产量问题，因为不同的切割产物在标准条件下不能经济地分离。作为一种解决方案，建议表达pro-NGF的变体，其中原肽中的蛋白酶切割位点R¹S²K³R⁴至少在对应于人野生型pro-NGF序列(SEQ ID NO:1)的101和103位的R1和K3位被另外的氨基酸取代(WO 2013/092776 A1)。在一个例子中，R1和K3分别被缬氨酸(V)和丙氨酸(A)取代，将最初的弗林蛋白酶切割位点R¹S²K³R⁴转化为V¹S²A³R⁴，其中胰蛋白酶只能特异性切割R4的碳末端；胰蛋白酶介导的相应pro-NGF的切割也可称为“VSAR方法”。尽管WO 2013/092776 A1没有提到根据本发明的实施例3或4的SEQ ID NO:3或4多肽，VSAR方法最初已经被提议适用于pro-NGF突变蛋白的某些变体，尽管据报道蛋白水解条件需要小心确定(US2018/0086805A1)。在获得本发明的过程中，本发明人发现，与先前的建议相反，VSAR技术不能令人满意地解决与以令人满意的纯度重组生产本发明多肽相关的纯度问题。事实上，重组表达的β-神经生长因子或其突变蛋白的纯化，不仅从宿主细胞蛋白(HCP)，而且从胰蛋白酶(或用于切割的其他蛋白酶)中纯化仍然是一个挑战；不用说，根据本发明，在药物蛋白的最终制剂中需要不存在蛋白水解酶(如胰蛋白酶),以避免多肽储存期间的蛋白水解，从而使多肽在给予受试者时基本上是纯的和未降解的。如本文所述，本发明人已经解决了这个挑战。因此，本发明使得根据SEQ ID NO:3或4的多肽能够以高纯度获得，因此基本上不含胰蛋白酶和/或所述多肽的降解产物。尽管生产神经生长因子(例如WO2013092776A1)和SEQ ID NO:4的多肽的某些方法(例如Malerbaet al.,2015,PLOS One,vol.10,e0136425)已经在前面描述过，本发明人惊奇地发现，以前公开的方法不足以获得高纯度的相应多肽。作为对这些不足的解决方案，本发明人达成了一种新的方法和相关方面，如在此详细描述的。

根据本发明在例如宿主细胞中通过重组表达获得SEQ ID NO:3多肽和SEQ ID NO:4多肽的方法可以包括纯化。在最广泛的意义上，纯化是指将SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽与其他分子分开，包括其他蛋白质，如宿主细胞蛋白质。因此，纯化可以包括从一种或多种其他分子中分离，包括其他蛋白质，例如宿主细胞蛋白质、蛋白酶(例如胰蛋白酶)和/或根据本发明的多肽的降解产物。

根据本发明生产SEQ ID NO:3多肽和SEQ ID NO:4多肽的方法优选包括以下步骤:

(a)获得SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽的前体,

(d)纯化，

并且步骤(d)中的纯化通常包括在混合模式固定相上的纯化。因此，在一个实施方案中，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽可通过重组表达和纯化获得，其中纯化包括在混合模式固定相上的纯化。术语“在混合模式固定相上”应被广义地理解，表示包含SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4多肽或其中任何一种的前体与其它分子种类一起的混合物暴露于混合模式固定相，例如通过色谱或其它合适的工艺步骤。事实上，优选包含SEQ ID NO:3或SEQID NO:4多肽或这些物质中任何一种的前体与其它分子物种一起的混合物进行色谱分离，因此步骤(d)中的纯化包括通过混合模式色谱分离进行纯化。优选地，混合模式色谱包括使用具有带电荷基团(优选带负电荷基团)和芳香基团和/或疏水基团的固定相。

根据本发明，从最广泛的意义上讲，纯化是指SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽至少部分与其它分子物种分离，包括其它蛋白质，如宿主细胞蛋白质、前体和/或降解产物。因此，可以获得至少部分纯化的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽。其他分子种类可以任选地被丢弃或不被丢弃，而作为纯化的结果，优选获得并保留SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽。

优选地，混合模式色谱包括使用具有带电荷基团(优选带负电荷基团)和芳香基团和/或疏水基团的固定相。

这些步骤中的每一个本身可以包括几个动作，为了简单起见，这些动作也可以被称为步骤。为了说明，如下文详述，步骤(d)可以包括一个以上的纯化步骤，例如在一个以上的固定相上。

本文中使用的与一个或多个工艺步骤相关的任何字母或数字，例如(a)、(b)、(c)、(d)、(d1)、(d2)，不应理解为限制性的，而是作为参考。不应该理解的是，根据本发明的工艺或使用中的事件顺序可能受到字母顺序或数字顺序的限制。尽管有上述内容，但强烈优选的是，根据本发明的方法或使用中的事件顺序是本文所述的顺序。

混合模式色谱的其他方面，特别是合适的固定相，将在下面更详细地描述，但是这些方面普遍适用于本发明。因此，特别是在下面描述为对步骤(d2)中的混合模式色谱特别有用的所有那些固定相，包括其所有实施方案，普遍可用于纯化本发明的SEQ ID NO:3多肽和/或SEQ ID NO:4多肽，并且可以用于所有类型的实施方案中，例如与(d1)捕获色谱的步骤结合或不结合。事实上，实施例2B描述了在根据现有技术的方案的变化中使用混合模式色谱可以获得一些优点

任选地，SEQ ID NO:3多肽或SEQ ID NO:4多肽可通过如下方法获得，该方法包括(再)折叠和/或色谱纯化和/或蛋白酶消化，以及任选地调节到最终蛋白质浓度和/或制备所需的制剂。

因此，如本文所公开的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽对有此需要的受试者的施用能够通过SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽的工业相关纯度和产率实现，这是本领域技术人员基于本文的公开内容可以达到的。因此，本公开还描述了生产SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4多肽的方法。

根据本发明生产SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽的方法优选包括以下步骤:

(a)获得SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽的前体，例如通过重组表达，

(d)纯化，其中纯化包括在混合模式固定相上的纯化。

在本发明中还优选对SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽的前体进行以下步骤：

(c)暴露于蛋白酶。

所述暴露通常在步骤(d)之前进行。

本发明方法优选地特征还在于在暴露于蛋白酶之前不进行色谱纯化。事实上，本发明人惊奇地发现，在从宿主细胞获得的粗级分中，即当在暴露于蛋白酶之前没有进行色谱纯化时，用蛋白酶进行的消化也很好且有效。

优选地，获得(a)的步骤包括表达SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽的前体，优选重组表达。更优选地，重组表达在宿主细胞中进行。在培养宿主细胞后，SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4多肽是在细胞培养物的一部分中获得的。该部分可以由宿主细胞组成，即在蛋白质基本上不从宿主细胞分泌的情况下。例如，当SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽在包涵体中和/或在包括胞质溶胶在内的细胞内区室中产生时就是如此。合适的宿主细胞可以选自原核和真核宿主细胞，尽管在典型的实施方案中原核宿主细胞是优选的。优选的原核宿主细胞包括大肠杆菌，优选大肠杆菌Rosetta(DE3)。在一个实施方案中，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽以不同于天然构象的构象和/或聚集体获得，最优选在包涵体中获得。然后，优选地，本发明的方法包括(重)折叠SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽的步骤(b)。优选地，步骤(c)在步骤(b)之后进行。

优选地，在步骤(c)中，蛋白酶是能够以释放SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的(成熟)多肽的方式切割SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽的蛋白酶。在一个特定的实施方案中，所述蛋白酶是胰蛋白酶，优选猪胰蛋白酶，任选重组表达。

优选地，纯化步骤(d)包括以下步骤，优选按顺序:

(d1)捕获，

(d2)精制。

优选地，捕获步骤(d1)通过色谱法，优选柱色谱法进行。更优选地，所述捕获步骤(d1)使用阳离子交换色谱固定相或混合模式色谱固定相进行。甚至更优选地，所述捕获步骤(d1)使用混合模式色谱固定相来进行，该固定相优选为Capto MMC。

优选地，精制步骤(d2)通过色谱法，优选柱色谱法进行。更优选地，所述精制步骤使用阳离子交换色谱固定相进行。甚至更优选地，所述捕获步骤(d1)使用SP sepharose进行，优选具有小粒径的SP sepharose。SP是磺丙基的缩写。

任选地，根据本发明的方法包括调节至最终蛋白质浓度和/或制备所需制剂的附加步骤。由此可获得根据本发明的组合物。

换句话说，本发明提供了用于制备SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽的混合模式色谱。混合模式色谱可用于制备SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽。在优选的实施方案中，SEQID NO:3或SEQ ID NO:4多肽的前体暴露于蛋白酶用于消化的目的，并且在暴露于蛋白酶之后的步骤中使用混合模式色谱。在优选的实施方案中，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽的非色谱纯化在所述暴露于蛋白酶之前进行。

多肽的纯度

本发明的多肽实质上或基本上不含在其天然状态下通常伴随的成分。本发明的多肽在给药前是分离的。在一个实施方案中，“分离的多肽”是指已经从细胞和细胞外环境(例如组织)中纯化的多肽，所述细胞和细胞外环境在天然存在的状态围绕所述多肽，例如从表达多肽的细胞(例如宿主细胞)中纯化的多肽。在另一个实施方案中，“分离的多肽”是指多肽分别从所述多肽的天然细胞环境中，以及从与所述多肽通常所在环境的其它成分的结合中体外分离和/或纯化。

优选地，根据本驸马使用的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽基本上不含杂质。这种有利地纯化了的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽可如本文所述获得。

本文所述的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽被认为是药物活性肽或蛋白质。

在本发明的一个特别有利的实施方案中，根据本发明的多肽以基本上不含所述多肽的降解产物的形式获得。特别地，本发明人观察到，与现有技术中关于野生型人神经生长因子的报道相反，如果纯化没有完全除去胰蛋白酶(des-nona变异体，数据未显示)，在纯化之前或之后，SEQ ID NO:4前体暴露于胰蛋白酶将固有地在SEQ ID NO:4的精氨酸(Arg,R)C末端部分切割所述前体。通过本发明提供的特定纯化方法，可以获得基本上不含胰蛋白酶和/或des-nona变体的本发明多肽。

优选地，如上所述可获得的多肽基本上不含多肽的降解物。特别地，本公开使得本发明的多肽可以以新的、提高的纯度等级获得，并且优选以如此高的纯度施用该多肽。优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于纯度等级至少为90％。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于纯度等级至少为91％。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于纯度等级至少为92％。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于纯度等级至少为93％。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于纯度等级至少为94％。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于纯度等级至少为95％。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于纯度等级至少为96％。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于纯度等级至少为97％。更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于纯度等级至少为98％。甚至更优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于纯度等级至少为99％。

最优选地，根据本发明使用的本发明多肽的特征在于纯度等级大于99.0％，例如纯度等级大于99.1％，大于99.2％，大于99.3％，大于99.4％，大于99.5％，大于99.6％，大于99.7％，大于99.8％，大于99.9％。

本文中，“纯度等级”通常指本发明多肽相对于除本发明多肽之外的生物材料的重量(w)的重量(w)百分比。举例来说，一般来说，在99.0％的纯度等级下，本发明的多肽以99.0单位(例如1.0毫克)的相对量(重量)存在，并且除了本发明的多肽之外的所有生物材料的重量总和为1.0单位(例如1.0毫克)。除了本发明的多肽之外的这种生物材料包括但不限于宿主细胞蛋白质、核酸、蛋白酶如胰蛋白酶(灭活或非灭活)、本发明多肽的降解产物如生物来源的其它大分子。在一个特定的实施方案中，“纯度”等级是指相对于本发明多肽以外的多肽的纯度。为了说明，在该实施方案中，在99.0％的纯度等级下，本发明的多肽以99.0单位(例如1.0毫克)的相对量(重量)存在，并且与本发明的多肽不相同的所有多肽的重量总和为1.0单位(例如1.0毫克)。为避免疑问，本发明多肽的降解产物包括在“与本发明多肽不相同的多肽”中。一种特殊的降解产物是des-nona变体(见实施例1和2)。

特别是基本上不含所述多肽的des-nona变体。des-nona变体是本发明多肽的先前未表征的降解产物，其与包括本发明多肽在内的神经生长因子的某些变体的产生相关，除非该多肽是通过本文公开的新方法产生的(参见例如实施例1和2)。本文中的“基本上不含”是指根据本发明使用的本发明多肽的特征在于相对于des-nona变体的纯度等级大于99.0％，例如纯度等级大于99.1％，大于99.2％，大于99.3％，大于99.4％，大于99.5％，大于99.6％，大于99.7％，大于99.8％，大于99.9％，所有这些都相对于des-nona变体而言。在最优选的实施方案中，des-nona变体是不可检测的和/或不存在的。

