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CN113215172B - 雄性不育基因MsJMT及其应用 - Google Patents

雄性不育基因MsJMT及其应用 Download PDF

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CN113215172B
CN113215172B CN202110471073.9A CN202110471073A CN113215172B CN 113215172 B CN113215172 B CN 113215172B CN 202110471073 A CN202110471073 A CN 202110471073A CN 113215172 B CN113215172 B CN 113215172B
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CN
China
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msjmt
alfalfa
gene
male
male sterile
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徐博
王英哲
徐小博
孟悦
徐安凯
张南翼
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Jilin Academy Of Agricultural Sciences China Agricultural Science And Technology Northeast Innovation Center
Jilin Agricultural University
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Jilin Academy of Agricultural Sciences
Jilin Agricultural University
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    • C12N15/8289—Male sterility

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Abstract

本发明公开了一种雄性不育基因MsJMT的应用及恢复紫花苜蓿雄性不育的方法，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种MsJMT基因的应用，所述MsJMT基因如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，所述的应用是：通过过表达MsJMT基因从而获得紫花苜蓿雄性不育株系并用其生产种子；本发明还提供一种恢复MsJMT基因过表达导致紫花苜蓿雄性不育的方法，通过构建RNAi表达载体，利用遗传转化手段转化上述育成的紫花苜蓿雄性不育株系，使其恢复育性及野生型表型；本发明创制的紫花苜蓿雄性不育株系以及提供的恢复该雄性不育株系育性的方法，在杂交紫花苜蓿构建和农业生产上具有十分重要的应用。

Description

雄性不育基因MsJMT及其应用
技术领域
本发明涉及一种生物工程技术领域的紫花苜蓿株系创制方法，尤其涉及一种雄性不育基因MsJMT及其应用。
背景技术
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种优质多年生豆科牧草，被誉为“牧草之王”，在我国具有多年的栽培历史。作为典型的雌雄同花异花授粉植物，具有自交不亲和性，需采用杂交的方式进行制种。通过“三系法”培育的杂交苜蓿较普通苜蓿品种具有植株高大，抗逆性强，叶片占比高等优势。因有着明显的杂种优势，在实际应用中利用这种优势制种主要分为人工去雄杂交制种和利用核质互作雄性不育系杂交制种两条途径，后者不仅可以减少去雄用工，降低制种成本且被证明能有效培育优质苜蓿杂交品种。为了提高苜蓿杂种优势，降低因人工去雄产生的时间、经济成本，开发优良苜蓿雄性不育系是目前完成苜蓿“三系”配套的重点；但“三系”法需要恢复系和保持系关系限制，不育系的新基因型筛选困难，造成优良种选育效率低下、产量提升困难，因此，筛选和培育新基因型不育系，扩展细胞质背景，为多年生牧草的杂种优势利用奠定基础。
紫花苜蓿在育种方面的研究虽一直在进行，但杂交种选育过程中优质雄性不育系与配套保持系材料筛选困难，同时作为四倍体植物，基因组相对复杂、生长周期较长等因素，也限制了其杂交、杂种优势利用在育性遗传基础和遗传模式等相关研究的进度。
