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CN113215150A - 一种保存裂解液及基于其的样本核酸快速提取方法 - Google Patents

一种保存裂解液及基于其的样本核酸快速提取方法 Download PDF

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CN113215150A CN202110706698.9A CN202110706698A CN113215150A CN 113215150 A CN113215150 A CN 113215150A CN 202110706698 A CN202110706698 A CN 202110706698A CN 113215150 A CN113215150 A CN 113215150A
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刘益含
曹雨娟
韦民进
陆莹
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Changzhou ailibei Medical Technology Co.,Ltd.
Jiangsu China Israel Industrial Technology Research Institute
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Changzhou Ailibei Medical Technology Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种保存裂解液及基于其的样本核酸快速提取方法，它包括以下体积含量的组分：无水乙醇5％～30％；混合水溶液70～95％；以所述保存裂解液的体积为基准，所述混合水溶液包含以下浓度的溶质：氯化铵0.5～1mol/L；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10～50mmol/L；硫氰酸胍0.4‑2mol/L；氯化钠0.4～1mol/L；乙二胺四乙酸10～50mmol/L；三‑(2‑甲酰乙基)膦盐酸盐0.1‑2mmol/L。它包括以下步骤：(a)将样本置于装有纳米珠和所述保存裂解液的密闭容器中；(b)使所述样本裂解；(c)于室温下孵育；经离心洗即可。通过调配的试剂，结合化学和物理方法实现细胞的充分裂解以及核酸保护。

Description

一种保存裂解液及基于其的样本核酸快速提取方法
技术领域
本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及一种保存裂解液及基于其的样本核酸快速提取方法。
背景技术
对于基于核酸扩增和测序技术的分子检测，如何在不同场景保存和获取高质量的核酸是保证下游核酸分析成功的必要因素。生物样品的核酸在室温下会迅速的降解，特别是在野外没有低温保存条件下，核酸降解将会特别严重。在有效样本量缺乏的情况下，有效获得高质量核酸的方法就显得尤为重要，在处理核酸过程中，环境中的核酸酶可降解核酸；另一方面在处理传染性生物样本过程中，这些具有危害性的样本(比如在处理当前疫情下的SARS-CoV-2病毒)有释放到环境中(甚至导致传染)的风险。因此，需要安全和低风险的核酸处理方法。
分子检测对于核酸处理的要求在不断的提高，需要做到对生物样本的处理安全，避免对环境的污染；即需要做到避免收到核酸酶的污染，从而降解样本。需要做到对样本的快速处理，避免长时间的保存引起的降解。核酸处理样品的回收率也是一个重点需要进一步的提升；只有足够高的回收率，才能保证在生物样品中的有效核酸回收率，以保证基于聚合酶链反应(PCR)和测序的需求。
现有的核酸提取技术主要是基于酚氯仿或者胍盐的有机溶剂抽提法。溶解在溶液中的核酸可以通过硅胶膜分离柱或者磁珠吸附来进一步纯化和提取。基于以上两步方法提取核酸所衍生的提取方法众多，比如基于分离柱的核酸提取试剂盒、基于磁珠的核酸提取试剂盒等。比较容易处理的细胞(比如没有细胞壁的革兰氏阴性菌)可以利用酚氯仿或者高浓度高盐直接裂解细胞，从而释放核酸物质。对于难处理的细胞(比如革兰氏阳性菌、真核细胞，甚至组织)需要前处理来裂解细胞，以实现完全释放核酸。