还优选的是，根据本发明的多肽基本上不含任何蛋白酶(如胰蛋白酶)。本文中“基本上不含”是指根据本发明使用的本发明多肽的特征在于相对于所有蛋白酶(包括胰蛋白酶)之和而言的纯度等级大于99.0％，例如相对于所有蛋白酶的纯度等级而言大于99.1％、大于99.2％、大于99.3％、大于99.4％、大于99.5％、大于99.6％、大于99.7％、大于99.8％、大于99.9％。在最优选的实施方案中，胰蛋白酶是不可检测的和/或不存在的。

在上述实施方案中，这种高纯度等级与监管当局改善的可接受性相关，并使本发明的多肽有资格作为用于哺乳动物受试者(尤其包括人类)的药物。因此，根据本发明的纯度等级第一次能够以安全可靠的方式将该多肽用于对受伤身体表面(包括人体受伤身体表面)和溃疡的给药。关于蛋白酶(胰蛋白酶)的高纯度等级使得多肽尤其能够以非冷冻形式储存。

成分

在一些实施方案中，本文所述的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽包含在另外包含一种或多种载体和/或一种或多种赋形剂的组合物中。本文使用的术语“载体”是指天然或合成性质的有机或无机组分，其与活性成分结合在一起，以便能够、增强或促进活性成分的应用。本文所用的术语“赋形剂”是指可能存在于本发明药物组合物中且不是活性成分的所有物质。

优选地，根据本发明的组合物至少包含水作为赋形剂。在一些实施方案中，根据本发明的组合物包含水性介质，更优选地，根据本发明的组合物为水溶液形式。在一个实施方案中，多肽包含在水性介质中，并且水性介质被给予哺乳动物受试者。水性介质可以是例如水溶液。在一些实施方案中，水溶液和其它相应的组合物可直接从含水介质中的神经生长因子纯化获得。例如，当根据本发明的药剂通过纯化从生物源中纯化获得时，相应的水性组合物可以直接从最后的纯化步骤中获得，例如从最后的色谱柱中洗脱(通常是精制步骤)和/或过滤。或者，通过调节最终蛋白质浓度和/或制备所需制剂的额外步骤，可获得各自的组合物。这样的额外步骤可以包括例如如本文所述的澄清或过滤步骤，和/或添加一种或多种赋形剂和/或一种或多种载体的步骤。本文描述了可用于本发明的示例性组合物，但没有限制。

因此，本文描述的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽可以存在于组合物中，例如药物组合物中。本文所述的组合物优选是无菌的，并且优选含有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽作为药物活性肽或蛋白质，以及任选地本文提及或未提及的其它试剂。组合物可以是任何状态，例如液体、冷冻、冻干等。

本文所述的组合物可包含盐、缓冲物质、防腐剂、载体、稀释剂和/或赋形剂，所有这些优选为药学上可接受的。术语“药学上可接受的”描述了无毒和/或不与药物组合物的活性成分的作用相互作用的物质。

适用于本发明的缓冲物质包括盐形式的乙酸、盐形式的柠檬酸、盐形式的硼酸和盐形式的磷酸。例如，作为本发明各个方面的结果，优选本发明的多肽可在具有4.5至6.5之间、优选在5.0至6.0之间的pH的缓冲液中获得。在一个实施方案中，乙酸盐缓冲液是用于此目的的合适缓冲液，因此是特别优选的。因此，在一个实施方案中，本发明的多肽是在pH为4.5至6.5、优选5.0至6.0的乙酸缓冲液中获得的。

适用于本发明组合物的防腐剂包括本领域已知的防腐剂，其中包括但不限于苯甲醇、苯扎氯铵及其盐、间甲酚、苯酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。

因此，本发明提供了SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽用于治疗用途，即用于通过治疗对人体或动物体进行治疗的方法。治疗可以包括预防和/或治疗疾病。考虑到潜在的治疗用途，所述多肽也可以称为药物活性蛋白或肽。

任选地，根据本发明的给药伴随着至少一种抗微生物剂如抗生素的给药。抗微生物剂可以是包含根据本发明的多肽的组合物的一部分，或者可以通过相同或不同的给药途径分开给予受试者的相同或不同的部位。

工业适用性

本文描述的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4多肽适用于多种目的，例如用于本文所述的治疗应用。

以下实施例和附图旨在说明本发明的一些优选实施方案，并且不应被解释为限制由权利要求限定的本发明的范围。

实施例

一个以上实施例共有的材料和方法

除非另有说明，以下实验例具体涉及SEQ ID NO:4的多肽，其相对于野生型人神经生长因子而言特征在于取代P61S R100E(称为“NGF P61S R100E”)，Malerba et al.PLOSOne,2015,vol.10,e0136425,SEQ ID NO:4)，以及其原形式等。SEQ ID NO:4的多肽也可以称为“神经生长因子突变蛋白”，但必须记住，根据本发明，这种蛋白特异的治疗适用性，如实验例，特别是实施例3和4所示的，与野生型人神经生长因子明显不同。同样，如实施例2所述，SEQ ID NO:4所示多肽的纯化不同于公开的针对野生型神经生长因子的纯化方案，根据本发明制备所述多肽的具体方法适合于获得高纯度，特别是没有des-nona variant和胰蛋白酶的情况下。

SEQ ID NO:4的多肽重组表达为前体。为此，将SEQ ID NO:4与野生型人神经生长因子的原肽(SEQ ID NO:1的位置1-121)融合。换句话说，SEQ ID NO:4多肽的前体由人野生型神经生长因子前体(SEQ ID NO:1)组成，除了人野生型神经生长因子成熟部分中的P61SR100E取代(但为清楚起见，缺少SEQ ID NO:1的2个最C末端氨基酸，其不构成人野生型神经生长因子多肽序列的部分)。在大肠杆菌Rosetta(DE3)(菌株：大肠杆菌Rosetta(DE3)/pET11a-hpro NGF P61S R100E)中以不溶性包涵体形式进行表达。

设备

表1_

表1所用设备清单。

本文描述的蛋白质和肽的蛋白质参数

相关蛋白质的蛋白质参数的理论值是用在http://web.expasy.org/protparam可获得的ExPASy’s ProtParam-Tool计算得到的。这些如下述表2所示:

表2

表2:相关蛋白质/多肽的理论推导性质

分析方法

聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹

使用标准程序进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。对于SDS-PAGE，在还原条件下于恒定电压(175伏)下在NuPAGE MES运行缓冲液(Thermo Fisher公司产品编号:NP0002)中操作12％Bis-TRIS NuPAGE凝胶。蛋白质印迹的一抗购自Santa Cruz Biotechnology(NGF(H-20)sc-548)。

分析性CEX-HPLC

CEX-HPLC是使用来自Dionex的ProPac SCX-10进行的。柱用50mM柠檬酸盐缓冲液，pH5.5操作，流速为1毫升/分钟。为了洗脱，加入1M氯化钠(B)，采用在50分钟内从0-100％B的线性梯度。

SE-HPLC

使用GE Healthcare的Superdex 200Increase 10/300GL进行SE-HPLC。该柱在PBS中操作。在280纳米处检测产物。

内毒素、DNA和HCP

内毒素、DNA和宿主细胞蛋白质(HCP)根据标准方案测定。

实施例1:将SEQ ID NO:4多肽表达为前体蛋白

生产菌株

将编码原神经生长因子的基因克隆到pET11a表达质粒中。该基因来源于智人，两个点突变(即P61S和R100E)被引入开放阅读框。随后，用表达质粒转化化学感受态Rosetta(DE3)细胞，并选择单个菌落(所得菌株命名为E5901-STRAIN(＝E.coli Rosetta(DE3)/pET11a-pro NGF P61S R100E

NGF RCB C-151101))。等分试样以1.0毫升储存在<-60℃。

在实施例1中，描述了基于菌株E5901-STRAIN的初始发酵开发。

设备

表3

生长培养基

用于发酵的复合培养基

用于发酵的复合培养基包括:49.3g/L酵母提取物，0.61g/L MgSO₄*7H₂O,0.5g/LNH₄Cl,14.2g/L K₂HPO₄*3H₂O和10g/L葡萄糖。用于该发酵的补料由263g/L酵母提取物和133g/L葡萄糖组成。

表4用于发酵的基本培养基

对于分批阶段，两种基本培养基都添加30克/升葡萄糖。如果没有另外说明，进料具有与相应分批培养基相同的组成，但是含有300克/升的相应碳源。

含有氨苄青霉素和氯霉素的LB琼脂平板

LB琼脂平板是新倒的。培养基由10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L氯化钠和15g/L琼脂组成。高压灭菌后，向培养基中加入100μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml氯霉素。

发酵

如果没有另外说明，在本实施例1中，发酵在由来自Sartorius的Biostat B单元控制的1L搅拌玻璃生物反应器中进行。典型地，将pO2控制在30％，将培养温度设定在37℃，使用2M磷酸和25％氢氧化铵将pH值控制在7。除非另有说明，分批阶段之后是F0＝6g/L/和μ＝0.25/h的指数进料。出于实际原因，所有指数进料都由两个线性进料逼近。典型地，通过加入1mM IPTG进行产物表达的诱导，诱导后，采用10克/升/小时的恒定进料速率。细胞生物量是通过使用Thermo Scientific的Sorvall Evolution RC离心收集的。离心机装有SLC-6000转子，培养物以8500rpm和4℃离心30分钟。

生物质样品中产物的相对定量

在给定的时间点，将培养物样品稀释至OD₆₀₀为10倍，并将该稀释物的100微升等份的生物量沉淀。将沉淀重新悬浮在150μl(非还原性)Laemmli缓冲液中，并将样品在95℃下煮5分钟。在Novex的10％Bis-Tris凝胶上分析每种样品10μl。电泳分离在125伏下进行90分钟，凝胶用考马斯染色。对脱色的凝胶进行扫描，对应于SEQ ID NO:4多肽的前体的条带丰度通过密度测定法定量。为了进一步校正所利用的生物量的可变性，对应于SEQ ID NO:4多肽前体的条带的强度针对看家蛋白的强度标准化。

相对产物积累由对应于SEQ ID NO:4多肽前体的条带的增加(诱导前和诱导后)计算。值得注意的是，测量值代表比产率(即标准化为OD₆₀₀＝10)。对于给定发酵的绝对产量，必须考虑实际细胞密度(参见下文)。

生物质样品中产品的绝对定量

SEQ ID NO:4多肽前体的标准品获自European Brain Research Institute(EBRI,Rome,Italy)。标准品在Laemmli缓冲液中稀释至浓度为65μg/mL。EBRI定义了规定的蛋白质浓度。用260、520、780、1040和1300纳克的SEQ ID NO:4多肽前体标准品制备标准曲线。样品在与标准曲线相同的凝胶上进行分析，并考虑样品的稀释度来计算给定时间内产品的绝对产率。

实施例1的总结和结论

基于以上所述，可以得出结论，生产菌株(E5901-STRAIN，参见上文)成功地用于1L规模的发酵。虽然已经评估了不同培养基组合物促进细菌生长和产物表达的能力，但是补充有5g/L酵母提取物的基本培养基MM I被证明在表达产量和可获得的细胞密度方面是有利的。就产物形成而言，当使用或不使用抗生素(氨苄青霉素和氯霉素，数据未显示)进行主要培养时，未观察到显著差异。

实施例1可以放大，以便以工业规模生产多肽。

实施例2:实验室规模纯化，Capto MMC的建立

如实施例1所述在包涵体中获得本实施例中使用的SEQ ID NO:4前体。

基于现有技术的优化起点

一开始，本发明人推断，在没有相反指示的情况下，工艺的开发可以遵循文献中先前报道的神经生长因子纯化的基本方案。然而，同样记住的是，为了大规模的有效生产，应该考虑适合于以后扩大规模的调整。因此，基于Rattenholl等人(出处同前)、WO2013092776A1和其他出版物，SEQ ID NO:4的多肽同样可以至少在实验室规模的工艺中，通过其前体形式，采用使用胰蛋白酶的非特异性消化和随后的纯化来获得。推断SEQ ID NO:4的高纯度成熟多肽可以由此获得。然而，只有通过本实施例中报道的特异性调整和修饰才获得了高纯度的SEQ ID NO:4成熟多肽。因此才能够向有需要的受试者施用SEQ ID NO:4多肽，特别是考虑到如本文所述SEQ ID NO:4多肽的高纯度。