发明内容
本发明的目的是通过提供一种MsJMT基因的应用及恢复MsJMT基因缺失导致紫花苜蓿雄性不育的方法，通过过表达MsJMT基因从而获得紫花苜蓿雄性不育株系，通过抑制MsJMT基因表达恢复紫花苜蓿的雄性不育性。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一方面，本发明提供了一种雄性不育基因MsJMT，所述的MsJMT基因为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了一种雄性不育基因MsJMT的应用，所述的应用是：通过过表达MsJMT基因从而获得紫花苜蓿雄性不育株系，并用所述紫花苜蓿雄性不育株系来生产种子。
最后，本发明还提供了一种恢复MsJMT基因缺失导致紫花苜蓿雄性不育的方法，通过构建含有MsJMT基因的干扰表达载体，利用遗传转化手段转化上述育成的紫花苜蓿雄性不育株系，能够使其恢复育性及野生型表型。
优选地，所述方法包括如下步骤：
将MsJMT互补构建的农杆菌转入所述紫花苜蓿雄性不育系，培育，即得；其中MsJMT互补构建载体中含有如SEQ IDNO.3(正向片段)和SEQ IDNO.4(反向片段)所示的核苷酸序列。
优选地，具体包括以下步骤：
(a)提供携带表达MsJMT互补构建干扰表达载体的农杆菌LBA4404；
以紫花苜蓿cDNA为模板，使用引物：
MsJMT-RNAi(Sense primer)ACTGACGTAAGGGATGACGCAC和
MsJMT-RNAi(Anti-sense primer)GATTTGTAGAGAGAGACTGGT
编码区序列的第195位至第764位共569bp的特异性片段,使产物为两端包含attB位点；将这个片段分别正反向插入使用BP Clonase的pENTR-MsJMT载体；测序验证正确，再用LR Clonase连入pRNAi载体中。再次测序检验核苷酸序列是否正确，成功构建pRNAi-MsJMT干扰表达载体，将所得pRNAi-MsJMT干扰表达载体导入农杆菌；
(b)将紫花苜蓿不育系细胞或组织与步骤(a)中农杆菌感受态细胞接触，从而使编码如SEQ IDNO.3和SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列转入到紫花苜蓿不育系细胞，并且整合到紫花苜蓿不育系细胞的染色体上；
(c)选择转入所述核苷酸的紫花苜蓿细胞或组织，再生，获得紫花苜蓿植株。
本发明的有益效果：
本发明首次从豆科植物的花药中克隆全新基因，即紫花苜蓿茉莉酸甲基合成酶MsJMT基因，通过控制紫花苜蓿茉莉酸甲基合成酶MsJMT基因及其编码蛋白获得紫花苜蓿雄性生殖发育的变异株，实现控制紫花苜蓿生殖过程；本发明获得的紫花苜蓿不育系植株在营养期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后雄性生殖发育异常，花粉败育，得到完全不育的植株，同时通过抑制基因MsJMT的表达而使雄性不育株系恢复育性，在杂交紫花苜蓿构建和农业生产上具有十分重要的应用。
附图说明
图1为本发明提供的实施例1中pBI121-MsJMT过表达载体构建示意图；
图2为本发明提供的实施例2中pRNAi-MsJMT干扰表达载体构建示意图；
图3为本发明提供的不育系形态学观察示意图；
图4为本发明提供的恢复育性植株表征镜像图。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验步骤，通常按照常规条件。
实施例1、紫花苜蓿雄性不育株系创制方法
1.1紫花苜蓿育性控制的MsJMT基因克隆
利用常规紫花苜蓿品种公农1号为材料(以下简称为：苜蓿)，根据MsJMT基因的全长序列设计特异性引物
MsJMT-25(Sense primer)ATGGTACAGAAAAAGGTTCTTTCTT和
MsJMT-26(Anti-sense primer)TCACACTTTTTTGGTCATTGATACGC
依次进行提取花药总RNA,合成cDNA及PCR扩增MsJMT基因的cDNA全长，经测序鉴定cDNA序列全长1047bp，如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，编码全长为348个氨基酸的紫花苜蓿雄性生殖发育控制蛋白，其序列如SEQ IDNO.2所示。
1.2通过过表达手段提高苜蓿中的MsJMT的表达水平
为了对MsJMT蛋白进行应用，构建了MsJMT基因的过表达载体pBI121-MsJMT，并转化野生型植株，以期提高MsJMT的表达，从而达到改变紫花苜蓿育性的目的。
从紫花苜蓿cDNA克隆(MsJMT—EST clone)中用引物
