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CN113215206B - 一种高抗氧化活性灰树花多糖的制备及提纯方法 - Google Patents

一种高抗氧化活性灰树花多糖的制备及提纯方法 Download PDF

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CN113215206B CN202110451393.8A CN202110451393A CN113215206B CN 113215206 B CN113215206 B CN 113215206B CN 202110451393 A CN202110451393 A CN 202110451393A CN 113215206 B CN113215206 B CN 113215206B
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Abstract

本发明公开了一种具有体外高抗氧化活性的灰树花(Grifola frondosa)多糖的制备和提纯方法，所述方法是在灰树花液体发酵初始时或发酵过程中加入法尼醇。本发明方法通过在灰树花菌丝体液体发酵过程中添加法尼醇，促使灰树花发酵液多糖产量变化，显著提高灰树花发酵所产生酸性多糖组分的产量，在不增加原有发酵周期的基础上，显著提高了灰树花发酵液多糖产量，最大提高幅度达149％，经分离纯化后的酸性多糖含量由7.4％增加到58.2％，经分离纯化后的酸性多糖的体外抗氧化活性相比对照组显著提高，且外源添加物法尼醇安全无毒且稳定性高，从而为工业化生产灰树花发酵液多糖奠定基础。

Description

一种高抗氧化活性灰树花多糖的制备及提纯方法
技术领域
本发明属于灰树花多糖提取技术领域，尤其是一种高抗氧化活性灰树花多糖的制备及提纯方法。
背景技术
灰树花多糖是灰树花发酵液主要的生物活性成份。大量的药理药效的研究证明，灰树花发酵液多糖在抗肿瘤、抗HIV病毒以及防治糖尿病、高血压、高血脂、肥胖症、老年痴呆症等方面具有良好的效果，有些方面甚至超过已经临床应用的香菇多糖、云芝多糖和裂褶菌多糖。另外，灰树花多糖具有很多有利于人体的活性功能。它可以提高机体耐受缺氧能力，增强机体免疫力，清除自由基，对抗放射，增强骨髓、肝脏活性，从而延长寿命。灰树花多糖可分为菌丝体结构多糖和分泌至细胞外的发酵液多糖。两者在结构层次、制备方法以及生理活性方面具有较大的差异。目前对灰树花的研究主要集中在灰树花子实体多糖的提取工艺方面，液态深层发酵的研究报道较少。灰树花多糖的药用价值和保健价值在医药界和食品行业获得密切关注，深受人们的喜爱和认可，具有广阔的应用前景。灰树花的药效已经得到了广泛的认可，但是灰树花酸性多糖组分的产量限制了市场的应用不能满足人们日益增长的需求。
法尼醇是真菌的一种群体感应分子，天然存在于金合欢、茉莉等的香精油中，主要用来制作香料或者制作食用香精，具有天然和安全可靠的优点。法尼醇具有调控真菌菌丝形成、调控细胞膜形成、氧化应激、调节药物流出等生理效应。法尼醇在云芝液态发酵过程中会诱导产生一些ROS，ROS含量的升高会使云芝发酵液的环境有一定的改变，近而影响云芝菌丝体形态的变化和细胞膜的形成及活性物质的产生。测定其体外抗氧化活性在灰树花液体发酵过程中添加法尼醇，以观察灰树花发酵液多糖的产量变化，并以此分离纯化，得到灰树花不同组分的多糖，测定其体外抗氧化活性。