生产SEQ ID NO: 4多肽的设备

表5

实施例2中使用的设备列表。

根据本实施例的制造工艺的细节，包括在实施例2B中描述的改进，在图1的过程概述中给出。

除非另有说明，分析方法如上文“分析方法”一节所述。

实施例2A:基于先前描述的方案的纯化。

如实施例1所述生产表达SEQ ID NO:1多肽前体的大肠杆菌细胞(“生物量”)，通过加入溶菌酶和随后在冰上超声裂解细胞。包涵体(“IBs”)(1)从宿主细胞中提取，用6％Triton X100(在1.5M氯化钠，60mM EDTA中)洗涤，和(2)溶解在6M盐酸胍(“gHCl”)，0.1MTris-HCl pH 8.0，1mM EDTA，100mM(新鲜)DTT中。IBs在室温下溶解2h。然后，通过加入37％的盐酸将pH降至3-4。如此获得的包含SEQ ID NO:4多肽前体的溶解前体溶液(“溶解物”)对6M gHCl(pH3-4)透析。

SEQ ID NO:4多肽前体的重折叠在0.1M Tris-HCl、1M L-精氨酸、5mM EDTA、0.61克/升氧化谷胱甘肽和1.53克/升还原型谷胱甘肽pH9.5中在+4℃下进行。因此，每小时每毫升重折叠缓冲液加入50克蛋白质。重折叠后，用50mM磷酸钠(pH 7.0)透析反应。当交换缓冲液时，发生了显著的沉淀。

SEQ ID NO:4多肽前体通过一系列连续的阳离子交换色谱(SP Sepharose HP，用50mM磷酸钠pH 7.0操作，用氯化钠梯度洗脱)和随后的疏水相互作用色谱(苯基SepharoseHP，用50mM磷酸钠，1M硫酸铵pH7.0操作)纯化。随后，采用另一次透析将样品的缓冲液针对50mM磷酸钠(pH 7.0)交换(注意，这种第二次透析可以在实施例5的过程中省略)。同样，在缓冲液电导率降低的整个过程中，有大量的产物沉淀下来。

如此制备的SEQ ID NO:4多肽前体通过每250毫克pro-NGF加入1毫克胰蛋白酶进行有限的蛋白水解。SEQ ID NO:4多肽前体对蛋白酶的暴露在2-8℃下进行14小时。

成熟的神经生长因子最终在阳离子交换剂上精制(SP Sepharose XL，用50mM磷酸钠，pH 7.0操作，用氯化钠梯度洗脱)。最后，将产品浓缩至0.5-1毫克/毫升，并在<-65℃下冷冻。

实施例2B:改进

在下文中，描述了与实施例2A相比的几个改进，这些改进由本发明人在实现本发明的过程中进行了测试和实施。除非上下文另有规定，所有未明确指出的细节如上文针对实施例2A所述。

IB溶解的优化

虽然以前有报道称少量的IBs(例如从摇瓶培养物中获得的)容易溶解在增溶缓冲液中(6M gHCl，0.1M Tris-HCL，pH 8.0，1mM EDTA，100mM(新鲜)DTT)，但从高细胞密度发酵中获得的IBs不能完全拆分。本发明人可以通过向所述增溶缓冲液中加入2M脲来解决这一问题，这证明显著提高了溶解产率(数据未显示)。为免生疑问:除了6M gHCl和其他成分外，还存在2M的脲。

重折叠优化

最初是根据Rattenholl et al.(2001,Eur.J.Biochem,vol.268,p.3296-3303；Rattenholl,2001,Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctorrerum naturalium(Dr.rer.nat.)，但重要的是还考虑到后来(向上)的可扩展性，每升重折叠反应用200-500毫克SEQ ID NO:4多肽前体进行重折叠，优选每升重折叠反应200至300毫克SEQ ID NO:4多肽前体。这导致SEQ ID NO:4多肽前体溶解前体的产率相对较好。特别重要的是，考虑到与重折叠反应的体积相比神经生长因子的量如此增加，并且考虑到重折叠反应包含相对昂贵的成分，例如谷胱甘肽和精氨酸，每单位体积的重折叠反应中可以有相对更多的SEQ ID NO:4多肽前体被重折叠，这应该使得重折叠在经济上是可行的，在生产规模上也是可行的。

SEQ ID NO:4多肽前体的纯化

重折叠后，SEQ ID NO:4多肽前体的纯化通过利用pro-NGF相当高的等电点和使用阳离子交换固定相(即SP Sepharose)进行纯化的方法进行。为了运行这种类型的色谱，出于技术原因，重折叠缓冲液必须针对低电导率的缓冲液进行交换。在此过程中，大量SEQ IDNO:4多肽前体沉淀(数据未显示)。这一现象可归因于缓冲液中精氨酸浓度的降低。

因此，采取了一些措施来用不同的柱(具有不同选择性的柱)代替捕获柱，该柱可以更耐受重折叠反应中精氨酸的存在。在第一次尝试中，评估了几个固定相的性能，但是没有一个方法产生了有希望的结果(参见表6)。因此，用于捕获柱的固定相保留为前面的工艺所确定的。然而，由于SEQ ID NO:4多肽前体的高等电点(pI)，有可能提高运行缓冲液的电导率(通过添加250mM L-精氨酸)而不影响性能。由此，重折叠的SEQ ID NO:4多肽前体可以稳定到一定程度，并且沉淀前体的量减少(数据未示出)。

表6

上表:对各种选择条件测试对SEQ ID NO:4多肽前体的捕获及其评价。

关于混合模式色谱，发明人理解，然而不希望受限于特定的理论，SEQ ID NO:4多肽前体不能有效地从混合模式色谱中洗脱，而SEQ ID NO:4成熟多肽可以。

蛋白酶消化产生成熟的神经生长因子

为了制造SEQ ID NO:4的多肽，蛋白酶(胰蛋白酶)是必需的，因此推断理想情况下选择的特定胰蛋白酶应满足以下标准:

1.源于重组来源。无动物原料的认证对于随后要求的该工艺符合GMP至关重要。

2.胰蛋白酶的低副作用。值得注意的是，胰蛋白酶可以自溶。这一过程可能导致所谓的假胰蛋白酶，它具有拓宽的底物谱，并具有胰凝乳蛋白酶样活性。可加入Ca²⁺(如1mM氯化钙)以减少自溶。然而，现在通常采用“修饰的胰蛋白酶”进行每一个方案，这需要严格的序列特异性(例如用于肽指纹)。这种修饰的胰蛋白酶通常是通过酰化胰蛋白酶的暴露的赖氨酸残基ε-氨基获得的。

3.低批次间可变性，以实现可重现的生产工艺。或者，所选的酶应附有证明，说明相应批次的比活性。所需的酶量可能基于活性而不是质量。

尽管进行了全面的搜索，在商业市场上没有发现同时满足标准1和2的胰蛋白酶。推断标准1更重要。为了减少自溶，添加氯化钙可能就足够了。因此，罗氏公司生产的重组“GMP级”胰蛋白酶(Roche 06369880103,批号:11534700)被选为该工艺的原料。该酶在毕赤酵母中表达，其序列来源于欧亚野猪(Sus scrofa)。根据其证书，使用的胰蛋白酶批次的比活为4997单位/毫克(根据USP确定)。

胰蛋白酶消化前省略第二步纯化

在为预期的胰蛋白酶化寻找最佳酶/底物比的初始筛选中，使用从捕获柱(见上文)获得的SEQ ID NO:4多肽前体。与先前建立的方法(European Brain ResearchInstitute(EBRI)，细节未公开，基于Rattenholl et al.，出处同前)相反，本发明人决定在胰蛋白酶化之前不使用额外的疏水相互作用色谱。在胰蛋白酶化之前省略第二个柱纯化步骤的决定主要基于两条思路:一方面，根据SDS-PAGE，在捕获柱后获得的产物实际上已经是纯的。另一方面，胰蛋白酶消化本身可能有助于通过消化剩余的宿主细胞蛋白质(HCPs)来改善杂质谱。

表7总结了第一轮筛选的条件矩阵。胰蛋白酶消化的结果用12％SDS-PAGE进行了研究(数据未显示)。结果(数据未显示)表明胰蛋白酶消化在相当宽的酶/底物比范围内(即从1-5μg胰蛋白酶/375μg SEQ ID NO:4多肽前体)可重复地产生稳定的SEQ ID NO:4多肽。消化的时机不是很关键。因此，反应的停止和将反应装入精制柱所需的时间显然没有限制。这一发现特别重要，因为该反应无法在制备规模上适当地或经济地猝灭。

进行了一些额外的实验以针对设想的胰蛋白酶消化改进最佳酶/底物比，发现酶/底物比为1/100至1/200(蛋白质重量/蛋白质重量)，一方面可再现地获得SEQ ID NO:4多肽的良好产率，另一方面截短产物的获得量少。必须说明的是，在所用的条件下(即在2-8℃的磷酸盐/精氨酸缓冲液(pH 7.0)中并孵育(暴露于蛋白酶)2-6小时)，消化的质量并不高度依赖于酶/底物的比例。这一发现特别重要，因为潜在的酶消化易于在实验设置中发生微小变化(例如，由于批与批之间的可变性或酶的储存导致胰蛋白酶活性的改变；孵育步骤的时间和温度(暴露于蛋白酶)；蛋白质浓度测定中的误差)。此外，这也是为什么小规模扩展微调以进一步减少潜在截断产物似乎没有意义的原因。如果在小范围内确定了一个“最佳”条件，那么下次在更大规模重复几乎相同的消化过程时，仍然有很好的机会产生稍微改变的产品模式。

胰蛋白酶消化后进行精制色谱以获得纯多肽

与以前建立的方法(European Brain Research Institute(EBRI)，细节未公布，基于Rattenholl等人，出处同前)中使用SP Sepharose固定相精制成熟多肽(注意:SPSepharose是一种阳离子交换固定相)相反，这里基于以下考虑寻找更合适的固定相:为了有效地装载到SP Sepharose柱中，需要降低包含SEQ ID NO:4多肽前体的溶液的导电率，例如通过缓冲区交换。然而，众所周知(例如实施例2A)，溶液离子强度的降低确实会导致目标分子的沉淀，因此，应该避免将缓冲液交换成低电导率缓冲液。此外，阳离子交换固定相已经用于捕获SEQ ID NO:4多肽前体，并且为了实现剩余污染物的更好分离，正交选择性是优选的。第三个也是最后一个反对使用SP固定相纯化胰蛋白酶消化反应的论点是，SEQ IDNO:4多肽前体中的潜在剩余前体将与该柱结合，并可以仅仅通过洗脱选择性、而不是通过结合选择性而与SEQ ID NO:4成熟多肽分开。

为了建立这种正交精制柱用于纯化SEQ ID NO：4成熟多肽，第一种情况是使用疏水相互作用(HIC)柱。选择这种固定相不仅是为了具有正交选择性，也是因为不需要将缓冲液更换为低电导率缓冲液。尽管测试了几种HIC固定相和条件(例如分别用1M(NH₄)₂SO₄和0.5M(NH₄)₂SO₄,操作的苯基-和丁基-Sepharose)，但不能实施基于HIC的令人满意的精制步骤(数据未显示)。

然而，在抛光步骤的进一步实验设置中，测试了混合模式固定相Capto MMC，并且可以成功实施。发现在优化的条件下，固定相与SEQ ID NO:4多肽可逆地进行，并且可以通过增加pH值来洗脱产物(数据未显示)。相比之下，SEQ ID NO；4多肽前体不可逆地结合在固定相上，只能用1M氢氧化钠作为流动相洗脱(数据未显示)。此外，可以表明胰蛋白酶根本不结合在相同条件下操作的柱上(数据未显示)。这些结果提供了清晰的证据，表明Capto MMC固定相能够有效地将SEQ ID NO:4成熟多肽与胰蛋白酶和SEQ ID NO:4多肽的剩余前体分开。