MsJMT-25(Sense primer)ATGGTACAGAAAAAGGTTCTTTCTT和
MsJMT-26(Anti-sense primer)TCACACTTTTTTGGTCATTGATACGC
扩增出MsJMT基因全长序列共1047bp，接入克隆载体pMD20T-MsJMT完成克隆载体的构建。以克隆载体为模板，5’端3’端分别添加SacⅠ、XbaⅠ酶切位点设计引物，引物序列如下。
MsJMT-JM(Senseprimer)GCTCTAGAATGGTACAGAAAAAGGTTCTTTCTTTG
MsJMT-JM(Anti-sense primer)CGAGCTCTCACACTTTTTTGGTCATTGATACG
扩增后片段与空载pBI121进行双酶切后连接，再次测序检验核苷酸序列是否正确，成功构建pBI121-MsJMT质粒。
(1)农杆菌转化
①将农杆菌感受态LBA4404(昂羽生物)于冰上融化。
②将pRNAi-MsJMT分别加入两管感受态细胞。
③冰上静置5min，液氮5min，28℃水浴5min，冰浴5min依次处理后，加入700μl无抗YEP培养基。
④28℃180rpm振荡培养3h。
⑤10000xg离心1min集菌，弃600μl上清，用剩余培养基重悬菌块，全部涂于90mmYEP+25mg·L-1Rif+50mg·L-1Spe的固体选择培养基，28℃倒置培养48h。
⑥挑取黄白色单菌落接种至5ml YEP+25mg·L-1Rif+100mg·L-1Spe的液体选择培养基中，28℃180rpm震荡培养24h。
⑦以1:100浓度接种至50ml相同YEP培养基中，28℃180rpm震荡培养至OD值0.6～0.8。
⑧10000xg离心菌液，弃上清，以20ml MS液体培养基重悬菌块。
(2)侵染苜蓿叶片
①将30d野生苜蓿无菌苗叶片剪成边长为1cm的正方形小块，置于已重悬农杆菌的MS液体培养中。
②140rpm震荡培养15min，使农杆菌充分侵染叶片。
③将叶片倒于无菌滤纸上，吸干水分后放置在90mm无抗MS固体培养基上，暗培养3d。
④将共培养后的苜蓿叶片用含500mg·L-1Cef的无菌水冲洗3遍，吸干水分后嵌入90mm苜蓿分化培养基(MS+1mg·L-16-BA+0.1mg·L-1IAA+200mg·L-1Kan+500mg·L-1Cef+100mg·L-1Tim)。人工气候箱设定参数：28℃恒温，湿度10％，80％光照16小时，0％光照8小时。
⑤10d后将叶片反面换至新的苜蓿分化培养基，使其充分抑菌。
(3)苜蓿组织培养
①将长至0.3～1cm的分化芽掰下，插入新的90mm苜蓿分化培养基上集中培养，7d后移至含有苜蓿生根培养基(1/2MS+200mg·L-1Kan)的650ml培养瓶中。
②15d后将生根的苜蓿挪入无抗MS中继续生长。
(4)阳性植株的检测
植物总DNA提取使用Plant DNA Mini Kit(OMEGA)。
得到洗脱DNA后使用相应引物对提取的总DNA进行PCR检测，电泳后查看条带。RT-PCR分析阳性植株中MsJMT基因的表达水平，表达水平降低到野生型20％以下为有效RNA干扰植株。将筛选后的有效植株进行炼苗。
(5)炼苗
室温下，将种有阳性植株的无菌瓶盖打开，置于阴凉通风处，用喷雾将叶片喷湿，早晚各一次。3d后将植株拔出，将根部残留的培养基冲洗干净，种入10cm育苗盆中，自然光照培养。
1.3MsJMT蛋白活性丧失或表达水平导致紫花苜蓿雄性发育异常
如图3所示，雄性不育系表型与野生型紫花苜蓿表型相比，不育系株形较为紧凑，植株较小，花药干瘪、不开裂，野生型株形较为松散，植株较高，花药大而饱满，开裂散粉(A，B，C)，采用碘化钾染色测定法后，表明花粉在四分体时期的绒毡层细胞异常导致小孢子发育缺陷，进而表现释放花粉粒数量少或不能正常释放花粉粒，导致紫花苜蓿花粉败育，创制新的紫花苜蓿雄性不育株系。
1.4上述创制的雄性不育系在紫花苜蓿制种中的用途
将MsJMT不育系作为父本与三系或两系杂交组合中的不育亲本杂交，得到Fl代。在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株，将该植株与原不育亲本对应的保持系杂交。再次在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株与保持系杂交，经多代杂交筛选后获得新的雄性不育不育系，适宜作为杂交组合中的母本。
实施例2、恢复MsJMT基因过表达导致紫花苜蓿雄性不育的方法
2.1通过抑制MsJMT基因恢复新雄性不育系的育性
将编码MsJMT基因的核苷酸序列通过RNAi技术使其沉默表达并将成功构建的pRNAi-MsJMT载体转入紫花苜蓿不育系植株，能够使紫花苜蓿不育系植株恢复到野生型表型，其中pRNAi-MsJMT载体内包含如SEQ IDNO.3(正向片段)和SEQ IDNO.4(反向片段)所示的核苷酸序列。