然而，现有的核酸提取技术主要有以下几点缺陷：(1)无法与临床需求配合使用：临床样本通常需要使用运输液或者临床样本储存液；运输液或者储存液会抑制下游的分子检测所需要的反应；而且运输液或者储存液也会大大的稀释样本的浓度，从而严重影响检测的极限，造成假阴性；(2)现有试剂盒通常不能完全提取所采样本，而只有所采样本的一部分被用来核酸提取；(3)大部分所用的裂解液试剂，都仅限于提取功能，对核酸的保护作用有限；(4)大部分试剂盒仅适用于特定的细胞：比如仅适用于细菌的、仅适用于植物细胞的、仅适用于动物细胞的等。
发明内容
为了解决现有的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种保存裂解液。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种保存裂解液，它包括以下体积含量的组分：
无水乙醇 5％～30％；
混合水溶液 70～95％；
以所述保存裂解液的体积为基准，所述混合水溶液包含以下浓度的溶质：
Figure BDA0003131578160000021
优化地，以所述保存裂解液的体积为基准，所述混合水溶液包含以下浓度的溶质：
Figure BDA0003131578160000022
Figure BDA0003131578160000031
本发明还提供一种基于上述保存裂解液的样本核酸快速提取方法，它包括以下步骤：
(a)将样本置于装有纳米珠和所述保存裂解液的密闭容器中；
(b)使所述样本裂解，随后转移至核酸分离柱中进行过柱，倾去废液；
(c)将步骤(b)中所述核酸分离柱放入微量管中，加入TE缓冲液，于室温下孵育；经离心洗即可。
优化地，步骤(a)中，用棉签采集样本，随后将所述棉签插入到装有所述纳米珠和所述保存裂解液的保存管中，旋紧盖子。
进一步地，步骤(b)中，将所述保存管放置在涡旋器上，震荡1.5～3min以进行裂解；或使用均质仪进行裂解，速度1.5～3m/s、时间15～30秒。
具体地，步骤(b)中，将所述保存管置于离心机内，于5000～8000rpm离心0.5～2min。
具体地，步骤(b)中，从离心机内取出所述保存管，将其内混合物转移到具有收集管的核酸分离柱中，盖上所述核酸分离柱的盖子，以8×103～1.5×104g的速度离心20～50秒，倾去所述收集管内的废液。
具体地，步骤(b)中，向所述核酸分离柱中加入洗涤缓冲液WB，再以1.0×104～1.5×104g的速度离心20～50秒；或还选择重复进行步骤(a)至步骤(b)，倒去所述收集管内的液体，以1.0×104～1.5×104g的速度离心1.5～5分钟。
优化地，步骤(c)中，将所述核酸分离柱放入微量管中，用移液器将TE缓冲液加到所述核酸分离柱的白色膜中心，盖上盖子，在室温下孵育3～8分钟。
进一步地，步骤(c)中，将所述核酸分离柱以1.0×104～1.5×104g的速度离心0.5～2分钟以洗脱所述核酸分离柱即可。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明保存裂解液，通过采用特定含量的原料进行复配，即可以用于保存生物样本，也可以同时用于裂解细胞和沉降核酸；可以于常温保存48小时并完全提取所采的样本，适用于细菌细胞，植物细胞和动物细胞，甚至生物组织。经过改进，本分试剂也适合于与磁珠配合使用，用于磁珠法的细菌和病毒的提取。
本发明样本核酸快速提取方法，通过调配的试剂，结合化学和物理方法实现细胞的充分裂解以及核酸保护；通过结合不同的纳米珠子型号，实现对不同微生物的抽提核酸产物类型的控制；采样棉签、保存管、保存裂解液和纳米珠的一体化；而且从采样到核酸提取的整个操作流程(特别是细胞裂解液和纳米珠的混合物)一起转移至核酸分离柱中过柱，较为安全。
附图说明
图1为本发明样本核酸快速提取方法的流程示意图；
图2为实施例1中保存裂解液和现有其他试剂盒的病毒RNA提取效果对比图(电泳结果对比)；