建立额外的膜色谱

为了进一步消除内毒素和DNA，在工艺中包括了额外的阴离子交换膜。一般来说，众所周知，膜色谱的特征在于包含待分析或纯化的组分(在本发明中为SEQ ID NO:4多肽)的溶液通过通常带电荷的膜。为此目的，在本发明中，在图1所示的位置掺入了STIC膜(Sartorius,Goettingen,Germany)。可以证明，SEQ ID NO:4多肽不与膜结合，因此，提供了一个概念证明，即膜色谱法适用于纯化SEQ ID NO:4多肽。关于整个工艺(包括膜色谱)中结合的说明，见图1。

根据实施例2的工艺的再现性

为了探究该方法的稳健性，该方法进行了五次，并分析了所得级分的产率和纯度。在整个运行过程中，对工艺细节进行了稳定的优化，并采用了缓冲液成分、梯度等，直到最终优化的工艺细节(见图1)建立。结果表明，在实验室规模约50至100毫克SEQ ID NO:4多肽可以从一个一致的生产运行中产生。值得注意的是，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行考马斯氏染色或银染，获得的产物始终被发现是相对纯的(不到5％的污染宿主细胞蛋白和仅痕量的截短NGF，数据未显示)。

对于SEQ ID NO:4多肽前体没有建立有意义的SE-HPLC方法。相比之下，SEQ IDNO:4成熟多肽的SE-HPLC分析更加直接，并产生了约为16千道尔顿的均一产物峰，符合SEQID NO:4多肽的单体状态(数据未显示)。

总结和结论

对于这一过程，使用SP Sepharose FF(“FF”代表快速流动，即具有相对大颗粒的固定相)捕获重折叠的SEQ ID NO:4多肽前体，随后用胰蛋白酶处理以产生成熟的神经生长因子。为此，重折叠反应的精氨酸浓度从1M(现有技术推荐的)降低到350mM。

控制SEQ ID NO:4多肽前体的蛋白水解切割以产生SEQ ID NO:4成熟多肽被认为是该工艺中最关键的因素。在此，条件被确定为一方面可重复地促进高效裂解，另一方面防止NGF降解产物的形成。本文的实验数据表明，在相当宽的酶/底物比范围内，可以建立明显稳健的生产工艺。对于胰蛋白酶消化，步骤产率显然是好的，并且在工艺的这个阶段预计没有显著损失。获得的产物模式显然不强烈依赖于所用的反应条件(就酶/底物比和孵育时间(暴露于蛋白酶的时间)而言)。值得注意的是，即使预期酶精制的产率很好，需要处理至少2*x克SEQ ID NO:4多肽，以递送x克SEQ ID NO:4的成熟多肽。

根据本实施例的纯化是仅由两个色谱纯化步骤组成的贫过程。对现有的纯化工艺进行了进一步优化，并从几个方面进行了放大(见图1)。示例性的、先前使用的细胞破碎方法被高压均质化代替，并且所有的透析步骤可以被切向流过滤代替。由此建立的方法能够递送高纯度的SEQ ID NO:4多肽。

尽管存在上述挑战，但整个工艺似乎能够得到质量可接受的产品。

包含根据实施例2的改进的完整工艺，包括膜色谱，示意性地描绘在图1中。

实施例2可以放大，以便以工业规模生产所述多肽。

实施例3:体外和非人哺乳动物的概念证明

本发明部分基于皮肤溃疡两种动物模型的实验。在这些模型中，在糖尿病小鼠中通过圆形活检穿孔或通过压力加载循环诱导皮肤溃疡，并局部应用本发明的多肽。

本文报道了一项关于SEQ ID NO:4多肽对非人动物是给药研究。SEQ ID NO:4的多肽可通过如实施例1所述的表达和如实施例2所述的纯化以高纯度获得。

本实施例的目的是研究SEQ ID NO:4多肽的局部施用对糖尿病小鼠的伤口愈合、相关的组织病理学、疼痛阈值和血浆人神经生长因子(hNGF)水平的影响。参考化合物(人神经生长因子(SEQ ID NO:2)和鼠神经生长因子，其氨基酸序列可在公共资源中获得)也包括在研究中。

施用SEQ ID NO:4多肽的动物的特征在于如本文所述的皮肤病。所述动物代表患有糖尿病或易患糖尿病(例如1型糖尿病或2型糖尿病)的人的动物模型。

SEQ ID NO:4的多肽可以单剂量或重复剂量给药。SEQ ID NO:4的多肽可以给患有糖尿病性溃疡的受试者，糖尿病性神经病性足部溃疡的动物模型(DFU)施用。

该实施例包括以下部分:

实施例3A:体外PC12神经突起伸长试验。本节的目的是确定SEQ ID NO:4多肽的效力。为此，在神经生长因子敏感细胞(PC12)中使用了常规的体外神经突起延长试验。

实施例3B:体内效力研究。本节的目的是确定局部应用SEQ ID NO:4多肽是否改善糖尿病小鼠的伤口愈合(手术损伤)。

包括下列群体:

-db/db，完好 N＝8，每个时间点

-db/db，伤口+媒介物 N＝8，每次

-db/db，伤口+SEQ ID NO:4的多肽、1μg/天；N＝8，每个时间点

-db/db，伤口+SEQ ID NO:4的多肽、10μg/天；N＝8，每个时间点

-db/db，伤口+SEQ ID NO:4的多肽、30μg/天；N＝8，每个时间点

-db/db，伤口+hNGF，10μg/天 N＝8，每个时间点

-db/db，伤口+mNGF，10μg/天 N＝8，每个时间点(以μg为单位的剂量是指每个伤口给药的相应剂量(每只动物有一个伤口)

在本部分研究中，在伤口诱导后7天和30天处死动物，终点如下:闭合时间；病变的组织学(4例)和免疫组织化学(4例)。

实施例3C:机制:探索性研究。本节的目的是探索支持SEQ ID NO:4多肽对糖尿病小鼠的伤口愈合的积极作用的分子机制，侧重于炎症、细胞外基质沉积、神经支配、血管生成。

包括下列群体:

- db/db，完好 N＝6

- db/db，伤口+媒介 N＝6

- db/db，伤口+SEQ ID NO: 4的多肽，1μg/天 N＝6

- db/db，伤口+SEQ ID NO: 4的多肽、10μg/天 N＝6

- db/db，伤口+SEQ ID NO: 4的多肽，30μg/天 N＝6

- db/db，伤口+ hNGF，10μg/天 N＝6

- db/db，伤口+ mNGF，10μg/天 N＝6

(以μg为单位的剂量是指每个伤口给药的相应剂量(每只动物有一个伤口)

在研究的这一部分中，在伤口诱导后14天处死动物，对应于50％的伤口愈合，具有以下终点:针对编码涉及细胞外基质生物学(84)、血管生成(84)、生长因子和神经营养因子生物学(84)的蛋白质的mRNA(N＝252)的表达和调节，探索导致SEQ ID NO:4多肽治疗效果的可能机制。

本实施例中的材料和方法

动物和监控

在8-12周龄时使用糖尿病自发突变纯合的小鼠(Leprdb)(遗传背景C57BL/6J)和来自相同群体的相应杂合子对照(Charles River Laboratories-Calco-Lecco,T/BKS.CG-M+/+LEPR DB/J和S/BKS.CG-M DB/+)。群体构成和动物处死见引言。

动物被关在一个笼子里，食物颗粒和水随意，暗-亮周期为12小时。本文描述的所有动物实验方案均根据European Community Council Directives(2010/63/EU)进行,并经the Ministry of Health(n°350/2015-PB)批准，符合the NIH Guide for the Careand Use of Laboratory Animals中公布的指南。

在治疗前、最后一次治疗后的第二天和处死前测量血糖水平(Contour XT,Bayer,Basel,Switzerland)。

表7 8天队列试验时间表

30天队列的试验计划:

第一周:与8天队列一样

然后:处死前每周两次拍照

第28天的血糖

第29天处死

在这个例子中，实验被表示为“8天”和“30天”队列，指示了如实验时间表中报告的测试或处死的天数。

病变、药物治疗和监测。

通过在小鼠背部中部进行皮肤穿刺活检，形成直径为6毫米的圆形全厚度伤口。简而言之，动物被异氟烷(+2l/min O2)深度麻醉。背部皮肤用上蜡化妆品刮过，用4％Clorexidina("Clorexyderm"I.C.F.srl Industria Chimica Fine-CR-Italy)或10％碘伏维酮("Poviderm"Nuova Farmec srl-VR-Italy)消毒。使用直径为6毫米的无菌穿孔活检工具在动物背部形成全层开放性伤口。伤口区域立即用半封闭的Tegaderm药物(TegadermRoll-3M Health Care,St.Paul,MN,USA)覆盖，在胸部周围形成1.5厘米厚的带，使小鼠不能啃咬敷料。在伤后第0-6天，使用26号针头通过Tegaderm向伤口床注入50μl药物。值得注意的是，Tegaderm敷料完全防止了溶液从病变处泄漏。

直径为6毫米的圆形全厚度伤口的表面积为28.26平方毫米。

在此基础上，给予动物的剂量如下:

1μg剂量:0.0035μg/mm²

10μg剂量:0.35μg/mm²

30μg剂量:1.05μg/mm²

每天监测动物的敷料完整性和无感染情况。所有动物每周更换一次Tegaderm，直到伤口完全愈合。

然后在第一周期间拍摄伤口照片(包括尺子)，并通过计算机图像分析(NISElements,Nikon)测量损伤区域三次，然后每周两次，直到实验结束。

SEQ ID NO:4多肽的给药

SEQ ID NO:4的多肽在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，并分成每日等份。所有程序都在冰中进行，最终的等分试样储存在-80℃。

人神经生长因子(重组hNGF，大肠杆菌，目录号：N-245，Alomone,Jerusalem,Israel)和重组小鼠神经生长因子(mNGF，目录号:1156-NG，R&D System)用作对照NGF。

从伤口诱导日开始，试验化合物每天给药进行7天。用26号针头将每种浓度的50μ测试化合物溶液注射到伤口区域的Tegaderm带下。Tegaderm弹性允许在针头缩回后密封针孔，没有观察到液体溶液的泄漏。

疼痛阈值监测

热痛觉过敏在自由活动的动物中通过Hargreave的方法使用热足底测试仪器(Thermal Plantar Test Instrument)(Ugo Basile-Comerio,Varese)进行评估。让动物在仪器的有机玻璃盒中适应15分钟。将恒定强度的辐射热源(光束直径0.5厘米，强度25I.R.)置于后爪下，记录从辐射加热开始到爪收回的收回延迟时间(秒)。四个测量值的平均值用于统计分析。在第-3天(手术前)和第7天(最后一次施用测试化合物后24小时)对动物进行足底测试(Plantar Test)。

组织收集和处理

处死当天，小鼠被深度麻醉(异氟烷+2l/min O2)，并从伤口区域采集皮肤样本(1cm×1cm)。对于研究B，在每组中收集4个样本用于免疫组织化学，收集4个样本用于组织学。对于研究C，用切除冲头取6毫米的皮肤区域(伤口区域)，在此周围取一个8毫米的环(伤口周边区域)，并从完整皮肤中取一个6毫米的区域。

为组织学收集的样品被包埋在石蜡中，切片并用苏木精和曙红(H&E)染色；收集用于免疫组织化学的样品进行后固定，在蔗糖PBS中洗涤，冷冻切片并处理用于间接免疫荧光。

免疫组织化学和定量分析

将皮肤浸泡在4％多聚甲醛(w/v)和苦味酸饱和水溶液(在0.1M缓冲液pH 7中)中24小时，然后在0.1M磷酸盐缓冲液的5％蔗糖中洗涤至少48小时。在CO2中冷冻后，使用低温恒温器(HM550 Microm，Bio-Optica)切割切片(14微米厚)。切片收集在明胶包被的载玻片上，首先在0.1M的PBS中室温孵育20分钟，然后在4℃的潮湿气氛中与0.3％的PBS-Triton X-100v/v中稀释的一抗孵育过夜。本研究中使用了以下抗血清:层粘连蛋白(兔，Sigma，1:1000)；蛋白质基因产物9.5(PGP-9.5)(兔，Boheringer,1:2000)。在PBS中冲洗20分钟(2x10分钟)后，将切片在潮湿的空气中采用于37℃孵育30分钟，将二级抗血清用与Rhodamine Red^TM-X缀合的亲和力纯的Donkey抗兔IgG(Jackson Immunoresearch)缀合的次级抗血清。稀释在PBS triton 0.3％中。然后切片在PBS中漂洗(如上)，并固定在含有1，4-苯基二胺(0.1g/l)的甘油中。