以紫花苜蓿cDNA为模板，使用引物
MsJMT-RNAi(Sense primer)ACTGACGTAAGGGATGACGCAC和
MsJMT-RNAi(Anti-sense primer)GATTTGTAGAGAGAGACTGGT
编码区序列的第195位至第764位共569bp的特异性片段,使产物为两端包含attB位点；将这个片段分别正反向插入使用BP Clonase的pENTR-MsJMT载体；测序验证正确，再用LR Clonase连入pRNAi载体中。再次测序检验核苷酸序列是否正确，成功构建pRNAi-MsJMT质粒，将所述沉默载体导入上述创制的新雄性不育系植株，通过共培养、筛选、分化及诱导生根等培养过程，进行阳性鉴定及花粉育性观察，如镜像图4所示，雄性不育系植株视野内含小孢子数量少且大小不一，部分外形不饱满，染色后呈黄绿色至透明色，活力差；野生型视野内含小孢子大小均匀，染色后呈紫灰色，活力强，多数形态饱满，内容物多；雄性不育系植株经RNAi技术转化得到的植株视野内含小孢子数量远超过不育系，且在花期采用I2-KI溶液染色进行育性测定，紫花苜蓿新雄性不育株系的花粉由之前的黄褐色变为蓝色，即恢复了新雄性不育系的育性，同时与野生型紫花苜蓿表型基本无异。
序列表
<110> 吉林农业大学、吉林省农业科学院
<120> 雄性不育基因MsJMT及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1047
<212> DNA
<213> 紫花苜蓿(Alfalfa mosaic virus)
<400> 1
atggtacaga aaaaggttct ttctttgaca aaagaaatga gagatgaagc cataaagaac 60
ctctactgca aaacgttccc aaaaaggcta ggtattgcag atttgggttg ttcttctggg 120
ccaaacactt tgtttgtgat atctgaagtt atcaaattag ttgagaaact ttgccaagaa 180
cataatcacg agtctccaga ataccaagtc tacatgaatg atcttcaagg gaatgatttc 240
aacaacattt ttaggttact tgatagattc acagagaaac taaatgatga agttgaaggt 300
gggattggtc aaatcttttt ctatggcgct cctggttctt tttatggcag gatttttcca 360
acaaaaacaa tgcatttcat tcattcctct tacagccttc aatggctctc acaggttcct 420
aaaggtgtag agaataataa gggtaacatt tacatggcta tcacaagccc cgcaaacgtg 480
ctcaacgctt accatgagca atttcaaaga gatttctcat tgtttctcaa gtgtcgtgca 540
gaagaacttg ttgacggggg tcgtatggtt ctgacaattt tgggaagaaa aagtgatgat 600
agatatagca aagaatgttg ctatatttgg gagcttcttg ctgttgcact taatgacatg 660
gtcttggagg gaattataat ggaggagcaa atggacactt tcaacattcc tcagtacaca 720
ccatctccat cagaagtaaa attagaggtt ttgagagaag ggtcattcac tattgatcgt 780
atggaggtaa caaaagtaca ttggaatgct tataatgatt ggaatgagat tgattatgaa 840
agtagtttat ctaaaccact cattgacgag gcatacaacg tcacaaaatg catgagggct 900
gtggctgaac ctttgttggt tagtcatttt ggagaagcta tcattgaaga agtttttgga 960
agatatttag aaattttagt tgatcgcatg tctaaggaga caactgaatt cattaatgtg 1020
agcgtatcaa tgaccaaaaa agtgtga 1047
<210> 2
<211> 348
<212> PRT
<213> 紫花苜蓿(Alfalfa mosaic virus)
<400> 2