图3为实施例1中保存裂解液和现有其他试剂盒的大肠杆菌提取效果对比图(电泳结果对比)。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种保存裂解液，它包括以下体积含量的组分：
无水乙醇 5％；
混合水溶液 95％；
以保存裂解液的体积为基准，该混合水溶液包含以下浓度的溶质：
Figure BDA0003131578160000041
Figure BDA0003131578160000051
采用上述保存裂解液进行的样本核酸快速提取方法，它包括以下步骤：
(a)将样本置于装有纳米珠和所述保存裂解液的密闭容器中；具体为，用棉签采集样本，随后将棉签插入到装有所述纳米珠和所述保存裂解液的保存管中，旋紧盖子(可以将采样棉签、保存管、保存裂解液和纳米珠组合以实现模块一体化)；
(b)使样本裂解，随后转移至核酸分离柱中进行过柱，倾去废液；具体为，将保存管放置在涡旋器上，震荡1.5～3min以进行充分裂解(或使用均质仪进行充分裂解，速度1.5～3m/s、时间15～30秒)；完毕后，将保存管置于离心机内，于5000～8000rpm离心0.5～2min；从离心机内取出保存管，将其内混合物转移到具有收集管的核酸分离柱中，盖上核酸分离柱的盖子，以8×103～1.5×104g的速度离心20～50秒，倾去收集管内的废液；小心地打开核酸分离柱的盖子，向核酸分离柱中加入600微升洗涤缓冲液WB，再以1.0×104～1.5×104g的速度离心20～50秒；
重复进行步骤(a)至步骤(b)(即前述步骤)，倒去收集管内的液体，将核酸分离柱放回收集管中，以1.0×104～1.5×104g的速度离心1.5～5分钟。
(c)将步骤(b)中所述核酸分离柱放入微量管中，加入TE缓冲液，于室温下孵育；经离心洗即可；具体地，将核酸分离柱放入微量管(新的1.5ml Eppendorf管)中，用移液器将50微升TE缓冲液加到所述核酸分离柱的白色膜中心，盖上盖子，在室温下孵育3～8分钟；将核酸分离柱以1.0×104～1.5×104g的速度离心0.5～2分钟以洗脱核酸分离柱中的DNA即可；Eppendorf管中即为纯化的样本核酸基因组DNA
实施例2
本实施例提供一种保存裂解液，它与实施例1中的基本一致，不同的是：
以保存裂解液的体积为基准，该混合水溶液包含以下浓度的溶质：
Figure BDA0003131578160000061
实施例3
本实施例提供一种保存裂解液，它与实施例1中的基本一致，不同的是：
以保存裂解液的体积为基准，该混合水溶液包含以下浓度的溶质：
Figure BDA0003131578160000062
实施例4
本实施例提供一种保存裂解液，它与实施例1中的基本一致，不同的是：
以保存裂解液的体积为基准，该混合水溶液包含以下浓度的溶质：
Figure BDA0003131578160000063
Figure BDA0003131578160000071
实施例5
本实施例提供一种保存裂解液，它与实施例1中的基本一致，不同的是：它包括以下体积含量的组分：
无水乙醇 30％；
混合水溶液 70％。
实施例6
本实施例提供一种保存裂解液，它与实施例1中的基本一致，不同的是：它包括以下体积含量的组分：
无水乙醇 10％；
混合水溶液 90％。
对比例1
本例提供一种保存裂解液，它与实施例1中的基本一致，不同的是：不含氯化铵。
对比例2
本例提供一种保存裂解液，它与实施例1中的基本一致，不同的是：不含三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。
对比例3
本例提供一种保存裂解液，它与实施例1中的基本一致，不同的是：不含硫氰酸胍。
对比例4
本例提供一种保存裂解液，它与实施例1中的基本一致，不同的是：不含氯化钠。
对比例5
本例提供一种保存裂解液，它与实施例1中的基本一致，不同的是：不含乙二胺四乙酸。
对比例6
本例提供一种保存裂解液，它与实施例1中的基本一致，不同的是：不含三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐。