免疫组织学图像由配备了数字式CCD相机Q Imaging Retiga-2000RV(Q Imaging,Surrey,BC,Canada)捕获。使用Nis-Elements AR 3.2软件进行分析。在皮肤损伤诱导后7天和30天，层粘连蛋白和PGP9.5免疫反应面积计算为表皮层的分数(百分比)。发芽指数通过观察PGP9.5 IRIR接近溃疡边缘的切片数来估计。对于所有的形态学分析，为每只动物和两个水平/动物分析了五幅图像。所有分析均以盲法进行。平均值/动物用于统计分析。

hNGF定量

将血液收集在EDTA-K2真空试管中，在30分钟内，在4℃下以3000×g离心10分钟。收集血浆，分装在聚丙烯试管中，并在-80℃下储存，直至使用。

试剂盒Human Adipokine Magnetic Bead Panel 2(HADK2MAG-61K,EMDMillipore Coorporation,Billerica,MA,USA)用于使用xMAP技术和MAGPIX Luminex平台定量血浆样品中的hNGF。该技术基于使用与特定蛋白质特异性的单克隆抗体缀合的不同群体的彩色编码珠，从而允许从少量样品中以高灵敏度同时捕获和检测特定分析物。我们使用了一种简单的试剂盒，只包括与人NGF-β单克隆抗体结合的一个珠群。检测是按照制造商的说明书进行的，只做了微小的修改。

简而言之，在室温下将特异性人神经生长因子-β单克隆抗体缀合的珠群与血浆样品(25μl)孵育过夜后，首先洗涤珠，并在室温下用检测抗体溶液孵育1小时，然后在室温下用链霉亲和素-藻红蛋白缀合溶液孵育30分钟。洗涤后，将珠子重新悬浮在100微升驱动液中，并在MAGPIX仪器上读取。数据用xPONENT软件分析，结果用pg/mL表示。我们获得了所有样品的标准曲线动态范围内的值(从10000到0，128pg/ml)。标准曲线的相关系数(R2)值>0.98。通过试剂盒中质量控制溶液(QC1和QC2)获得的值进一步验证了所得结果的准确性，这些值在试剂盒制造商规定的范围内。人NGF-β的检出限为0.3-0.7pg/mL。

选择这种检测方法是因为与其他ELISA方法相比，它对hNGF具有较高的灵敏度和特异性。

PC12培养和治疗

细胞在T25cm2烧瓶(NUNC)中的培养基(DMEM，马血清10％，胎牛血清5％，pen/strep 1x)中保持标准培养条件。在至少两次传代后，将细胞接种(1000个细胞/孔)在细胞培养物处理的96孔平底细胞板(NUNC)上。体外培养(DIV)1天后，取出培养基，将细胞保存在剥夺培养基中(DMEM，马血清1％，胎牛血清0.5％，pen/strep 1x)。在血清缺失后24小时，用三种不同浓度的所有测试化合物(50、100和200nM)处理细胞。在2个DIVs后更换培养基，在DIV 7将细胞固定并通过使用间接免疫荧光对β-III-微管蛋白抗原进行染色(图1)。

免疫细胞化学

在7DIV时，细胞用冷的4％多聚甲醛固定20分钟。用封闭溶液(PBS，triton X-1000.3％，BSA1％和驴正常血清1％)处理1小时后，将细胞与初级抗血清(小鼠抗β-III-微管蛋白，1:1000；R&D)在4℃过夜。然后将细胞与次级抗小鼠抗体(驴抗小鼠Alexa-488缀合物；1:500；Jackson)在37℃下30分钟。最后，将细胞与核染料Hoechst33258在室温下孵育20分钟。

基于细胞的高含量筛选分析

用Cell Insight^TMCX5 High Content Screening(HCS；Thermo Scientific)，使用Neuronal Profiling BioApplication进行神经突起延伸分析。该软件能够通过核染料荧光识别每个孔中的每个细胞。每个细胞核都被识别为一个物体，每个物体对应一个细胞。该系统识别细胞核周围的绿色荧光(β-III-微管蛋白免疫反应性)，从而识别细胞体。神经元作图分析工具能够识别和跟踪从每个细胞体出现的所有神经炎。这允许计数和测量来自每个细胞的所有神经炎。细胞聚集体不被识别为单个细胞维度对象，因此被排除在分析之外。

分析了2000-4000个单细胞/孔和6个孔/处理。

逆转录聚合酶链反应

采用探索性策略进行支持SEQ ID NO:4多肽对糖尿病小鼠中伤口愈合的积极作用的可能机制探索性研究(使用RT2 Profiler PCR Arrays进行聚焦途径的基因表达分析)，并聚焦于50％修复过程中伤口愈合所涉及的主要分子路径，例如血管生成、细胞外基质和粘附蛋白、生长因子。从损伤的核心(直径6毫米)收集样品，从所有动物(每组6只动物)中提取RNA，定量(Nanodrop 2000分光光度计)并汇集(每只动物100纳克)。因此，每组600纳克的RNA用于反转录。

使用CFX96实时聚合酶链反应仪(BioRad)对每组进行单聚合酶链反应阵列。对于所有的平板使用相同的阈值，通过2-ΔΔCq比较方法计算基因的相对表达。根据制造商的说明，使用RT2第一链试剂盒(QIAGEN)合成的cDNA，使用小鼠血管生成、细胞外基质和粘附蛋白(ECM)和生长因子(GFs)Rt2 Profiler^TM阵列(QIAGEN)来分析血管生成、细胞外基质和GFs(各84个基因)中涉及的250个关键基因的表达。

结果

结果按以下顺序显示:

-PC12体外试验

-功效，8天

-功效，30天

-机制，14天

实施例3A:体外PC12神经突起延伸试验

在体外测试SEQ ID NO:4多肽对PC12细胞的功效(实验设计见图1)，通过基于细胞的高含量筛选，使用以下参数测量神经突起延伸:

-平均神经突起平均长度:代表每个细胞的平均神经突起长度；

-平均神经突起总长度:代表每个细胞的神经突起总长度；

-％高神经突起最大长度:表示显示神经突起等于或长于细胞体长度的细胞百分比。

首先，对所有试验化合物剂量进行分析，并与媒介物组进行比较(数据未显示)。在本报告中，仅显示了每种试验化合物的更有效剂量的结果(图1)。暴露于所有试验化合物有效剂量的细胞显示平均神经突起平均长度增加(A；mNGF,P＝0.0394；hNGF,P＝0.0196；SEQID NO:4多肽,P＝0.0033)和平均神经突起总长度增加(B；mNGF,P＝0.0338；hNGF,P＝0.0006；SEQ ID NO:4多肽,P＝0.0211；Aloe,P<0.0001)。只有SEQ ID NO:4的多肽(P＝0.0367)能够增加显示长神经炎的细胞的百分比。

实施例3B:疗效研究，8天队列。

动物监控

在伤口形成之前，对动物的血糖水平进行监测。结果如图3所示。如试点研究中测量的，糖尿病小鼠的血糖水平高于对照动物。在分配到不同实验组的动物中没有观察到差异。

图4报告了损伤后第0天和第7天之间的体重增加。无论是根据时间(第0天对比第7天)还是根据治疗，都没有观察到差异。

痛觉过敏

在第3天(皮肤损伤前)和最后一次施用试验化合物后的那天(第7天)，使用热足底测试仪(Thermal Plantar Test Instrument)，通过Hargreave氏方法对自由活动的动物进行热痛觉过敏评估。结果如图5所示。在第0天，各组之间没有观察到差异。通过比较相同处理组在第0天和第7天的平均爪缩回潜伏期，在第7天观察到用hNGF处理的动物的爪缩回潜伏期显著降低。在其他组中没有观察到对热刺激的痛觉过敏。值得注意的是，在经SEQ IDNO:4多肽处理的小鼠中第7观察到更高的阈值-，表明该组的疼痛阈值较高。

关闭时间

通过肉眼观察照片进行伤口愈合评估，照片从第0天(手术日)开始，在第一周内每两天拍摄一次。使用NIS元素(尼康)在这些伤口图像上测量“愈合时间”。结果报告在图6中，其中绘制了外部和内部区域。双向方差分析表明时间效应(F(4，203)＝41.25，p<0.0001)和群体效应(F(5，203)＝2.565，P＝0.0282)。

图7报告了第7天的关闭时间。尽管在经SEQ ID NO:4多肽治疗的组中观察到促进伤口愈合的剂量依赖性趋势，但是在各组之间没有观察到差异

神经生长因子血浆水平

在处死时采集血液，因此是在最后一次施用试验化合物后48小时。使用能够检测人神经生长因子、鼠神经生长因子以及根据SEQ ID NO:4的多肽的抗体通过基于抗体的测定法确定NGF血浆水平。这里，如此确定的神经生长因子血浆水平被称为“总NGF血浆水平”。结果如图8所示。在接受治疗的小鼠中观察到总神经生长因子血浆水平的剂量依赖性增加，达到高于350pg/ml的值。此外，在mNGF处理组中也观察到了增加。这并不奇怪，因为用于治疗的重组小鼠NGF-β是两种氨基酸多肽的同二聚体，在氨基酸水平上与人神经生长因子具有约90％的同一性，并被同一抗体识别。

实施例3C:疗效研究，30天队列。

动物监控

在伤口产生前、试验化合物给药结束后和处死时，监测动物的血糖水平。结果如图9所示。在所有实验组的28天观察中，我们观察到血糖水平逐渐升高。各处理组在不同时间无差异。

图10报告了损伤后第0天和第28天之间的体重增加。无论是根据时间还是根据治疗，都没有观察到差异。

痛觉过敏

在第-3天(皮肤损伤前)和第7天，即最后一次应用神经生长因子后24小时，使用热足底测试仪，通过Hargreave方法评估自由活动动物的热痛觉过敏。结果如图11所示。在第0天，各组之间没有观察到差异。通过比较相同处理组中第0天和第7天的潜伏期，在hNGF处理的动物中，在第7天观察到爪缩回潜伏期降低的不显著趋势。然而，当第8天和第30天队列的数据汇集在一起时，在用hNGF治疗的动物中观察到疼痛阈值显著降低，因此表明这种hNGF制剂诱导痛觉过敏。在其他组中没有观察到差异。结果如图12所示。

闭合时间

在从第-3天(手术日)开始的第一周内，通过每两天拍摄照片进行宏观观察来进行伤口愈合评估，然后每周两次，直到处死。使用NIS要素(尼康)在这些伤口图像上测量“闭合时间”。

“闭合时间”的各数据以表格形式显示(图13)。图14中绘出了连续的外部伤口面积测量值随时间的作图。双向方差分析表明时间效应(F(50，434)＝417.3，p<0.0001)，治疗效应(F(5，434)＝21.45，p<0.0001)，以及治疗和时间之间的相互作用(F(50，434)＝1.638，p＝0.0055)。

与用媒介物治疗的动物相比，在用SEQ ID NO:4多肽治疗的小鼠中，伤口愈合的速率以剂量依赖的方式显著加快。

图15报告了第8天的闭合时间，其中汇集了第8天和第30天队列的数据。与媒介物治疗组相比，在用SEQ ID NO:4多肽以30μg/天治疗的组中观察到在此时间伤口愈合的显著降低。

神经生长因子血浆水平

处死时采集血液。使用能够检测人神经生长因子、鼠神经生长因子以及SEQ IDNO:4多肽的抗体通过基于抗体的测定法测定NGF血浆水平。这里，如此测定的神经生长因子血浆水平被称为“总NGF血浆水平”。结果如图16所示。总NGF血浆水平非常低(与图8相比)，不高于10pg/ml，且在所有组中相似。

组织学(第8天和第30天)(另见初步研究报告)

包含溃疡区域的皮肤样品(包括5毫米完整皮肤边缘)被切下，包埋在石蜡中，并根据图17B所示的方案连续切片。然后对切片进行染色(苏木精-伊红)，并在图17A中报告了伤口不同水平的代表性低倍图像。高倍显微照片显示了伤口边缘的再上皮化过程(图17C)，其中表皮迁移舌(epidermis migrating tongue，MET)是明显的，表皮层下真皮中广泛的肉芽组织，其特征为炎症、细胞增殖、基质沉积(图17D)和血管生成(图17E)。通过测量表皮层厚度来评估再上皮化。来自完整动物、经媒介物、SEQ ID NO:4多肽1μg/天、SEQ ID NO:4多肽30μg/天处理的小鼠的代表性图像显示在图18中。SEQ ID NO:4的多肽诱导表皮层的剂量依赖性增厚，这种增厚程度明显高于完整皮肤。表皮基底层的特征是基底层和棘层细胞过多，这可能反映了细胞增殖的增加。此外，真皮也更厚且染色强烈，表明细胞外基质沉积更高，并且根据剂量富集了皮肤附件(腺体和毛囊)。图表中显示了所有组的表皮厚度。SEQ IDNO:4的多肽诱导了表皮层的剂量依赖性增厚，比媒介物组厚得多。mNGF合hNGF也诱导相同的效应，与经SEQ ID NO:4的多肽处理的剂量匹配组相当。