Met Val Gln Lys Lys Val Leu Ser Leu Thr Lys Glu Met Arg Asp Glu
1 5 10 15
Ala Ile Lys Asn Leu Tyr Cys Lys Thr Phe Pro Lys Arg Leu Gly Ile
20 25 30
Ala Asp Leu Gly Cys Ser Ser Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Ile Ser
35 40 45
Glu Val Ile Lys Leu Val Glu Lys Leu Cys Gln Glu His Asn His Glu
50 55 60
Ser Pro Glu Tyr Gln Val Tyr Met Asn Asp Leu Gln Gly Asn Asp Phe
65 70 75 80
Asn Asn Ile Phe Arg Leu Leu Asp Arg Phe Thr Glu Lys Leu Asn Asp
85 90 95
Glu Val Glu Gly Gly Ile Gly Gln Ile Phe Phe Tyr Gly Ala Pro Gly
100 105 110
Ser Phe Tyr Gly Arg Ile Phe Pro Thr Lys Thr Met His Phe Ile His
115 120 125
Ser Ser Tyr Ser Leu Gln Trp Leu Ser Gln Val Pro Lys Gly Val Glu
130 135 140
Asn Asn Lys Gly Asn Ile Tyr Met Ala Ile Thr Ser Pro Ala Asn Val
145 150 155 160
Leu Asn Ala Tyr His Glu Gln Phe Gln Arg Asp Phe Ser Leu Phe Leu
165 170 175
Lys Cys Arg Ala Glu Glu Leu Val Asp Gly Gly Arg Met Val Leu Thr
180 185 190
Ile Leu Gly Arg Lys Ser Asp Asp Arg Tyr Ser Lys Glu Cys Cys Tyr
195 200 205
Ile Trp Glu Leu Leu Ala Val Ala Leu Asn Asp Met Val Leu Glu Gly
210 215 220
Ile Ile Met Glu Glu Gln Met Asp Thr Phe Asn Ile Pro Gln Tyr Thr
225 230 235 240
Pro Ser Pro Ser Glu Val Lys Leu Glu Val Leu Arg Glu Gly Ser Phe
245 250 255
Thr Ile Asp Arg Met Glu Val Thr Lys Val His Trp Asn Ala Tyr Asn
260 265 270
Asp Trp Asn Glu Ile Asp Tyr Glu Ser Ser Leu Ser Lys Pro Leu Ile
275 280 285
Asp Glu Ala Tyr Asn Val Thr Lys Cys Met Arg Ala Val Ala Glu Pro
290 295 300
Leu Leu Val Ser His Phe Gly Glu Ala Ile Ile Glu Glu Val Phe Gly
305 310 315 320
Arg Tyr Leu Glu Ile Leu Val Asp Arg Met Ser Lys Glu Thr Thr Glu
325 330 335
Phe Ile Asn Val Ser Val Ser Met Thr Lys Lys Val
340 345
<210> 3
<211> 472
<212> DNA
<213> 紫花苜蓿(Alfalfa mosaic virus)
<400> 3
caatggtaca gaaaaaggtt ctttctttga caaaagaaat gagagatgaa gccataaaga 60
acctctactg caaaacgttc ccaaaaaggc taggtattgc agatttgggt tgttcttctg 120
ggccaaacac tttgtttgtg atatctgaag ttatcaaatt agttgagaaa ctttgccaag 180
aacataatca cgagtctcca gaataccaag tctacatgaa tgatcttcaa gggaatgatt 240