现阶段，由于液体深层发酵技术生产灰树花发酵液多糖具有生产周期短、生产成本低、经济效益高等特点，目前已成为获取灰树花发酵液多糖的有效方法。有文献和专利公开报道了提取灰树花多糖的各种方法，专利公开文献CN105669876A公开了一种灰树花多糖的提取工艺，以灰树花子实体干品作为多糖提取的原料，采用水提法、碱提法、超滤、醇沉等方法来获得灰树花多糖。专利公开文献CN1752109A公开了一种酶解制备灰树花多糖的方法,借助灰树花菌丝体内存在的自身酶系对发酵液中的灰树花菌丝体进行酶解，再向发酵液中加入纤维素酶、β－葡聚糖酶、果胶酶及中性蛋白酶，进行酶解，再经灭酶、过滤、浓缩、醇沉及分离等步骤得到灰树花多糖，巧妙地利用菌丝体自身酶系和外加的混合酶系在适宜的条件下对灰树花真菌发酵液进行酶解，酶解后灰树花粗多糖产品中灰树花多糖含量显著提高。专利公开文献CN104403014A公开了一种提高灰树花多糖得率的制备方法，通过合适的酶解、醇沉技术、利用大孔吸附树脂脱色、超滤膜进行过滤等步骤来提高灰树花多糖的提取率。专利公开文献CN101880700A公开了一种提高灵芝多糖产量的液体发酵方法，该方法是利用灵芝细胞的液体培养,通过在培养基中添加稀土元素镨、钕或镧,提高灵芝多糖的产量。专利公开文献CN110128558A公开了一种具有抗氧化活性的桑葚多糖-铁螯合物的制备方法，该发明制备出一种具有抗氧化活性的补铁剂，利于人体吸收，使螯合物在治疗缺铁性贫血的同时发挥抗氧化作用,达到双重保健功能。专利公开文献CN109988251A公开了一种具有抗氧化活性的金针菇酸性多糖的制备方法，该发明通过向金针菇菌丝体或子实体中加入乙醇、碱性溶液得到金针菇酸性多糖。该发明具有提取得率高,无需加热提取,活性成分破坏小,操作简便,对设备无腐蚀等优点。
通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高抗氧化活性灰树花多糖的制备及提纯方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种具有体外高抗氧化活性的灰树花(Grifola frondosa)多糖的制备和提纯方法，所述方法是在灰树花液体发酵初始时或发酵过程中加入法尼醇。
而且，所述灰树花为保藏编号为CGMCC No.5.404的灰树花孔菌，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所。
而且，所述方法是在第0-2d添加法尼醇。
而且，所述法尼醇的终浓度为0.2～1.0mmol/L。
而且，所述方法是将灰树花接种至发酵培养基中，向发酵培养基中添加法尼醇。
而且，所述液体发酵培养基每L含有：葡萄糖22g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾1.2g，七水硫酸镁0.8g，维生素B10.12g，自然pH。
而且，具体步骤为：
(1)将灰树花种子液接种至发酵培养基中，在灰树花发酵初始时或发酵过程向发酵培养基中加入法尼醇，于25～28℃，160r/min发酵8d；
(2)取分离灰树花菌丝体后的发酵液按发酵液：95％乙醇的体积比为1：4与95％乙醇混合，4℃醇沉过夜，离心后弃上清，沉淀加蒸馏水溶解，在60℃以下溶解8h，即得发酵液多糖溶液；
(3)将得到的发酵液多糖溶液冷冻干燥后，进行脱蛋白脱色后，冷冻干燥；配制5mg/mL的多糖溶液经DEAE-650M离子交换柱层析纯化，依次用蒸馏水、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L的NaCl溶液洗脱，收集相应的组分；将相应组分多糖溶液经葡聚糖凝胶柱纯化得到相应组分，即得具有体外高抗氧化活性的灰树花多糖。
而且，按体积比为10％的接种量进行接种。
一种食药用真菌，所述真菌的生物活性成分为所述的方法制得的胞外多糖。
本发明的优点和积极效果如下：
1、本发明方法通过在灰树花菌丝体液体发酵过程中添加法尼醇，促使灰树花发酵液多糖产量变化，显著提高灰树花发酵所产生酸性多糖组分的产量，在不增加原有发酵周期的基础上，显著提高了灰树花发酵液多糖产量，最大提高幅度达149％，经分离纯化后的酸性多糖含量由7.4％增加到58.2％，经分离纯化后的酸性多糖的体外抗氧化活性相比对照组显著提高，且外源添加物法尼醇安全无毒且稳定性高，从而为工业化生产灰树花发酵液多糖奠定基础。