免疫组织化学(第8天和第30天)

通过蛋白PGP9.5的免疫染色分析皮肤神经再支配，其中PGP9.5是一种高度敏感的神经外胚层标记物，广泛用于可视化皮肤神经支配。图19显示了皮肤神经再支配的解剖结构，其中显示了完整小鼠皮肤中的OGO9.5-IR纤维。特别是，皮下、深层皮肤和表皮下丛可见；表皮下神经丛为表皮提供表皮游离神经末梢。

局部应用SEQ ID NO:4多肽对修复皮肤中的神经再生长的效果在损伤后第8天在损伤边缘使用“出芽指数”和修复区域的表皮和真皮中的PGP9.5-IR进行分析。代表性图像如图20所示。小图A、B和C显示了完整动物、媒介物和SEQ ID NO:4多肽30μg/天处理的小鼠中在30天时的PGP9.5-IR。形态计量分析的结果如图21所示。30μg/天施用SEQ ID NO；4的多肽在第8天诱导了出芽的显著增加，如hNGF。在第30天，虽然在媒介物处理的动物中神经支配尚未恢复，但是在施用SEQ ID NO:4(所有剂量)和mNGF多肽后没有观察到完整和经NGF处理的动物之间的差异。相反，用hNGF可以观察到过度的神经支配。

局部施用SEQ ID NO:4多肽对血管生成的效果使用层粘连蛋白作为标记来估计。层粘连蛋白是一种基膜标记物，因此可以标记皮肤中的几种结构，包括内皮细胞。其他内皮标记物，如PECAM(也称为CD31)、血管性血友病因子、胶原蛋白，提供的染色不适合在本研究中使用的固定条件下定量。代表性图像如图22所示。小图A显示了传统组织学观察的表皮层。箭头表示基底层。小图B显示了表皮下的基膜(箭头)；小图C显示了源自室管膜下神经丛的表皮感觉神经支配；小图D显示了8天(E)和皮肤修复后(F)的溃疡边缘和相关神经支配。小图G-I显示了第8天(G,EE；H,层粘连蛋白-IR)和第30天(I)的血管生成。

形态计量分析的结果如图23所示。SEQ ID NO:4多肽以30μg/天施用在第8天诱导了层粘连蛋白-IR的显著增加，如hNGF，在第30天时仍存在，可能反映了正在进行的血管生成。

机制:探究性学习

基因表达调控

本研究的目的是探索支持SEQ ID NO:4多肽对糖尿病小鼠伤口愈合的积极作用，侧重于炎症、细胞外基质沉积、神经支配、血管生成。一种探索性策略(使用RT2 Profiler聚合酶链反应阵列的路径聚焦基因表达分析)已被用于在修复过程的50％确定伤口中的主要分子路径。小鼠血管生成、细胞外基质和粘附蛋白(ECM)和生长因子(GFs)Rt2 Profiler^TM用于分析血管生成、细胞外基质和GFs中涉及的252个关键基因(每种84个基因)的表达。

每组(血管生成、细胞外基质、生长因子)的表达分析如下:

-基因清单；

-热图提供了重叠在聚合酶链反应阵列板展示上的两组之间的调节表达倍数数据的图形表示；

-散点图，比较两组之间阵列上每个基因的标准化表达，通过将它们相对于彼此作图来快速观察大的基因表达变化，以及表达变化大于所选边界(≥3)的基因列表。

散点图说明了如下的组比较:

-db/db对比WT小鼠(WT作为对照组)

-db/db媒介物对比db/db完整(db/db完整作为对照组)

-db/db神经生长因子(SEQ ID NO:多肽,mNGF,hNGF)对比db/db媒介物(db/db媒介物作为对照组)

-db/db神经生长因子(SEQ ID NO:多肽,mNGF,hNGF)对比db/db完整(db/db完整作为对照组)

结果被评估为细胞外基质和粘附分子以及生长因子和神经营养因子(图中未显示)。

根据目前的分析，主要结果和结论如下:

基因型效应:

-db/db完整对比WT完整之间的比较表明，根据基因型，许多血管生成和细胞外基质基因受到差异调节，而极少的GF基因被差异表达，因此表明，对于伤口修复而言，细胞外基质和血管生成是主要受糖尿病状况影响的过程；

-db/db中的损伤效应；

-病变诱导许多血管生成和细胞外基质基因的下调，以及少数GF基因的上调，由此表明细胞外基质和血管生成也是糖尿病小鼠中驱动伤口修复的主要过程；

-SEQ ID NO:4多肽在db/db中发挥作用(相对于媒介物)；

-SEQ ID NO:4多肽下调几个基因，包括:血管生成:akt、Ccl2(趋化因子(C-C基序)配体2)、Ctgf(结缔组织生长因子)、Hif1a、MMP14、thbs2(血小板反应蛋白2)；

-SEQ ID NO:4多肽上调几个基因，其中一些基因也受hNGF和mNGF的调节；

-SEQ ID NO:4多肽不调控GF基因，其中一部分受hNGF和mNGF调控。

还进行了STRING分析(数据未显示)。STRING是已知和预测的蛋白质相互作用的生物数据库和网络资源，广泛用于搜索差异表达基因之间的相互作用关系。STRING软件的“聚类”分析是基于不同阵列中调节的所有基因。

结论

这个例子的主要结论如下:

1.PC12细胞偶联HCS作为一种分析方法是一种评估SEQ ID NO:4多肽体外功效的合适方法；

2.SEQ ID NO:4多肽以剂量依赖的方式促进伤口愈合。

3.SEQ ID NO:4多肽强烈增加表皮层修复并诱导厚度强烈增加；SEQ ID NO:4多肽还积极影响神经再支配和血管发生(通过层粘连蛋白-IR评估)。经SEQ ID NO:4多肽治疗的小鼠中的所有这些参数都高于对照的完整小鼠，因此表明伤口愈合的再模式化阶段必须在进一步的研究中进行评估。

4.探索性研究表明，AKT-mTOR通路可能参与了SEQ ID NO:4多肽的效果。Akt和mTOR被认为是生存和细胞生长的促进剂，已经表明PI3K-Akt-mTOR信号轴的瞬时药理学激活可能代表一种新的临床干预策略来加速愈合。值得注意的是，AKT-mTOR通路受损被认为是糖尿病小鼠伤口愈合受损的可能原因，并且AKT-mTOR通路已被证明通过几种分子参与促进伤口愈合，如糖尿病小鼠中的三七皂苷Ft1、乙酰甘露聚糖、SR-0379、microRNA-99家族。

因此，SEQ ID NO:4多肽是一种重组蛋白，其多肽序列与人神经生长因子相似，但具有至少一个突变，使其无痛(hNGFp)并具有治疗效果。

表8

上表:PC12细胞中体外神经突起延伸试验的实验设计。详情请见方法

实施例4:概念证明:小鼠中压力溃疡模型

本文报道了一项关于SEQ ID NO:4多肽对非人动物施用的研究。SEQ ID NO:4的多肽可通过如实施例1所述的表达和如实施例2所述的纯化以高纯度获得。

方法

实验中包括对照组(C57BL6，白化)和遗传性糖尿病C57BL/KsJ-m+/+Leprdb(db/db)雄性小鼠，Jackson laboratories，8-10周龄。在气体麻醉下，动物背部被剃光，剃光的区域被彻底清洁以防止皮肤刺激。提起皮肤褶皱，将两个直径为12毫米、厚度为5.0毫米、平均重量为2.4克、磁力为1000G的磁性陶瓷盘(Magnetic Fountain,Castle Rock,CO)施加到皮肤上，在两个磁体之间留下大约5.0毫米的皮肤“桥”。这一过程在两块板之间产生50毫米汞柱的压力，这已被证明是造成局部组织缺血所必需的(Peirce et al.,2000,WoundRepair Regen.,vol.8,p.68-76.)。应用三个周期的缺血-再灌注(I/R)诱导形成2个相同严重程度的溃疡。I/R的单个周期包括从上午8:00开始的12小时施加磁体期，随后是12小时的无磁体休息期。在I/R周期结束后3天开始用媒介物和试验化合物进行治疗，以便能够对溃疡进行手术刮除，包括去除纤维蛋白渗出物和坏死组织。

其中一些小鼠接受了SEQ ID NO:4多肽(也可称为重组人突变型无痛神经生长因子，hNGFp))的研究性处理。具体而言，对以下实验组进行了研究:

-db/db，媒介物

-db/db，SEQ ID NO:4多肽，1μg/cm²/天

-db/db，SEQ ID NO:4多肽，10μg/cm²/天

-db/db，SEQ ID NO:4多肽，100μg/cm²/天。

连续14天每天继续治疗，然后每周治疗两次，直到以相同剂量(根据治疗时间点溃疡大小计算的剂量)结束。通过目测监测溃疡以确定愈合日期。此外，当溃疡每周用药两次时，拍摄包括尺子在内的伤口照片，并通过计算机图像分析来测量病变区域。压力溃疡评估是根据标准化的尺度和通过计算机图像分析测量伤口面积来进行的。

用Bioseb的电子冯弗雷仪(一种能够测定啮齿动物机械痛敏阈值的电子仪器)在受伤部位评估自由活动的动物中该化合物对痛敏阈值的效果。

病变的组织学、神经支配和血管生成将通过组织学和免疫组织化学以及计算机图像分析进行分析。

结果

将磁铁放在糖尿病小鼠背部的皮肤褶皱上，会对受压部位的整个皮肤表皮组织造成不可逆的损伤。目测(坏死和出血区域的存在)和组织学分析都证实，3个I/R周期能够诱发类似压迫溃疡的病变。

在用SEQ ID NO:4的多肽处理的所有组中，与媒介物处理的动物相比，伤口愈合的速度加快。在经SEQ ID NO:4多肽处理的动物中溃疡的闭合从第17天和第21天开始比较明显，而经媒介物处理的动物从第23天开始经历愈合。

在第28天，观察的最后一天，在80％以上的经SEQ ID NO:4多肽处理的动物中皮肤溃疡完全闭合；如图25所示；与媒介物处理的动物相比，在所有剂量的SEQ ID NO:4多肽中效果都具有统计学显著性，前一组中愈合概率小于60％。这些数据与文献证据一致，后者表明在糖尿病动物模型中伤口愈合速率受损，所述数据与外科溃疡模型中产生的数据(实施例3)一起表明了SEQ ID NO:4多肽可能使糖尿病小鼠的延迟愈合过程正常化。

除了对伤口愈合的积极作用之外，组织学和免疫组织化学数据进一步证明了SEQID NO:4多肽具有提高愈合受损的糖尿病小鼠的伤口愈合参数程度的生物学能力。在组织学水平上，在修复区域，在用SEQ ID NO:4多肽处理后观察到完全再上皮化和正常皮肤解剖学的恢复。免疫组织化学显示SEQ ID NO:4多肽还积极影响神经再支配(如通过表皮内PGP9.5免疫反应性测定的)和新血管生成(如通过真皮内PECAM免疫反应性测定的)(图26A和B)。

由于已报道野生型神经生长因子可增加给药部位的疼痛敏感性，因此通过在溃疡边缘施加机械刺激，在用SEQ ID NO:4多肽处理连续14天后评估疼痛机械阈值。与经赋形剂治疗的糖尿病小鼠相比，没有观察到疼痛机械阈值的改变，这表明慢性局部治疗后SEQ IDNO:4多肽可在大剂量间隔内对皮肤产生积极的营养作用，而不会引起伤害感受器过敏(图27)。

实施例5：随机化、双盲的、采用安慰剂对照的研究，用于在患有糖尿病性神经病性足部溃疡(DFU)的受试者中单次和重复递增剂量后调查SEQ ID NO:4多肽的安全性、耐受性、药代动力学和药效学特征。