tcaacaacat ttttaggtta cttgatagat tcacagagaa actaaatgat gaagttgaag 300
gtgggattgg tcaaatcttt ttctatggcg ctcctggttc tttttatggc aggatttttc 360
caacaaaaac aatgcatttc attcattcct cttacagcct tcaatggctc tcacaggttc 420
ctaaaggtgt agagaataat aagggtaaca tttacatggc tatcacaagc ct 472
<210> 4
<211> 472
<212> DNA
<213> 紫花苜蓿(Alfalfa mosaic virus)
<400> 4
aggcttgtga tagccatgta aatgttaccc ttattattct ctacaccttt aggaacctgt 60
gagagccatt gaaggctgta agaggaatga atgaaatgca ttgtttttgt tggaaaaatc 120
ctgccataaa aagaaccagg agcgccatag aaaaagattt gaccaatccc accttcaact 180
tcatcattta gtttctctgt gaatctatca agtaacctaa aaatgttgtt gaaatcattc 240
ccttgaagat cattcatgta gacttggtat tctggagact cgtgattatg ttcttggcaa 300
agtttctcaa ctaatttgat aacttcagat atcacaaaca aagtgtttgg cccagaagaa 360
caacccaaat ctgcaatacc tagccttttt gggaacgttt tgcagtagag gttctttatg 420
gcttcatctc tcatttcttt tgtcaaagaa agaacctttt tctgtaccat tg 472

Claims (5)

1.一种雄性不育基因MsJMT，其特征在于，所述的MsJMT基因为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种雄性不育基因MsJMT的应用，其特征在于，所述的应用是：通过过表达MsJMT基因从而获得紫花苜蓿雄性不育株系，并用所述紫花苜蓿雄性不育株系来生产种子。
3.一种恢复MsJMT紫花苜蓿雄性不育的方法，其特征在于，通过构建干扰表达载体，利用遗传转化手段转化权利要求2中的紫花苜蓿雄性不育株系，能够使其恢复育性及野生型表型。
4.根据权利要求3所述的一种恢复MsJMT紫花苜蓿雄性不育的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将MsJMT互补构建的农杆菌转入所述紫花苜蓿雄性不育系，培育，即得；其中MsJMT互补构建载体中含有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的一种恢复MsJMT紫花苜蓿雄性不育的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(a)提供携带表达MsJMT互补构建干扰表达载体的农杆菌LBA4404；
以紫花苜蓿cDNA为模板，使用引物：
MsJMT-RNAi Sense primer ACTGACGTAAGGGATGACGCAC和
MsJMT-RNAi Anti-sense primer GATTTGTAGAGAGAGACTGGT
编码区序列的第195位至第764位共569bp的特异性片段,使产物为两端包含attB位点；将这个片段分别正反向插入使用BP Clonase的pENTR-MsJMT载体；测序验证正确，再用LRClonase连入pRNAi载体中；再次测序检验核苷酸序列是否正确，成功构建pRNAi-MsJMT干扰表达载体，将所得pRNAi-MsJMT干扰表达载体导入农杆菌；
(b)将紫花苜蓿不育系细胞或组织与步骤(a)中农杆菌感受态细胞接触，从而使编码如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列转入到紫花苜蓿不育系细胞，并且整合到紫花苜蓿不育系细胞的染色体上；
(c)选择转入所述核苷酸的紫花苜蓿细胞或组织，再生，获得紫花苜蓿植株。
CN202110471073.9A 2021-04-29 2021-04-29 雄性不育基因MsJMT及其应用 Active CN113215172B (zh)

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