2、本发明方法得到的灰树花粗多糖溶解经阴离子交换层析和凝胶层析纯化后得到一种酸性多糖组分，其分子量为2.02ⅹ106Da。本发明使用的灰树花菌株为中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)No.5.404。本发明方法中提纯后的多糖具有对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基(OH-)自由基和超氧阴离子(O2-)自由基的清除效果均呈现明显的剂量效应，还原能力也提高。制备得到的灰树花多糖组分的DPPH自由基清除率由49.82％提高到71.68％，提高了44％；ABTS自由基清除率由65.43％提高到98.38％，提高了50％；羟基自由基清除率由78.5％提高到99.46％，提高了27％；超氧阴离子自由基清除率由94.65％提高到98.1％，提高了3.6％；还原力由0.23提高到0.38，提高了65％。此方法制备提纯得到的灰树花多糖的抗氧化活性相对于对照组显著增高，此为胞外多糖在提高生物抗氧化活性中的应用提供实践依据，为提高灰树花多糖的体外抗氧化活性研究提供了新的方向，也更利于工业化生产应用。
3、本发明方法中使用的外源添加物法尼醇是真菌的一种群体感应分子，具有作用在于调控灰树花真菌菌丝形成、调控细胞膜形成、氧化应激、调节药物流出等生理效应，外源添加物的用途是提高灰树花真菌胞外多糖的体外抗氧化活性。
附图说明
图1为本发明中未添加法尼醇灰树花发酵液的参数变化图；其中，(a)为发酵液多糖产量图；(b)为菌体干重图；(c)为残糖含量图；(d)为发酵液pH变化图；
图2为本发明中在发酵0-2d时添加0-0.2mmol/L法尼醇的参数变化图；其中，在灰树花菌丝体进入发酵阶段0-2d时加入法尼醇，灰树花干重有所降低但发酵液多糖产量升高；pH整体变化不大，但相对于没有添加法尼醇的灰树花液体深层发酵的发酵液pH值略高；其中，(a)为发酵液多糖产量图；(b)为菌体干重图；(c)为残糖含量图；(d)为发酵液pH变化图；
图3为本发明中在发酵0-2d时添加0.2-0.4mmol/L法尼醇的参数变化图；其中，经过0-2d发酵后添加外源添加物法尼醇使灰树花发酵液多糖产量明显提高；pH整体变化不大，但相对于没有添加法尼醇的灰树花液体深层发酵的发酵液pH值略高；其中，(a)为发酵液多糖产量图；(b)为菌体干重图；(c)为残糖含量图；(d)为发酵液pH变化图；
图4为本发明中在发酵0-2d时添加0.4-0.6mmol/L法尼醇的参数变化图；其中，在菌丝体发酵0-2d加入法尼醇，可以使灰树花发酵液多糖的产量提高；pH整体变化不大，但相对于没有添加法尼醇的灰树花液体深层发酵的发酵液pH值略高；其中，(a)为发酵液多糖产量图；(b)为菌体干重图；(c)为残糖含量图；(d)为发酵液pH变化图；
图5为本发明中在发酵0-2d时添加0.6-0.8mmol/L法尼醇的参数变化图；其中，在菌丝体发酵至0-2d加入法尼醇，可以使灰树花发酵液多糖的产量显著提高，发酵至结束时，葡萄糖几乎耗尽，得到充分利用。pH整体变化不大，但相对于没有添加法尼醇的灰树花液体深层发酵的发酵液pH值略高；其中，(a)为发酵液多糖产量图；(b)为菌体干重图；(c)为残糖含量图；(d)为发酵液pH变化图；
图6为本发明中在发酵0-2d时添加0.8-1.0mmol/L法尼醇的参数变化图；在菌丝体发酵至0-2d加入法尼醇，可以使灰树花发酵液多糖的产量提高，但影响效果逐渐减弱；pH整体变化较大，相对于没有添加法尼醇的灰树花液体深层发酵的发酵液pH值偏高；其中，(a)为发酵液多糖产量图；(b)为菌体干重图；(c)为残糖含量图；(d)为发酵液pH变化图；
图7为本发明中对照组发酵结束时灰树花发酵液多糖含量、菌丝体多糖含量和总糖含量与在发酵0-2d时添加0.6-0.8mmol/L法尼醇组发酵结束时灰树花发酵液多糖含量、菌丝体多糖含量和总糖含量的变化图；添加法尼醇促进灰树花菌丝体多糖向发酵液中分泌，因此使得灰树花菌丝体多糖含量降低，灰树花发酵液多糖含量升高；