此处报道了一项关于在患有糖尿病性神经病性足部溃疡(DFU)的参与者中以单次和重复递增剂量施用SEQ ID NO:4的研究。参与者是人受试者。

本实施例中描述的试验已获得相关当局的伦理批准。

SEQ ID NO:4的多肽也可称为重组人突变型无痛神经生长因子(hNGFp)。SEQ IDNO:4的多肽也称为“重组人神经生长因子(RHNGF)”或“SUB77552”，全分子式为C580H895N163O176S8。SEQ ID NO:4的多肽可从生物/生物技术来源获得(AdvancedTherapy IMP(ATIMP)除外)。它是一种重组药物产品(也参见实施例1)。更具体地，SEQ IDNO:4多肽可通过实施例1所述的表达和实施例2所述的纯化获得。特别地，如实施例2中所述可获得的高纯度，优选在GMP标准下，使得能够使用SEQ ID NO:4作为药物。

如本实施例中所用，SEQ ID NO:4多肽是一种研究用药品(IMP)。根据指令2001/20/EC，“IMP”是“在临床试验中被测试或用作参考的活性物质或安慰剂的药物形式，包括已经获得上市授权但以不同于授权形式的方式使用或组装(配制或包装)的产品，或用于未经授权的适应症，或用于获得关于授权形式的进一步信息的产品。”此处，SEQ ID NO:4多肽是一种用于人类首次临床试验的IMP。因此，本实施例描述了人类首次临床试验。没有鉴定到根据人类首次使用指南的任何风险因素。

本实施例中所用的IMP是以1毫克/毫升SEQ ID NO:4多肽制备的hNGFp的澄清无色溶液。SEQ ID NO:4的多肽被调节到所需浓度，并装入玻璃瓶中。溶液的浓度为1毫克/毫升。

SEQ ID NO:4的多肽被施用给有此需要的人。所述SEQ ID NO:4多肽作为皮肤溶液给药。这不是特定的儿科配方。

需要施用SEQ ID NO:4多肽的人类受试者是患有糖尿病性神经病性足部溃疡(DFU)的受试者。没有鉴定到根据首次人类使用指南的风险因素。

SEQ ID NO:4的多肽可以局部给药。因此，SEQ ID NO:4多肽用于局部使用(非流动的)。

SEQ ID NO:4的多肽以0.3至6μg/mm²的总剂量施用。“mm²”^指溃疡面积。指示量(μg)是指每天施用的所述多肽的量。

SEQ ID NO:4的多肽连续14天每天施用两次。此后，停止施用。

在这项研究中，有一种安慰剂。安慰剂被称为PL1。安慰剂是一种皮肤溶液。安慰剂用于局部使用(非流动的)。安慰剂是SEQ ID NO:4多肽(PR1)的安慰剂。安慰剂在其他方面与IMP(PR1)相同。安慰剂的施用与SEQ ID NO:4多肽相同。

PR1和安慰剂1都是由Klifo A/S,Smedeland 36,2600Glostrup,Denmark制备用于试验的。

本研究中没有其他(比较性)药品。

接受本研究的受试者患有或易患一种疾病，即皮肤和结缔组织疾病。更具体地说，接受本研究的受试者是患有糖尿病性神经病性足部溃疡(DFU)的受试者。糖尿病足溃疡是糖尿病的一种主要并发症，是糖尿病患者踝部以下穿过真皮的不愈合或愈合不良的全层伤口。

表9

该试验有一个独立的数据监测委员会。

初步估计试验持续时间为2年1个月。

计划纳入92名受试者(其中60名年龄在18-64岁之间；32人年龄在65岁或以上)。受试者组由患者组成，不包括健康志愿者。包括特定的易感群体。

受试者结束参与试验后的治疗或护理是护理的标准。

已获得当局的伦理批准。已经颁发了赞同的意见。

试验目标:

主要目标:为了评估具有DFU的受试者中单天和多天局部施用SEQ ID NO:4多肽的安全性和耐受性。

次要目标:

(a)评估具有DFU的受试者中单天和多天局部施用SEQ ID NO:4多肽后全身可获得药物的药代动力学特征；

(b)在12周期间评估多日局部施用SEQ ID NO:4多肽对DFU愈合的药效动力学效果。

没有子研究。

主要纳入标准:

第一部分SD和第二部分MD:

受试者必须满足以下所有标准，才有资格参加本研究:

1.在任何研究相关程序之前获得的受试者书面知情同意书；

2.男性或女性受试者，年龄18-80岁(包括极端值)，诊断为1型或2型糖尿病，糖化血红蛋白(HbA1c)≤10％。

3.非生育潜力的女性受试者(WONCBP):-他们必须报告手术绝育(至少在筛查前6个月进行)，或-绝经(必须在筛查前至少一年没有常规月经出血，年龄≥45岁，筛查时FSH≥40mIU/ml)。

4.具有生育能力的女性受试者(WOCBP):她们必须在研究期间和最后一次研究药物给药后至少90天内使用以下一种或多种可靠的避孕方法:a)放置宫内节育器(IUD)或宫内系统(IUS)。b)激素避孕(植入、贴片、口服)。c)屏障避孕法:避孕套或带有杀精子泡沫/凝胶/薄膜/乳膏/栓剂的封闭帽(隔膜或宫颈穹窿/帽)。d)男性伴侣绝育(输精管切除术后证明射精中没有精子)。

5.男性受试者；他们必须在整个研究期间使用两种有效的避孕方法，并且在最后一次研究药物给药后90天内不捐献精子。

6.存在符合以下标准的至少一个糖尿病足溃疡:

a)诊断为全层神经病性DFU，位于踝部或远端(不包括脚趾间溃疡，但包括脚后跟溃疡)。

b)SD：存在6周至12个月，在急剧清创后面积为3–5cm2，在筛选时得到确认。

MD:存在6周至12个月，在急剧清创后面积为3–5cm2，在2周的磨合期后确认。

c)合格研究溃疡和指定足部的任何其他溃疡之间至少有2厘米的边缘。

d)深度≥5毫米，并根据"The University of Texas Staging System forDiabetic Foot Ulcers"(22)分级为1A，在最初的彻底清创后，无包膜、腱或骨外露，无隧道、破坏或窦道。

7.受试者必须能够将目标溃疡保持在这样的位置和方向，即在施用敷料之前，研究药物的施用不会因流失而造成物质的显著损失。

8.筛选前30天内证明了患肢有足够的血管灌注，由以下至少一项定义:

a)踝臂指数(ABI)≥0.9且≤1.2，通过以下方式确认

经皮氧分压(TcPO2)>50毫米汞柱

脚趾压力(体积描记法)>50毫米汞柱

c)多普勒超声(双相或三相波形)至少在两个

脚踝处的血管与受影响肢端的充足血流一致，如SoC测定的。

主要排除标准:

第一部分标清和第二部分标清:

受试者必须不属于以下任何标准，才有资格注册参加研究:

1.仅适用于女性:妊娠或哺乳期女性受试者，由筛查时血清妊娠试验阳性和第-1天进行的尿液试验证实。

2.具有下述的受试者:

a)溃疡伴有感染蜂窝织炎、骨髓炎或根据the Infectious Diseases Society ofthe America's Guidelines(IDSA)(19)的感染临床症状或体征。

b)患肢任何部位的坏疽或坏死。

c)研究肢体上的活动或慢性Charcot足。

d)注册前1个月内进行的计划血管外科手术、血管成形术或溶栓或血管重建术。

e)涉及肌腱、骨骼或关节囊暴露的溃疡(溃疡延伸穿过真皮并进入皮下组织、存在肉芽组织是可接受的)。

f)非糖尿病病因的溃疡。

g)同一目标脚上以前的主要截肢。

h)出于任何原因的实际或最近(3周)抗生素治疗。

i)卧床不起的受试者或预期寿命不到一年的受试者。

3.筛查前6个月内使用任何其他生长因子疗法。

4.筛查前5年内有恶性肿瘤史或有强烈癌症家族史者(如家族性癌症障碍)，但已明确治疗的皮肤鳞状细胞癌或基底细胞癌除外。

5.临床上显著的心血管、肺、肾、内分泌、肝、神经、精神、免疫、胃肠、血液学或代谢疾病，研究者认为这些疾病尚未稳定或可能影响受试者安全或研究结果(如有疑问，应咨询Sponsor's Clinical Research Physician)。

6.接受血液透析或腹膜透析或患有慢性肾功能不全(血浆肌酐>2mg/dl)的受试者。

7.根据PI判断，受试者的关键实验室参数明显异常，干扰患者的安全。

试验范围/试验部分:

试验分两部分:

-第1部分SD-单次递增剂量

-第2部分MD-多次递增剂量

剂量:

SD:0.3、1、3和6μg/mm²

MD:1和3μg/mm²

终点:

主要终点:

第1部分SD:

安全性:

不良事件(AE)和不良药物反应(ADR)

生命体征:收缩压(SBP)和舒张压(DBP)

从Holter提取的12导联ECG参数(HR,PR,QRS,QTcF,QT)

临床实验室评估(化学、血液学和尿液分析)。

第2部分MD:

安全性:

AE和ADR；

生命体征:SBP，DBP，温度；

一式三份12导联ECG；

(如果在研究的第1部分出现任何ECG/心血管发现，则SAC也可以对第2部分的部分或全部实施Holter监测，如所示)；

从Holter提取的12导联ECG参数(HR,PR,QRS,QTcF,QT)；

24小时Holter ECG异常发现(总暂停时间>2.5秒、心房颤动和心房扑动、心室运行、房性早搏(PAC)负担、室性早搏(PVC)负担、异常形态)；0-24小时心率(来自24小时Holter ECG)和每小时平均心率；

临床实验室评估(化学、血液学和尿液分析)。

评估该终点的时间点:如上所示。

次要终点:

第1部分SD:

药代动力学变量:

以下药代动力学参数将从SEQ ID NO:4多肽的血清浓度获得:

AUC 0-12h，AUC00-24h，，AUC0-t，AUC0-∞，Cmax，tmax，t，CL/F，Vd/F；

AUC 0-12h DN，AUC00-24h DN，AUC0-t DN，AUC0-∞DN，Cmax DN。

免疫原性变量:ADA Ct

第2部分MD:

药代动力学变量:

以下药代动力学参数将从SEQ ID NO:4多肽的血清浓度获得:

第一天:AUC 0-12h，Cmax和tmax，；

从第2天到第13天:Ctrough

在给药的最后一天(第14天):AUC 0-12h，AUC0-t，AUC0-∞，Ctrough，Cmax，Cmin，，tmax，tmin，Cav，和Rac，t1/2，CL/F，和Vd/F。

免疫原性变量:

抗药物抗体(ADA)血清浓度将在首次给药前的第1天、出院前的第15天、第24天(第4周)、第52天(第8周)和第80天(第12周)进行评估。

Ct

药效/功效变量:

从基线到D14、D21、D28、D56和D84的目标溃疡面积和体积的平均减少；

目标溃疡面积和体积的愈合时间。治愈将被定义为“完全康复”。也将应用不同的“治愈”定义(部分减少:50％,66％,75％).