以实施例1的保存裂解液取样咽拭子，同时加入搭载的甲型流感病毒片段的MS2噬菌体；按照实施例1中描述的提取步骤提取病毒RNA(磁珠法)。与其它两家厂商的病毒RNA提取试剂盒(均为一类医疗器械)进行对比。可见进行核酸提取后，实施例1的保存裂解液和方法有较高的提取效率(参见表1)和更好的提取效果(图2)。可见，实施例1中保存裂解液保持了更好的RNA完整性，说明有效的避免了RNA的降解。实施例2-6中的保存裂解液提取效果分别达60％、72％、45％、10％、20％；而对比例1-6中的保存裂解液均无法提取病毒RNA。
表1咽拭子采样病毒核酸提取浓度对比表
提取浓度(ng/μL,Nanodrop检测的结果)
实施例1中试剂和提取方法(A) 54.2
厂商1的试剂盒提取方法(B) 42
厂商2的试剂盒提取方法(C) 30
还以实施例1的保存裂解液提取革兰氏阴性菌大肠杆菌为例，验证本试剂的细菌核酸提取效果。具体为：取300μL过夜培养的大肠杆菌，离心后，取上清，加入500μL裂解液；按照提取的过柱法和磁珠法步骤分别提取，提取结果件表2和图3；可见磁珠法与保存裂解液的效果更佳。
表2实施例1的保存裂解液以不同方法对革兰氏阴性菌大肠杆菌的提取效果表
Figure BDA0003131578160000081
Figure BDA0003131578160000091
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种保存裂解液，其特征在于，它包括以下体积含量的组分：
无水乙醇 5％～30％；
混合水溶液 70～95％；
以所述保存裂解液的体积为基准，所述混合水溶液包含以下浓度的溶质：
Figure FDA0003131578150000011
2.根据权利要求1所述的保存裂解液，其特征在于，以所述保存裂解液的体积为基准，所述混合水溶液包含以下浓度的溶质：
Figure FDA0003131578150000012
3.一种样本核酸快速提取方法，其特征在于，采用权利要求1或2中所述的保存裂解液，它包括以下步骤：
(a)将样本置于装有纳米珠和所述保存裂解液的密闭容器中；
(b)使所述样本裂解，随后转移至核酸分离柱中进行过柱，倾去废液；
(c)将步骤(b)中所述核酸分离柱放入微量管中，加入TE缓冲液，于室温下孵育；经离心洗即可。
4.根据权利要求3所述的样本核酸快速提取方法，其特征在于：步骤(a)中，用棉签采集样本，随后将所述棉签插入到装有所述纳米珠和所述保存裂解液的保存管中，旋紧盖子。
5.根据权利要求4所述的样本核酸快速提取方法，其特征在于：步骤(b)中，将所述保存管放置在涡旋器上，震荡1.5～3min以进行裂解；或使用均质仪进行裂解，速度1.5～3m/s、时间15～30秒。
6.根据权利要求5所述的样本核酸快速提取方法，其特征在于：步骤(b)中，将所述保存管置于离心机内，于5000～8000rpm离心0.5～2min。
7.根据权利要求6所述的样本核酸快速提取方法，其特征在于：步骤(b)中，从离心机内取出所述保存管，将其内混合物转移到具有收集管的核酸分离柱中，盖上所述核酸分离柱的盖子，以8×103～1.5×104g的速度离心20～50秒，倾去所述收集管内的废液。
8.根据权利要求6所述的样本核酸快速提取方法，其特征在于：步骤(b)中，向所述核酸分离柱中加入洗涤缓冲液WB，再以1.0×104～1.5×104g的速度离心20～50秒；或还选择重复进行步骤(a)至步骤(b)，倒去所述收集管内的液体，以1.0×104～1.5×104g的速度离心1.5～5分钟。
9.根据权利要求3所述的样本核酸快速提取方法，其特征在于：步骤(c)中，将所述核酸分离柱放入微量管中，用移液器将TE缓冲液加到所述核酸分离柱的白色膜中心，盖上盖子，在室温下孵育3～8分钟。
10.根据权利要求9所述的样本核酸快速提取方法，其特征在于：步骤(c)中，将所述核酸分离柱以1.0×104～1.5×104g的速度离心0.5～2分钟以洗脱所述核酸分离柱即可。
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