图8为本发明中不同发酵条件下灰树花发酵液多糖样品的离子交换柱层析洗脱曲线图；在灰树花发酵过程中添加法尼醇可以显著增加灰树花发酵液多糖中的酸性多糖组分；其中，(a)为未添加法尼醇灰树花发酵液多糖样品的离子交换柱层析洗脱曲线图；(b)为在发酵0-2d时添加0.6-0.8mmol/L法尼醇的灰树花发酵液多糖样品的离子交换柱层析洗脱曲线图；
图9为本发明中不同发酵条件下灰树花发酵液多糖不同组分的体外抗氧化活性图；在灰树花发酵过程中添加法尼醇可以显著提高灰树花发酵液多糖中的中、酸性多糖组分的体外抗氧化活性，酸性多糖的抗氧化活性提高尤为显著；其中，(a)为灰树花发酵液多糖的不同组分对DPPH自由基的清除能力图；(b)为灰树花发酵液多糖的不同组分对ABTS自由基的清除能力图；(c)为灰树花发酵液多糖的不同组分对羟基自由基的清除能力；(d)为灰树花发酵液多糖的不同组分对超氧阴离子自由基的清除能力；(e)为灰树花发酵液多糖的不同组分的还原能力；未添加法尼醇组的中性多糖和酸性多糖以及添加法尼醇组的中性多糖和酸性多糖分别记为：EPS-C-0M、EPS-C-0.2M、EPS-F-0M、EPS-F-0.2M；
图10为本发明中使用到的保藏编号为CGMCC No.5.404的灰树花孔菌菌种购买证明照片；
图11为本发明中使用到的保藏编号为CGMCC No.5.404的生物材料订购单照片。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一种具有体外高抗氧化活性的灰树花(Grifola frondosa)多糖的制备和提纯方法，所述方法是在灰树花液体发酵初始时或发酵过程中加入法尼醇。
较优地，所述灰树花为保藏编号为CGMCC No.5.404的灰树花孔菌，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所，如图10和图11所示。
较优地，所述方法是在第0-2d添加法尼醇。
较优地，所述法尼醇的终浓度为0.2～1.0mmol/L。
较优地，所述方法是将灰树花接种至发酵培养基中，向发酵培养基中添加法尼醇。
较优地，所述液体发酵培养基每L含有：葡萄糖22g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾1.2g，七水硫酸镁0.8g，维生素B10.12g，自然pH。
较优地，具体步骤为：
(1)将灰树花种子液接种至发酵培养基中，在灰树花发酵初始时或发酵过程向发酵培养基中加入法尼醇，于25～28℃，160r/min发酵8d；
(2)取分离灰树花菌丝体后的发酵液按发酵液：95％乙醇的体积比为1：4与95％乙醇混合，4℃醇沉过夜，离心后弃上清，沉淀加蒸馏水溶解，在60℃以下溶解8h，即得发酵液多糖溶液；
(3)将得到的发酵液多糖溶液冷冻干燥后，进行脱蛋白脱色后，冷冻干燥；配制5mg/mL的多糖溶液经DEAE-650M离子交换柱层析纯化，依次用蒸馏水、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L的NaCl溶液洗脱，收集相应的组分；将相应组分多糖溶液经葡聚糖凝胶柱纯化得到相应组分，即得具有体外高抗氧化活性的灰树花多糖。
较优地，按体积比为10％的接种量进行接种。
一种食药用真菌，所述真菌的生物活性成分为所述的方法制得的胞外多糖。
具体地，相关制备及检测实施例如下：
本发明中，所述的灰树花的活化、种子液培养、发酵液培养，发酵液培养所用到的培养基和培养条件均为灰树花培养中的常规培养基和常规培养条件，这些都是本领域技术人员所公知的。
一种制备具有体外高抗氧化活性的灰树花多糖和提高灰树花发酵液多糖产量的液体发酵方法，步骤如下：
(1)在灰树花菌丝体液体发酵过程中，加入外源添加物法尼醇；
(2)在灰树花液体发酵液过程中添加法尼醇后，发酵培养8d后，得发酵液和灰树花菌丝体；
(3)分离灰树花菌丝体和发酵液后，提取发酵液多糖。
较优地，在灰树花进入发酵阶段0-2d时，加入法尼醇进行发酵。
较优地，所述步骤⑴中加入的法尼醇的浓度为0.6-0.8mmol/L。
较优地，所述步骤⑴中添加法尼醇的时间，在灰树花菌丝体液体发酵的0-2d。
较优地，所述步骤⑶中发酵液多糖的提取步骤如下：