评估该终点的时间点:如上所示。

单次递增剂量(SAD)按以下剂量进行:队列A:0.3μg/mm²；队列B:1μg/mm²；队列CA:3μg/mm²；队列D:6μg/mm²。每个队列由SEQ ID NO:4-本地受试者，以避免队列间遗留效应的可能性。这对于痛觉过敏(已知为野生型人神经生长因子)尤其重要。如有必要，可调整剂量水平，如果需要，可包括洗脱期，以满足研究目标。

在单次递增剂量(SAD)中，在筛查和每次连续随访时给予护理标准(SOC)，直到随访期结束，除非发生完全的上皮再形成/愈合，持续2次连续随访。在这种情况下，可以停止SoC，并根据研究者的评估/决定管理受试者的足部。SoC由以下程序组成:

·目标溃疡的清创术(清创术引起的任何可能的出血仅通过压迫和抬高腿部来控制)，

·用石蜡纱布包扎损伤并用无菌纱布制成的保护性绷带覆盖，

·包扎后使用卸载的可移动助行器(walker)(随访期间不可移动)。

如果在研究过程中出现病变感染，必须对病变进行取样用于微生物培养，并根据研究者的决定对受试者进行系统性经验性抗生素治疗，研究者必须根据培养结果调整治疗。必须对每一种感染进行评估，以确定其严重性，尤其是比较严重时。

多次递增剂量(MAD)是在两个队列中进行的，每个队列依次有本地受试者。目标日剂量水平为1μg/mm²和3μg/mm² SEQ ID NO:4多肽(20)或安慰剂(10)。筛选后，符合条件的受试者根据护理标准(SOC，导入期)进行治疗；在测量溃疡大小后确认登记。如果在此导入期溃疡面积减少50％或更多，受试者将不被纳入研究。

试验范围:

在人体内测定IMP的安全性、药代动力学、药效学和其他(耐受性)。

结果

单次递增剂量(SOC)

单次递增剂量(SAD)在四个连续队列中进行，剂量如下:队列A:0.3μg/mm²；队列B:1μg/mm²；队列CA:3μg/mm²；队列D:6μg/mm²，在护理标准之上。在所有这些队列中，SEQ IDNO：4多肽的可定量水平是在各自人受试者的全身血液循环中可检测的。因此，所施用的多肽在施用后存在于受试者体内。

在单剂量给药后对受试者监测不良事件28天。没有与施用SEQ ID NO:4相关的不利事件。因此，施用SEQ ID NO:4多肽与任何可观察到的药物不良反应无关。由于不存在不良药物反应，因此得出结论，SEQ ID NO:4多肽是安全的，被人类受试者很好地耐受。

前景

SEQ ID NO:4多肽的生物活性源于其促进细胞、特别是神经细胞的生长以及维持、增殖和存活的能力。

通过本实施例，研究和确认了在对人体进行单次和重复递增剂量后SEQ ID NO:4多肽安全性、耐受性、药代动力学和药效学模式。

附图简述

图1:根据实施例2的方法的概述，包括在实施例2B中描述的改进。

图2:体外PC12神经突起延伸试验。

表征神经突起平均长度(A；孔中的平均长度)，神经突起总长度(B；每个细胞的平均总长度)和显示神经突起比细胞体长度更长的细胞的百分比(C)。

条形代表平均值±SEM。统计分析:单因素方差分析，然后是Tukey’s post hoc对比媒介物处理组(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图3。疗效研究，8天队列

在皮肤活检时测量的db/db小鼠的血糖水平。在分配到不同治疗组的动物之间没有观察到差异。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图4。功效研究，8天队列。

实验期间(皮肤损伤后第0天和第7天)的体重增加。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图5:疗效研究，8天队列。

热阈值。皮肤活检和神经生长因子给药后第-3天和第7天进行的足底试验中爪子缩回的潜伏期。数据表示为平均值+SEM。使用Student’s t检验进行统计分析，*p<0.05。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图6。疗效研究，8天队列。

从皮肤活检直到第8天，以溃疡外部面积和内部面积测量“愈合时间”(详见试点研究报告)。结果表示为第0天损伤区域的百分比值；数据用平均值+SEM表示。双向方差分析统计分析见正文。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图7。B.功效研究，8天。

第8天溃疡(外部区域)的愈合时间，表示为与第0天相比溃疡愈合的百分比。数据表示为平均值+SEM。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图8:B.疗效研究，8天队列

处死时神经生长因子血浆水平数据表示为平均值+SEM；统计分析:单因素方差分析，随后是post-hoc Dunnett’s检验。*p<0，05，**p<0.01。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图9。疗效研究，30天队列

在皮肤活检时(d-1)、在用SEQ ID NO:4多肽治疗结束后(d-8)和处死时(d28)，测量血糖浓度。详见正文。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图10。疗效研究，30天队列

实验期间体重增加。实验组之间没有观察到差异。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图11:疗效研究，30天队列

皮肤活检和施用SEQ ID NO:4多肽后第0天和第7天的足底试验结果(每组N＝8)。30天队列中获得的数据以平均值+SEM表示；由Student’s t检验进行统计分析。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图12:疗效研究，30天队列

穿刺活检后第0天和第7天测量热痛觉过敏。在该图中，汇集了从8天和30天实验获得的数据(每组中N＝16)；数据为平均值+SEM。统计分析Student’s t检验，*p<0.05。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图13:疗效研究，30天队列。

该表列出了根据临床观察得出的随观察时间的闭合日。“否”表示未观察到闭合。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图14:疗效研究，30天队列。

从皮肤活检到第29天，愈合过程的时间进程，以溃疡的外部面积测量。结果表示为第0天病变面积的百分比值；数据为平均值+SEM。统计分析见正文。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图15:疗效研究，8+30天队列

第8天溃疡(外部区域)的闭合时间。图表中描述的数据是通过汇集8天和30天实验的值获得的；N＝16。数据表示为平均值+SEM。统计分析:单因素方差分析，随后是post-hocDunnett's多重比较检验:F(5，77)＝3.007，P＝0.0156。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图16:疗效研究，30天队列。

在第30天测量神经生长因子血浆水平。数据表示为平均值+SEM；统计分析:单因素方差分析和post-hoc Dunnett’s检验。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图17:疗效研究，30天队列。

A.根据B中的方案取样，显示第7天伤口组织学(苏木精-伊红染色)的显微照片

C-E.伤口边缘的显微照片，显示MET(表皮迁移舌，C,D)和血管生成(E)。

图18:疗效研究，30天队列。

从经媒介物、SEQ ID NO:4(1、10和30μg/天)处理的小鼠获得的再上皮化过程的代表性显微照片。为了进行比较，还报告了完整皮肤的显微照片。图中显示了不同组的表皮层厚度。数据以平均值+SEM报告；统计分析:单因素方差分析，随后进行post-hoc Tukey’s检验，**p<0.01，****p<0.0001。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图19:疗效研究，30天队列。

通过PGP-9.5免疫染色显示的小鼠背部皮肤神经支配的解剖。

图20:疗效研究，8+30天队列。

完整动物(A)、经媒介物(B)和SEQ ID NO:4(30μg/天)(C)处理的小鼠中损伤诱导后30天皮肤中的PGP9.5-IR。D，E:用于评估30天皮肤神经支配的计算机化图像分析程序的ROI(感兴趣区域，D)和阈值设置(E)。

图21:疗效研究，8+30天队列。

伤口诱导后第8天(A)和第30天(B)皮肤中PGP9.5-IR形态测定分析。数据表示为平均值+SEM；统计分析:单因素方差分析，然后是Dunnett’s post-hoc检验；*p<0.05，**p<0.01。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图22:疗效研究，8+30天队列。

SEQ ID NO:4(30μg/天)治疗的组中被修复皮肤的组织学(苏木精-伊红染色)和免疫组织化学分析。A-B:基底膜上修复的皮肤层，如层粘连蛋白染色所示(B，箭头)；神经支配从皮下神经丛出现，并通过基底膜向上突出(C)。损伤后第8天(E)和第30天(F)，MET(D)受到高度的神经支配；在MET中观察到血管生成，如通过苏木精-伊红染色(G)、在低倍镜(H)和高倍镜(I)放大下层粘连蛋白-IR染色观察到的。

缩写:ep，表皮层；表皮迁移舌

图23:疗效研究，8+30天队列。

伤口诱导后第8天(A)和第30天(B)皮肤中的层粘连蛋白-IR形态定量分析。B图中的灰色横条代表完整皮肤中的层粘连蛋白-IR。数据表示为平均值+SEM；统计分析:单因素方差分析，随后进行Dunnett’s post-hoc检验；*p<0.05；***p<0.001；****p<0.0001。

图24:多肽序列。星号(*)＝成熟人NGF中的61位；交叉(+):成熟人神经生长因子中的100位。

A:SEQ ID NO:1:由相应人类开放阅读框编码的前原人NGF序列。

前肽:氨基酸位置1-18；原肽:氨基酸位置19-121；成熟NGF:氨基酸位置122-239；C末端二肽:氨基酸位置240-241。

二硫键(在正确折叠的成熟部分):连接氨基酸位置

弗林蛋白酶切割位点(RSKR):氨基酸位置118-121。

B:前肽、原肽和成熟NGF的示意图。

C:SEQ ID NO:2:成熟人NGF的序列。

D:SEQ ID NO:3

E:SEQ ID NO:4

图25:在糖尿病小鼠中用媒介物或SEQ ID NO:4多肽(1-10-100μg/cm²/天)治疗后的伤口愈合速率以在整个研究过程中“未愈合小鼠的比例”表示。统计分析:Kaplan-Meier生存曲线估计。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图26:伤口诱导后28天修复皮肤中PGP9.5-IR(A)和PECAM1-IR(A)形态计量学分析。数据表示为平均值±SEM(n＝15-18)。统计分析:单因素方差分析，随后进行Dunnett’spost-hoc检验；*p<0.05；**p<0.01。

CHF6467＝SEQ ID NO:4的多肽

图27:在14天的慢性局部治疗后，用Bioseb的电子von Frey装置评估SEQ ID NO:4多肽对溃疡边缘周围区域的疼痛机械阈值的影响。数据表示为平均值±SEM(n＝15-18)。统计分析:单因素方差分析。

序列表

<110> Chiesi Farmaceutici S.p.A.

<120> 皮肤病治疗剂

<130> D411P2

<140>

<141>

<150> EP18194930.6

<151> 2018-09-17

<150> EP18203665.7

<151> 2018-10-31

<160> 4

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 241

<212> PRT

<213> 人

<220>

<223> 相应人开放阅读框编码的前原人NGF的序列

<400> 1

Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile

1 5 10 15

Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile

20 25 30

Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu

35 40 45

Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala

50 55 60

Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg

65 70 75 80

Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu

85 90 95

Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro

100 105 110

Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe

115 120 125

His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly

130 135 140

Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu

145 150 155 160

Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu

165 170 175

Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile

180 185 190

Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val

195 200 205

Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg

210 215 220

Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg

225 230 235 240

Ala

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> 人

<220>

<223> SEQ ID NO: 2: 成熟人NGF的序列

<400> 2

Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp

1 5 10 15

Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys

20 25 30

Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val

35 40 45

Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val

50 55 60

Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys

65 70 75 80

Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln

85 90 95

Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Ala Val Arg

115

<210> 3

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 3

<400> 3

Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp

1 5 10 15

Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys

20 25 30

Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val

35 40 45

Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val

50 55 60

Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys

65 70 75 80

Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln

85 90 95

Ala Ala Trp Glu Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Ala Val Arg

115

<210> 4

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO: 4

<400> 4

Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp

1 5 10 15

Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys

20 25 30

Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val

35 40 45

Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Ser Asn Pro Val

50 55 60

Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys

65 70 75 80

Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln

85 90 95

Ala Ala Trp Glu Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Ala Val Arg

115

Claims (22)

1.SEQ ID NO: 4所示的多肽在制备用于直接施用到皮肤损伤处以局部治疗和/或预防哺乳动物受试者中的皮肤损伤、并且不会导致痛觉过敏的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述哺乳动物受试者是人。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述皮肤损伤的特征为真皮的至少部分消融。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述皮肤损伤是真皮的皮肤损伤。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述皮肤损伤包括至少一种溃疡。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述皮肤损伤选自糖尿病性溃疡、创伤性溃疡、手术性溃疡、压迫性溃疡、慢性溃疡以及这些溃疡的任何组合。

7.根据权利要求1所述的用途，其中所述皮肤损伤是烧伤或机械损伤。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述哺乳动物患有糖尿病或具有患糖尿病的倾向。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述糖尿病选自1型糖尿病和2型糖尿病。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的用途，其中所述多肽以单次施用给药。

11.根据权利要求1-9中任一项所述的用途，其中所述多肽被重复施用。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述多肽每天重复施用1至5次。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述多肽每天重复施用两次。

14.根据权利要求11所述的用途，其中所述多肽被重复施用，持续3至30天。

15.根据权利要求11所述的用途，其中所述多肽被重复施用，持续7至14天。

16.根据权利要求11所述的用途，其中所述多肽被重复施用，直到受伤的身体表面闭合。

17.根据权利要求1-9中任一项所述的用途，其中将所述多肽施用给患有糖尿病性足溃疡(DFU)的受试者。

18.根据权利要求1-9中任一项所述的用途，其中将所述多肽施用给患有糖尿病性神经病性足溃疡的受试者。

19.根据权利要求1-9中任一项所述的用途，其中所述多肽被施用到受伤的身体表面上。

20.根据权利要求19所述的用途，其中剂量/每剂的量为每平方毫米被治疗的受伤身体表面0.3至6微克所述多肽(0.3至6μg /mm²)。

21.根据权利要求1-9中任一项所述的用途，其中所述多肽包含在水性介质中，并且所述水性介质被给予所述哺乳动物受试者。

22.根据权利要求1-9中任一项所述的用途，其中所述多肽通过重组表达和纯化能够获得，其中所述纯化包括在混合模式固定相上的纯化。