取发酵液1体积与4倍体积95％乙醇静置，4℃醇沉过夜，离心后去上清，沉淀加蒸馏水溶解，在60℃以下溶解8h，即得发酵液多糖。
更具体地，相关制备及检测如下：
本发明所述的方法适用于任何灰树花菌种液体深层发酵。
发酵液多糖测定：取上述发酵液1体积与4倍体积95％乙醇静置，4℃醇沉过夜，离心后去上清，沉淀加蒸馏水溶解，在60℃以下恒温溶解8h，采用苯酚-硫酸法对灰树花发酵液多糖进行测定。
发酵液多糖分离纯化：将上述发酵液多糖溶解，与Sevage试剂(氯仿、正丁醇的体积为4:1)按体积比为3:1混合，磁力搅拌20min，除去蛋白，透析后冻干备用；将除去蛋白的多糖溶解经大孔树脂进行脱色处理，冻干备用；将除去蛋白、脱色后的多糖经DEAE-650M离子交换柱层析进行分离纯化，用0～1.0mol/L的NaCl溶液洗脱，分离出不同性质的多糖组分。
实施例1(对照组)
灰树花种子培养：将生长在PDA平板上的灰树花切割成1cm2大小的小块，取3～5块接种到装液量100mL/250mL三角瓶的种子培养基中，160r/min、28℃培养5d。
灰树花发酵培养：500mL三角瓶中加入150mL发酵培养基，接种量为15mL种子液，160r/min、28℃培养8d。
所述种子培养基每L含有马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾2g，七水硫酸镁1g，维生素B10.02g，pH自然。所述发酵培养基每L含有葡萄糖22g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾1.2g，七水硫酸镁0.8g，维生素B10.12g，pH自然。
其中灰树花多糖的提取方法和测定方法为：
取上述发酵液1mL与4倍体积95％乙醇混合，4℃醇沉12h后，10000rpm离心10min，收集沉淀，沉淀用蒸馏水复溶，得到发酵液多糖溶液。采用苯酚-硫酸法对灰树花发酵液多糖溶液进行多糖含量测定。测定灰树花发酵液多糖含量为(0.5036±0.0011)g/L，各项参数如图1所示。
实施例2
培养基和培养方法同实施例1，区别在于灰树花发酵培养第0-2d，添加外源添加物法尼醇0-0.2mmol/L，添加法尼醇后的灰树花发酵液继续发酵至第8d。发酵结束，获得灰树花菌丝体并提取发酵液中的发酵液多糖。其中，灰树花发酵液多糖的提取方法和测定方法为同实施例1，测定灰树花发酵液多糖含量为(0.8371±0.0532)g/L，相对于对照组提高了66％，各项参数如图2所示。
实施例3
培养基和培养方法同实施例1，区别在于灰树花发酵培养第0-2d，添加外源添加物法尼醇0.2-0.4mmol/L，添加法尼醇后的灰树花发酵液继续发酵至第8d。发酵结束，获得灰树花菌丝体并提取发酵液中的发酵液多糖。其中，灰树花发酵液多糖的提取方法和测定方法为同实施例1，测定灰树花发酵液多糖含量为(1.0058±0.0128)g/L，相对于对照组提高了98％，各项参数如图3所示。
实施例4
培养基和培养方法同实施例1，区别在于灰树花发酵培养第0-2d，添加外源添加物法尼醇0.4-0.6mmol/L。添加法尼醇后的灰树花发酵液继续发酵至第8d。发酵结束，获得灰树花菌丝体并提取发酵液中的发酵液多糖。其中，灰树花发酵液多糖的提取方法和测定方法为同实施例1，测定灰树花发酵液多糖含量为(1.1381±0.062)g/L，相对于对照组提高了126％，各项参数如图4所示。
实施例5
培养基和培养方法同实施例1，区别在于灰树花发酵培养第0-2d，添加外源添加物法尼醇0.6-0.8mmol/L，添加法尼醇后的灰树花发酵液继续发酵至第8d。发酵结束，获得灰树花菌丝体并提取发酵液中的发酵液多糖。其中，灰树花发酵液多糖的提取方法和测定方法为同实施例1，测定灰树花发酵液多糖含量为(1.2528±0.0079)g/L，相对于对照组提高了149％，各项参数如图5所示。
实施例6
培养基和培养方法同实施例1，区别在于灰树花发酵培养第0-2d，添加外源添加物法尼醇0.8-1.0mmol/L，添加法尼醇后的灰树花发酵液继续发酵至第8d。发酵结束，获得灰树花菌丝体并提取发酵液中的发酵液多糖。其中，灰树花发酵液多糖的提取方法和测定方法为同实施例1，测定灰树花发酵液多糖含量为(1.0833±0.0022)g/L，相对于对照组提高了115％，各项参数如图6所示。
实施例7
一种提高灰树花发酵液多糖产量的液体发酵方法，步骤如下：
灰树花菌丝体进行活化，种子液培养和液体深层发酵培养。
灰树花发酵培养第0-2d，添加外源添加物法尼醇0.6-0.8mmol/L。
添加法尼醇后的灰树花发酵液继续发酵至第8d。
发酵结束，获得灰树花菌丝体并提取发酵液中的发酵液多糖。
将灰树花胞外粗多糖脱蛋白脱色后经DEAE-650M离子交换柱层析纯化收集相应的多糖组分。
其中灰树花多糖样品经DEAE-650M离子交换柱层析纯化收集的不同多糖组分测定方法为：
将不同浓度NaCl溶液洗脱的多糖溶液用自动收集器收集，每管收集8mL，每个浓度NaCl收集100管，测定每管多糖溶液的多糖含量。
采用苯酚-硫酸法对不同管多糖溶液进行多糖含量测定。
如图7、图8所示：测定未添加法尼醇的灰树花发酵液多糖样品经DEAE-650M离子交换柱层析纯化收集的中性多糖含量为78.2％，酸性多糖为7.4％；添加法尼醇的灰树花发酵液多糖样品经DEAE-650M离子交换柱层析纯化收集的中性多糖含量为33.5％，酸性多糖为58.2％。
实施例8
实施例5与实施例1相比，灰树花液体深层发酵均为8d，添加了0.6-0.8mmol/L外源添加物法尼醇进行发酵产发酵液多糖，经测定均比实施例1显著提高。两种发酵方法得到的灰树花不同组分多糖的体外抗氧化活性不同，如图9所示：未添加法尼醇的灰树花发酵液多糖样品经DEAE-650M离子交换柱层析和葡聚糖凝胶柱层析纯化收集的中性多糖(2.5g/L,记为EPS-C-0M)对DPPH自由基的清除率为49.82％，对ABTS自由基的清除率为65.43％，对羟基自由基的清除率为78.5％，还原力为0.23；未添加法尼醇的灰树花发酵液多糖样品经DEAE-650M离子交换柱层析和葡聚糖凝胶柱层析纯化收集的酸性多糖(2.5g/L,记为EPS-C-0.2M)对DPPH自由基的清除率为64.96％，对ABTS自由基的清除率为96.8％，对羟基自由基的清除率为83.96％，还原力为0.33。添加法尼醇的灰树花发酵液多糖样品经DEAE-650M离子交换柱层析和葡聚糖凝胶柱层析纯化收集的中性多糖(2.5g/L,记为EPS-F-0M)对DPPH自由基的清除率为58.47％，对ABTS自由基的清除率为88.10％，对羟基自由基的清除率为98.67％，还原力为0.35；未添加法尼醇的灰树花发酵液多糖样品经DEAE-650M离子交换柱层析和葡聚糖凝胶柱层析纯化收集的酸性多糖(2.5g/L，记为EPS-F-0.2M)对DPPH自由基的清除率为71.68％，对ABTS自由基的清除率为98.38％，对羟基自由基的清除率为99.46％，对超氧阴离子自由基的清除率为98.1％，还原力为0.38。
在相同发酵阶段与不同添加量的法尼醇进行发酵培养，并且灰树花的液体深层发酵的总时长不变的条件下，所产生的灰树花发酵液多糖均比实施例1液体发酵所得的灰树花发酵液多糖产量增加。
实施例2～6中，最优的选择是在发酵0-2d添加0.6-0.8mmol/L外源添加物法尼醇的实施例5。
此时，相对于未添加法尼醇的实施例1的灰树花发酵液多糖产量相比可至少提高148.77％。
实施例7中，将灰树花胞外粗多糖脱蛋白脱色后经DEAE-650M离子交换柱层析纯化收集相应的多糖组分。灰树花发酵液添加法尼醇培养后发酵液多糖样品经DEAE-650M离子交换柱层析纯化收集的酸性多糖含量由7.4％增加到58.2％。
实施例8中，经法尼醇诱导的灰树花多糖样品经分离纯化后的中性多糖相比于未添加法尼醇组对DPPH自由基的清除率由49.82％增加到58.47％，对ABTS自由基的清除率由65.43％增加到88.10％，对羟基自由基的清除率由78.50％增加到98.67％，对超氧阴离子自由基的清除率由94.65％增加到96.23％，还原能力由0.23增加到0.35；经法尼醇诱导的灰树花多糖样品经分离纯化后的酸性多糖相比于未添加法尼醇组对DPPH自由基的清除率由64.96％增加到71.68％，对ABTS自由基的清除率由96.80％增加到98.38％，对羟基自由基的清除率由83.96％增加到99.46％，对超氧阴离子自由基的清除率由95.00％增加到98.10％，还原能力由0.33增加到0.38，而添加法尼醇后的酸性多糖组分的抗氧化活性与未添加法尼醇时的中性多糖组分相比对DPPH自由基的清除率由49.82％增加到71.68％，提高了44％；对ABTS自由基的清除率由65.43％增加到98.38％，提高了50％；对羟基自由基的清除率由78.50％增加到99.46％，提高了27％；对超氧阴离子自由基的清除率由94.65％增加到98.10％，提高了3.6％；还原能力由0.23增加到0.38，提高了65％。
以上图中数据在不同的时间加入法尼醇，并均从2d开始测量记录。数据中包括灰树花菌丝体液体发酵和添加法尼醇发酵两个过程。同时，可从中计算出添加法尼醇发酵时长较优范围。从两种发酵得到的多糖经分离纯化得到不同的多糖组分，经法尼醇诱导得到的酸性多糖组分体外抗氧化活性显著提高。
综上所述，在灰树花的发酵0-2d时添加法尼醇进行发酵，可有效提高灰树花液体深层发酵产生发酵液多糖的产量，尤其是酸性多糖的产量，且法尼醇诱导可以增加灰树花各组分的体外抗氧化活性。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (7)

1.一种具有体外高抗氧化活性的灰树花(Grifola frondosa)多糖的制备和提纯方法，其特征在于：所述方法是在灰树花液体发酵初始时或发酵过程中加入法尼醇；
所述法尼醇的终浓度为0.2～1.0mmol/L。
2.根据权利要求1所述的具有体外高抗氧化活性的灰树花多糖的制备和提纯方法，其特征在于：所述灰树花为保藏编号为CGMCC No.5.404的灰树花孔菌，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所。
3.根据权利要求1所述的具有体外高抗氧化活性的灰树花多糖的制备和提纯方法，其特征在于：所述方法是在第0-2d添加法尼醇。
4.根据权利要求1所述的具有体外高抗氧化活性的灰树花多糖的制备和提纯方法，其特征在于：所述方法是将灰树花接种至发酵培养基中，向发酵培养基中添加法尼醇。
5.根据权利要求4所述的具有体外高抗氧化活性的灰树花多糖的制备和提纯方法，其特征在于：所述液体发酵培养基每L含有：葡萄糖22g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾1.2g，七水硫酸镁0.8g，维生素B10.12g，自然pH。
6.根据权利要求1所述的具有体外高抗氧化活性的灰树花多糖的制备和提纯方法，其特征在于：具体步骤为：
(1)将灰树花种子液接种至发酵培养基中，在灰树花发酵初始时或发酵过程向发酵培养基中加入法尼醇，于25～28℃，160r/min发酵8d；
(2)取分离灰树花菌丝体后的发酵液按发酵液：95％乙醇的体积比为1：4与95％乙醇混合，4℃醇沉过夜，离心后弃上清，沉淀加蒸馏水溶解，在60℃以下溶解8h，即得发酵液多糖溶液；
(3)将得到的发酵液多糖溶液冷冻干燥后，进行脱蛋白脱色后，冷冻干燥；配制5mg/mL的多糖溶液经DEAE-650M离子交换柱层析纯化，依次用蒸馏水、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L的NaCl溶液洗脱，收集相应的组分；将相应组分多糖溶液经葡聚糖凝胶柱纯化得到相应组分，即得具有体外高抗氧化活性的灰树花多糖。
7.根据权利要求6所述的具有体外高抗氧化活性的灰树花多糖的制备和提纯方法，其特征在于：按体积比为10％的接种量进行接种。
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